DE69332100T2

DE69332100T2 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis von zellen

Info

Publication number: DE69332100T2
Application number: DE69332100T
Authority: DE
Inventors: Elias Hakalehto
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 2003-03-13
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: EP0665893B1; WO1994010336A1; GB2286245A; AU5113593A; GB9508202D0; DK0665893T3; DE4395461T1; DE69332100D1; ATE220422T1; JPH08502413A; EP0665893A1; CN1088987A; FI93742C; IL107326A0; FI924834A; FI924834A0; ES2179830T3; FI93742B

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Apparatur zum Nachweis von Zellen, einschließlich von Viren. nie Erfindung betrifft ferner einen Kit, der zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Zellen, worin die zu testende Probe unter Abtrennung der Zellen filtriert wird, und die durch den Filter abgetrennten Zellen unter Freisetzung der in der Zellnachweisreaktion eingesetzten Komponenten hieraus behandelt werden.
Der Nachweis der Zellen betrifft Anwendungen in vielen wissenschaftlichen und technischen Bereichen. Solche Anwendungsbereiche umfassen z. B. klinische und diagnostische Testverfahren, Biotechnologie und Molekulartechnologie wie auch Nahrungsmittel und Umweltanalysen.
In einigen anderen kürzlich beschriebenen Verfahren (WO Patentanmeldung WO 90/11522 und dem US-Patent 4,303,752) kann eine Filtrierung auch zum Aufkonzentrieren der Zellen benutzt werden, aber nicht zum Trennen der nicht-zytoplasmatischen Antigene von den verbleibenden Zellen. Das vorliegende Verfahren bietet daher eine klare Verbesserung auch im Vergleich mit diesen Verfahren, z. B. durch das Hinzugewinnen von Spezifität und die Eliminierung von Hintergrundeinflüssen.

Stand der Technik

Zellen können auf eine Vielzahl von Arten sowohl direkt als auch indirekt nachgewiesen werden. Ein indirekter Weg ist z. B. der Nachweis bestimmter Zellkomponenten auf Basis ihrer chemischen, biologischen, immunologischen oder physikalischen Eigenschaften.
Vor dem Zellnachweis muss die Probe oft filtriert werden, z. B. aus dem Grund, weil das Probenvolumen so groß ist und der Zellgehalt so niedrig ist, dass die Empfindlichkeit des für die der Nachweisreaktion eingesetzten Verfahrens nicht ausreicht, oder aus dem Grund, dass es erwünscht ist, die Zellen auf einem Filter vor der eigentlichen Bestimmung zu waschen. Nachdem die Zellen auf dem Filter-konzentriert wurden und möglicherweise gewaschen wurden, werden sie unter Freisetzung der in der Zellnachweisreaktion eingesetzten Komponenten hieraus behandelt, wobei die Komponenten auf dem Filter nachgewiesen werden (WO-Patentanmeldung 88/08037 und europäisches Patent 101 398).
Bei Zellnachweisverfahren dieser Art treten Probleme aufgrund einer Zahl von Verunreinigungen auf, welche den Nachweis hemmen. Solche Verunreinigungen umfassen z. B. die übrigen Zellen und Zellfragmente und andere in der Probe vorhandene feste Partikel. Auch kann der Filter selbst einen störenden Hintergrund darstellen. Ferner ist das Verfahren arbeitsaufwendig und die Verluste sind groß, insbesondere bei Proben mit einem niedrigen Zellgehalt.

Zusammenfassung der Erfindung

Es war die Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und eine Apparatur zu entwickeln, womit filtrierte Zellen verlässlich und bequem nachgewiesen werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die aus den Zellen freigesetzten Komponenten von den Zellen mit dem gleichen Filter, der für die Filtration der Probe eingesetzt wird, abgetrennt werden, und daß die Komponenten aus dem Filtrat unter Anzeige des Vorliegens der Zellen in der Originalprobe bestimmt werden.
Durch Nachweis der Zellkomponenten aus dem Filtrat und nicht vom Filter werden Verunreinigungen und Hintergrund, der durch den Filter gebildet wird, wie oben dargestellt, vermieden. Ferner können mögliche Pathogene in der Probe inaktiviert werden, und daher haben sie keinen Zugang zu dem zu analysierenden Filtrat. Durch Abtrennung der Zellkomponenten, die aus den Zellen freigesetzt wurden und die für den Nachweis signifikant sind mit demselben Filter, der für die Konzentrierung der Probe verwendet wird, können Labor- und Materialkosten, wie auch Verluste an Zellgehalt oder Zellkomponenten minimiert werden. Ferner ist es möglich, gleichzeitig mehrere Zellenkomponenten, die aus einer Vielzahl von Zelltypen stammen können, zu bestimmen.

Kurze Beschreibung der Abbildung

Die Abbildung zeigt eine für das erfindunsgemäße Verfahren geeignete Apparatur.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren kann für eine große Vielzahl an Probentypen eingesetzt werden. Das Verfahren ist gut für Proben mit einem großen Volumen und niedrigem Zellgehalt geeignet. Das Verfahren wird vorteilhaft für flüssige Proben angewandt, jedoch sind auch andere Proben möglich, wie z. B. Gas, das möglicherweise zunächst mit einer Flüssigkeit extrahiert wird. Proben, die ursprünglich im festen Zustand vorliegen, können in einer Flüssigkeit gelost oder suspendiert und möglicherweise vorfiltriert werden, oder die störenden Substanzen können auf anderem Weg, z. B. durch Zentrifugation, vor dem Nachweis entfernt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann z. B. in der Nahrungsmittel und Getränkeindustrie, bei Wasser-, Gas- und Luftanalysen und bei der Hygienekontrolle im allgemeinen wie auch bei klinischen Proben eingesetzt werden.
Die zu prüfende Probe wird durch einen Filter geleitet, dessen Porengröße auf Basis der abzutrennenden Zellgröße ausgewählt ist. In der vorliegenden Anmeldung umfaßt der Begriff "Zelle" auch Viren, obwohl Viren keine Zellen im eigentlichen Wortsinn sind, sondern infektiöse Partikel mit der Fähigkeit, eine Zelle zu durchdringen. Analog bedeutet eine Zellkomponente auch eine Viruskomponente. Das erfindungsgemäße Verfahren ist gut für den Nachweis von Bakterien und Viren einsetzbar. Bei Bakterien wird im allgemeinen ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 bis- 0,5/um verwendet. Bei eukaryontischen Zellen wird eine größere Porengröße eingesetzt, und bei Viren wird eine kleinere Porengröße - ein Ultrafilter - verwendet. Zum Beispiel kann Saugen oder Druck bei der Filtration eingesetzt werden.
Die Filtration kann in einer üblichen Filtrierapparatur durchgeführt werden, worin der Filter am Boden eines Trichters vorgesehen ist, der Trichter wird auf einer Öffnung einer Saugflasche platziert, und ein Vakuum wird an die Saugflasche, z. B. mit einer Wasserstrahlpumpe, angelegt. Alternativ kann eine Injektionsspritze verwendet werden, wobei die Probe in die Spritze gezogen wird, ein Filter am Ende der Spritze angebracht wird, und die Probe durch den Filter gepresst wird. Es ist natürlich möglich, auch andere Filtriersysteme zu verwenden. Bei Viren ist es praktikabel, Ultrafiltration einzusetzen, worin die Probe auf dem Filter eines Ultrafiltrationsrohrchens aufgebracht wird und durch den Filter durch Zentrifugation gedrückt wird.
Nachdem die Zellen in der Probe auf dem Filter gesammelt wurden, ist es oft praktikabel, einen Waschvorgang durch Durchleiten einer Waschlosung durch den Filter durchzuführen. Destilliertes Wasser oder Puffer kann z. B. als Waschlösung verwendet werden. Die bislang erhaltenen Filtrate werden verworfen. Nach dem möglichen Waschvorgang werden die Zellen unter Freisetzung der für den Nachweis der Zellen signifikanten Zellkomponenten hieraus behandelt. Die Behandlung kann chemisch oder physikalisch durchgeführt werden, und vorzugsweise auf eine solche Art und Weise, dass die Zellen oder der Hauptteil ihrer Textur auf dem Filter verbleiben. Die chemische Behandlung kann enzymatische Behandlung, Detergenzbehandlung, Extraktion, z. B. mit einer Säure oder einer Base oder einem anderen geeigneten Losungsmittel oder Spülen mit Wasser oder einer Pufferlosung oder einem osmotischen Schock umfassen. Die erwünschten Zellkomponenten können physikalisch von den Zellen, z. B. mittels einer Eispresse, durch Ultraschallbehandlung, Elektroporation, Schütteln oder andere mechanische Maßnahmen abgelöst werden.
Die Zelloberflächenschicht wird vorzugsweise entfernt, wobei die Oberflächenschicht in diesem Zusammenhang auch Zellauswüchse umfaßt, und insbesondere bakterielle Flagella werden abgelöst oder abgebrochen und Flagellin-ähnliche Strukturen oder ähnliches wird nachgewiesen. Zum Beispiel kann die bakterielle Oberflächenschicht mit ihren Auswüchsen durch milde Säurebehandlung entfernt werden. Dadurch werden Flagella abgelöst und in diesem Zusammenhang in Flagellin- Moleküle abgebaut. Bei Viren können Antigene, die für den Nachweis signifikant sind, hiervon abgelöst werden.
Die abgelösten Komponenten, die für den Nachweis signifikant sind, werden durch denselben Filter, der für die Filtration der Probe eingesetzt ist, gespült. Das Filtrat wird gesammelt, und das Vorliegen der Zellen in der ursprünglichen Probe wird aus der Spüllösung mittels Reaktionen der Komponenten, die durch den Filter traten, auf Basis der chemischen, biologischen, physikalischen oder immunologischen Eigenschaften der Zellkomponenten nachgewiesen. Es gibt zahlreiche Verfahren zum Nachweis von Zellkomponenten, einschließlich biochemischer, immunologischer und radiochemischer Analysen. Die für den Nachweis notwendigen Reagenzien können auch durch den Filter geleitet werden, oder sie können direkt dem Filtrat zugesetzt werden.
Das erfindunsgemäße Verfahren kann sowohl als ein universelles Verfahren zum Zellnachweis als auch zur Identifikation eines bestimmten Zelltyps eingesetzt werden. Falls das Vorliegen von Zellen im allgemeinen von Interesse ist, ohne Beachtung der Identifizierung, ist der praktikabelste Weg der Nachweis einer Komponente, die in den Zellen universal vorliegt, wie z. B. LPS oder strukturelle Teile davon. Wahlweise kann das Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Zelltyps oder Stammes, der von Interesse ist, eingesetzt werden, in diesem Fall wird eine Zellkomponente, die nur in der fraglichen Zelle vorliegt, als nachzuweisende Zellkomponente ausgewählt. Ein sehr spezifisches Nachweisverfahren wird unter Verwendung immunologischer Verfahren erreicht. Es ist möglich, mehrere Zellkomponenten gleichzeitig aus demselben Filtrat zu bestimmen, und das ist vorteilhaft. Mit anderen Worten ist es möglich, mehrere Zelltypen gleichzeitig durch Selektion der zu bestimmenden Zellkomponenten in einer solchen Weise, dass nur eine Komponente in jedem Zelltyp vorliegt und eine andere in einem anderen Zelltyp usw., nachzuweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist gut geeignet zum Nachweis von Oberflächenkomponenten in einer Zelle, wie einer Zellwand oder Zellmembranproteinen, LPS, Kapselpolysacchariden, Hüllproteinen (z. B. RS-Proteine, d. h. S-Schichtproteine), Flagella oder anderen Auswüchsen von Zellen oder ähnlichen Strukturen, oder von ihren Strukturteilen usw. Die freigesetzten Zellkomponenten werden anschließend durch Abtrennung von dem Hauptteilen der Zellen mit einem Filter nach üblichen Verfahren, wie einem Protein- Bestimmungsverfahren oder einem immunologischen Bestimmungsverfahren, nachgewiesen. Im Prinzip kann jedes von den Zellen abgelöste Protein zum Nachweis des Vorliegens der Zellen in der Originalprobe eingesetzt werden. Zum Beispiel sind Gelelektrophorese, Immunoblot-Analyse und Immuno-PCR (Immuno-Polymerase-Kettenreaktion) (Sano, T., Smith, C. und Cantor, C., 1992), Science 258, Seiten 120-122) für diesen Zweck geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zum Nachweis von Viren, sowohl aus unreinen Proben als auch aus Kulturen eingesetzt werden. Die Probe wird auf einen Ultrafilter aufgebracht, durch den sie durch Zentrifugation geleitet wird, worauf der Filter unter Ablösung der im Nachweis verwendeten Komponenten, wie z. B. Antigenen, aus den Viren, die auf dem Filter verbleiben, behandelt wird. Gleichzeitig wird der Vorteil erreicht, daß pathogene Viren inaktiviert werden können. Die abgelösten Antigene werden durch den gleichen Filter durch Rezentrifugation geleitet, und die Antigene aus dem Filtrat z. B. nach dem Immuno-PCR-Verfahren nachgewiesen, und daher können sehr kleine Antigen- Konzentrationen nachgewiesen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit anderen Worten für die Konzentrierung und Reinigung von Antigenen und die Vorbehandlung von zu testenden Proben durch die Immuno-PCR-Technik geeignet.
Der Umfang der Erfindung umfaßt auch eine Apparatur, die für die Anwendung in dem oben beschriebenen Verfahren geeignet ist. Die erfindungsgemäße Apparatur ist gekennzeichnet dadurch, dass sie Mittel zur Filtrierung der zu testenden Probe wie auch zur Abtrennung der Zellen, mittels der Behandlung der durch den Filter unter Freisetzung der Komponenten, die in der Zellnachweisreaktion eingesetzt werden, hieraus abgetrennten Zellen; Mittel zur Abtrennung der aus den Zellen freigesetzten Komponenten und Mittel zur Bestimmung der Komponenten aus dem Filtrat unter Nachweis des Vorliegens der Zellen in der ursprünglichen Probe umfaßt.
Mittel zur Filtrierung der zu testenden Probe, wie auch der zur Abtrennung der Zellen können z. B. ein oder mehrere Gefäße umfassen, die mit dem Filter verbunden sind, der ferner an einen Abfallbehälter angeschlossen ist, zur Durchleitung der Probe und zum möglichen Waschen von Flüssigkeit durch den Filter, und möglicherweise Mittel zur Durchleitung der Probe durch den Filter, wie eine Pumpe, eine Presse oder eine Zentrifuge. Die Porengröße des Filters wird auf Basis der abzutrennenden Zellen ausgewählt.
Mittel zur Behandlung der durch den Filter freigesetzten Zellen unter Freisetzung der bei der Zellnachweisreaktion eingesetzten Komponenten hieraus können ein Gefäß umfassen, das mit dem Filter zur Durchleitung der Reagenzien, die die Zellkomponenten durch den Filter freisetzen, verbunden ist, oder Mittel zur physikalischen Ablösung der Zellbestandteile und Mittel zur Durchleitung einer Waschlösung durch den Filter.
Das Mittel zur Abtrennung der freigesetzten Komponenten aus den Zellen besteht aus dem gleichen Filter, der zur Filtrierung der Probe eingesetzt wird, und ist möglicherweise ein Mittelstück, wie eine Transfervorrichtung, die die Verwendung desselben Filters erlaubt. Sie können ferner Gefäße umfassen, die mit dem Filter zur Durchleitung von Reagenzien durch den Filter zu den Mitteln zur Bestimmung der Zellkomponenten verbunden sind.
Die Mittel zur Bestimmung der Zellkomponenten umfassen eine Meßstation, die eine Testeinheit, eine Detektoreinheit und eine elektronische Einheit zum Nachweis der aus den Zellen freigesetzten zu bestimmenden Komponente enthält. Die Testeinheit kann z. B. verschiedene Typen an Analysesystemen umfassen, eine Lichtquelle usw., zum Nachweis von aus den Zellen freigesetzten Komponenten aufgrund ihrer chemischen, biologischen, immunologischen oder physikalischen Eigenschaften. Die Detektoreinheit kann z. B. Lichtmessvorrichtungen, radioaktive Messvorrichtungen usw. umfassen. Die Messstation umfasst normalerweise zusätzlich eine elektronische Einheit zum Empfang des gelieferten Signals. Die elektronische Einheit ist vorzugsweise mit einer Datenverarbeitungseinheit und einer Kontrolleinheit verbunden. Die Messstation ist vorzugsweise auch an Gefäße zur Überwachung der Lauflosungen und Elutionslösungen zu den Messstationen verbunden, wobei die anderen Enden mit einem Abfallbehälter verbunden sein können. Die Messstation ist vorzugsweise eine solche, die verschiedene Zellkomponenten hiermit gleichzeitig bestimmen kann.
Die erfindungsgemäße Apparatur umfaßt Ventile oder andere Transfervorrichtungen, mit denen die eingesetzten Reagenzien, der Filter selbst oder das zu testende Filtrat an die gewünschte Stelle befordert werden können.
Die Apparatur umfaßt vorzugsweise einen Behälter für die Probe und einen Behälter für die Waschlösung, die mit dem Filter verbunden werden, wobei der Filter zusätzlich mit einem Abfallbehälter verbunden ist, Transfervorrichtungen zur Übertragung des Filters auf eine andere Station, woran ein drittes Gefäß für die Extraktlösung angeschlossen ist, und das eine Verbindung zum transferierten Filter hat, wobei der Filter ferner an die Meßstation, die Datenverarbeitungseinheit und die Kontrolleinheit angeschlossen ist; und Gefäße für die Lauflösungen und die Elutionslösung, wobei die Gefäße ebenfalls an die Meßstation angeschlossen sind.
Mit der erfindungsgemäßen Apparatur kann das erfindungsgemäße Verfahren weitgehend automatisiert ablaufen. Die Erfindung begrifft auch die Verwendung der Apparatur in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Vorzugsweise wird die Apparatur eingesetzt zum simultanen Nachweis von verschiedenen Zellkomponenten aus der gleichen Probe.
Die Abbildung zeigt ein Beispiel der erfindungsgemäßen Apparatur. Es ist offensichtlich, dass die angegebene Ausführungsform nicht die einzig mögliche innerhalb des Umfangs der Erfindung darstellt.
Die Abbildung zeigt ein Probengefäß 1, das mit Filter 10 über Ventil 7 und an Abfallbehälter 6 über Ventil 14 zur Durchleitung der Probe durch den Filter in den Abfallbehälter verbunden ist. Ferner ist ein weiterer Behälter 2 mit dem Filter über Ventil 8 zur Durchleitung einer Waschflüssigkeit durch den Filter verbunden. Die Apparatur umfasst ferner Transfervorrichtungen 13 zur Beforderung des Filters zu den Stationen 11 und 12. Ein Behälter 3 ist mit der Station 11 über Ventil 9 zur Zuführung einer Extraktionslösung an den Filter verbunden. Der Filter bei Station 11- ist mit einer Meßstation 18 über ein Ventil 15 zur Zuführung der Extraktlösung an die Meßstation verbunden, woran ein Gefäß 4 über Filter 16 zur Zuführung einer Lauflösung angeschlossen ist. Die Meßstation ist an eine Datenverarbeitungseinheit 19 zur Auswertung und Ausgabe des Signals angeschlossen. Die Apparatur umfaßt auch eine Kontrolleinheit 20 zur Überwachung der Funktion der Ventile und anderer mechanischer Teile der Apparatur und zur Stromzufuhr. Ferner ist ein Gefäß 5 an die Meßstation über Ventil 17 zur Zuführung der Elutionslösung zu der Meßstation für die Regeneration angeschlossen. Station 12 ist eine Filteraustauschstation.
Die oben beschriebene Apparatur wird wie folgt eingesetzt: Die zu testende Probe wird dem Probenbehälter 1 zugeführt, woraus sie mittels Druck über Ventil 7 durch Filter 10 und Ventil 14 in den Abfallbehälter 6 geleitet wird. Die auf dem Filter verbleibenden Zellen werden mit einer Waschlösung, die durch Ventil 8 aus Behälter 2 zugeführt wird, gewaschen. Anschließend wird der Filter mit der Transfervorrichtung 13 zur Station 11 überführt, auf der die auf dem Filter verbleibenden Zellen mit einer Losung aus Gefäß 3, kontrolliert durch Ventil 9, extrahiert werden. (Anstelle der Überführung des Filters ist es natürlich möglich, die Extrahierlosung an einen stationären Filter zu leiten, worauf das Filtrat der Meßstation, z. B. über geeignete Ventile, zugeführt wird). Der Extrakt wird über Ventil 15 der Meßstation 18 zugeführt, durch die sie mittels der Lauflösung aus Gefäß 4, zur Verfugung gestellt durch Filter 16, geleitet wird. Das aus der Meßstation abgeleitete Signal wird mittels der Datenverarbeitungseinheit 19 verarbeitet. Die Datenverarbeitung 19 gibt das verarbeitete Signal aus und beurteilt das Vorliegen und die Menge der zu bestimmenden Zellkomponenten. Die Kontrolleinheit 20 überwacht die Funktion der Ventile und anderer mechanischer Teile in der Apparatur und versorgt das System mit Strom. Nach der Messung wird die Meßstation durch Elution der Losung aus Gefäß 5, bereitgestellt über Ventil 17, regeneriert. Bei Station 12 wird der verbrauchte Filter durch einen neuen Filter ersetzt.
Die Erfindung betrifft ferner einen Kit, umfassend die im Verfahren eingesetzten Mittel. Der Kit ist dadurch gekennzeichnet, dass er Mittel zur Filtrierung der zu testenden Probe unter Abtrennung der Zellen, Mittel zur Behandlung der vom Filter abgetrennten Zellen unter Freisetzung der in Zellnachweisreaktion eingesetzten Komponenten hieraus, Mittel zur Abtrennung der freigesetzten Komponenten von den Zellen und Mittel zum Nachweis der Komponenten aus dem Filtrat unter Anzeige des Vorliegens der Zellen in der ursprünglichen Probe umfaßt.
Die Mittel zur Filtrierung der zu testenden Probe zur Abtrennung der Zellen umfassen vorzugsweise Filter und dazugehörige Gefäße, die zur Filtration geeignet sind, und möglicherweise die notwendigen Waschlösungen. Die Mittel zur Behandlung der Zellen umfassen vorzugsweise Reagenzien zur Freisetzung der in der Zellnachweisreaktion verwendeten Komponenten, und das Mittel, womit die Komponenten aus den Zellen freigesetzt werden, besteht aus demselben Filter, der für die Filtration der Probe verwendet wird. Das Mittel zum Nachweis der Komponenten aus dem Filtrat umfaßt die beim Nachweis verwendeten Reagenzien. Die bei der Bestimmung eingesetzte Apparatur ist normalerweise nicht im Kit enthalten.
Die Filter im erfindunsgemäßen Kit werden ausgewählt auf der Basis der abzutrennenden Zellgrößen. Die an den Filter anzuschließenden Gefäße, die zur Filtrierung geeignet sind, können an eine Saugflasche, Injektionsspritze oder Ultrafiltrationsröhrchen angeschlossene Trichter sein. Das zur Freisetzung der Zellkomponenten verwendete Reagens kann z. B. ein Enzym, ein Detergens, eine Säure- oder Laugenlösung oder ein anderes Lösungsmittel, Wasser oder ein Puffer sein. Die für den Nachweis der aus den Zellen freigesetzten Komponenten benötigten Reagenzien können alle Reagenzien sein, die an einer üblichen Reaktion zum Nachweis von Zellkomponenten notwendig sind, wie Reagenzien, die bei der Proteinbestimmung oder Immuntests eingesetzt werden.
Der erfindungsgemäße Kit enthält vorzugsweise Proben und Reagenzgefäße, Filter, Reagenzien zur Freisetzung der in der Nachweisreaktion verwendeten Komponenten und Reagenzien zur Bestimmung der freigesetzten Komponenten.
Die Erfindung wird im Einzelnen mittels der folgenden nichtlimitierenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1

Bakterienkulturen zu 1,5 ml, enthaltend den Pectinatus frisingiensis-Stamm VTT-E-82165 (Hakalehto, E. und Finne, J., 1990, FEMS Microbiology Letters 67, Seiten 307-312) wurden in eine 2 ml Injektionsspritze gezogen und durch einen Filter gepresst, der am Ende der Spritze angebracht war, wobei der Filter eine Porengröße von 0,45/um (Millipore Millex HA) hatte. Die Zellen wurden mit destilliertem Wasser gespült.
Das erhaltene Filtrat wurde verworfen. Ca. 0,2 ml 0,05 M HCl wurde dann unter Verwendung einer anderen Spritze geleitet durch den selben Filter, und das Filtrat wurde in einem Eppendorff-Röhrchen gesammelt und mit NaOH neutralisiert.
Hierauf wurde ein Probenpuffer zum Einsatz in der SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) zu den Filtraten gegeben, und SDS-PAGE mit ihnen durchgeführt, wie beschrieben bei Laemmli, U. S., 1970, Nature (London) 227, Seiten 680-685, unter Verwendung eines 8%igen Gels und handelsüblicher Molekulargewichts-Standards (Pharmacia). Einige der Proben wurden vor dem Lauf gekocht. Die Gele wurden mit Proteinfarbstoff Coomassie Brilliant Blue (CBB) gefärbt und/oder Immunblotting erfolgte unter Verwendung eines Antikörpers, erzeugt in einem mit den Zellen des besagten Bakterienstammes (Hakalehto, E. und Finne, J., 1990, FEMS Microbiology Letters 67, Seiten 307-312) immunisierten Kaninchen. Sowohl bei der Direktfärbung als auch in Immunblotanalyse wurde eine bestimmte Bande bei ca. 63 kDa gefunden, was auf das Vorliegen eines Flagellinproteins mit der Größe von ca. 63 kDa aus dem Pectinatus frisingiensis- Stamm hinwies. Dies ist wiederum ein Hinweis auf das Vorliegen des Pectinatus frisingiensis-Stammes in der ursprünglichen Probe.

Beispiel 2

Eine Probe mit dem Bakterium Bacillus polymyxa (ATCC 842) wurde wie in Beispiel 1 behandelt, und ein SDS-PAGE wurde auf dem gesammelten Filtrat unter Verwendung eines 10%igen Gels durchgeführt, das mit CBB anschließend gefärbt wurde. Eine bestimmte Bande wurde bei 120 bis 130 kDa beobachtet, die dem RS (Regularly Structured) Protein entsprach, das auf der Hülle dieser Bakterien vorliegt, wobei das RS-Protein ein Molekulargewicht von ca. 120 bis 130 kDa hat.

Beispiel 3

Eine Probe mit dem Bakterium Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) wurde wie in Beispiel 1 behandelt. SDS-PAGE-Analyse wurde auf dem gesammelten Filtrat mit einem 8%igen Gel unter Erhalt einer unterschiedlichen Proteinbande leicht unterhalb des 63 kDa des Pectinatus-Stammes, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Nach Reinigung und Sequenzanalyse wurde gefunden, daß die Proteinbande dem Flagellin des Stammes entspricht.

Beispiel 4

Eine Probe mit allen drei Bakterien aus den Beispielen 1 bis 3, d. h. P. frisingiensis VTT-E-82165, E. polymyxa ATCC 842 und E. aerogenes ATCC 13048, wurde wie in Beispiel 1 behandelt und eine SDS-PAGE wurde auf dem gesammelten Filtrat unter Verwendung eines 8%igen Gels durchgeführt. Unterschiedliche Banden wurde an Orten der Banden aus den Beispielen 1 bis 3 erhalten, was auf das Vorliegen aller drei Bakterien in der ursprünglichen Probe hinwies.

Beispiel 5

400 ml einer Probe mit 0,2 ml einer Kultur des Bakteriums E. aerogenes (ATCC 13048) wurde unter Verwendung eines Millipore HA-Filters mit einer Porengröße von 0,45/um und einem Durchmesser von 25 mm filtriert. Die filtrierte Kultur wurde mit destilliertem Wasser oder einem Puffer gewaschen. Die Filtrate wurden verworfen. Anschließend wurden 200/ul 0,05 M HCl zum Filter zugegeben, und das Filtrat wurde in ein Eppendorff-Röhrchen gezogen. NaOH wurde zur Neutralisierung zugegeben, und schließlich wurde mit destilliertem Wasser unter Absaugen gespült. Anschließend wurde SDS-PAGE mit der in dem Eppendorff-Röhrchen gesammelten Probe unter Verwendung eines 12%igen Gels durchgeführt.
Silberfärbung erfolgte auf dem Gel wie folgt: Das Gel wurde zunächst in 50% Methanol geschüttelt, worauf es in eine Silberlösung, hergestellt durch Zutropfen von 0,8 g AgNO3 in -4 ml destilliertem Wasser zu einer Losung, in die 0,36%ige NaOH (21 ml) und Ammoniak (1,4 ml) gemischt worden waren. Nach der Silberlösung wurde das Gel mit destilliertem Wasser gewaschen und in eine Lösung, enthaltend 1,25 ml 1%ige Zitronensäure und 0,125 ml 30%ige Formaldehyd in wäßriger Lösung (250 ml) transferiert. Nach dem die gefärbten Silberbanden erschienen, wurde das Gel mit Wasser gewaschen und in eine Lösung mit 45% Methanol und 1% Essigsaure überführt. Die am deutlichsten Proteinbanden wurden bei ca. 21 kDa und 29 kDa erhalten. Auch wurden andere, von den Zellen abgelöste Komponenten erhalten, aber diese Banden waren schwächer.

Beispiel 6

Ein Coxsackie B 6-Virus, zugehörig zu den Picorna-Viren, erhalten aus einer Patientenprobe, wurde in einer Affennieren-Zellkultur kultiviert, worauf die Viren aus den Zellen durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen der Kultur freigesetzt wurden, 500/ul dieser Virussuspension wurden in 500/ul entionisiertem Wasser gemischt und auf dem Filter eines Ultrafiltrationsröhrchen aufgebracht (Microsep 10K, Filtron, USA) und eine halbe Stunde bei 4000 bis 5000 upm zentrifugiert. Waschen war nicht nötig. 100/ul 0,05 M HCl wurden zum Filter zugegeben, und man ließ eine Stunde bei 37ºC reagieren, worauf Zentrifugation wie oben durchgeführt wurde. Es wurden 100/ul 0,05 M NaOH zum Filter zugegeben und wie oben rezentrifugiert. Es folgte SDS-PAGE mit dem Filtrat (in 10%igen Gel) wie in Beispiel 1. Vor dem Lauf wurden die Proben 5 Minuten in einem SDS-PAGE-Probenpuffer gekocht. Das Gel wurde durch Silberfärbung wie in Beispiel 5 gefärbt, und es wurde eine Immunblotanalyse wie in Beispiel 1 durchgeführt. Ein Anti-Coxsackie B 6-Antikorper, gewonnen in einem Affen (verdünnt 1 : 50) wurde als erster Antikörper eingesetzt, und ein 1 : 1000 verdünnter anti-Mensch-Antikörper markiert mit alkalischer Phosphatase (Dako, Dänemark) wurde als zweiter Antikörper des Immunblots verwendet. Der Anti- Mensch-Antikörper zeigte mit dem Affenantikörper eine Kreuzreaktion.
Das silbergefärbte SDS-Gel hatte mehrere Banden, die teilweise von den mit dem gekochten ganzen Virus erhaltenen Banden verschieden waren. Beim Immunblot-Verfahren wurden vier Banden im Bereich von 25 bis 32 kDa hervorgehoben. Nach der Literatur sind die deutlichsten Strukturproteine von Picorna-Viren normalerweise im Bereich von 9 bis 35 kDa (Andrews, C., Pereira, H. G. und Wildly, P., 1978, Viruses of Vertebrates. Bailliere Tindall, London).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Zellen, umfassend

a) Filtrieren der zu testenden Probe unter Abtrennung der Zellen,

b) Behandeln der Zellen auf dem Filter, um durch chemische oder physikalische Mittel die Oberflächenbestandteile davon freizusetzen, die in der Zellnachweisreaktion benutzt wurden, wobei die Oberflächenbestandteile Makromoleküle, deren Komplexe oder deren Strukturteile, die von Zellauswüchsen wie Flagella oder Auswüchsen von Zellen oder von Kapseln, RS-Schichten, oder LPS, oder der äußeren Membran oder einer anderen entsprechenden Struktur bedeuten

c) Abtrennen der Oberflächenbestandteile, die von den Hauptbestandteilen der Zellen freigesetzt wurden, mit dem gleichen Filter, der zum Filtrieren der Probe benutzt wurde, ohne die Verunreinigungen von den verbleibenden Teilen der Zellen oder vom Filter zu filtrieren im Filtrat zu haben, wobei die Verunreinigungen die Nachweisreaktion verhindern würden, und

d) Bestimmen der Oberflächenbestandteile in dem Filtrat, um das Vorhandensein von Zellen in der ursprünglichen Probe anzuzeigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, das für den Nachweis von Bakterien eingesetzt wird.

3. Verfahren gemäß einen der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die Oberflächenschicht der Zellen, einschließlich der Auswüchse der Zellen, entfernt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, bei dem die Flagella der Bakterien abgelöst und zerbrochen und Flagellinhaltige Strukturen oder ähnliche Strukturen bestimmt werden.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das RS-Protein der Bakterien bestimmt wird.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin ein in den Auswüchsen, Hüllen oder Zellwänden der Bakterien vorhandener Oberflächenbestandteil bestimmt wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die freigesetzten Oberflächenbestandteile in einem Immuntest freigesetzt und bestimmt werden.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin mehrere der Oberflächenbestandteile aus dem Filtrat gleichzeitig zum Nachweis des Vorliegens mehrerer Zelltypen in der selben Probe bestimmt werden.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin ein durch das Immuno- PCR-Verfahren zu bestimmendes Antigen von der Zelloberfläche freigesetzt wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-9, worin die zum Nachweis der Oberflächenbestandteile notwendigen Reagenzien durch den gleichen Filter gepresst werden, der zum Filtrieren der Probe benutzt wird.

11. Verwendung eines Apparatur umfassend:

a) Vorrichtung zum Filtrieren der zu testenden Probe, um die Zellen zu trennen;

b) Vorrichtung zum Behandeln der durch den Filter getrennten Zellen, um davon die Oberflächenbestandteile freizusetzen, die in der Zellnachweisreaktion benutzt wurden;

c) Vorrichtung zum Trennen der von den Zellen freigesetzten Oberflächenbestandteile, wobei die Vorrichtung aus dem gleichen Filter besteht, der zum Filtrieren der Probe benutzt wird; und

d) Vorrichtung zum Nachweisen der Oberflächenbestandteile aus dem Filtrat um das Vorhandensein von Zellen in der ursprünglichen Probe anzuzeigen; in dem Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis von Zellen.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11 wobei die Apparatur verwendet wird, um einige der Oberflächenbestandteile gleichzeitig zu bestimmen.