SE448100B - Forfarande for metning av koncentrationen av atp i mikrobiella celler i ett biologiskt prov, som omfattar en blandning av mikrobiella och somatiska celler - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 443 100 och bakteriella celler i ett prov. Enligt detta sätt omvandlas mängden uppmätt ATP till antal celler, eftersom halten ATP hos ett särskilt slag av cell är tämligen konstant. På liknande sätt kan andra bioluminiscensmätningar, såsom reaktionen för fotobak- teriumbioluminiscens, användas för att bestämma antalet viabla celler med hjälp av flavinmononukleotid (FMN) och en reducerad form av nikotinamindinukleotid (NADH). 7 7 I syfte att bestämma antalet bakterier i födoämnen och kroppsvätskor, som t.ex. mjölk, urin, blod, central ryggmärgs- vätska och saliv, måste ATP, FM och NADH i somatiska celler, exempelvis celler från blod, muskler och epitel, elimineras.

Dessutom måste interferenseffekten av nukleotiderna från mikro- biella celler undvikas i syfte att exakt kunna mäta de soma- tiska cellerna. Användningen av bioluminiscensmetoder för mätning av olika slag av celler har begränsats på grund av brist på lämp- liga provberedningsförfaranden, som möjliggör separat mätning av nukleotiders somatiska och mikrobiella celler.

Selektiv mätning av somatiska eller mikrobiella celler krävs på många områden av vetenskap, medicin, hygienisk kontroll och kontroll av industriell kvalitet. På dessa områden avser de flesta prov följande mätningsbetingelser. g 1. Mätning av endast somatiska celler i närvaro av mikrobi- ella celler. 7 g g 7 7 2. Mätning av provets totala celler; 5. Mätning av endast mikrobiella celler i närvaro av andra celler. 7 77 7 7 7 ' _ 7 Föreliggande uppfinning gör det möjligt att genomföra des- sa mätningar snabbt, enkelt och exakt.

Förfarandet enligt uppfinningen utmärkes härvid av att man bringar provet i kontakt med ett non-joniskt ytaktivt ämne valt bland etoxylerade alkylfenoler och fettsyrapolyglykoletrar under betingelser för selektiv frigöring av ATP från i huvudsak enbart de somatiska cellerna utan att cellmembranen i de somatiska cel- lerna förstörs, avlägsnar därigenom frigjort somatiskt ATP, bringar provet i kontakt med ett jonískt ytaktivt ämne valt bland etoxylerade aminer, etoxylerade diaminer, etoxylerade amider, kvaternära ammoniumsalter av en etoxylerad amin och blandningar därav och/eller polyetylenglykolestrar av fettsyror under be- tingelser för selektiv frigöring av ATP från de mikrobiella . _. .«.._......._.

.MI ß; ä* p 10 15 20 25 30 35 448 100 3 cellerna utan att cellmembranen och cellväggarna hos de mikro- biella cellerna förstörs, och därefter med hjälp av biolumini- _scensanalysteknik mäter koncentrationen av ATP som har selek- tivt frigjorts.från de mikroöiella_cellerna i provet.

Olika alternativ, vilka representerar förfarandet enligt uppfinningen eller har samband med detta, belyses genom följande 0 bakgrundsbeskrivning och utföringsexempel.

Princip för selektiv mätning av somatiska och mikrobiella celler.

A, Provets beredning: p Det är tidigare känt att använda ytaktiva medel för att lysera enkla celler i syfte att eliminera ATP från somatiska cele g ier (den amerikanskanpatentekriften 3 7115 090), Det är deek nu- mera möjligt att utveckla ett sätt för att selektivt fri-göra nukleotider genom cellväggen från olika slag av celler med spe- ciella ytaktiva medel i syfte att mäta koncentrationen av nukleo- tider i levandelsomatiska eller mikrobiella celler eller att be- stämma provets antal viabla celler. _ I I _ I studier av cellers metabolism, inom biokemi, medicin och i studier avseende levande organismer, spelar nukleotidernas koncentrationer en viktig roll. De flesta av 2000 kända enzym använder-nukleotider, t.ex. adenosin- och andra nukleotidfosfa- ter (ATP, ADP, AMF, GTP, ITP, ete.)-,- fiavinmononukleotider (FMN, FMNH2), nikotinamidadenindinukleotider (NAD; NADH; NADPH), som substrat. Till dags dato har det varit svårt att frigöra nukleo- tider från celler utan att cellernas enzymer tillåtits att bryta ned dem eller att nukleotiderna påverkats av behandlingen. För närvarande använda sätt är både mödosamma, kostnadskrävande, långsamma, inexakta och svåra att genomföra på reproducerbart sätt- Enligt separationsmetoden utspädes ofta provet, och kemi- kalier tillföras, vilka stör analysen av nukleotiderna, eller också införes helt enkelt extra felkällor på grund av otaliga förfarandesteg. Konventionella metoder inkluderar splittring av cellerna på mekanisk eller kemisk väg och inaktivering av enzy-A mer genom frysning, uppvärmning eller kemiska medel och efter- följande separering av nukleotiderna från provet genom fällning, vätskekromatografi, tunnskiktskromatografi, vätskeextraktion med organiska lösningsmedel och andra metoder.- 7I samband med föreliggande uppfinning frigöres nukleoti- derna från enkla celler eller ett enkelskikt av celler via cell- 10 l5_ 20 25 50 35 443 100V H väggarna, genom att man gör dessa cellväggar permeabla med yt- aktiva ämnen. Nukleotider med ringa molekylstorlek kan genom- tränga cellväggen efter behandling med ytaktiva ämnen, men enzym uppvisande större molekylstorlek kan icke genomtränga cellväggen och stannar kvar inne i cellen. Härigenom medges fri- göring av nukleotider till extracellulär vätska utan nedbryt- ning av nukleotiderna genom cellens egna enzymer. Röda blodkrop- par (erytrocyter) splittras av de ytaktiva ämnena, men frigjort ATP kan fortfarande mätas exakt, om detta sker inom en minut och företrädesvis inom 15 sekunder efter tillsats av det ytaktiva ämnet. De ytaktiva ämnena kan väljas i enlighet med deras speci- fika egenskaper, som t.ex. föreningens alkylkedjelängd, non- -jonisk och jonisk egenskap, alkoxyleringsgrad (grad av lipo- fílitet eller hydrofilitet) och närvaro av särskilda radikaler, t.ex. kvaternära ammoniumsalter, varvid frigöringen av nukleo- tider kan genomföras selektivt från olika slag av celler. Som en följd härav kan nukleotider, såsom adenosinfosfater, frigöras selektivt från somatiska celler (non-mikrobiella celler) medelst non-joniska ytaktiva ämnen, under det att joniska ytaktiva ämnen användes för att frigöra nukleotider från alla slag av celler.

Denna selektiva frigöring av nukleotider innebär en fördel jäm- fört med tidigare använda sätt, enligt vilka en selektiv extrak- tion icke kan genomföras mellan olika slag av celler. Ytterligare en viktig fördel med_föreliggande uppfinning är att frigöringen av nukleotider från enkla celler sker snabbt, på mindre än 10 se-D kunder. Dessutom kräves endast 0,02-0,1% koncentration av det ytaktiva ämnet för att göra cellväggen permeabel och frigöra nukleotider, varför provet icke utspädes vid tillsats av nämnda nukleotidfrigörande reagens. De ytaktiva ämnena kan.väljas på sådant sätt att deras närvaro icke stör analysen av nukleotiderna.

B. Mätning _ I _ . i ,. i i En känd tillämpning av mätningen av koncentration av nuk- leotider, t.ex. adenosintrifosfat (ATB) och flavinmononukleotid (FMN), är användningen av bioluminiscens. Med bioluminiscens kan extremt låga koncentrationer,ot;ek..10_15M, av nukleotider mätas (amerikanska patentskriften 3 7H5 090). Nämnda höga känslighet möjliggör mätning av nukleotidkoncentration, t.ex. ATP, i en enda levande cell. Denna analysprincip uppvisar otaliga användnings- områden vid mätning av antalet celler i ett prov. Bioluminiscens- u; G l§ 10 15 20 25 30 35 448 100 5 mätningen är mycket snabb och känslig, varför denna mätmetod utgör ett tilltalande sätt för att snabbt mäta bakteriella, jäst-, mögel- och somatiska celler inom hygien, födoämnesindu- stri, mikrobiologi, klinisk kemi, virologi, vävnadskultur, ve- terinärvetenskap och på alla områden av livsvetenskap.

Enligt föreliggande uppfinning möjliggöres snabb, enkel, reproducerbar och fullständig frigöring av nukleotider från alla slags celler, och med användning av uppfinningen uppnås bioluminiscensmätningar snabbare, mer effektivt och selektivt än vad som tidigare varit möjligt med konventionella extrak- tionsmetoder. 0 g vi Exempel på selektiv mätning av somatiska och mikrobiella celler: 1. Mätning av somatiska celler: 0 'Räkningen av levande somatiska celler är betydelsefull i 'många biologiska vätskor såsom blodprov (erytrocyter, leuko- ' cyter och trombocyter) och mjölk (leukocyter för bestämning av mastitis). Detta åstadkommes vanligen medelst råuuwe för elekt- ariska partiklar, som t.ex. instrument baserade på ändringen i elektrisk ledníngsförmåga i medium när cellerna passerar genom en smal öppning, medelst direkt räkning i mikroskop eller genom att man nyttjar nukleotidfällning eller mätning av nukleotid- absorbans (California Mastitis Test och DNA-absorbans av leuko- cyter). Dessa metoder är antingen subjektiva, kräver dyrbar ut- rustning eller är behäftade med inneboende fel på grund av andra 0 partiklar än cellerna. Mätning av somatiska celler i biologiska vätskor med bioluminiscens är både känslig, snabb och exakt. Enl non-jonisk ytaktiv detergent "Triton X-100" (varumärke för Rohm and Haas Comp., Philadelphia, Pennsylvania, USA) har föreslagits för analys av somatiska celler i syfte att non-bakteriellt ATP skall elimineras av ett enzym, benämnt apyras (den amerikanska patentskriften 3 745 090). Man har emellertid icke föreslagit användningen av "Triton X-100" för att frigöra ATP i syfte att mäta halten ATP i somatiska celler. Dessutom sänker "Triton X-100" i en koncentration av 0,1% ljusproduktionen från bio- luminiscensreaktionen med ca 21% och "Triton X-100" frigör ATP från vissa grampositiva bakterier. Det har visat sig möjligt att utveckla ett sätt för att använda särskilda ytaktiva ämnen för att kvantitativt och selektivt frigöra ATP från somatiska celler utan inhibering av bioluminiscensreaktionen i syfte att mäta ~.....;.:.J._.__. _ _ ' 10 15 20 25 30 35 448 100 6 halten ATP i somatiska celler. Dylika non-joniska ytaktiva ämnen inkluderar föreningar såsom etoxylerade alkylfenoler med den kemiska formeln, A n i t- o -r (enats, mxn och fettsyrapolyglykoletrar med den kemiska formeln r n - ena f o - (ena 0112 o)xn vari R betecknar en alkylgrupp eller fettsyrarest och x betyder 2-30 molekyler etylenoxid. Mikrobiellt ATP stör ej mätningen, eftersom de non-joniska ytaktiva ämnena kan väljas på sådant sätt att de icke frigör ATP från mikrobiella celler. Denna se- lektiva frigöring av nukleotider, t.ex. ATP, från somatiska cel- ler åstadkommes genom att man sätter non-joniskt ytaktivt ämne till provet i en koncentration av 0,01-2%, företrädesvis 0,05-0,2%, av provets volym. Denna koncentration av non-joniskt ytaktivt ämne, t.ex. etoxylerade alkoholer och fenoler, som icke ostör bioluminiscensreaktionen, frigör nukleotider från de soma- tiska cellerna till den ektracellulära vätskan, exempelvis vat- ten, buffert- eller saltlösning,-inom tio sekunder-efter att det ytaktiva ämnet blandats med provet. Nukleotiderna är tämli- gen stabila i den extracellulära vätskan, om frigöring av enzy- mer undvikes. Nukleotidkoncentrationen kan mätas omedelbart el- ler några få minuter efter det ytaktiva ämnets tillsats, men då vissa nukleotider, t.ex. adenosinfosfater, kan självoxideras el- ler nedbrytas av bakterier i provet, är det bättre att mäta kon- centrationen av nukleotider inom fem minuter efter tillsatsen av det ytaktiva ämnet; När cellväggen gjorts permeabel med ett non- -joniskt ytaktivt ämne, rör sig de små molekylerna mot den lägret koncentrationsgradienten. ATP och andra ämnen diffunderar ut från cellerna till dess att koncentrationen är lika stor på ut-i sidan som på insidan av cellerna, vilket resulterar iden prak- tiskt taget fullständig, frigöring av ATP (> 99%), när celly-øly- men utgör mindre än 12 av provets totala volym. När de små mole- kylerna frigjorts, börjar cellens egna enzym att utnyttja de sub- strat, vilka lämnats kvar på cellens insida. Om prov får stå längre än fem minuter innan mätningen sker, börjar koncentra- tionen av sutstraten, t.ex. ATP, att minska inne i cellerna och- . substraten frigjorda från cellerna, börjar diffundera tillbaka wii 10 15 20 25 30 f) 35 448 100 ¿ 7 _ : in i cellerna (mot gradienten av lägre koncentration). Häri- - genom kan den totala koncentrationen minska med 10-40% på 30 minuter. Sålunda bör mätningen ske inom fem minuter efter det att man anbringat det ytaktiva ämnet. Koncentrationen av celler får icke vara högre än 10 miljoner och bör företrädesvis vara lägre än 1 miljon celler per ml för att man skall försäkra sig om fullständig och ögonblicklig frigöring av substrat från soma- niska eeller. T Mätning av ATP 1 leukeeycer i mjölk: 0 I syfte att bestämma ATP 1 leukeeyter 1 råmjölk jämfördes effektiviteten hos olika neukleotidektraktionsmetoder. Resulta- ten visade att användningen av non-joniskt ytaktive ämne (etoxy- lerad fenol) gav bättre resultat (Tabell 1) än konventionella metoder: överklorsyraextraktion (1,0 N) och kokning i 1,5-10 mi- nuter i 20 mM buffertlösning av Tris (tris-hydroximetylamino- metan) - 2 mM EDTA (etylendiamintetraättiksyra). Frigöringen av ATP var fullständig een användningen av esexylerad elkenel i 2 0,1% av provets totala volym störde icke bioluminiscensreaktionen.T ATP-koncentrationen mättes med en luminiscensanalysator medelst . ..-vv-___ eldfluge-luciferin-luciferasreagens.

Tabell 1 ' _ Intensiteten hos bioluminiscensljus utsänt av ATP och eldfluge- _ g -luciferin-luciferasreaktion i 1 ml prov av râmjölk innehållande g ,_ * levande leukocyter mättes. g . .

A. Med 0,1 ml2M överklorsyra och neutraliserad med 0,1 ml 1M KOH, B. Med 9 ml kokande buffertlöening 0,02 M Tris - 0,002 M EDTA vid pH 7,ä, och 2 ^' T C. Med 1 ml 0,2% etoxylerad alkohol.

I vardera fallet gjordes mätningar med tre 0§1 ml lika delar av proven. I ' - _ 2 A B 2 c _ Extraktflxl Ennektflxl Non-joniskt ytaktivt ned över- ned ämne (etoxylerad klorsyra . lris4flM alkylfiæuiß f Reletiva ljusenheter 10800 36.200 55.300 I ett studium (P: Tarkkanen, R. Driesch och H. Greiling, A rapid enzymatic micromethod for the determination of intra- cellular and extracellular ATP and its clinical-chemical applications. Analytische Chemie 290 (2):180, 1978) av olika extraktionsmetoder för ATP från blodkroppar jämfördes det non- 10 15' 20 25 30 35 448 100 e 8. -joniska ytaktiva ämnet (NRS, varumärke för Lumac Systems AG, Basel, Nucleotide Releasing_Reagent for Somatic Cells) med den metod där man använder kokande Tris och etanol-EDTA (0,1 M) i blandning 9:l._Extraktion av ATP med NRS var snabb, kvantitativ (96,8-102,2%) och gav ATP-värden, vilka väl korrelerade med a konventionella metoder (r=O,92-0,93)-eNRS var enklare, snabbare och mer reproducerbar. En kopia av försökets sammanfattning bi- fogas.e E E f a e g E En stor fördel, som uppnås vid användning av non-joniska ytaktiva ämnen, är att vissa av dem icke stör den enzymatiska aktiviteten hos det bioluminiscenskatalyserande enzymet, luciferas, varför dessa_non-joniska ytaktiva ämnen kan blandas med bioluminiscensreagensen. Det är sålunda möjligt att kombi- nera samtliga erforderliga kemiska föreningar för att frigöra ATP från cellerna (non-joniska ytaktíva ämnen) och för att alstra bioluminiscensljusreaktionen (luciferas, substrat, enzym- aktivatorer och -stabilisatorer, Mg-salt och buffert) i.en enda reagensförening. Enligt föreliggande uppfinning är beredningen av provet och mätningen utomordentligt enkla och lätta att an- passa till automation. Somatiska celler kan mätas med ett manu-» ellt instrument på mindre än 30 sekunder inkluderande pipet-~ teríng av provet, provets placering i en fotometer, utmatning av reagensförening och erhållande av den relativa ljusavläs- ningen. p 7 p' 2. Mätning av prover med en huvuddel mikrobiella celler: Prov huvudsakligen innefattande mikrobiella celler, t§ex. aktiverat slam och mikrobiella kulturer, kan mätas utan föregå- enda eliminering av.ATP från de non-mikrobiella cellerna. Bak- ; teriens celhßæg uppvisar en polymer benämnd PePÜíd0glycan, som - i gör cellväggen mycket motståndskraftig mot extern kemisk och fysikalisk interferens. Sålunda är det svårare att göra den bak- teriellacellens vägg permeabel än den somatiska cellens vägg.

Enligt föreliggande uppfinning kan man påverka cellväggen hos bakterien på sådant sätt, att den blir permeabel för ämnen av tämligen ringa molekylstorlek, t.ex. nukleotider. Denna permea- bilitet uppnås genom att man behandlar bakterier med joniska yt- aktiva ämnen, varvid de bästa typerna är de innehållande kvater- nära ammoniumsalter och en fettsyra med en kedjelängd av 12 kol- atomer, men vilken som.helst kolkedjelängd mellan H och 22 kan , .- M.. «. -...-f.. u - Wi w' 10' 15 20 :9 448 100 användas.e Man kan använda etoxylerade aminer, etoxylerade diaminer, etoxylerade amider och polyetylenglykolestrar av fettsyror med de kemiska formlerna (C112 cflz o)yH /(CH2 CHQ O)ZH - /(CH2 CHZ O)XH ai 1 ' (CH2 CH2 O)yH eller eller eller u _ i ~ Rco _- (ena C112 o)xH vari R betecknar en fettalkylgrupp härledd från fettsyror med 8-18 ikolatomer och x,¶y och z är antalet etylenoxidgrupper, som ligger i intervallet 2-50, ß _ och kvaternära salter av etoxylerade aminer med den kemiska formeln 7 + 1:1 _ (cflz 0112 o)xH y “ß R R l _ 2 ivari R, Bl och R2 betecknar en grupp som alkyl, etoxylerad alkohol, alkylaryl, etoxylerad amin, alkylarylalkyl, etoxialkyl eller hydroxi- alkyl och R3 betecknar metylgrupp eller etylgrupp, x kan ha värdet 2-l5 och y t.ex. kan beteckna halogen, sulfat, sulfit, fosfat.

Dylika ytaktiva ämnen kan även vara fluorerade kolväten elleri hyaminklorid. ¶ _ ¶ Ett kvaternärt ammoníumsalt är icke nödvändigt, eftersom katjonf aktiva etoxylerade amíner också frigör nukleotider från bakteriellaa celler, men kvaternära ammoniumsalter av etoxylerade aminer med en 'kedjelängd av 12 kolatomer arbetar snabbare och påverkas mindre av buffríngsmedel, pH och andra medel, som eventuellt kan ingå i de mikrobiella proven. En blandning av 5-95 % katjonaktiv etoxylerad amin och 5-95 % kvaternär polyoxietylerad amin kan användas för att uppnå snabb nukleotidfrigöring från cellerna utan att störa eller in-5 aktivera luciferasenzym använda i bioluminiscenssystemen. 5 Hastigheten för luminiscensljusreaktionen med användning av eld- 10 15 20 25, 30 35 f Z ” 10 flugeluciferin-luciferasreagens från eldf1ugaikan.ändras genom att man ändrar förhållandet mellan etoxylerad amin med en kedjelängd av 12 kolatomer och kvaternär etoxylerad amin med en kedjelängd av 12 L9\ kolatomer. Frigöringen av ATP och bioluminiscensreaktionen med endast etoxylerad amin är lângsam§ Med användning av en blandning av kvater- när etoxylerad amin och etoxylerad amin är frigöringen tämligen lång- sam eller tämligen snabb beroende på de båkzytaktiva ämnenas propor- tioner i blandningen (fig. 1), Ju större mängd kvaternär etoxylerad amin som är närvarande, desto snabbare sker frigöring¿ enzymkinetik och ljusreaktion. En blandning av 70 % etoxylerad amin och 30 % kva- ternär etoxylerad amin ger en modest reaktionshastighet och 1,2-2,0 gånger förhöjd relativ ljusavläsning i eldflugebioluminiscensreaktio- nen jämfört med samma koncentration av ATP i vatten utan blandningen_ av ytaktiva ämnen uppmätt vid 10-sekunders intervall; Det är uppen-_ bart att denna blandning ökar omvandlingshastigheten för luciferas- enzym och eventuellt påverkar enzymets hydrofila lägen. Mer än 50 % kvaternärt salt av etoxylerad amin reducerar aktiviteten hos nämnda luciferasenzvm, och saltets proportion i förhållande till den etoxy- lerade aminen måste följaktligen kontrolleras. 0 0 Mätning av mikrobiella celler: 0 a Om ett prov, exempelvis en ren bakteriell kultur, eller en blan- dad bakteriell kultur endast innehåller bakterier eller 1000 gånger I fler bakterier än andra celler utföres mätningen av bakteriella nukleo- tider helt enkelt genom att man tillsätter 0,01-2 Z, företrädesvis_ 0,05-0,2 %, joniska ytaktiva ämnen; som t.ex; etoxylerade aminer, och företrädesvis uppvisande ett kvaternärt ammoniumsalt som del därav, varvid man blandar detta med provet i syfte att frigöra nu- kleotiderna genom cellväggarna, Därefter kan man placera provet i ett instrument för mätning av nukleotidkoncentrationen, exempelvis ATP, 0 med eldflugebioluminiscensreaktionen. Den ljusintensitet, som alstras av reaktionen i provet, är direkt relaterad till koncentrationen av ATP eller antalet viabla bakterier i provet, som visas i tabell 2.

Tabell 2 ' c a _ a _ _ _ Relativ ljusintensitet alstrad av ATP, frigjort från ölika an- t å tal bakteriella celler medelst etoxylerad amin-kvaternär etoxylerad amín i en koncentration av 0,1 %,tuppmättes; Bakteríerna suspenderades n! i 0,5 mi fysiologisk Nacl-lösning (0,9 z) och mattes enligt eiafiuge- bioluminiscensmetoden. 0 f! 10 15 20 25 30 35 0 448 100 11g - Antal bakterier i provet Relativa ljusenheter uppmätta med fotometer 150 000 lU80 500 000 aÄ800 1.000 000 9580 2.000 000 18900 Extraktionseffektiviteten hos blandningen av etoxylerad amin och kvaternärt salt av etoxylerad amin i förhållandet 70:50 och i en kon- centration av 0,1 % av provets volym jämfördes med Tris (0,02 M) - EDTÅ (0,002 M) vid PH 7,5, kdaüngmetmkm, och jämfördes med överklor- syraextraktion enligt tabell 1. Resultaten från de tre replikaförsö- ken ges nedan: 0 I' 0 g 0 0,1% etoxylerad Trisf amin och kvater- Överklorsyra närt salt av etoxí- serad m. KOH kande -lerad amin i för- buffert- hållandet 70:30 medel ' ' Komplett blod _ 100 % 7 % 80 % ” Escherichia coli” . 0 A b Suspension 10 celler 100 % t 3 % 95 %Ä Chlorella sp.alga 100 % _ - 100 2 ï- Frigöringen av_ATP från jäst- och svampceller med nämnda bland- ning av etoxylerad amin och dess kvaternära salt är långsammare än frigöringen av ATP från bakterier. Frigöringen från bakterier är full- ständig på mindre än 15 sekunder under det att den kvantitativa fri- göringen från jäst- och svampceller sker på 30-60 sekunder. För kvan-_0 titativ frigöring får cellernas volym icke vara större än l % av pro- vets totala volym. Frigöringen är icke fullständig från tjocka väv-ha nadssektioner och tjocka flockar av mikrober (mer än 1 mm3), eftersom reagenset icke bryter sönder mikrobiella celler utan i stället fri- gör små molekyler genom cellväggene g _i 3. Mätning av mikrobiella celler i närvaro av ett stort antal soma-T tiska celler: När bakterieprovet, i fall där nukleotider såsom ATP eller FMN skall mätas, innehåller non-mikrobiella celler, måste nukleotiderna från dessa non-bakteriella celler elimineras innan de bakteriella nukleotiderna kan mätas. Enligt tidigare eldflugebioluminiscensmeto- der sker detta genom att man lyserar de non-bakteriella cellerna med-”li ett non-joniskt ytaktivt ämne “Triton X-100", varjämte man sätter_ett__ ATP-as enzym, såsom apyras, till provet i syfte att bryta ned non- bakteriellt ATP. Senare mätes bakteriellt ATP genom att man extraherar o,1M neutrali- EDTA xof L7 10 '15 20 25 30 35 448'10Û D 12 ATP och inaktiverar apyras med kokande Tris-EDTA-buffringsmedel, organiska lösningsmedel, baser, syror och använder andra konventionel- la metoder (se den amerikanska patentskriften 3,7H5,090).

Ovan nämnda metod är behäftad med en del nackdelar: “Triton X-100" extraherar icke ATP kvantitativt från alla slags non-bakteriella cel- ler. Dessutom frigör "Triton X-lbb" ATP från grampositiva bakterier, vilket reducerar bioluminiscensljusreaktionen. Ovan nämnda metod kan leda till inexaktheter vid mätning av bakterier i kroppsvätskor och födoämnen. När provet behandlas med kokande buffertlösning Trís-EDTA i syfte att inaktivera apyras och frigöra ATP frå bakteriella celler (se den amerikanska patentskriftena3,7ü5,090) utspädes provet starkt, vilket sänker metodens känslighet." j A Fyra förbättrade sätt för att eliminera non-bakteriellt ATP från bakterieprov avses enligt föreliggande patent. Det första sättet_ är fö1¿anae=. " c _ ' ' _ Non-bakteriella nukleotider, t.ex. ATP, frigöres av ett non-jo- niskt ytaktivt ämne.eller annat ytaktivt ämne, som icke påverkar den bakteriella cellväggens permeabilitet, och provet med volym 50 /ul- l00 ml, företrädesvis 50-lOO0_/ul, filtreras genom ett membranfilter uppvisande 0,1-2 fun, företrädesvis 0,2-O,h5 /um, porstorlek. Non- bakteriellt ATP passerar filtret och elimineras sålunda samtidigt, som intakta bakterier lämnas kvar på filtret. Filtret sköljes däref- ter med buffertlösning, fysiologisk saltlösning eller destillerat _ vatten och placeras ilen transparent mätflaska, varefter joniskt yt- aktivt ämne, t.ex._en blandning av etoxylerad amin och kvaternär etoxylerad æün, tillsättes i en koncentration av 0,05-2 Z för att fri- göra bakteriellt ATP och mätning sker därefter enligt reaktionen med. eldflugebioluminiscens; Enligt detta sätt är stegen enkla och snabba,' och eventuellt störande ämnen, förutom non-bakteriellt ATP, såsom salter, färgade ämnen, enzyminhibitorer och liknande, avlägsnas ock- så. Dessutom utspädes ej provet utan koncentreras i själva verket, varför analysens känslighet ökas. När man använder en mätflaska med flat botten och ett filter med mindre diameter än flaskans innerdia- meter, kan filtermembranet placeras på flaskans botten och som ett resultat härav kommer filtret ej att utestänga ljus mellan vätskepro- vet och ljusdetektorn. g 7 g Det andra sättet sker enligt följande: A Provet med volym 0,1-100 ml, företrädesvis 0,5-10 ml, filtreras genom ett membranfilter 0,1-O,U5 /um till dess en tunn vätskefilm åter- få [av 10 15 20 2.5 30 35 448 100 13 g står på filtrets översida. Filtret bör icke bli torrt, då detta medför påkänningar på mikroberna och reduktion av deras ATP-halt från den normala. Non-joniskt ytaktivt-ämne i koncentration av t.ex. 0,01-0,10 % men företrädesvis 0,1-0,2 %-i form av en lösning av etoxylerade fenoler tillsättes filtret i en volym av 0,01-10 ml, företrädesvis 0,1-0,5 ml. Efter 10-60 sekunder filtreras vätskan. vätskan spars ej och man ger akt på att filtret ej blir torrt. Filtret sköljes en till tre gånger med 0,1-10 ml sterilt vatten, fysiologisk saltlösning eller lämplig buffertlösning i syfte att avlägsna hela mängden non- bakteriellt ATP från filtret, cellspillror och fílterhållarens väggar, r men under filtreringen av sköljlösningen får filtret icke bli torrt.

Efter sköljningen täckes filtret med 0,05-10 ml, företrädesvis 0,1-li mi, av en lösning 0,01-1 1, speciellt 0,05-0,2 z, av_joniska ytaktiva- ämnen, företrädesvis med en blandning av en etoxylerad amin och kva- ternärt ammoniumsalt av etoxylerad amin i ett förhållande av 95:5-5á95 men företrädesvis i förhållandet 70:30. En kedjelängd av 12 kolatomer föredrages i den etoxylerade aminen. Detta reagens får påverka de g mikrobiella cellerna på filtret i 10-30 sekunder, och lösningen inne- hållande ATP frigjort från de mikrobiella cellerna filtreras ned if ett provrör eller direkt ned i en mätkyvett; Filtret och filterhålla- re sköljes med 0,05-10 ml, företrädesvis 0,1-0,5 ml, destillerat vat- ten ned i samma behållare som lösningen av joniskt ytaktivt ämne I med ATP. Därefter är provet redo för mätning.

-Ett annat sätt för att eliminera non-bakteriella nukleotider, är centrifugering. Nukleotider av somatiska celler frigöres av ett? non-joniskt ytaktivt ämne, såsom etoxylerade fenoler, och bakterier- ' na sedimenteras genom centrifugeríng i l-20 minuter vid 3000-20000 g; Den överst stående vätskan med frigjorda non-bakteriella nukleotider slängs bort och bakterierna suspenderas ånyo i en ringa volym vatten, saltlösning eller buffertlösning, och de bakteriella nukleotiderna frigöras genom tillsats av joniska ytaktiva ämnen, t.ex. etoxylerade u æmüær, i koncentration av 0,05-2 Z av total volym. Omedelbart efter- åt kan koncentrationen av bakteriella nukleotider mätas enligt bio- luminíscensmetoden. Höga nollprovsvärden (non-bakteriellt ATP) kan 'sänkas genom ytterligare tvättning med vatten, buffertlösning eller saltlösning och efterföljande centrifngeríng före tillsats av jonískt ytaktivt ämne och mätning av de bakteriella nukleotiderna.

Enligt det fjärde sättet användes ett ATP-as enzym, t.ex. apyras, i immobiliserad form. Sättet sker enligt följande: 10 15 20 25 30 35 _-. ..«.. 448 100 e i i A114 Ett.prov av 0,05-10 ml, företrädesvis 0,1-1 ml, eller ett filtermembran innehållande både somatiska och mikrobiella celler behandlas med 0,05-10 ml, men företrädesvis med 0,1-1 ml av 0,01-2%, speciellt 0,05-0,25, non-joniskt ytaktivt ämne, såsom e e etoxylerade fenoler, vilka ej stör reaktionen med eldfluge- i I bioluminiscens. Enligt denna behandling frigöres ATP från soma- tiska celler på nâgra få sekunder. Immobiliserat ATP, 0,1-10 enhe- ter, företrädesvis 1-5 enheter, tillsättes i form av.glaskulor, plaststicka, cellulosa eller andra fibrer, metallkulor, latex el- ler andra makromolekylkulor, eller också kan apyras immobiliseras på provrörets väggar. Provet inkuberas 0,5-30 minuter, företrä- desvis 1-10 minuter, vid temperaturer 20-3700 med eller utan om- ' röring för att tillåta apyras att bryta ned somatiskt ATP. Efter inkubation behandlas en jämn volym av 0,01-10 ml, företrädesvis 0,05-1 ml, av provet med 0,1-10 ml, företrädesvis 0,05-1 ml- 0,01-1%, speciellt 0,05-0,2%, av joniskt ytaktivt ämne såsom etoxylerad amin, och företrädesvis en blandning av etoxylerad amin och etoxylerad amin med ett kvaternärt ammoniumsalt i för- hållandet 5:95% till 95:51-men företrädesvis i ett förhållande P1 av respektive 70:30%Q'Härigenom frigöres mikrobiellt ATP kvanti- tativt på några få sekunder, från bakterier på 10-15 sekunder och från jäst och svampar på 20-60 sekunder när antalet celler är lägre än 10 pför bakterier och mindre än 106 per ml för jäst och svampar. Koncentrationen av mikrobiellt ATP kan sedan mätas med eldflugebioluminiscensreagens. Koncentrationen av ATP omvand- las till antalet bakterieceller med användning av bestämda värden för ATP per cell i kända prov eller 0,3-2 femtogram Q p (0,A x 10-15) per cell för okänd blandad population av bakterier, 130-170 femtogram per cell för bryggerijäst som rapporterats i litteraturen (A.J.D*Eustachío,iD.R;Johnson_och G.V.Levín. Rapid assay of bacteria popolations. Bacteriol. Prcc, 21:23-, 1968, och A.Thore, S}Ånsehn, A.Lundin och S.Bergman. Detection of bacteriuria by luciferase assay of adenosine triphosphate.

J_C1in_ Miçrobiql, 1:1-8, 1975, Och amerikanska patentskriften 3 vhs 090). _ de* du A e P P Detta sistnämnda alternativa sätt kan lätt automatiseras »mi 0. med redan existerande provtagnings- och utmatningsenheter.

Användningen av apyrasenzym rapporteras i litteraturen och i den amerikanska patentskriften }-TUS 090 men det är icke tidi- f) 10 15 20 25 448 100 :sp gare känt att använda nämnda enzym i immobiliserad form. An- vändningen av ímmobilíserat apyras eliminerar behovet av att inaktivera apyras genom uppvärmning eller med kemiska medel och gör det möjligt att använda joniska aktiva ämnen, som t.ex. de etoxylerade aminerna, för att frigöra ATP från bakte- rier. Detta sätt tillåter en enkel automatisering både med ge- nomflödesmetoder och uppdelade system med separata provrör. Det immobiliserade apyraset kan användas upprepat under flera veckor efter tvättning med buffertlösning och lagring i buffertlösning vid +u°c. P I A _'_ W _Föreliggande sätt resulterar, som tidigare beskrivits, i tidsbesparingar jämfört med konventionella sätt för att extra- hera nukleotider¿ som t.ex. ATP för biokemiska analyser, och sär- skilt för biolumíniscensanalys av ATP med luciferin-luciferas i eldflugesystem. Dessutom kan mätningen av ATP ske selektivt för somatiska eller mikrobíella celler. Provets beredning är snabb, effektiv och reproducerbar och de vtaktiva ämnena kan väljas på sådant sätt, att de icke stör luciferin-luciferasbioluminiscens- reaktionen eller påverkar stabiliteten hos nukleotiderna t.ex.

ATP; P b g g Principer; föredragna utföringsformer och förfaringssätt enligt föreliggande uppfinning har beskrivits i föregående be- skrivning. Angivna exempel på ytaktiva ämnen, förfaringssätt och användningsområden får icke anses såsom begränsade till de särskilda beskrivna formerna utan måste ses såsom illustrerande gsnarare än begränsande exempel.

Claims (4)

44s 1oo A raw PATENTKRAV'

1. Förfarande för mätning av koncentrationen av ATP i mikrobiella celler í ett biologiskt prov, som omfattar en blandning av somatiska och-mikrobiella celler, k ä n n ei- t e c k“n a t av att man bringar provet i kontakt med ett non-joniskt ytaktivt ämne valt bland etoxylerade alkylfenoler och fettsyrapolyglykoletrar under betingelser för selektiv frigöring av ATP från i huvudsak enbart de somatiska cellerna utan att cellmembranen i de somatiska cellerna förstörs, av- lägsnar därigenom frigjort somatiskt ATP, bríngar provet i kontakt med ett joniskt ytaktivt ämne valt bland etoxylerade aminer, etoxylerade diamíner, etoxylerade amíder, kvaternära ammoniumsalter av en etoxylerad amín och blandningar därav och/eller polyetylenglykolestrar av fettsyror under heting- _ elser för selektiv frigöríng av ATP.fràn de mikrobíella cel- lerna utan att cellmembranen och cellväggarna hos de mikro- biella cellerna förstörs, och därefter med hjälp av biolumini- scensanalystekník mäter koncentrationen av ATP som har selek- tivt frígjorts från de mikrobiella cellerna i provet.

2. -Förfarande enligt.krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att det non-joníska ytaktiva ämnet har formelnzi R,<::>-o~(cH2cH2o)x H eller formeln; R-Cfiz-O(CH2CH20)xH .vari R är en alkylgrnpp eller fettsyrarest och x är 2-30.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, _k ä n n e - t e c k n a t av att koncentrationen av ATP frigjorts från g de somatiska cellerna mätes med hjälp av eldfluge- eller bak- teriebíoluminíscensanalysteknik. * A

4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t~e c kan a t av att man använder en blandning av joniska ytaktiva ämnen innefattande en etoxylerad amín och ett kvaternärt ammoniumsalt av en etoxylerad amín och att man mäter koncentrationen av ATP, som har selektivt frígjorts från de mikrobíella cellerna, med hjälp av eldflugebiolumíni- scensanalys. I I I I * A (J) m.