PL189724B1

PL189724B1 - Sposób, urządzenie oraz zestaw do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych

Info

Publication number: PL189724B1
Application number: PL97329003A
Authority: PL
Inventors: C.David Miller; Lawrence Loomis
Original assignee: New Horizons Diagnostics Corp
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2005-09-30
Also published as: US5736351A; JP2002514916A; EP0901631A4; DE69730425T2; IL126192A0; EP0901631B1; CN1154847C; WO1998032020A1; EP0901631A1; DE69730425D1; AU2533297A; IL126192A; ATE274700T1; CN1218553A; CA2249370A1; PL329003A1; EP1460427A1

Abstract

1. Sposób wykrywania obecnosci i pomiaru ilo- sci zanieczyszczen mikrobiologicznych przez zbieranie zanieczyszczen i wykrywanie ich z wykorzystaniem reakcji luminescencji, przy czym próbke zanieczyszczen, w których analizowany skladnik zawiera trójfosforan adenozyny zbiera sie w nosniku zawierajacym srodek powierzchniowo czynny i/lub sól i/lub bufor, znamien- ny tyra, ze do pomiaru ilosci zanieczyszczen stosuje sie jednoczesnie blone filtrujaca i krazek z blony filtrujacej nasycony roztworem wywolujacym swiecenie, przy czym na blone filtrujaca wprowadza sie najpierw próbke zanieczyszczen w nosniku zatezona do objetosci od 20 do 1000 µl, po czym nanosi sie kroplami czynnik uwalnia- jacy komórki somatyczne, nastepnie na powierzchnie krazka z blony filtrujacej nanosi sie czynnik uwalniajacy bakterie, po czym sciska sie razem blone filtrujaca i krazek z blony filtrujacej, wsuwa sie do fotometru i wykonuje sie pomiar swiatla emitowanego w wyniku reakcji luminescencji. 11. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze stosuje sie roztwór lucyferyny i lucyferazy dodatkowo zawierajacy odczynniki chemiczne wybrane z grupy obejmujacej: trehaloze [(a -D-glukozydo)-a -D-gluko- zyd], ditiotretiol (threo-2,3-dihydroksy-1,4-ditiobutan), bufor HEPES [kwas 4-[2-hydroksyetylo)piperazyno-N-2-eta- nosulfonowy] oraz ich mieszaniny. F i g.9 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych przez zbieranie zanieczyszczeń i wykrywanie ich z wykorzystaniem reakcji luminescencji, przy czym próbkę zanieczyszczeń, w których analizowany składnik zawiera trójfosforan adenozyny zbiera się w nośniku zawierającym środek powierzchniowo czynny i/lub sól i/lub bufor.

Istotą wynalazku jest to, że do pomiaru ilości zanieczyszczeń stosuje się jednocześnie błonę filtrującą i krążek z błony filtrującej nasycony roztworem wywołującym świecenie, przy czym na błonę filtrującą wprowadza się najpierw próbkę zanieczyszczeń w nośniku zatężoną do objętości od 20 do 1000 ul, po czym nanosi się kroplami czynnik uwalniający komórki somatyczne, następnie na powierzchnię krążka z błony filtrującej nanosi się czynnik uwalniający bakterie, po czym ściska się razem błonę filtrującą i krążek z błony filtrującej, wsuwa się do fotometru i wykonuje się pomiar światła emitowanego w wyniku reakcji luminescencji.

Korzystnie odczyn pH nośnika do zbierania próbek wynosi od 6,0 do 7,0.

Korzystnie, objętość próbki nanoszonej do aparatu wynosi od około 60 do około 100 μΐ.

Korzystnie, analizę od naniesienia czynnika uwalniającego komórki somatyczne do pomiaru światła emitowanego wykonuje się w czasie 5 minut.

W innym korzystnym wariancie, analizę, od naniesienia czynnika uwalniającego komórki do pomiaru światła emitowanego wykonuje się w czasie 2 minut. Korzystnie, stosuje się nośnik do zbierania próbek zawierający jako środek powierzchniowo czynny oksyetylenowany laurynian sorbitanu w stężeniu 0,05%.

Korzystnie stosuje się nośnik do zbierania próbek zawierający jako sól chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,3 M.

Korzystnie, w trakcie nanoszenia czynnika uwalniającego komórki somatyczne 10.zatęża się próbkę zawieraj ącą zanieczyszczenia.

Korzystnie stosuje się roztwór wywołujący świecenie zawierający lucyferynę i lucyferazę.

W innym korzystnym wariancie, stosuje się roztwór lucyferyny i lucyferazy dodatkowo zawierający magnez.

W jeszcze innym korzystnym wariancie, stosuje się roztwór lucyferyny i lucyferazy dodatkowo zawierający odczynniki chemiczne wybrane z grupy obejmującej: trehalozę [(α-D glukozydo)-a-D-glukozyd], ditiotretiol (threo-2,3-dihydroksy-l,4-ditiobutan), bufor HEPES [kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-2-etanosulfonowy] oraz ich mieszaniny.

Przedmiotem wynalazku jest również urządzenie do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych stosowane do umieszczenia próbki w luminometrze, zawierające błonę filtracyjną oraz podkładkę absorpcyjną.

Istotą wynalazku jest to, że urządzenie posiada dwuczęściową składaną zawiasowo obudowę posiadającą część górną i część dolną, podkładkę absorpcyjną umieszczoną po wewnętrznej górnej stronie części górnej, przy czym błona filtrująca umieszczona jest na górnej części podkładki absorpcyjnej;

sztywną warstwę trzymającą błonę filtrującą;

otwór w sztywnej warstwie umieszczonej nad błoną filtrującą do nanoszenia próbki na powierzchnię błony filtrującej;

otwór w części dolnej urządzenia;

krążek z błony dopasowany do otworu, nasycony roztworem wywołującym świecenie; przezroczyste okienko po zewnętrznej stronie dolnej części zlokalizowane pod krążkiem z błony.

Korzystnie, urządzenie dodatkowo zawiera czynnik uwalniający komórki somatyczne osadzony na hydrofitowej przepuszczalnej błonie filtrującej.

Korzystnie, urządzenie umieszczone jest we wkładce pomiarowej luminometru, przy czym krążek z błony nasycony roztworem wywołującym świecenie skierowany jest ku dolo189 724 wi i znajduje się bezpośrednio nad służącym do odczytu otworem, a fotopowielacz jest umieszczony bezpośrednio pod otworem.

Korzystnie, średnica błony filtrującej wynosi od 0,5 do 2,0 cm.

W innym korzystnym wariancie, średnica błony filtrującej wynosi 1 cm

Przedmiotem wynalazku jest również zestaw do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych obejmujący urządzenie analityczne do wykrywania obecności i określania ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych, w skład którego wchodzi błona filtracyjna.

Istotą wynalazku jest to że zestaw zawiera jednorazowe urządzenie do zbierania próbek, jednorazowe urządzenie do zatężania dużych objętości próbek, przenośne jednorazowe urządzenie analityczne, posiadające w górnej części wlot, strzykawkę z końcówką typu Luer dołączoną do wlotu, a w dolnej części wylot; zawierające półprzepuszczalną błonę filtracyjną, otwartą krawędź górną, przezroczyste ściany wykonane z tworzywa sztucznego oraz uszczelki; przy czym jednorazowe urządzenie analityczne jest dostosowane do umieszczenia w otworze próżniowego urządzenia stosowanego do wprowadzania roztworu do płukania lub lizy komórek somatycznych;

jednorazowe urządzenie ciśnieniowe umożliwiające przepływ płynu z próbką do badań do krążka absorpcyjnego; przy czym urządzenie ciśnieniowe składa się z tłoka, tubusu, uchwytu oraz otworu przeznaczonego do wstawienia jednorazowego urządzenia analitycznego, uszczelki umieszczonej na górnej części wstawionego jednorazowego urządzenia; oraz luminometr zawierający wkładkę pomiarową umieszczoną w otworze dostosowanym kształtem do jednorazowego urządzenia analitycznego, przy czym po umieszczeniu wkładki pomiarowej w odpowiedniej ciemnej komorze lumenometru, okienko w przezroczystej ściance jednorazowego urządzenia analitycznego jest bezpośrednio wystawione na działanie fotopowielacza.

Korzystnie urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające miękki element absorpcyjny.

W innym korzystnym wariancie, urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające jako element absorpcyjny gąbkę.

W jeszcze innym korzystnym wariancie, urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające miękki element absorpcyjny i bagietkę.

Korzystnie, ściany przenośnego jednorazowego urządzenia są z tworzywa sztucznego całkowicie przepuszczalnego dla światła o długości fali w zakresie od 500 do 600 nm.

Wynalazek może być zastosowany do oznaczania poziomu zanieczyszczeń w próbkach płynu lub powietrza. Użycie próbek płynu wyklucza konieczność powierzchni i/lub odmywania zebranego materiału płynem. Podobnie w przypadku próbek powietrza może być zastosowany konwencjonalny sposób ich pobierania bez konieczności wycierania jakiejkolwiek powierzchni.

Wynalazek pozwala na identyfikację i/lub określenie stężenia czynnika zanieczyszczającego w czasie krótszym niż jedna godzina od momentu pobrania próbki do chwili uzyskania wyniku, a zazwyczaj w czasie krótszym niż 5 minut.

Zasady doboru płynu do zbierania zanieczyszczeń są dobrze znane ze stanu techniki. Ogólnie płyn taki składa się z detergentu, soli lub buforu lub dowolnej kombinacji powyższych umożliwiającej zachowanie integralności ścian komórki mikroorganizmu.

Płyn będący 0,15 M chlorkiem sodu zawierający 0,5% detergent Tween 20 jest jednym z możliwych do zastosowania. Możliwym jest zastosowanie roztworów zawierających inne składniki w tym fosforany lub solankowy bufor HEPES i inne detergenty włącznie z detergentami amfoterycznymi i detergentami niejonowymi.

W urządzeniu według wynalazku, wszystkie odczynniki i roztwory są osadzone na jednorazowych błonach. Elementy takie są łatwiejsze w stosowaniu zwłaszcza tam gdzie wskazane jest użycie elementów jednorazowych lub urządzeń pozwalających na zatężanie próbek o dużej objętości. Wykorzystanie błon w znacznym stopniu ogranicza potrzebę stosowania dodatkowych odczynników stanowiąc system bardziej mobilnym i precyzyjniejszym. Urządzenia wyposażone w błony umożliwiają również badanie próbek płynów i powietrza bezpo8

189 724 średnio na błonach. Korzystne jest, aby urządzenie wyposażone w błony posiadały zamocowane wzmocnienia z dwustronnie pokryte plastikiem tekturki lub papieru posiadające stronę górną i dolną z krążkiem absorpcyjnym umieszczonym na górnej stronie wewnętrznej części górnej powierzchni. Na górnej części krążka absorpcyjnego umieszczony jest filtr z włókna szklanego, który może być przymocowany przez sztywną warstwę z plastiku lub papieru.

Urządzenie wyposażone w błony może służyć zarówno jako urządzenie zbierające jak również jako system w którym prowadzone są reakcje. Przykładowo, dla oznaczenia ilości bakterii w próbce powietrza o zadanej objętości filtr szklany wielkości biletu jest umieszczany w komorze, przez którą przepuszcza się pożądaną ilość powietrza pozwalając mu oddziaływać z powierzchnią filtra z włókien szklanych. Urządzenie jest usuwane, a po dodaniu czynnika uwalniającego dla bakterii celem uwolnienia komórkowego ATP, urządzenie jest składane celem zapoczątkowania reakcji. Korzystnie, czynnik uwalniający dla bakterii może być związany z filtrem szklanym lub inną znajdującą się w urządzeniu błoną.

Jest wiadome że mieszanie reagent(ów)a na każdym z etapów sposobu może być dokonane przy pomocy mikropipety. Szczególnie zestaw według wynalazku pozwala zarówno na zatężanie badanej próbki oraz przeprowadzenie dowolnej reakcji chemiluminescencji wywołanej obecnością wspomnianej próbki w tej samej komorze jednorazowego urządzenia do oznaczeń. Dodatkową cechą jednorazowego urządzenia do oznaczeń jest to, że średnica filtra wynosi od 0,5 do 2,0 cm, korzystnie 1,0 cm, co powoduje, że zminimalizowana zostaje objętość roztworu substratu dla reakcji bioluminescencji lub chemiluminescencji dla maksymalizacji sygnału odbieranego przez fotodetektor. Końcowa objętość substratu powinna wynosić od 20 do 1000 μΐ najkorzystniej około 60 μΐ do 100 μΐ. Jednorazowe urządzenie analityczne może być umieszczane w odpowiednim urządzeniu posiadającym większą komorę (wodoszczelną), a które zbudowane jest z dwóch części, które mogą pomieścić jednorazowe urządzenie analityczne i przez które, stosując ciśnienie lub podciśnienie, można sączyć próbki o objętości większej niż 500 μΐ odzyskując na powierzchni filtra, mikroorganizmy lub inne badane składniki.

Przykładowo jednorazowe urządzenie analityczne może zostać umieszczone w niższej komorze urządzenia zbudowanego z dwóch części, w którym dolna komora posiadająca odpływ wyprowadzający filtrat połączona jest w sposób umożliwiający jej odłączenie do górnej komory urządzenia. Górna komora posiada uszczelkę i jest dopasowana do dolnej komory w sposób uniemożliwiający wyciek płynu oraz posiada wlot z odpowiednim mocowaniem. Wlot może posiadać mocowanie odpowiadające mocowaniu końcówek typu Luer, co umożliwia przyłączenie strzykawki z końcówką typu Luer. Strzykawka może zawierać jeden rodzaj filtr(ów)u wstępn(ych)ego którego zadaniem jest usunięcie grubszych zanieczyszczeń przed wprowadzeniem próbki na filtr jednorazowego urządzenia analitycznego. Po zakończeniu sączenia przez filtr jednorazowego urządzenia analitycznego dwuelementowe urządzenie może zostać otwarte, a jednorazowe urządzenie analityczne wyjęte z niego. Jednorazowe urządzenie analityczne będzie zawierało wtedy koncentrat uzyskany z dużej objętości (np. 50 ml). Filtrowanie dużych ilości analizowanej cieczy zwiększa czułość wykrywania w badanym płynie analizowanych składników.

Reakcja chemiluminescencji lucyferyny/łucyferazy w obecności ATP jest dobrze znana. Inne reakcje chemiluminescencji opracowane dla bakteryjnej lucyferazy lub luminoli stosowane celem określenia całkowitego stężenia mikroorganizmów mogą być łatwo zaadaptowane dła metod i urządzeń z przedstawianego wynalazku.

Opisany powyżej zestaw według wynalazku może być również zmodyfikowany przez dodanie do jednorazowego urządzenia analitycznego, błony cząsteczek wychwytujących, takich jak kulki lateksowe powleczone czynnikiem wiążącym takim jak przeciwciała specyficznie skierowane przeciw antygenowi lub antygeny dla danych przeciwciał skierowanych przeciw wykrywanemu mikroorganizmowi. Zestaw może być również zmodyfikowany w ten sposób, do jednorazowego urządzenia analitycznego dodawane są równocześnie cząsteczki wychwytujące, enzymatycznie znakowane przeciwciała oraz zebrana ciecz zawierająca oznaczany składnik. Cząsteczki mogą również być powleczone specyficznym antygenem wiążącym przeciwciała specyficznie skierowane przeciw wirusowi. Cząsteczki są wprowadzane wraz z badanym płynem do jednorazowego urządzenia analitycznego. Wykrywanym odczynnikiem

189 724 może być enzym sprzężony z elementem wiążącym, gdzie elementem wiążącym może być przeciwciało zależne od ATP lub ATP zamknięty w liposomach związanych z elementem wiążącym i gdzie sam element wiążący może być przeciwciałem, antygenem, lektyną, fragmentem DNA, wirusami i kombinacją któregokolwiek z powyższych. Enzym może być peroksydazą, fosfatazą, oksydazą, lucyferazą lub ich kombinacją.

Dobrze znane są różnorodne bufory dla ekstrakcji antygenów i odpłukiwania kompleksów immunologicznych.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony na rysunku, na którym, fig. 1 przedstawia widok boczny aparatu do zbierania próbek, złożonego z bagietki, końcówki absorpcyjnej i pojemnika z cieczą; fig. 2 - widok boczny aparatu do zbierania próbek złożonego z gąbki i torby z płynem; fig. 3 - widok od przodu aparatu do zatężania próbek o dużej objętości; fig. 4 - widok rozłożonego aparatu do zatężania próbek o dużej objętości; fig. 5 - widok z ujawnionym przekrojem aparatu podciśnieniowego; fig. 6 - widok rozłożonego aparatu ciśnieniowego, jednorazowego urządzenia analitycznego i uchwytu z krążkiem absorpcyjnym; fig. 7 - rysunek jednorazowego urządzenia analitycznego umieszczonego stosownie względem odpowiadającego mu leża oraz względem fotosensora; fig. 8 - wykres przedstawiający łączne wyniki zliczeń uzyskanych po 48 godzinnej inkubacji wyrażone w jednostkach względnych opisujących bioluminescencję uzyskaną w efekcie minutowej procedury zgodnej z korzystnym zastosowaniem wynalazku, gdzie każdy punkt na wykresie odpowiada pojedynczej tuszy wołowej; fig. 9 - przekrój boczny urządzenia wyposażonego w błonę; fig. 10 - widziane pod pewnym kątem od góry urządzenie wyposażone w błonę; fig. 11 przedstawia przekrój urządzenia wyposażonego w membranę umieszczonego nad fotopowielaczem.

Figura 1 jest rysunkiem urządzenia do zbierania próbek, stanowiącego część zestawu według wynalazku, w którego skład wchodzi 1-bagietka i końcówka absorpcyjna 2. Końcówka absorpcyjna 2 jest nasączona nadmiarem płynu do zbierania próbek i używana jest do wycierania wyznaczonego na badanej powierzchni obszaru. Po wytarciu powierzchni końcówka absorpcyjna 2 jest umieszczana w pojemniku 4 i wytrząsana w nim celem uwolnienia do płynu do zbierania próbek wszelkich bakterii.

Odnośnie fig. 2, aparat do zbierania próbek może zawierać gąbkę 5. Gąbka 5, jest nasączona płynem do zbierania próbek 3 i używana do wycierania wyznaczonego obszaru badanej powierzchni. Po wytarciu tego obszaru gąbka 5 jest umieszczana w plastikowej torbie 6 zawierającej nadmiar płynu do zbierania próbek, a następnie w celu uwolnienia z niej do płynu do zbierania próbek 3 zaabsorbowanych bakterii, kilkukrotnie wyciskana.

Objętość płynu do zbierania próbek może się różnić w zależności od rozmiarów absorbenta i wielkości wycieranego obszaru. Płyn do zbierania próbek 3 jest dobrany tak, aby zapewniał przeniesienie zakażeń mikroorganizmami z badanej powierzchni do urządzenia zbierającego próbki, a następnie do jednorazowego urządzenia analitycznego. Ogólnie, pH płynu do zbierania próbek powinno wahać się pomiędzy 5, a 8, lecz najkorzystniej, aby mieściło się w zakresie od 6,0 do 7,0. Korzystnie, aby roztwór do zbierania próbek zawierał sole takie jak chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,3 M, korzystnie dla zapewnienia przeżycia bakterii, aby wynosiło ono 0,25 M. Płyn do zbierania próbek powinien zawierać detergent taki jak 0,05% Tween 20 co zapewnia łatwe przenoszenie bakterii z badanej powierzchni oraz z aparatu do zbierania próbek.

Odnośnie fig. 3-6 przedstawiają one urządzenie do zatężania dużych objętości próbek 7, zatęża w jednorazowym urządzeniu analitycznym.

Odpowiednia strzykawka z końcówką typu Luer dołączana jest do wpływu 8 aparatu do zatężania dużych objętości próbek 7 i wytwarzane jest ciśnienie przez wywieranie nacisku na tłok strzykawki, czego konsekwencjąjest przepływ płynu do ujścia urządzenia 9.

Zebrany płyn przepływa przez błonę filtrującą 11, znajdującą się w dolnej części jednorazowego urządzenia analitycznego 10. Uszczelki 14 i 15 zapewniają szczelność układu. Po zakończeniu zatężania zebranego płynu górna część urządzenia 13 jest odłączana od części dolnej 16 dla odsłonięcia brzegu lejkowatego naczynia 12 wchodzącego w skład jednorazowego urządzenia analitycznego 10. Następnie jednorazowe urządzenie analityczne jest ręcznie wyjmowane z dolnej komory 16.

189 724

Dolna część jednorazowego urządzenia analitycznego jest wprowadzana do otworu 18.

Nanoszona jest odpowiednia ilość roztworu do płukania, lub roztworu do lizy komórek somatycznych, a następnie wywierane może być ciśnienie za pośrednictwem wyprowadzenia 19, co pozwala na usunięcie płynu z jednorazowego urządzenia analitycznego 10.

Urządzenie ciśnieniowe 20, składa się z tłoka 19 i tubusu 21, jednorazowego uchwytu 25 oraz otworu 24 do wprowadzania urządzenia analitycznego 10 i jest wyposażony we wkładkę absorpcyjną lub krążek pochłaniający płynne odpady 26. Jednorazowe urządzenie analityczne jest wprowadzane do otworu 24. Dodawana jest określona objętość płynnej próbki (np. 50 do 100 ul) oraz odpowiednia objętość płynu do płukania lub lizy komórek somatycznych. W ciśnieniowym urządzeniu filtrującym, na górnej części jednorazowego urządzenia analitycznego 10 umieszczana jest gumowa uszczelka 23. Wywieranie nacisku na tłok powoduje powstanie w tubusie 20, aż po ujście ciśnienia powietrza, które wymusza przepływ płynu przez krążek absorpcyjny 26. Proces może zostać powtórzony po dodaniu następnej porcji płynu do płukania.

Jednorazowe urządzenie analityczne jest odpowiednio zorientowane w komorze 28, 29 względem, fotosensora 30, co przedstawiono na fig. 7. Korpus jednorazowego urządzenia analitycznego 10 jest wykonany z materiału optycznie przepuszczalnego, plastiku, takiego jak polistyren, który jest całkowicie przepuszczalny dla światła o długości fali w zakresie 500-600 nm. W dolnej części urządzenia wbudowana jest półprzepuszczalna błona filtrującą którą charakteryzuje wytrzymałość i brak odkształceń pod wpływem ciśnienia oraz porowatość pozwalająca na zatrzymanie komórek bakteryjnych, podczas, gdy w trakcie sączenia ciśnieniowego przechodzi przez nią faza płynna zawiesiny. Błona ta musi się również charakteryzować odpowiednim napięciem powierzchniowym pozwalającym na zatrzymanie roztworu podlegającego analizie nawet po jej nasączeniu.

Wkładka pomiarowa jest integralną częścią luminometru. Po wysunięciu wkładki pomiarowej w otworze 28 umieszczane jest jednorazowe urządzenie analityczne, w taki sposób, że okienko w przezroczystej ściance jednorazowego urządzenia analitycznego jest bezpośrednio dostępne dla fotosensora jeśli wkładka pomiarowa zostanie umieszczona w odpowiedniej dla niej ciemnej komorze luminometru.

Ogólnie, analizę bakterii w jednorazowym urządzeniu analitycznym opiera się na bioluminescencji powstającej po dodaniu powodującego liżę bakterii odczynnika, a w konsekwencji po uwolnieniu ATP, z zatężonej próbki mikroorganizmów. Dodaje się odpowiednią objętość substratu dla luminescencji (np. lucyferyna-lucyferaza) do jednorazowego urządzenia analitycznego, a następnie wkładkę pomiarową z powrotem umieszcza się w ciemnej komorze luminometru. Przeprowadza się cyfrowy pomiar emisji światła lub przekształca sygnał elektryczny powstający w fotosensorze na umowne jednostki określające siłę świecenia. Jeśli sposób przeznaczony jest dla wykrywania określonych bakterii stosuje się specyficzne przeciwciała sprzężone z sondą chemiluminescencyjną lub enzymatyczną.

W korzystnym zastosowaniu przeciwciało umieszczone jest w jednorazowym urządzeniu analitycznym, a reakcje prowadzi się przez 10 minut. Przeprowadzony może być dodatkowy etap płukania przez naniesienie i usunięcie roztworu do płukania. Następnie dodawany jest roztwór substratu dla luminescencji. W korzystnej postaci roztwór substratu składa się z mieszaniny nadtlenku wodoru i luminolu. Wkładka pomiarowa ponownie umieszczana jest w ciemnej komorze luminometru. Pomiar emisji światła dokonywany jest cyfrowo lub przez przekształcenie sygnału elektrycznego wysyłanego przez fotosensor na umowne jednostki określające siłę świecenia.

W urządzeniu według wynalazku, wszystkie odczynniki chemiczne i roztwory mogą występować w formie jednorazowego urządzenia 'z błonami. Tak jak w powyżej opisanych systemach i procedurach wymagane jest wykrywanie i oszacowanie ilości bakterii w próbkach, które mogą również zawierać komórki somatyczne jak również wolny ATP i składniki takie jak jony chlorkowe, o których wiadomo, że hamują reakcję enzymatyczną lucyferynylucyferazy.

Korzystnie aby urządzenie wyposażone w błony 100 zbudowane było ze zgiętej tektury lub wzmocnionego papieru dwustronnie pokrytego plastikiem stanowiącym obudowę 101, posiadało część górną 102 i dolną 103. Podkładka absorpcyjna 104 jest umieszczona na

189 724 szczycie wewnętrznej strony 105 górnej części urządzenia 102. Wkładka absorpcyjna 104 zawiera materiał będący pochodną celulozy. Może nim być bawełna, jedwab kukurydziany, włókno szklane lub inny materiał o właściwościach absorpcyjnych. Na wierzchu podkładki absorpcyjnej 104 umieszczona jest błona filtrująca 106 z włókna szklanego, która może być przytwierdzona przez sztywną warstwę 107 z plastiku lub papieru.

Korzystne jest, aby w dolnej części 103 urządzenia 100 wyposażonego w błony znajdowało się przezroczyste okienko 108 zlokalizowane po zewnętrznej strome 109 części dolnej oraz roztwór lucyferyny-lucyferazy unieruchomiony na krążku błony 111.

Krążek błony pasuje do otworu 113 znajdującego się w dolnej części 103 urządzenia 100.

W pewnej postaci wynalazku czynnik uwalniający dla komórek somatycznych lub bakteryjnych może być osadzony na błonie filtrującej 106 z włókna szklanego w taki sam sposób, w jaki na krążku błony 111 osadzony jest roztwór lucyferyny-lucyferazy.

Aby użyć urządzenie 100 wyposażone w błony, próbka o objętości 25 pl, którą pobrano w typowy sposób, umieszczona jest przez otwór 110 w sztywnej warstwie 107 zabezpieczającej na powierzchni błony filtrującej 106 z włókna szklanego. Filtrująca błona z włókna szklanego 106 wiąże na swojej powierzchni bakterie i komórki somatyczne podczas, gdy płyn przesiąka do podkładki absorpcyjnej 104.

W metodzie z wynalazku czynnik uwalniający dla komórek somatycznych nanoszony jest na powierzchnię błony filtrującej 106 z włókna szklanego. Czynnik uwalniający dla komórek somatycznych jest nanoszony na powierzchnię filtrującej błony z włókna szklanego kropla po kropli tak aby uniknąć zalania błony, a w efekcie wypłukania komórek z błony filtrującej 106 z włókna szklanego.

Po dodaniu czynnika uwalniającego dla komórek somatycznych ulegają one lizie, a w konsekwencji z komórek somatycznych uwolniony zostaje ATP, który wraz z wolnym ATP oraz inhibitorami mogącymi zaburzać wyniki oznaczeń są wychwytywane przez wkładkę absorpcyjną. Na tym etapie oznaczenia nieuszkodzone pozostają jedynie komórki bakteryjne znajdujące się na powierzchni błony filtrującej 106 z włókna szklanego. W innym alternatywnym rozwiązaniu czynnik uwalniający dla komórek somatycznych może być umieszczony na ściereczce używanej do przecierania testowanej powierzchni. W kolejnej postaci wynalazku konieczność dodawania czynnika wyzwalającego dla komórek somatycznych do badanej próbki wykluczono bowiem czynnik wyzwalający dla komórek somatycznych został związany z błonami z włókna szklanego jeszcze przed ich zastosowaniem w urządzeniu wyposażonym w błony.

Następnie, 10 pl czynnika uwalniającego dla bakterii jest nanoszone na błonę filtrującą 106 z włókna szklanego lub na powierzchnię krążka z błony 111 umieszczonej po stronie wewnętrznej 112 części dolnej 103 urządzenia 100 wyposażonego w błony.

Krążek z błony 111 zawiera osadzony na niej kompleks lucyferyna-lucyferaza. Krążek z błony 111 może być nasycony kompleksem lucyferyna-lucyferaza, albo kompleks ten może występować na powierzchni krążka z błony 111.

W kolejnej postaci wynalazku czynnik uwalniający dla bakterii może być unieruchomiony na błonie filtrującej 106 z włókna szklanego lub na krążku z błony 111. Część górna 102 i część dolna 103 urządzenia 100 wyposażonego w błony są następnie ze sobą ściśnięte korzystnie przez wprowadzenie jednorazowego urządzenia wyposażonego w błony do wkładki pomiarowej luminometru. W momencie połączenia części górnej 102 i 10 części dolnej 103 urządzenia 100 wyposażonego w błony zapoczątkowana zostaje reakcja której efektem jest emisja światła:

lucyferaza + lucyferyna + ATP (Mg²⁺, O2) -> oksy-lucyferyna + AMP + światło

Wyniki oznaczeń wyrażone są w RLU gdzie zliczania prowadzi się przez dziesięć sekund, a co odpowiada zawartości bakterii w próbce.

Jak pokazano na fig. 11 korzystnym jest aby urządzenie 100 wyposażone w błony umieszczane było we wkładce pomiarowej 200 luminometru, tak aby błona z kompleksem lucyferyny-lucyferazy skierowana była ku dołowi znajdując się bezpośrednio nad służącym do odczytu otworem 201. Bezpośrednio pod otworem 201 zlokalizowana jest rura fotopowielacza 30.

189 724

W jednej z odmian wynalazku cząsteczki powleczone specyficznym antygenem mogą być dodawane z próbką płynnego nośnika do jednorazowego urządzenia analitycznego zawierającego antygen wiążący specyficzne przeciwciała skierowane przeciw wirusowi. Powyżej opisane sposoby mogą być użyte nie tylko do badania powierzchni, lecz również dla badania wszelkiego rodzaju nośników włącznie z powietrzem i płynami. Dla sprawdzenia ilości bakterii w próbkach powietrza urządzenie wyposażone w błony lub jednorazowe urządzenie analityczne może zostać umieszczone na wszelkiego rodzaju urządzeniach nawiewającym lub ssących, co umożliwia przepływ powietrza przez kolektor lub urządzenie wyposażone w błony. Zakażenia bakteryjne zostaną wychwycone z powietrza bezpośrednio na powierzchni błon, co umożliwia ich bezpośrednie badanie.

Wynalazek jest dalej zilustrowany przez następujące przykłady.

Przykład 1: Ogólne badanie obecności bakterii na twardych powierzchniach.

W przykładzie tym opisano postępowanie mające na celu badanie zanieczyszczenia mikrobiologicznego na powierzchni stali nierdzewnej. Hodowano bakterie Escherichia coli na trypsynowym agarze sojowym przez 18 godzin w 30°C. Próbkę bakterii dodano do 10 ml pepsynowego bulionu sojowego i inkubowano przez kolejne 18 godzin. Bakterie zostały zebrane przez wirowane i płukane trzy razy w 0,9% NaCl, które było filtrowane w celu uzyskania sterylności. Gęstość optyczną roztworu mierzono przy 650 nm, a stężenie zostało dostosowane tak, że gęstość optyczna wynosiła 0,300. Przygotowano trzy serie 10-krotnych rozcieńczeń tak, aby otrzymać stężenie wynoszące 10⁵ mikroorganizmów w ml. 100 |il tego roztworu rozprowadzono na powierzchni 10 x 10 cm oznaczonej na powierzchni arkusza nierdzewnej stali, która była uprzednio oczyszczona za pomocą wybielacza, alkoholu i sterylnej wody destylowanej. Roztwór zawierający bakterie suszono przez 5 godzin w temperaturze pokojowej. Przygotowano oznaczone powierzchnie kontrolne nie zawierające bakterii.

Gąbki o 10 x 10 cm zwilżono wstępnie za pomocą około 750 |il zebranego płynu, w skład którego wchodził 0,15 M NaCl zawierający 0,05% Tween 20 w torbie. Roztwór ten wystarczył, by całkowicie zwilżyć gąbkę. Po wyjęciu każdej gąbki z torby przecierano nią oznaczone powierzchnie dziesięcioma posunięciami w każdym kierunku. Następnie gąbka była powtórnie umieszczana w torbie i wyciskana ręcznie w celu uzyskania roztworu. Określona ilość (25 |il) roztworu była usuwana z torby i umieszczona w urządzeniu testowym jednorazowego użytku. Dodano 25 p1 środka uwalniającego bakterie, a także 50 μ.1 mieszaniny lucyferyna/lucyferaza/magnez. Zamknięto szkiełko i badano względne jednostki świetlne.

W drugiej grupie eksperymentów zwilżono wstępnie tampony za pomocą około 300 |il płynu zebranego w torbie, jak opisano powyżej. Tampony zostały następnie użyte do przecierania zaznaczonych powierzchni stali nierdzewnej, jak opisano powyżej.

W każdym przypadku badano również powierzchnie kontrolne, które nie zawierały bakterii. Dodatkowo, roztwór bakterii wyhodowanych na powierzchni umieszczano bezpośrednio w zebranym płynie jako kontrola dodatnia. Każda wartość danych reprezentuje średnią z trzech badań. Zgodnie z tabelą 1, około 80% wyhodowanych bakterii można wykryć przy użyciu gąbki lub tamponu.

Tabela 1

Przyrząd	Powierzchnia kontroli ujemnej (względnej jednostki świetlne)	Powierzchnia kontroli dodatniej (względne jednostki świetlne)	Próbka z powierzchni z wyhodowanymi bakteriami	% odzysku wyhodowanych bakterii
Gąbka	0	115	88	79%
Tampon	0	330	272	82%

Przykład2: Testy badania Salmonelli za pomocą chemiluminescencj i.

W przykładzie tym opisano postępowanie mające na celu wykrywanie obecności Salmonelli.

Bakterie, Salmonella typhimurium, ATCC 14028 lub Aeromonas hydrophila, ATCC 7966 (po rozmrożeniu) posiano na płytki z trypsynowym agarem sojowym i inkubowano przez 18 godzin w temperaturze 26°C. Kolonie bakterii zebrano i umieszczono w sterylnym 0,9% NaCl.

189 724

Badano gęstość optyczną roztworu przy 650 nm, a stężenie dostosowano tak, że gęstość optyczna wynosiła 0,300 na skutek rozcieńczenia bakterii w 0,05 M Tris, 0,05 M EDTA, 0,15 M NaCl, pH = 8,2.

Określoną ilość (10 μ.1) 0,5% roztworu lateksowych mikrosfer pokrytych przeciwciałami przeciwko salmonelli dodano do urządzenia testowego jednorazowego użytku. Określoną ilość, 100 jj.1, rozcieńczonych bakterii umieszczono w urządzeniu testowym jednorazowego użytku, które posiadało na dolnej powierzchni filtr złożony z Biodyne C (1,2 mikrona). Po dodaniu określonej ilości bakterii, pozostawiano roztwór na 10 minut.

Zastosowano dodatnie ciśnienie i płyn przedostał się na podkładkę absorbującą.

„Złapane” antygeny przemywano za pomocą 200 jal roztworu składającego się z 0,01 M PES, pH = 7,2, zawierającego 0,05% Tween 20. Ponownie zastosowano dodatnie ciśnienie i płyn przedostał się na dysk absorbujący. Przeciwciała przeciwko Salmonelli znakowane peroksydazą chrzanu dodano do jednorazowego urządzenia analitycznego i pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zastosowano dodatnie ciśnienie i pobrano płyn z urządzenia testowego jednorazowego użytku. Roztwór do przemywania został dodany i pobrany za pomocą zastosowania dodatniego ciśnienia jeszcze dwa razy. Jednorazowe urządzenie analityczne zostało umieszczone w luminometrze. Dodano 100 (ił substratu Lumiglo Chemiluminescent (Kirkegaard and Perry Laboratory Gaithersburg, 20 MD), szufladka została natychmiast zamknięta i zbadano emisję światła.

Wyniki przedstawione w tabeli 2 wskazują, że stężenia tak niskie, jak 10⁵ mikroorganizmów mogą być z łatwością odróżniane od kontroli ujemnej przy użyciu tego systemu.

Tabela 2

Wyniki badań Salmonelli

Całkowita liczba mikroorganizmów	Względne jednostki świetlne dla Salmonella typhimurium	Względne jednostki świetlne dla Aeromonas hydrophila	Stosunek sygnału do szumów
10⁸	18,940	5,290	3,6
10⁷	13,780		2,6
10⁶	10,720		2,0
10*	9,220		1,7

Zastosowano również drugi sposób, podobny do opisanego powyżej (z wyjątkiem tego, że nie dodano lateksowych kulek do jednorazowego urządzenia analitycznego przed dodaniem określonych ilości bakterii). W tym przypadku stosunek sygnału do szumów dla roztworu S. typhimurium (10^s mikroorganizmów) i A. hydrophila (10⁸ mikroorganizmów) wynosił 5,91.

Badano także trzeci sposób. W tym sposobie dodano 40 fil próbki i 40 pl przeciwciał przeciwko salmonelli znakowanych peroksydazą chrzanu do jednorazowego urządzenia analitycznego. Mieszanina była inkubowana przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Zastosowano dodatnie ciśnienie w celu wydostania płynu z urządzenia analitycznego. Uzyskany materiał był przemywany trzy razy za pomocą 200 jG 0,1 M soli zbuforowanej fosforanem zawierającej 0,05% Tween 20 i, następnie, wydostawano go z jednorazowego urządzenia analitycznego przy użyciu dodatniego ciśnienia. Jednorazowe urządzenie analityczne umieszczano w luminometrze i dodawano 100 μΐ substratu Lumiglo Chemiluminescent (Kirkegaard and Perry Labotatories, Gaithersburg, MD). Szkiełko było natychmiast zamykane i oznaczano emisję światła. Stosunek sygnału do szumów dla roztworu S. typhimurium (10 ⁶ mikroorganizmów) i A. hydrophila (106mikroorganizmów) wynosił 1,83.

Przykład 3: Wykrywanie obecności bakteryjnego ATP w próbkach sproszkowanej żywności. .

Przygotowano roztwór sproszkowanej próbki żywności poprzez zmieszanie 25 g próbki z 225 ml roztworu SRA w zlewce. 50 fil zawiesiny umieszczono w aparacie filtravette. Cztery krople SRA dodano do zawiesiny. Filtravette™ umieszczono na plastikowym stojaku z bibułą w dolnej części. Filtrowano zawiesinę, przy użyciu dodatniego ciśnienia ekstrahując w ten sposób całość ATP z komórek somatycznych i umożliwiając ich absorpcję przez bibułę,

189 724 podczas gdy wszystkie komórki bakteryjne pozostawały na papierze filtracyjnym. Dodano jeszcze sześć kropli SRA do filtravette™ i powtórzono proces filtracji przy użyciu dodatniego ciśnienia.

Następnie umieszczono filtravette™ w mikroluminometrze i dodano 50 (il BRA w celu uwolnienia bakteryjnego ATP. Użyto końcówki pipety do zmieszania BRA z zawiesiną.

Dodano 50 jj.1 zrekonstruowanego LL i zmieszano 2 do 3 razy przy użyciu końcówki pipety. Zamknięto natychmiast szufladkę na okres 10 minut. Zarejestrowano względne jednostki świetlne (RLU) z czytnika cyfrowego mikroluminometru.

Przykład 4: Sposób oznaczania ilości ATP z drożdży przy użyciu różnych 20 membran.

Wyhodowano szczepy Escherichia coli i Streptococcus pyogenes na trypsynowym agarze sojowym oraz Saccharomyces cerevisiae na agarze Rose Bengal. Świeżo wyhodowane kolonie każdego z badanych mikroorgnizmów umieszczono w 0,01 M PBS. Zawiesinę dostosowano do wartości OD ⁶⁵⁰ wynoszącej 0,3, reprezentującej zawartość około 3 x 10⁸ komórek bakteryjnych na ml i 3 x 10° komórek drożdży na ml. Z każdej zawiesiny wykonano dwa dziesięciokrotne rozcieńczenia w 0,01 M PBS. Filtravette™ umieszczono na plastikowym stojaku z bibułą w dolnej części. Próbki każdej zawiesiny w ilości 50 ul (około 10⁶ komórek bakteryjnych na ml i 10⁴ komórek drożdży na ml dodano do Filtravette™. Dodano cztery krople SRA. Roztwór przefiltrowano za pomocą dodatniego ciśnienia. Powtórzono tę czynność dodając ponownie 6 kropli SRA. Następnie umieszczono filtravette w szufladce mikroluminometru. Do filtravette dodano 50 |il BRA. Następnie dodano 50 fil zrekonstruowanego LL i mieszano 3-4 razy przez pipetowanie w górę i w dół. Zamknięto natychmiast szufladkę rozpoczynając 10-sekundowy okres integracji i odczytano wskazania RLU z cyfrowego czytnika. Te wartości zostały uznane za absolutne w celu uzyskania 100% roztworu retencyjnego (kontrola). Wyniki zebrano w następującej tabeli:

Tabela

Skuteczność różnych membran w filtracji / retencji bakterii i grzybów

Typ membrany	S. pyogenes % roztworu % filtratu retencyjnego	E. coli % roztworu % filtratu retencyjnego	S. cerevisiae (drożdże) % roztworu % filtratu retencyjnego
Membrana 1	100	0	100	0	100	0
Membrana 2	ND	ND	94,1	5,9	99,8	0,2
Membrana 3	ND	ND	7,6	92,4	95,4	4,6
Membrana 4	81,1	18,9	ND	ND	99,9	0,1
Membrana 5	66,2	33,8	ND	ND	99,9	0,1
Membrana 6	79,5	20,5	ND	ND	99,9	0,1
Membrana 7	76,2	23,8	ND	ND	99,9	0,1
Membrana 8	0,1	99,9	ND	ND	69,9	30,1
Membrana 9	25,5	74,5	28,9	71,1	99,3	0,7

ND: nie badano

Przykład 5: Wykrywanie bakteryjnego ATP w próbce osadu benzyny.

Przed pobraniem próbek z osadu benzyny jest on pozostawiany bez żadnej interwencji tak długo, aż utworzą się wyraźne obszary oddzielonych faz. W próbce osadu benzyny może wystąpić do trzech faz z dwiema interfazami. Próbki są pobierane z każdej fazy przy użyciu pipety Pasteur'a i umieszczane w rurce Eppendorf a.

Po 50 (il próbki z każdej rurki Eppendorf a reprezentującej odpowiednią fazę osadu benzyny umieszcza się w Filtravette™. Dodaje się cztery krople SRA. Filtravette™ umieszcza się w plastikowym stojaku z bibułą w dolnej części, a roztwór jest filtrowany przy użyciu dodatniego ciśnienia. Dzięki temu całe ATP z komórek somatycznych zostaje wyekstrahowane i n^tępraie zostaje ono zaabsorbowane przez bibułę, podczas gdy komórki bakteryjne pozostają na papierze filtracyjnym. Dodaje się jeszcze sześć kropli SRA do Filtravette™, a proces

189 724 filtracji jest powtarzany przy użyciu dodatniego ciśnienia. Filtravette™ jest umieszczany w mikroluminometrze, następnie dodaje się 50 pl BRA w celu uwolnienia bakteryjnego ATP a płyny są dokładnie mieszane przy użyciu końcówki pipety.

Dodaje się 50 pl zrekonstruowanej lucyferyny - lucyferazy i miesza dwa do trzech razy przy pomocy końcówki pipety. Szufladka zostaje zamknięta i rozpoczyna się 10-sekundowy okres integracji, następnie wykonywany jest odczyt względnych jednostek świetlnych (RLU) z cyfrowego czytnika mikroluminometru.

Przy użyciu powyższej metody badana jest próbka osadu benzyny posiadająca trzy odrębne fazy (1. górna półprzezroczysta faza olejowa, 2. pośrednia faza brązowa i 3. dolna głęboka faza lepka). Badana była każda z wyżej wymienionych faz włącznie z dwoma dodatkowymi „interfazami” obecnymi pomiędzy trzema fazami pierwotnymi.

Wyniki przedstawiono w następującej tabeli:

Faza benzyny	Bakteryjne ATP
Faza 1	401
Faza 2	480
Faza 3	462
Interfaza 1	2890
Interfaza 2	3060

Próbki z każdej fazy zostały posiane na trypsynowy agar sojowy (TSA; Difco).

Następnie inkubowano płytki przez 24-48 godzin w temperaturze 37°C.

Kolonie bakterii obserwowano na płytce reprezentującej próbkę z fazy 2 z liczbą 5,5 x 10³ jednostek tworzących kolonię w ml. Inne fazy nie wytworzyły żadnych widocznych kolonii na odpowiednich płytkach.

Przykład 6: Konkurencyjne badanie wody z kranu

Badano próbkę wody przy użyciu konwencjonalnej metody heterotroficznego liczenia płytek (HPC) szeroko używanej do monitorowania wody pitnej i porównano wyniki ze sposobem według wynalazku polegającym na zastosowaniu aparatu koncentrującego duże objętości (rys. 3, # 7) w celu zebrania i skoncentrowania wody otrzymanej z dwóch różnych źródeł. Próbka wody została pobrana do plastikowego urządzenia. Dodano do niego cztery krople SRA, a dalsze czynności wykonano według przykładu 2.

Miejsce pobrania próbek	Ujęcie (Holding)	HPC	ATP	Objętość
I	0	1	10	80
	2	3	11	80
			140	80
	3	387	143	80
II	0	3	4 7	80 160
			3120	80
	2	3,76x10⁴	1261	40
			1111	40
			3630	40
	3	4,73 x 10s	3250	40
			3880	40

189 724

Wyniki tych dwóch okresów badawczych wykazują, że dzięki wynalazkowi można wykryć bakterie w ilości poniżej 100 CFU/ml, prawdopodobnie także poniżej 10 CFU/ml.

Przykład 7: Oznaczanie efektywności unieruchamiającej lucyferyny-lucyferazy na membranie.

Wykorzystanie plastikowego urządzenia podobnego do urządzenia z fig. 10 z lucyferyną-lucyferazą na szklanej membranie. Dodano lOjj.1 próbki standardu TP.

Wartość względnej jednostki świetlnej standardu ATP jest porównywana z fazą ciekłą układu LL.

Wyniki wykazują korelację pomiędzy LL unieruchomioną na plastikowym urządzeniu a układem fazy ciekłej Ll.

Uzyskano informację badawczą na temat trzech partii urządzeń membranowych służących wykazaniu, czy istnieje bezpośrednia korelacja pomiędzy ilością obecnego ATP a uwolnionym światłem przy użyciu mikroluminometru.

Średnia ATP Kontrola	Membrana Urządzenie I	Membrana Urządzenie II	Membrana Urządzenie III
Próbka 1	10039	10117	12941
Próbka 2	9007	10877	10331
Próbka 3	9699	10686	13430

Obliczenia trzech urządzeń LL przy użyciu średnich zakresów roztworu kontrolnego ATP (obliczenia roztworu aTp ~ 100ϋ0).

Wysoki zakres ATP Kontrola	Membrana Urządzenie I	Membrana Urządzenie II	Membrana Urządzenie III
Próbka 1	20000	17856	20000
Próbka 2	20000	20000	19353
Próbka 3	20000	20000	20000

Zliczenia dla trzech urządzeń membranowych przy użyciu wysokiego zakresu roztworu kontrolnego ATP (obliczenia roztworu ATP ~ 20000)

Przykład 8: Oznaczanie zawartości bakterii w wodzie podczas oczyszczania 10 sekwencyjnego.

Ten przykład ilustruje postępowanie mające na celu badanie zawartości bakterii w ultraczystych próbkach wody używanych w procesie produkcji wiórów silikonowych podczas różnych etapów oczyszczania. Pobrano próbki z roztworów zbiorczych z każdego etapu sekwencyjnego oczyszczania. Do każdego testu zainstalowano urządzenie membranowe w aparacie pomocniczym, który służył do zaciskania części szklanej membrany filtracyjnej pomiędzy dwoma obręczami w kształcie litery „o”, pozwalając na pobranie próbek o względnie dużych objętościach poprzez filtr, gdy stosowano ujemne ciśnienie.

Urządzenie membranowe było usuwane, na membranę z lucyferyną-lucyferazą dodawano 10 μ1 środka uwalniającego bakterie, a urządzenie zamykano i umieszczano w luminometrze.

189 724

Wyniki są przedstawione w następującej tabeli, wskazują one jasno na postępujące obniżanie zawartości bakterii w każdym etapie sekwencyjnego procesu oczyszczania.

Nr etapu oczyszczania	Miejsce	Badana objętość (ml)	Całkowite RLU
1	„Multimedia” zmieszana warstwa żywicy	10	132
2	Warstwa węglowa	10	100
3	Wstępna odwrócona osmoza -1200	10	21
4	Odwrócona osmoza - 1200	10	15
5	Odwrócona osmoza - 1300	10	0
	Dostawa wody	1000	0
	Dostawa wody	1000	6
	Dostawa wody	1000	22

Wszystkie powyższe przykłady i testy mogą być przeprowadzone przy użyciu wersji urządzenia membranowego według wynalazku.

189 724

Fig. 7

189 724

Fig-. 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych przez zbieranie zanieczyszczeń i wykrywanie ich z wykorzystaniem reakcji luminescencji, przy czym próbkę zanieczyszczeń, w których analizowany składnik zawiera trój fosforan adenozyny zbiera się w nośniku zawierającym środek powierzchniowo czynny i/lub sól i/lub bufor, znamienny tym, że do pomiaru ilości zanieczyszczeń stosuje się jednocześnie błonę filtrującą i krążek z błony filtrującej nasycony roztworem wywołującym świecenie, przy czym na błonę filtrującą wprowadza się najpierw próbkę zanieczyszczeń w nośniku zatężoną do objętości od 20 do 1000 μ.1, po czym nanosi się kroplami czynnik uwalniający komórki somatyczne, następnie na powierzchnię krążka z błony filtrującej nanosi się czynnik uwalniający bakterie, po czym ściska się razem błonę filtrującą i krążek z błony filtrującej, wsuwa się do fotometru i wykonuje się pomiar światła emitowanego w wyniku reakcji luminescencji.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odczyn pH nośnika do zbierania próbek wynosi od 6,0 do 7,0.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że objętość próbki nanoszonej do aparatu wynosi od około 60 do około 100 fil.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że analizę od naniesienia czynnika uwalniającego komórki somatyczne do pomiaru światła emitowanego wykonuje się w czasie 5 minut.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że analizę od naniesienia czynnika uwalniającego komórki do pomiaru światła emitowanego wykonuje się w czasie 2 minut.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nośnik do zbierania próbek zawierający jako środek powierzchniowo czynny oksyetylenowany laurynian sorbitanu w stężeniu 0,05%.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się nośnik do zbierania próbek zawierający jako sól chlorek sodu w stężeniu od 0,1 do 0,3 M.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trakcie nanoszenia czynnika uwalniającego komórki somatyczne zatęża się próbkę zawierającą zanieczyszczenia.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się roztwór wywołujący świecenie zawierający lucyferynę i lucyferazę.
10. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się roztwór lucyferyny i lucyferazy dodatkowo zawierający magnez.
11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stosuje się roztwór lucyferyny i lucyferazy dodatkowo zawierający odczynniki chemiczne wybrane z grupy obejmującej: trehalozę [(a-D-glukozydo)-a-D-glukoz.yd], ditiotretiol (threo-2,3-dihydroksy-l,4-ditiobutan), bufor HEPES [kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-N'-2-etanosulfonowy] oraz ich mieszaniny.
12. Urządzenie do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych stosowane do umieszczenia próbki w luminometrze, zawierające błonę filtracyjną oraz podkładkę absorpcyjną, znamienne tym, że ma dwuczęściową składaną zawiasowo obudowę (101) posiadającą część górną (102) i część dolną (103);

podkładkę absorpcyjną (104) umieszczoną po wewnętrznej górnej stronie (105) części górnej (102), przy czym błona filtrująca (106) umieszczona jest na górnej części podkładki absorpcyjnej (104);

sztywną warstwę (107) trzymającą błonę filtrującą (106);

otwór (110) w sztywnej warstwie umieszczonej nad błoną filtrującą do nanoszenia próbki na powierzchnię błony filtrującej (106);

otwór (108) w części dolnej (103) urządzenia (100);

189 724 krążek z błony (111) dopasowany do otworu (113), nasycony roztworem wywołującym świecenie;

przezroczyste okienko (108) po zewnętrznej stronie dolnej części zlokalizowane pod krążkiem z błony (111).
13. Urządzenie według zastrz. 12, znamienne tym, że dodatkowo zawiera czynnik uwalniający komórki somatyczne osadzony na hydrofilowej przepuszczalnej Wonie filtrującej (106).
14. Urządzenie według zastrz. 12, znamienne tym, że umieszczone jest we wkładce pomiarowej (200) luminometru, przy czym krążek z błony (111) nasycony roztworem wywołującym świecenie skierowany jest ku dołowi i znajduje się bezpośrednio nad służącym do odczytu otworem (201), a fotopowielacz (30) jest umieszczony bezpośrednio pod otworem (201).
15. Urządzenie według zastrz. 12, znamienne tym, że średnica błony filtrującej (106) wynosi od 0,5 do 2,0 cm.
16. Urządzenie według zastrz. 12, znamienne tym, że średnica błony filtrującej (106) wynosi 1 cm.
17. Zestaw do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych obejmujący urządzenie analityczne do wykrywania obecności i określania ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych, w skład, którego wchodzi błona filtracyjna, znamienny tym, że zawiera jednorazowe urządzenie do zbierania próbek, jednorazowe urządzenie do zatężania dużych objętości próbek (7), przenośne jednorazowe urządzenie analityczne (10), posiadające w górnej części (13) wlot (8), strzykawkę z końcówką typu Luer dołączoną do wlotu (8), a w dolnej części (16) wylot (9); zawierające półprzepuszczalną błonę filtracyjną (11), otwartą krawędź górną (12), przezroczyste ściany wykonane z tworzywa sztucznego oraz uszczelki (14, 15): przy czym jednorazowe urządzenie analityczne (10) jest dostosowane do umieszczenia w otworze (18) próżniowego urządzenia (17) stosowanego do wprowadzania roztworu do płukania lub lizy komórek somatycznych;

jednorazowe urządzenie ciśnieniowe (20) umożliwiające przepływ płynu z próbką do badań do krążka absorpcyjnego (26); przy czym urządzenie ciśnieniowe składa się z tłoka (19), tubusu (21), uchwytu (25) oraz otworu (24) przeznaczonego do wstawienia jednorazowego urządzenia analitycznego (10), uszczelki (23) umieszczonej na górnej części wstawionego jednorazowego urządzenia (10);

oraz luminometr zawierający wkładkę pomiarową (27) umieszczoną w otworze (28) dostosowanym kształtem do jednorazowego urządzenia analitycznego (10), przy czym po umieszczeniu wkładki pomiarowej w odpowiedniej ciemnej komorze lumenometru, okienko w przezroczystej ściance jednorazowego urządzenia analitycznego (10) jest bezpośrednio wystawione na działanie fotopowielacza (30).
18. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające miękki element absorpcyjny.
19. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające jako element absorpcyjny gąbkę.
20. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że urządzenie do zbierania próbek zanieczyszczeń stanowi jednorazowe urządzenie zawierające miękki element absorpcyjny i bagietkę.
21. Zestaw według zastrz. 17, znamienny tym, że ściany przenośnego jednorazowego urządzenia (10) są z tworzywa sztucznego całkowicie przepuszczalnego dla światła o długości fali w zakresie od 500 do 600 nm.

Wynalazek dotyczy sposobu, urządzenia oraz zestawu do wykrywania obecności i pomiaru ilości zanieczyszczeń mikrobiologicznych. W szczególności wynalazek dotyczy sposobu, urządzenia oraz zestawu służących do szybkiego określania całkowitego zanieczyszczenia mikrobiologicznego lub określania obecności i ilości specyficznych mikroorganizmów lub

189 724 zanieczyszczeń chemicznych występujących na rozmaitych typach powierzchni, w tym na powierzchni tusz mięsnych lub innej żywności, powierzchni sprzętu, powierzchni gdzie pokarm jest poddawany obróbce, powierzchni sprzętu, rękawic i środków używanych w medycynie. Możliwe jest również wykrywanie zanieczyszczeń powietrza i płynów. Ponadto, wynalazek dotyczy sposobu określania na podstawie bioluminescencji lub chemiluminescencji, całkowitego zanieczyszczenia mikrobiologicznego lub zanieczyszczenia specyficznym mikroorganizmem lub zanieczyszczenia chemicznego.

Zanieczyszczenia mikrobiologiczne są znaczącą przyczyną zachorowań i zejść.

Szybkie i rutynowe sposoby ilościowego określania bakterii, zwłaszcza występujących na powierzchniach, są często niezwykle istotne w szczególności w przypadku procesów związanych z przetwarzaniem żywności oraz w szpitalach. Zatrucie żywności jest zazwyczaj skutkiem zanieczyszczenia mikroorganizmami mięsa lub żywności, do którego dochodzi w czasie jego obróbki. Zanieczyszczenie może być rozprzestrzeniane poprzez kontakt pokarmu z powierzchniami. Dodatkowo, rozprzestrzenianie się chorób w szpitalach i innych placówkach może być wynikiem przenoszenia mikroorganizmów zakaźnych na powierzchni ubrań lub sprzętów albo za pośrednictwem powietrza, wody bądź innych płynów.

Podstawową cechą tego typu zastosowań jest to, że wymagają one szybkiego sposobu badania, umożliwiającego otrzymanie wyników w ciągu minut, sposobu, który umożliwiać będzie badanie potencjalnych zanieczyszczeń na różnorodnych powierzchniach, w płynach i powietrzu, przy czym sposób musi zapewniać niezależność poszczególnych testów oraz umożliwiać ogólne jak i specyficzne określanie zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Powinien również umożliwiać badanie zanieczyszczeń zarówno przez zliczanie organizmów, jak również pozwalać na wykrywanie specyficznych mikroorganizmów.

Stosowano rozliczne metody dla pomiarów zanieczyszczenia powierzchni mikroorganizmami. Tradycyjne sposoby oznaczania bakterii na powierzchniach polegają na ścieraniu ich z powierzchni, a następnie hodowaniu zebranego materiału przez 24 do 48 godzin w lub na podłożu umożliwiającym wzrost mikroorganizmów. Hodowle obserwowano lub analizowano, także przy zastosowaniu urządzeń automatycznych, celem określenia liczby powstających koloni co określa liczbę mikroorganizmów obecnych na badanej powierzchni. Wadą tego typu postępowań jest długi czas wymagany do przeprowadzenia badań oraz konieczność zatrudnienia specjalistycznie wyszkolonych pracowników, jak również możliwość błędnego określenia obecności konkretnego mikroorganizmu patogennego, który nie mógł rosnąć na zastosowanym podłożu

W sposobie tym szczególnie trudnym, jest wykrywanie zakażeń grzybami.

Dodatkowo w przypadku licznych potencjalnych zastosowań, sposób nie zapewniał możliwości otrzymania wyników w czasie umożliwiającym podjęcie efektywnych działań zapobiegawczych. Dla wykrywania obecności bakterii w płynach i innych poddanych obróbce materiałach stosowano różnego rodzaju reakcje luminescencji. Szczególnie często wykorzystywana była powodująca świecenie reakcja bioluminescencji oparta na reakcji trójfosforanu adenozyny (ATP) z lucyferyną, katalizowana przez enzym lucyferazę (reakcja „świetlika”). Ponieważ ATP występuje we wszystkich żywych komórkach, również w komórkach mikroorganizmów, sposób ten może być użyty do szybkiego, ilościowego oznaczenia ilości żywych komórek w próbce. Wstępne rozważania dotyczące charakteru reakcji, historii jej odkrycia oraz ogólnych możliwości jej zastosowania przedstawił E.N. Harvey (1957) w A History of Luminescence: From the Erliest Time Until 1900, Amer. Phil. Soc., Philadelphia PA i W.D. McElroy i B.L. Strehler (1949) Arch. Biochem. Biophys. 22:420-433. Alternatywnie, używano chemiluminescencyjną metodę detekcji przy pomocy izoluminolu lub podobnych odczynników. Metoda ta oparta jest na wykrywaniu w mikroorganizmach substancji zawierających żelazo.

Ujawniono przykładowe sposoby użycia odczynników wywołujących biolumimiscencję do określania bakterii oraz specjalne instrumenty dla pomiaru towarzyszącej reakcji emisji światła. Plakas (amerykańskie opisy patentowe nr. 4, 0l3, 418, 4, 144, 134 i 4, 283, 490) przedstawiał oznaczenie bioluminescencyjne do wykrywania bakterii w próbkach obejmujące etapy lizy komórek niebakteryjnych, wydajnego filtrowania pod ciśnieniem, płukania, lizy

189 724 komórek bakteryjnych i wykrywania uwolnionego ATP przez odczynnik zawierający lucyferynę/lucyferazę/Mg²⁺.

Przedstawione w tych opisach patentowych dane, nie odnoszą się do specyficznych problemów związanych z pozyskiwaniem materiału do analizy z powierzchni lub z wykrywaniem specyficznych bakterii. Nie określono również czasu wymaganego dla przeprowadzenia oznaczenia, a wynalazek w przedstawionej postaci dotyczy procedury dla przeprowadzenia, przy, której wymagany jest znacząco długi czas.

Chappelle w amerykańskim opisie patentowym nr 4,385,112 ujawnił oparty na bioluminiscencji sposób wykrywania bakterii w wodzie. Przeprowadzenie tego oznaczenia trwa kilka godzin i umożliwia określenie całkowitej zawartości bakterii w wodzie.

Clendenning w amerykańskim opisie patentowym nr 3,933,592 przedstawia sposób bioluminiscencyjnego wykrywania zakażeń mikroorganizmami i przykładowo przedstawia procedurę wymagającą mniej niż 2 minuty do takiego oznaczenia. Sposób ten nie obejmuje wstępnej obróbki próbki dla usunięcia ATP pochodzącego z komórek somatycznych.

Aegidius (amerykański opis patentowy nr 5,258,285) ujawnia sposób określania stężenia bakterii w próbce obejmujący etapy: filtrowania, płukania dla usunięcia egzogennego materiału, w tym ATP pochodzącego z komórek somatycznych, przeprowadzenia reakcji przy udziale lucyferyny/lucyferazy/Mg²⁺ w komorze reakcyjnej oraz pomiar produktu tej reakcji. W sposobie nie jest określony czas trwania pomiaru.

Dodatkowo wykorzystuje ona niezależne komory dla płukania, ekstrakcji bakteryjnego ATP i pomiaru produktów reakcji. Potencjalnym efektem prowadzenia oznaczenia w taki sposób może być obniżenie jej czułości w wyniku tracenia materiału w czasie przenoszenia roztworu z komory do komory. Co więcej metoda ta nie opisuje sposobu pobierania próbek z badanej powierzchni.

Wykrywanie bakterii na powierzchniach cechują inne specyficzne zagadnienia, które nie są poruszane w wyżej wspomnianych sposobach. Pierwszym, i podstawowym zagadnieniem jest sposób zbierania próbek zgodny z wymaganiami stawianym przez przyrząd użyty do oznaczeń oraz zbierany materiał. Metoda musi umożliwiać wydajne zbieranie bakterii z powierzchni, a w efekcie prowadzić do uzyskania zawiesiny mikroorganizmów.

Drugie zagadnienie dotyczy głównie tego, że powierzchnie są zazwyczaj zanieczyszczone materiałem, który może utrudniać wykrywanie mikroorganizmów. Składnikami wpływającymi na oznaczenia, które mogą być obecne na powierzchniach, w powietrzu lub w płynach są komórki somatyczne pochodzące z samego pokarmu, zawierającego zarówno komórki zwierzęce jak i roślinne lub z rąk osób kontaktujących się z powierzchnią. Ponieważ wszystkie żywe organizmy zbudowane są z komórek somatycznych zawierających ATP to ich obecność może maskować lub zmieniać wyniki odczytów.

Innymi czynnikami wpływającymi na wynik są substancje oddziaływujące bezpośrednio na reakcje wytwarzające światło. Substancjami tymi są liczne odczynniki chemiczne takie jak chlorki, czynniki utleniające, wolny ATP, metale ciężkie oraz inne chemikalia. Ponieważ niektóre z nich są używane do dezynfekcji powierzchni, oczywistym jest, że odpowiednia metoda analizy zakażeń mikrobiologicznych musi obejmować sposoby wykluczania tych substancji z próbek.

Kolejne wymaganie dotyczy licznych przypadków związanych z zastosowaniami sposobu do monitorowania zakażeń mikrobiologicznych powierzchni, występujących przy obróbce żywności oraz w szpitalach, gdzie oznaczenie musi być wykonane bardzo szybko.

Przykładowo, w trakcie obróbki tusz wołowych gdzie tusze przemieszczają się wzdłuż linii technologicznej, każde badanie materiału z uwagi na zakażenia mikrobiologiczne musi być wykonane w trakcie przemieszczania się tuszy pomiędzy kolejnymi etapami procesu technologicznego.

Wcześniej ujawnione oparte na luminescencji sposoby wykrywania zakażeń mikrobiologicznych nie obejmowały żadnych etapów bezpośredniej obróbki próbek pobranych z powierzchni, próbek stałych lub gazów, z których przygotowuje się zawiesiny dla dalszej analizy lub bezpośrednio pobranych próbek gazów lub cieczy. Co więcej procedury wymagały różnorodnego oprzyrządowania lub komór dla przechowywania, filtrowania i pomiarów produktów reakcji. Co więcej procedury te nie uwzględniały zastosowania oprzyrządowania jed6

189 724 norazowego użytku umożliwiającego ograniczenie zakażeń krzyżowych. Co więcej w oznaczeniach stosowanych dla wykrywania ATP pochodzącego z mikroorganizmów i innych specyficznych zanieczyszczeń, wcześniej ujawnione wynalazki wymagały względnie długiego czasu, co umożliwia ich zastosowanie dla kontroli jakości w procesach ciągłych oraz tam gdzie wymagana jest natychmiastowa weryfikacja wyników.