DE102011077238B4 - Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel - Google Patents
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Abstract
Um Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel auf Wasserbasis, in dem ein Mineralöl und ein polymeres Bindemittel dispergiert sind, nachzuweisen, wird eine Probe des Hohlraumkonservierungsmittels mit einem Alkohol in einem Volumenverhältnis von höchstens 1:4 verdünnt. Das polymere Bindemittel wird von der Flüssigkeit durch Zentrifugieren getrennt und die Flüssigkeit mit einem Lysemittel versetzt, um das in den Mikroorganismen enthaltene Adenosintriphosphat freizusetzen. Mit einem Gemisch aus Luciferin und Luciferase wird der Adenosintriphosphatgehalt durch Biolumineszenz bestimmt.
Description
- Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel auf Wasserbasis, in dem ein Mineralöl und ein polymeres Bindemittel dispergiert sind.
- Damit die Hohlräume des Fahrgestells und der Karosserie eines Fahrzeugs, in die beim Betrieb des Fahrzeugs Wasser und feuchte Umgebungsluft eindringen können, vor Korrosion geschützt werden, wird in die Hohlräume ein Hohlraumkonservierungsmittel eingebracht, um auf der Hohlraumoberfläche einen dauerhaft wasserdichten Film zu bilden.
- Dabei besteht die Gefahr, dass das wässrige Hohlraumkonservierungsmittel, das einem Tank entnommen wird und in die Hohlräume eingebracht werden soll, von Mikroorganismen befallen ist. Ein Befall des Hohlraumkonservierungsmittels mit Mikroorganismen hat jedoch zur Folge, dass das Hohlraumkonservierungsmittel koaguliert und damit die Bildung eines dauerhaften, wasserdichten, haftenden Films auf der Hohlraumoberfläche verhindert wird. Da die Hohlräume nicht einsehbar sind, kommt dem Nachweis einer Verkeimung des Hohlraumkonservierungsmittels vor dem Einbringen in den Hohlraum besondere Bedeutung zu.
- Derzeit werden Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel durch Koloniebildung auf einem Nährmedium, beispielsweise auf Agar-Platten nachgewiesen. Eine Aussage über den Verkeimungsgrad des aufzubringenden Hohlraumkonservierungsmittels kann danach erst nach mehreren Tagen erfolgen. Das heißt, um zu verhindern, dass bei einer größeren Anzahl von Fahrzeugen eine fehlerhafte Hohlraumkonservierung durchgeführt wird, kann das angelieferte Hohlraumkonservierungsmittel erst nach Tagen eingesetzt werden.
- Es ist bekannt, Mikroorganismen in wässriger Dispersion, die ein polymeres Bindemittel enthalten, anhand des Adenosintriphosphat- oder ATP-Gehalts der Mikroorganismen mit Hilfe der Reaktion von Luciferin mit Luciferase durch Biolumineszenz nachzuweisen.
- Nach
DE 60 2004 011 086 T2 wird dazu die wässrige Dispersion mit Glasperlen umgewälzt, um die Mikroorganismen aufzubrechen und damit das ATP freizusetzen. Da eine Reihe von weiteren Schritten bis zur Biolumineszenz-Messung durchgeführt werden muss und sich ATP an der Luft rasch zersetzt, ist dieses Verfahren für den Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel jedoch zu ungenau. - Nach
EP 816 512 A1 - Aus
EP 1 134 291 ist ein Biolumineszenz-Verfahren zur Zählung lebender Zellen bekannt, bei dem die Probe mit einem Nährmedium verdünnt und das ATP z. B. mit einem Lysozym freigesetzt wird. Um den Nachweis zu verbessern, können die Zellen vor der ATP-Bestimmung abfiltriert werden, wobei als Leer-Probe auch die Biolumineszenz des Filtrats bestimmt wird. - Nach
DE 10 2009 048 473 A1 wird zum Nachweis von Mikroorganismen von einem Elektrotauchlackbad in einer Probe der Lack koaguliert, das Koagulat durch Filtrieren abgetrennt und der ATP-Gehalt des Filtrats bestimmt. - Ähnliche Verfahren gehen aus
DE 10 2007 035 588 B1 zur Bestimmung acidophiler Mikroorganismen bei der Erzaufbereitung,DE 691 28 425 T2 ,DE 694 19 948 T2 ,US 4 303 752 A undUS 5 700 645 A zur Bestimmung von Mikroorganismen in Lebensmitteln, Körperflüssigkeiten und anderen Materialien biologischen Ursprungs hervor, ferner ausDE 694 21 085 T2 zur Bestimmung von Bakteriophagen sowieUS 7 871 444 B2 zur Überprüfung der Wäsche auf Reinheit. - Nach
DE 697 25 100 T2 werden Arzneimittel auf Mikroorganismen getestet, indem sie z. B. mit einem Tensid lysiert werden, um ATP herauszulösen, worauf Luciferin und Luciferase als Lumineszenzreagenz zugesetzt wird. - Aus
FR 2 937 977 A1 - Weitere Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen durch ATP-Bestimmung mittels Biolumineszenz sind in
JP 09 121 896 A EP 0 781 349 B1 ,WO 00/46392 A2 US 5 055 397 A ,US 7 628 823 B2 undUS 6 465 201 B1 beschrieben. - Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein schnelles Verfahren bereitzustellen, mit dem auch ein geringer Mikroorganismenbefall in einem Hohlraumkonservierungsmittel zuverlässig nachgewiesen werden kann.
- Dies wird erfindungsgemäß mit dem im Anspruch 1 gekennzeichneten Verfahren erreicht. In den Unteransprüchen sind vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wiedergegeben.
- Das Hohlraumkonservierungsmittel, mit dem das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, ist ein Hohlraumkonservierungsmittel auf Wasserbasis, in dem ein Mineralöl und ein polymeres Bindemittel als Hauptbestandteile dispergiert sind. Zusätzlich kann das Hohlraumkonservierungsmittel Additive enthalten, beispielsweise ein Dispergiermittel für das Mineralöl und/oder das Bindemittel. Das polymere Bindemittel kann beispielsweise ein Bindemittel auf Alkyd- oder Acrylharzbasis sein.
- Die Probe, die getestet werden soll, wird einem Tank oder dergleichen Vorratsbehälter entnommen, der das Hohlraumkonservierungsmittel enthält. Dabei kann es sich beispielsweise um das angelieferte Gebinde des Hohlraumkonservierungsmittels oder einen Zwischenbehälter handeln.
- Die Probe wird mit einem Alkohol in einem Volumenverhältnis der Probe zu dem Alkohol von höchstens 1:4 versetzt und vermischt.
- Dadurch wird die Dispersion so geschwächt, dass sie zerfällt und damit das polymere Bindemittel bei dem anschließenden Zentrifugieren von der Flüssigkeit abgetrennt werden kann. Damit wird eine klare Flüssigkeit erhalten, die neben Wasser und Alkohol das Mineralöl enthält.
- Der zugegebene Alkohol stellt also eine Voraussetzung für die Zentrifugierbarkeit und damit die Abtrennung des polymeren Bindemittels von der Flüssigkeit dar. Zugleich wird durch den Alkohol die Probe konserviert, d. h. ein Wachstum der Mikroorganismen in der Probe während der Aufbereitung der Probe verhindert. Dabei werden die Mikroorganismen nicht aufgebrochen, so dass das ATP in den Mikroorganismen vor einer Zersetzung durch Kontakt mit Luft bis zur Zugabe des Lysemittels geschützt in den Zellen verbleibt.
- Als Alkohol wird ein einwertiger Alkohol mit maximal vier Kohlenstoffatomen verwendet, also Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol oder Isobutanol. Es können auch Gemische dieser Alkohole eingesetzt werden. Vorzugsweise wird Ethanol verwendet.
- Für eine möglichst hohe Nachweisgrenze, also um einen möglichst geringen Mikroorganismenbefall nachweisen zu können, wird die Probe mit möglichst wenig Alkohol verdünnt. Die Mindestmenge wird dabei durch die Alkoholmenge bestimmt, bei der noch eine ausreichende Zentrifugierbarkeit gewährleistet ist, um das polymere Bindemittel von der Flüssigkeit abzutrennen. Vorzugsweise beträgt das Volumenverhältnis von Probe zu Alkohol daher höchstens 1:2, insbesondere 1:0,5 bis 1,5.
- Das Zentrifugieren wird vorzugsweise mit einer Zentrifugalbeschleunigung von mehr als 3000 g durchgeführt, insbesondere mehr als 10000 g, vorzugsweise mindestens 10 Minuten, insbesondere mindestens 30 Minuten durchgeführt.
- Je höher die Zentrifugalbeschleunigung ist umso klarer ist die abgetrennte Flüssigkeit und damit umso höher die Nachweisgrenze, da eine Absorption des bei der Biolumineszenz-Reaktion emittierten Lichts in der Flüssigkeit verhindert ist, wenn alle Bindemittelteilchen abgetrennt worden sind.
- Vorzugsweise wird nach dem Zentrifugieren noch eine Filtration der Flüssigkeit durchgeführt, um Spuren des polymeren Bindemittels aus der Flüssigkeit zu entfernen.
- Zur Bestimmung des ATP-Gehaltes muss das ATP in den Mikroorganismen, die in der Flüssigkeit enthalten sind, vor der Biolumineszenz-Reaktion mit einem Lysemittel freigesetzt werden. Als Lysemittel kann beispielsweise ein Tensid verwendet werden.
- Der Gehalt an freigesetztem ATP in der Flüssigkeit wird durch Biolumineszenz mit einem Gemisch aus Luciferin und Luciferase bestimmt. Das Gemisch aus Luciferin und Luciferase kann zugleich das Lysemittel enthalten. So ist in
WO 96/07759 - In der Praxis hat sich für die Bestimmung des ATP-Gehalts aufgrund der Biolumineszenzreaktion mit Luciferin und Luciferase eine im Handel erhältliche Messvorrichtung unter der Bezeichnung Hy-Lite der Firma Merck KgaA, Darmstadt, als geeignet erwiesen. Die Messvorrichtung besteht im wesentlichen aus einem sogenannten „Pen” für jede Probe, also einem zylindrischen, mit einem Stopfen verschlossenen Gefäß, das eine Lösung mit Luciferin, Luciferase und dem Lysemittel enthält und einen den Stopfen durchragenden Stift zum Transport von Probenflüssigkeit in diese Lösung, sowie einem Luminometer zur Messung der Lumineszenz. Dabei wird der Gehalt der Mikroorganismen in RLU (relative light units) angegeben. D. h., je höher der ATP-Gehalt der Probe, umso höher ist der RLU-Wert.
- Ein wesentlicher Vorteil der Bestimmung des ATP-Gehalts mithilfe der Reaktion mit Luciferin und Luciferase durch Biolumineszenz besteht darin, dass dieser Test sehr schnell durchgeführt werden kann. D. h., während der mikrobiologische Test durch Koloniebildung auf einem Nährmedium neben einer umfangreichen Vorbereitung zur bakteriellen Bestimmung und zur Bestimmung von Hefen und Pilzen in einem Brutschrank bei etwa 30° Celsius mehrere Tage dauert, kann die ATP-Bestimmung durch Biolumineszenz mit Luciferin und Luciferase in wenigen Minuten durchgeführt werden.
- Damit kann der Verkeimungsgrad des angelieferten Hohlraumkonservierungsmittels mit dem mikrobiologischen Testverfahren durch Koloniebildung auf einem Nährmedium erst nach mehreren Tagen bestimmt werden, während erfindungsgemäß der Verkeimungsgrad innerhalb von 1 bis 2 Stunden ermittelt werden kann.
- So ist zum Beispiel eine schnelle Überprüfung eines Hohlraumkonservierungsmittel-Gebindes im Anlieferungszustand möglich, bevor das Hohlraumkonservierungsmittel aus dem Gebinde dem System zugeführt werden kann, mit dem das Hohlraumkonservierungsmittel z. B. durch Sprühen in den Hohlraum eingebracht wird. Eine Kontaminierung der Leitungen und sonstigen Komponenten des Systems und damit kostspielige Reinigungskosten durch ein kontaminiertes Hohlraumkonservierungsmittel sind damit vermieden.
- Beispiel
- Ca. 20 ml der Probe des zu prüfenden Hohlraumkonservierungsmittels werden mit 20 ml Ethanol absolut versetzt und vermischt. Das Gemisch wird mit einer Zentrifuge mit einer Zentrifugalbeschleunigung von 15777 g etwa eine Stunde lang zentrifugiert. Die dadurch abgetrennte Flüssigkeit wird mit einem Papierfilter (Weissbandfilter) filtriert.
- Anschließend wird der ATP-Gehalt in dem Filtrat mit einer Hy-Lite®-Messvorrichtung gemessen.
- Ein RLU-Wert von 20 oder weniger zeigt dabei an, dass keine mikrobielle Kontamination des Hohlraumkonservierungsmittels vorliegt, jedenfalls konnte bei Proben mit diesem RLU-Wert, die zugleich einem Test mit einem Nährmedium unterzogen worden sind, keine Koloniebildung festgestellt werden.
Claims (5)
- Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in einem Hohlraumkonservierungsmittel auf Wasserbasis, in dem ein Mineralöl und ein polymeres Bindemittel dispergiert sind, dadurch gekennzeichnet, dass a) eine Probe des Hohlraumkonservierungsmittels mit einem Alkohol mit höchstens vier Kohlenstoffatomen in einem Volumenverhältnis von höchstens 1:4 versetzt wird, b) das polymere Bindemittel von der Flüssigkeit durch Zentrifugieren getrennt wird, c) die Flüssigkeit mit einem Lysemittel versetzt wird, um das in den Mikroorganismen enthaltene Adenosintriphosphat freizusetzen, d) der Flüssigkeit ein Gemisch aus Luciferin und Luciferase zugegeben wird, und e) der Adenosintriphosphat-Gehalt durch Biolumineszenz bestimmt wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkohol Ethanol ist.
- Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Volumenverhältnis der Probe zu dem Alkohol höchstens 1:2 beträgt.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren gemäß b) und vor dem Versetzen mit dem Lysemittel gemäß c) filtriert wird.
- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch aus Luciferin und Luciferase gemäß d) auch das Lysemittel nach c) enthält.
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