DE69311944T2

DE69311944T2 - Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebender Mikroorganismen

Info

Publication number: DE69311944T2
Application number: DE69311944T
Authority: DE
Inventors: Masaya Kawakami; Susumu Seto; Seiken Tei
Original assignee: Nihon Millipore KK
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1992-04-01
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 2013-03-30
Also published as: EP0563858B1; US5366867A; EP0563858A1; DE69311944D1; DE563858T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben bzw. der Lebendkeimzahl. Insbesondere betrifft die Erfindung ein schnelles, geeignetes und hochempfindliches Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben durch Registrierung des Adenosintriphosphats (ATP), das in Mikroben, welche wahrscheinlich in Industriewasser, Rohstoffen, Zwischenstufen und Produkten, welche in der Nahrungsmittel-, Pharma-, Kosmetik-, Elektronikindustrie u.dgl. verwendet werden, vorhanden sind, enthalten sind.

Beschreibung des Standes der Technik

In der Nahrungsmittel-, Pharma- und Kosmetikindustrie u.dgl. ist bekanntlich die Bekämpfung lebensfähiger Mikroben in Industriewasser, Rohstoffen, Zwischenstufen und Endprodukten von größter Bedeutung. Die Qualitätskontrolle von Industriewasser ist ferner in der Elektronikindustrie von größter Bedeutung und die Anzahl lebensfähiger Mikroben im Wasser muß zu jeder Zeit überwacht werden. Infolgedessen ist die Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben in diesen Industrien ein wesentliches Erfordernis.
Zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben wird ein übliches bekanntes sogen. "Standard-Agarplattenverfahren" allgemein verwendet, wobei die lebensfähigen Mikroben in einer Probe auf einem Agarplattennährmedium zur Bildung von Kolonien zu ihrem Nachweis kultiviert werden. Dieses Verfahren ist jedoch ziemlich problematisch und erfordert darüber hinaus zur Beurteilung eine lange Zeitspanne von 24 - 72 h. Daher besteht in diesen Industrien ein Bedarf zur Entwicklung eines schnelleren und bequemeren Verfahrens.
In einem Versuch zur Befriedigung dieses Bedarfs wurde eine Vielzahl von Methoden für einen raschen Nachweis vorgeschlagen, einschließlich eines Biolumineszenz-Verfahrens, bei welchem die Mikroben zur Messung der Menge des Adenosintriphosphats (ATP) in den Mikrobenkörpern unter Verwendung eines Luminometers und dadurch zur Berechnung der Anzahl lebensfähiger Mikroben auf einem Filter durch Filtrieren durch dasselbe festgehalten werden (offengelegtes japanisches Patent Nr. 02-163098). Bei Anwendung dieses Verfahrens auf eine Probenlösung mit einer niedrigeren Zahl lebensfähiger Mikroben werden die Mikroben auf einem Filter gesammelt und verdichtet, bevor ihre Anzahl unter Verwendung eines Luminometers bestimmt wird (offengelegtes japanisches Patent Nr. 02-57197). Bei diesen Verfahren besteht jedoch das Problem, daß das Meßgefäß lebensfähige Mikroben in einer Zahl, welche oberhalb der Nachweisgrenze des Luminometers liegt (beispielsweise ≥ 1 x 10³ oder 1 x 10&sup4; Zellen/ml) enthalten muß, so daß, insbesondere bei einer Probenlösung mit einer äußerst geringen Zahl lebensfähiger Mikroben ein großes Volumen der Probe filtriert werden muß.
Demgemäß entwickelten die Erfinder der vorliegenden Erfindung einst ein Filter mit einer Anzahl kleiner hydrophiler Filtrationsmembranabschnitte, welche durch hydrophobe Trennwände voneinander praktisch vollständig isoliert waren, und sie erfanden ein Verfahren, welches ein Zufügen von Reagenzien zur Extraktion und Induzierung von Lumineszenz zu den auf den Filtrationsmembranen gesammelten Mikroben durch Aufsprühen und ein Behandeln der erhaltenen Zubereitung mit einem hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildanalysesystem umfaßt, zur Einreichung einer Anmeldung (japanische Patentanmeldung Nr. 3-40615 und PCT-JP92-00145).
Bei diesem Verfahren besteht jedoch ein Nachteil darin, daß die Verwendung eines üblichen bekannten Extraktionsreagens, welches als Hauptbestandteil ein Netzmittel enthält, während des Vorgangs des Extrahierens von ATP aus lebensfähigen, auf der Filtrationsmembran festgehaltenen Mikroben eine gleichzeitige Extraktion von ATP-abbauenden Enzymen durch die Zerstörung der Zellmembran verursacht, wobei ein Abbau des extrahierten ATPS erfolgt, und dazu führen kann, daß die extrahierten Bestandteile wegen ihrer hohen Affinität zur Membran in die Nachbarschaft der Mikroben diffundieren. Diese Neigung macht die Extraktion von ATP unter Aufrechterhaten einer hohen Konzentration schwierig.
Andererseits entsteht bei der Verwendung von stark extrahierenden Reagenzien, wie Trichloressigsäure und Perchlorsäure, ein anderes Problem, da diese auf der Filtrationsmembran zurückbleibenden Reagenzien diese stark sauer machen, was zu einer Hemmung der nachfolgenden enzymatischen Reaktionen führt und somit die Zugabe einer ausreichenden Menge an Puffersubstanzen zur Neutralisierung nach der Extraktion erforderlich macht. Dadurch weist das Verfahren noch den Nachteil auf, daß das erhöhte Volumen der zu verwendenden Reagenzien eine Verdünnung, Diffusion und ein Ausschwemmen verursacht, das wiederum eine Abnahme der Genauigkeit bei der Bestimmung von ATP und etwas unbestimmte Umrisse heller Flecken in der Umgebung der festgehaltenen Mikroben bewirkt.

Durch die Erfindung zu lösende Probleme

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben zur Lösung der genannten Probleme während des Vorgangs der Extraktion von ATP bei den bekannten Verfahren durch Maßnahmen zum Nachweis von ATP aus lebensfähigen Mikroben, wobei ATP effizient extrahiert werden kann. Es werden Entwicklungen für ATP-Extraktionsreagenzien mit ausgezeichneter Qualität zur deutlichen Sichtbarmachung der hellen Flecken bei der Induktion von Lumineszenz gemacht. Dabei wurde eine Verbesserung bei der Art, ATP zu extrahieren, erreicht und eine Kombination des Verfahrens mit einem Biolumineszenz-Bildanalysesystem durchgeführt.

Verfahren zur Lösung der Probleme

Als Ergebnis intensiver Bemühungen zur Lösung der genannten Probleme bei verschiedensten, üblicherweise auf dem Gebiet der Biochemie zur Trennung spezieller Bestandteile verwendeten Extraktionsreagenzien fanden die Erfinder der vorhegenden Erfindung die folgenden Tatsachen heraus und sie gelangten zur folgenden Erfindung: Ein flüchtiges Extraktionsreagenz mit einem Siedepunkt unter 120 ºC zeigt eine gute Wirkung bezüglich der Extraktion von ATP aus lebensfähigen Mikroben und beim Abdamfen des Extraktionsreagenz unter Erwärmen können erfolgreiche Ergebnisse erhalten werden.
Danach liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben in einer Probe, welches gekennzeichnet ist durch:
Filtrieren einer Lösung der (betreffenden) Probe durch ein hydrophiles Membranfilter zum Festhalten bzw. Einfangen darin enthaltener lebensfähiger Mikroben auf der Filtrationsmembran dieses Filters;
Aufsprühen eines flüchtigen Extraktionsreagenz eines Siedepunkts unter 120ºC auf die Membran zur Extraktion von mikrobiellem ATP;
anschließende oder gleichzeitige Durchführung des Abdampfens flüssiger Bestandteile bei Umgebungstemperatur oder erhöhter Temperatur an der Membran;
Aufsprühen eines Llumineszenz induzierenden Reagens vom Luciferin/Luciferase-Typ auf die Membran zur Induktion von Lumineszenz und
Bestimmen der Lumineszenzmenge unter Verwendung einer für eine solche Messung geeigneten Vorrichtung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Im folgenden erfolgt eine weitere detailliertere Beschreibung mit Bezug auf die Zeichnungen, wobei:
Fig. 1 (A) eine Darstellung eines im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Membranfilters in der Draufsicht und (B) eine vergrößerte Teilansicht hiervon;
Fig. 2 eine Teildarstellung des Membranfilters im Querschnitt und
Fig. 3 das Schemadiagramm eines in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Biolumineszenz-Bildanalysesystems zeigen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Bezugnehmend auf Fig. 1 und 2 umfaßt das bei der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendete Filter 1 eine Anzahl kleiner hydrophiler Filtrationsmembranabschnitte 2, welche durch die hydrophoben Trennwände 3 praktisch völlig voneinander isoliert sind. Dieses Filter ist aus einer Filtermembran 4 und hydrophoben Trennwänden 3 durch Aufdrucken eines hydrophoben Druckfarbemusters auf die Membran hergestellt. Die Druckfarbe kann in das Filterelement eindringen und die Trennwände können mit der Oberfläche der Membran abschließen oder höher als diese sein.
Die für die erfindungsgemäße Verwendung geeigneten ATP- Extraktionsreagenzien umfassen Alkohole, Ether, Ester und Halogenderivate von Methan, Ethan, Methylen oder Ethylen und auch Acetonitril, Triethylamin und andere mit Siedepunkten unter 120ºC. Methanol und Ethanol sind besonders bevorzugt.
Der Extraktionseffekt wird weiter gesteigert durch die Zumischung von 0,1 - 5 Gew.-% Chlorwasserstoffsäure, organischen Säuren mit einem Siedepunkt unter 120ºC oder basischen Verbindungen wie Ammoniumhydroxid, organischen Aminen und anderen mit einem Siedepunkt unter 110ºC zu den genannten Alkoholen. Obwohl Chlorwasserstoffsäure und organische Säuren mit einer Tendenz zur Flüchtigkeit den Extraktionseffekt signifikant steigern, reduzieren sie die Aktivität des Lumineszenz induzierenden Enzyms, wenn sie selbst spurenmäßig in der Probe zurückbleiben, so daß eine vollständigere Verdampfung und manchmal ein weiteres Aufsprühen von Neutralisationsreagens zum Ausgleich der Azidität nötig wird. Ammoniumhydroxid ist daher besonders bevorzugt, da es eine hohe Flüchtigkeit aufweist und die Induktion von Lumineszenz nicht hemmt.
Diese ATP-Extraktionsreagenzien können bei einer Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 80ºC, vorzugsweise zwischen 40ºC und 70ºC abgedampft werden. Die Verwendung eines feinen Sprühnebels der Extraktionsreagenzien mit einem Ultraschall- Sprühgerät (beispielsweise von Matsushita Electric Industries Co., Ltd., hergestellt) ist zur Zugabe einer genauen erforderlichen Menge geeignet und wirksam.
Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Membranfilter ist ein Film oder eine Folie einer hydrophilen Filtrationsmembran, welche(r) genau aus Kunststoffmaterial, wie hydrophilem Polytetrafluorethylen, hydrophilem Poly(vinylidenfluorid), hydrophilem Polysulfon, hydrophilem Polycarbonat, hydrophilem Polyamid, hydrophilem Polyethylen und hydrophilem Polypropylen, und Cellulosematerial, wie Acetylcellulose und Nitrocellulose, hergestellt ist und eine Zahl gleichformiger Mikroporen der Porengröße 0,1 bis 1 µm umfaßt.
Bevorzugt ist die Verwendung eines Membranfilters gemäß der Beschreibung in der japanischen Patentanmeldung Nr. 3-40615 (PCT-JP92-00145), umfassend eine Zahl hydrophiler, praktisch vollständig durch gitterartige oder kreisrunde hydrophobe Mikrotrennwände voneinander isolierter Filterabschnitte (Darstellung in der Draufsicht, s. Fig. 1). Als für Probenlösungen mit einer Zahl lebensfähiger Mikroorganismen auf der Filtrationsmembran von mehr als 100 Zellen geeignetes Membranfilter wird zusätzlich zum genannten ein Extraktionseinsatz mit einer Filtrationsmembran einer Porengröße von 0,1 bis 1 µm, vorzugsweise von 0,2 bis 0,45 µm auf dem Boden eines Zylinders (Durchmesser: 10 - 40 mm φ) aus Kunststoff (vgl. japanische Patentanmeldung Nr. 2-253093) verwendet.
Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Einschließen bzw. Festhalten und Messen lebensfähiger Mikroben detaillierter beschrieben.
Zuerst wird eine Probenlösung unter Verwendung einer Filtriervorrichtung - einem mit der Lösung zu füllenden becherförmigen Gefäß -, welche mit dem genannten Membranfilter ausgestattet ist, zum Einschließen bzw. Festhalten der lebensfähigen Mikroben auf diesem filtriert. Das Membranfilter wird dann bei einer Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 80ºC, vorzugsweise zwischen 40ºC und 70ºC während einer Zeitspanne zwischen 5 s und etwa 5 min unter Verwendung eines Sprühgeräts, z.B. eines Geräts vom Ultraschall-Typ von Matsushita Electr. Ind. Co., Ltd., einem feinen Besprühen mit dem genannten ATP-Extraktionsreagenz zum Extrahieren des mikrobiellen ATP unterzogen. Die zum Sprühen geeignete Zeitspanne kann in Abhängigkeit von der Art der zu testenden Mikroben und der zu verwendenden Art des Extraktionsreagens variieren.
Das Erwärmen kann während und/oder nach dem Besprühen erfolgen, jedoch wird das Membranfilter vorzugsweise bei Umgebungstemperatur dem Ringsprühauftrag unterzogen und dann zum raschen wegdampfen des übrigen Extraktionsreagenz auf eine 10 Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 80ºC, vorzugsweise zwischen 40ºC und 70ºC erwärmt.
Danach wird ein Lumineszenz induzierendes Reagens vom Luciferin/Luciferase-Typ auf das Membranfilter gegeben. Für den Fall, daß eine ausreichende Keimzahl (mehr als 100 Zellen/Membran) erwartet wird, die die Verwendung eines Luminometers möglich macht, kann das Reagens auf den Extraktionseinsatz mittels einer Pipette oder eines üblichen Sprühgeräts zur Induzierung der Lumineszenz gegeben werden. Im anderen Fall (weniger als 100 Zellen/Membran) wird das Besprühen wegen der erforderlichen größeren Genauigkeit des Sprühens von kleinen Mengen mit einem Sprühgerät des Ultraschall-Typs u.dgl. durchgeführt.
Zur effektiveren Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erhöhte Konzentration des Lumineszenz induzierenden Reagens vom Luciferin/Luciferase-Typ bei der Induktion von Lumineszenz durch Versprühen des Reagens mit einem Sprühgerät oder durch Zugabe des Reagens mit einer Pipette (für den Fall, daß eine Keimzahl von über 100 Zellen/Membran erwartet wird) verwendet. Der Grund hierfür liegt darin, daß die erhöhte Konzentration eine erhöhte Rate der Lumineszenzreaktion bewirkt und damit das Ausmaß der Lumineszenz erhöht. Dies ist ein effektiverer Weg für Proben mit besonders niedriger Keimzahl (d.h. weniger als 100 Zellen/Membran, insbesondere weniger als 50 Zellen/Membran), welche mit einem Biolumineszenz-Bildanalysesystem bestimmt werden sollte.
Daher wird die Konzentration des zu verwendenden Lumineszenz induzierenden Reagens vorzugsweise auf das zwei- bis zehnfache, insbesondere auf das drei- bis sechsfache der Standardkonzentration erhöht. Infolgedessen wird die Lumineszenzrate zur Erhöhung der Lumineszenzintensität der hellen Flecken und gleichzeitig die Nachweisgeschwindigkeit erhöht.
Der hier verwendete Ausdruck "Standardkonzentration" bedeutet die für die regelmäßige Verwendung üblicher Lumineszenz induzierender Reagenzien (beispielsweise ein Reagens vom Luciferin/Luciferase-Typ, Lucifer LU , kommerziell erhältlich von Kikkoman Co., Ltd.) spezifizierte Konzentration.
Insbesondere kann bei Verwendung eines Lumineszenz induzierenden Reagens, wie das von Kikkoman Co., Ltd. (Lucifer LU ) hergestellte, welches normalerweise in der Verdünnung 70 mg des trockenen Reagens mit 5 ml Wasser verwendet wird, in einer etwa 3- bis 6fach höheren Konzentration als der genannten Konzentration zur regelmäßigen Verwendung die Zeit bis zur Emission von Licht nach dem Aufsprühen des Reagens verringert und die Menge der Lumineszenz fast direkt proportional zur Konzentration des Reagens erhöht werden.
Das Membranfilter, welches auf diese Weise Licht emittieren kann, kann zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben unter Verwendung eines Luminometers, z.B. eines Luminescence Reader BLR-201 (verbessertes Modell), Aloka Corporation, einem Zählverfahren, oder unter Verwendung von Geräten für ein Biolumineszenz-Bildanalysesystem, z.B. ARGUS-50/CL (mit konischen Lichtfasern) Hamamatsu Photonics, Co., Ltd. einer Bildaufzeichnung der auf dem Filter erscheinenden Flecken unterworfen werden. Das letztere Biolumineszenz- Bildanalysesystem der verbesserten Art kann ziemlich schwache Lumineszenz mit hoher Empfindlichkeit verarbeiten und erlaubt eineschnelle Datenverarbeitung und -analyse im Vergleich zu üblicherweise verwendeten ähnlichen Instrumenten, so daß in Verbindung mit den erfindungsgemäßen Effekten des Filters und des Aufsprühens von Reagensien ein ausgezeichnetes Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen verwirklicht werden kann.
Das System ist in Fig. 3 skizziert, wobei (A) eine Gesamtdarstellung und (B) vergrößert eine Teildarstellung angibt. Dieses System umfaßt einen Probenhalter 9 als Träger des Membranfilters (Probe) 5 nach der Behandlung mit den genann ten Extraktions- und Lumineszenz induzierenden Reagenzien; eine totalreflektierende Platte 6; ein Abblendgehäuse 8; konusförmige möglichst dicht am Membranfilter positionierte (Licht-)Fasern 7 zur Registrierung der Lumineszenz in zweidimensionaler Hinsicht; eine aus einem Photoverstärkerteil und einer Kameraröhre ultrahochempfindliche Fernsehkamera 10; eine Kamerasteuereinheit 11; einen Bildprozessor 12; eine Datenanalysevorrichtung 13; und einen Fernsehmonitor 14. ARGUS-50/CL von Hamamatsu Photonics, Co., Ltd. mit einem Eingang aus konusförmigen Fasern, oder Geräte mit einer ähnlichen Zählleistung sind besonders bevorzugt.
Als ultrahochempfindliche Fernsehkamera kann eine gekühlte Festkörperkameraeinheit (CCD) verwendet werden, welche im Inneren auf eine Temperatur von etwa -30ºC bis -120ºC zur Unterdrückung des Rauschens der Kamera selbst gekühlt ist, so daß sie selbst sehr schwaches Licht akkumulieren kann. Beispielsweise ist ein gekühltes CCD-Digitalbildaufnahmesystem von Hamamatsu Photonics erhältlich. Alternativ kann das System so arbeiten, daß die sich verjüngenden Fasern 7 im Kameraröhrenteil und die ultrahochempfindliche Fernsehkamera unterhalb des Probenhalters positioniert sind, und der Probenhalter mit einer Probe auf den sich verjüngenden Fasern plaziert wird.
Es ist wünschenswert, daß die Probe 5 möglichst dicht an den sich verjüngenden Fasern 7 plaziert ist, so daß dadurch die Meßempfindlichkeit signifikant erhöht wird. Zum Zwecke eines automatischen Zählens können gegebenenfalls ein Sprühgerät oder Sprühgeräte für Extraktions- und Lumineszenz induzierende Reagenzien und andere damit verbundene Einrichtungen, beispielsweise ein Probenträger, mit diesen Einrichtungen kombiniert werden.
Zur Bestimmung der Zahl lebensfähiger Mikroben wird der Probenhalter 9 mit einer Probe (eine die zu testenden Mikroben festhaltenden Membranfilter) nach dem bereits erwähnten Lumineszenz induzierenden Verfahren in engem Kontakt mit der Oberfläche der konusförmigen (Kilt-)Fasern 7 gehalten, während die von den Mikrobenkörpern emittierte Lumineszenz über die ultrahochempfindliche Fernsehkamera 10 und die Kamerasteuereinheit 11 in den Bildprozessor 12 geführt wird, wo die Photonen für eine Zeitspanne von 30 - 180 s, z.B. 120 s bei einem zweidimensionalen Verfahren, zur Bildaufnahme gesammelt werden, wobei das Bild dann durch die Datenanalysevorrichtung 13 zur Anzeige auf dem Femsehmonitor 14 verarbeitet wird, wobei nur die aus den lebensfähigen Mikroben stammende helle Lumineszenz übrig bleibt und schwache Hintergrundlumineszenz entfernt wird. Da durch diese Verarbeitung jegliche Lumineszenz aus anderen Quellen als den Mikrobenksrpern eliminiert wird, entspricht die Anzahl der gezählten hellen Flecken praktisch der Anzahl lebensfähiger Mikroben.

Wirkungen der Erfindung

Erfindungsgemäß werden lebensfähige Mikroben auf einem Membranfilter in einer bereits beschriebenen vorteilhaften Form eingeschlossen bzw. festgehalten und in situ unter Verwendung eines feinen Sprühnebels eines bevorzugten flüchtigen Extraktionsreagenz einer Extraktion von mikrobiellem ATP unterzogen. Danach wird dieses Lösungsmittel rasch durch Erwärmen des Filters auf eine Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 80ºC, vorzugsweise zwischen 40ºC und 70 ºC abgedampft. Anschließend wird direkt mit einem Lumineszenz induzierenden Reagens zur Induktion von Lumineszenz besprüht, wobei die Lumineszenz zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben unter Verwendung eines hochempfindlichen Biolumineszenz-Bildanalysesystems gemessen wird.
Die Verwendung eines bevorzugten Extraktionsreagenz und dessen Verdampfung verhindert, daß restliche Bestandteile des Extraktionsreagens wie im Falle der Verwendung üblicher bekannter Extraktionsreagenzien auf der Basis einer wäßrigen Lösung von Netzmitteln vorhanden bleiben. Das praktische Fehlen von restlichem Extraktionsreagens eliminiert die Möglichkeit der Hemmung der Lumineszenz durch dieses. Da ferner die Aktivität der ATP abbauenden Enzyme gehemmt ist, erfolgt auch keine Abschwächung der Lumineszenz. Ferner tritt keine Diffusion von ATP in die Umgebung der einzelnen Mikroben auf, so daß deren Lokalisierung genauer erfolgen kann. Dadurch erhöht sich die Nachweisempfindlichkeit des Systems beträchtlich und verringern sich die Meßzeit und der Meßaufwand signifikant.
Bei Verwendung eines Membranfilters, das eine Anzahl kleiner hydrophiler voneinander durch hydrophobe Trennwände vollständig isolierter Abschnitte umfaßt, als Filter werden alle lebensfähigen Mikroben innerhalb der kleinen Abschnitte gut verteilt und eingeschlossen bzw. festgehalten. Ferner sind die beiden auf das Membranfilter auf zusprühenden Lösungen, die Extraktionslösung (Lösung des ATP-Extraktionsreagens) und die Lösung des Lumineszenz induzierenden Reagens (Luciferin/Luciferase-Typ), so bemessen, daß sie innerhalb der Abschnitte bleiben, ohne aus den einzelnen Abschnitten herauszudiffundieren oder eine Verdünnung zu erfahren. Dadurch kann der nun Licht emittierende Mikrobenbestandteil nahe am Ort der Mikrobe in einer relativ hohen Konzentration erhalten bleiben, so daß die genannte Effektivität weiter erhöht wird, wodurch eine äußerst empfindliche Bestimmung möglich wird.
Darüber hinaus kann bei der Behandlung der auf diese Weise lichtemittierenden Probe (Membranfilter) mit einem Biolumineszenz-Bildanalysesystem, mit welchem der hochempfindliche und selektive Nachweis heller Flecken möglich ist, ein von anderen Quellen als lebensfähigen Mikroben herrührende Hintergrundlumineszenz ohne Schwierigkeiten entfernt werden, so daß selbst eine äußerst geringe Anzahl lebensfähiger Mikroben (z.B. einige Zellen/Membran) automatisch sowie schnell und bequem bestimmt werden kann.

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden Beschreibung der Beispiele genauer erläutert.

Beispiel 1

Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) wurde über Nacht in einem Glucose/Pepton-Nährmedium (Eiken Chemicals Co., Ltd.) gezüchtet. 5 ml der durch Verdünnen der genannten Kultur mit Phosphatpuffer (pH-Wert 7,5) erhaltenen Probenlösung mit etwa 100 Zellen/ml wurden zum Festhalten bzw. Einschließen der Mikroben unter Verwendung eines Millicell-CM (Nippon Millipore Co.), eines mit einer Bioporenmembran (0,4 µm) auf dem Boden eines Zylinders aus Polystyrol ausgestatteten Kulturbechers, filtriert. Die Millicell-CM-Membran wurde 30 s lang einem feinen Sprühnebel (d.h. einem sehr feinen Nebel des Sprühmittels) aus 90%igem Ethanol unter Verwendung eines Ultraschall-Sprühgeräts von Matsushita Electr. Ind. Co. ausgesetzt, um ATP aus den Mikroben zu extrahieren.
Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bei einer Temperatur von 50 ºC bis 60ºC wurde 20 s lang ein Lumineszenz induzierendes Reagens (Lucifer-LU , Kikkoman Co., Ltd.) zur Induktion von Lumineszenz auf die Membran gesprüht und anschließend die Menge der Lumineszenz 1 min lang zur Berechnung der Anzahl lebensfähiger Mikroben unter Verwendung eines Luminometers (Luminescence Readertm BLR-201, verbesserter Typ, Aloka Corp.) gemesen, wobei die in Tabelle 1 angegebenen Ergebnissen erhalten wurden. Zum Vergleich sind die Ergebnisse einer Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben für die gleiche Probenlösung nach dem standardmäßigen Agarplattenverfahren unter Verwendung eines Kartoffeldextrose/Agar- Nährmediums (Nissui Seiyaku Co., Ltd.) ebenfalls in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1

Beispiel 2

Escherichia coli (IFO 13898) wurde über Nacht in m-TGE- Nährmedium (DIFCO Laboratories) gezüchtet. Die Kultur wurde mit Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,5) verdünnt. 5 ml der erhal tenen etwa 1 x 10³ Zellen/ml enthaltenden Probenlösung wurden durch ein Millicell-CM gemäß Beispiel 1 zum Einschließen bzw. Festhalten der Mikroben auf diesem filtriert. Dann wurde das Verfahren gemäß Beispiel 1 mit Ausnahme davon, daß das Lösungsmittel durch 3-minütiges Stehenlassen der Probe bei Umgebungstemperatur verdampft wurde, durchgeführt, wobei die Anzahl lebensfähiger Mikroben berechnet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammen mit den mittels des standardmäßigen Agarplattenverfahrens erhaltenen Ergebnissen angegeben. TABELLE 2

Beispiel 3

Unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) wurde das Verfahren gemäß Beispiel 1 durchgeführt, mit Ausnahme davon, daß Millicell-GVWP (Nippon Millipore Co.) mit einer hydrophilen PVDF-Membran anstelle von Millicell-CM und Methanol anstelle von Ethanol verwendet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammen mit den mittels des standardmäßigen Agarplattenverfahrens erhaltenen Ergebnissen angegeben. TABELLE 3

Beispiel 4

Die Lösung einer Über-Nacht-Kultur von Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) in einem Glucose/Pepton-Nährmedium wurde mit Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,5) verdünnt, wobei eine Probenlösung mit etwa 20 Zellen/ml erhalten wurde. 1 ml dieser Lösung wurde durch eine in einzigartiger Weise gitterförmig unterteilte hydrophile Durapor-Filtrationsmembran (25 mm φ, Nippon Millipore Co.) filtriert. Nach dem Waschen der Membran und dem Sammeln der Mikroben auf der Membran wurde die Filtrationsmembran vom Filter entfernt und getrocknet.
Ein feiner Sprühnebel aus 90%igem Ethanol wurde dann gemäß Beispiel 1 zur Extraktion von ATP 30 s lang auf die Membran appliziert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels bei einer Temperatur von 50ºC bis 60ºC wurde ein feiner Sprühnebel eines Lumineszenz induzierenden Reagens (Lucifer-LU , Kikkoman Co., Ltd.) zur Induktion von Lumineszenz 10 s lang appliziert.
Die Probe wurde in einen Bildanalysator (ARGUS-50/CL , Hamamatsu Photonics Co., Ltd.) gegeben. Nach dem Sammeln der Photonen während 2 min und dem Verarbeiten des Bildes wurden nur helle Flecken mit einer Leuchtdichte bzw. Lumineszenz oberhalb des Schwellenwertes zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben abgebildet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammen mit den Ergebnissen für die Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben der gleichen Pröbenlösung mittels des standardmäßigen Agarplattenverfahrens unter Verwendung eines 48 h lang bei 30ºC kultivierten Kartoffeldextrose/Agar-Nährmediums zum Vergleich wiedergegeben. TABELLE 4

Beispiel 5

Die Lösung einer Über-Nacht-Kultur von Staphylococcus aureus (IFO 3060) in einer Nährlösung (Eiken Chemicals Co., Ltd.) wurde mit Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,5) verdünnt, wobei eine etwa 30 Zellen/ml enthaltende Probenlösung erhalten wurde. 1 ml dieser Lösung wurde durch eine Filtrationsmembran gemäß Beispiel 4 filtriert. Nach dem Sammeln der Mikroben, dem Extrahieren von ATP und der Induktion von Lumineszenz gemäß Beispiel 4 wurden nur die von lebensfähigen Mikroben herrührenden hellen Flecken zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben bildmäßig abgebildet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Ferner sind in Tabelle 5 die für die gleiche Probenlösung nach dem standardmäßigen Agarplattenverfahren unter Verwendung der 48 h bei 37 ºC kultivierten Nährlösung erhaltenen Ergebnisse angegeben. TABELLE 5

Beispiel 6

Eine Probenlösung, die etwa 30 Zellen/ml von Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) enthält, wurde durch Züchten und Verdünnen gemäß Beispiel 4 hergestellt. 1 ml dieser Lösung wurde durch eine Filtrationsmembran gemäß Beispiel 4 filtriert. Nach dem Sammeln der Mikroben wurde ein feiner Sprühnebel aus Methanol mit 3 Gew.-% Triethylamin 30 5 lang auf die Membran zur Extraktion von ATP appliziert.
Nach 3-minütigem Stehenlassem bei Umgebungstemperatur und anschließendem Besprühen mit Lumineszenz induzierendem Reagens während 10 s zur Induktion von Lumineszenz wurde das Lösungsmittel bei einer Temperatur zwischen 50ºC und 60ºC gemäß Beispiel 4 abgedampft. Dann wurde die Probe zum 2- minütigen Sammeln der Photonen in einen Bildanalysator gegeben. Nur die hellen Flecken mit einer Leuchtdichte bzw. Lumineszenz oberhalb des Schwellenwerts und der Abstammung von lebensfähigen Mikroben wurden zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben abgebildet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 angegeben. Ferner sind in Tabelle 6 die für die gleiche Probenlösung mittels des standardmäßigen Agarplattenverfahrens unter Verwendung eines 48 h bei 30ºC kultivierten Peptondextrose/Agar-Nährmediums erhaltenen Ergebnisse angegeben. TABELLE 6

Beispiel 7

Eine Probenlösung, die etwa 1 x 10³ Zellen/ml von Staphylococcus aureus (IFO 3060) enthielt, wurde durch Züchten und Verdünnen gemäß Beispiel 5 hergestellt. Nach dem Filtrieren von 5 ml dieser Lösung und Sammeln der Mikroben auf der Membran gemäß Beispiel 5 wurde ATP gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von 90%igem Ethanol mit 1% Ammoniumhydroxid (wäßrigem Ammoniak) anstelle von 90%igem Ethanol extrahiert.
Durch Aufsprühen von Lumineszenz induzierendem Reagens (Lumit-PM , Lumac Co.) während 20 s wurde anschließend Lumineszenz induziert und deren Menge gemessen.
In diesem Beispiel wurde das gesamte Vorgehen zum Vergleich der Lumineszenzmenge unter Ersatz des ATP-Extraktionsreagens lediglich durch ein anderes Reagens (NRB , Lumac Co.) wiederholt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. TABELLE 7

Beispiel 8

Jeweils 0,5 µl einer wäßrigen Lösung mit entweder 4 x 10&supmin;¹³ g, 4 x 10&supmin;¹&sup4; g oder 2 x 10&supmin;¹&sup4; g ATP wurden punktförmig auf eine eindeutig gitterformig unterteilte hydrophile Filtrationsmembran (47 mm φ, Nippon Millipore Limited) gemäß Beispiel 4 aufgetragen und getrocknet.
Ein feiner Sprühnebel des üblicherweise in den vorliegenden Beispielen verwendeten Lumineszenz induzierenden Reagens (Kikkoman Co., Ltd.) wurde 10 s lang getrennt in zwei Konzentrationen, d.h. in der normalen Konzentration und in einer gegenüber der normalen auf das Vierfache erhöhten Konzentration, auf die Membran appliziert. Das Sammeln der Photonen während 2 min wurde wie während des gesamten Experiments durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Die Werte geben die Zahl der emittierten Photonen einer Fläche von 25 x 25 Pixel auf dem Monitor wieder. TABELLE 8

Beispiel 9

Eine verdünnte etwa 100 Zellen/ml enthaltende Lösung von Saccharomyces cerevisiae (IFO 0209) mit wurde gemäß Beispiel 1 hergestellt. 0,2 ml dieser Lösung wurden durch eine eindeutig gitterförmig unterteilte hydrophile Filtratationsmembran (47 mm φ, Nippon Millipore Limited) filtriert und getrocknet. Das Extraktionsreagens wurde dann 30 s gemäß Beispiel 1 zur Extraktion von ATP aufgesprüht
Danach wurde ein feiner Sprühnebel des üblicherweise in den vorliegenden Beispielen verwendeten Llumineszenz induzierenden Reagens 10 s gemäß Beispiel 8, d.h. in der normalen Konzentration und in einer gegenüber der normalen auf das 4fache erhöhten Konzentration auf die Membran appliziert. Das Sammeln der Photonen während 2 min wurde auf die gleiche Weise wie während des gesamten Experiments durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben. TABELLE 9
*Gesamtmenge der pro Membran nachgewiesenen Photonen
Aus den in den Tabellen 1 bis 9 wiedergegebenen Ergebnissen der Beispiele 1 bis 9 ist verständlich, daß mittels des zeitaufwendigen standardmäßigen Agarplattenverfahrens und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ähnliche Werte erhalten werden, und daß das letztere Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben gut anwendbar ist.

Vorteile der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist insofern vorteilhaft, als sie ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben unter Verwendung der Techniken des ATP-Biolumineszenzverfahrens bereitstellt, wobei die Verwendung besonderer flüchtiger Extraktionsreagensien und eines Verdampfungsprozesses die effiziente Extraktion von ATP aus auf einem Membranfilter eingeschlossenen bzw. festgehaltenen und gesammelten lebensfähigen Mikroben ermöglicht und eine Hemmung der Enzymaktivität (d.h. Luciferase-Aktivität) und nachteilige Effekte ATP-abbauender Enzyme während des sich anschließenden Lumineszenz-Induktionsprozesses verhindert werden. Daher wurde ein empfindlicheres und schnelles Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben im Vergleich zu üblichen bekannten Verfahren realisiert.
Die vorliegende Erfindung ist ferner insofern vorteilhaft, als das vorliegende Verfahren, die Verwendung eines durch leicht überstehende Trennwände voneinander isolierte kleine Bereiche umfassenden Membranfilters und ein Sprühverfahren für die Zugabe von Reagenzien in Kombination mit einem verbesserten Biolumineszenz-Bildanalysesystem, welches einen hochempfindlichen und schnellen Nachweis selbst schwacher Lumineszenz ermöglicht, die Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen im Vergleich zu üblichen bekannten Verfahren in wesentlich kürzerer Zeit und ferner die Durchführung einer hochempfindlichen, schnellen, bequemen Bestimmung für Proben mit einer relativ geringen Keimzahl, was bisher nur unter Schwierigkeiten möglich war, ermöglicht.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben in einer Probe, gekennzeichnet durch:

Filtrieren einer Lösung der (betreffenden) Probe durch ein hydrophiles Membranfilter zum Einfangen darin enthaltener lebensfähiger Mikroben auf einer Filtrationsmembran dieses Filters;

Aufsprühen eines flüchtigen Extraktionsreagenz eines Kp unter 120ºC auf die Membran zur Extraktion von mikrobiellem Adenosintriphosphat;

Anschließendes oder gleichzeitiges Einwirkenlassen von Umgebungstemperatur oder erhöhter Temperatur auf die Membran zur Verdampfung flüssiger Bestandteile;

Aufsprühen einer Lösung eines lumineszenzinduzierenden Reagenz vom Luciferin/Luciferase-Typ auf die Membran zur Induktion von Lumineszenz und

Bestimmen der Lumineszenzmenge unter Verwendung einer für eine solche Messung geeigneten Vorrichtung.

2. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebenfähiger Mikroben nach Anspruch 1, wobei das hydrophile Membranfilter eine Anzahl kleiner hydrophiler Filtrationsmembranabschnitte, die voneinander durch hydrophobe Trenneinrichtungen praktisch vollständig isoliert sind, aufweist.

3. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroben nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem hydrophilen Membranfilter um einen am unteren Ende bzw. Boden eines Kunststoffzylinders mit einer hydrophilen Filtrationsmembran ausgestatteten Filterbecher handelt.

4. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hydrophile Membranfilter aus einem Werkstoff, ausgewählt aus der Gruppe hydrophiler Formen von Polytetrafluorethylen, Poly(vinylidenfluorid), Polycarbonat, Polyamid, Polysulfon, Polyethylen, Polypropylen und Mischungen und Mischpolymeren hiervon, Acetylcellulose und Nitrocellulose, hergestellt ist.

5. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das flüchtige Extraktionsreagenz für ATP aus Methanol oder Ethanol besteht.

6. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das flüchtige Extraktionsreagenz für ATP aus einem Gemisch aus Methanol oder Ethanol mit 0,1 bis 5 Gew.% Ammoniumhydroxid besteht.

7. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das lumineszenzinduzierende Reagenz in 3- bis 6- mal höherer Konzentration als normalerweise verwendet eingesetzt wird.

8. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran zur Verdampfung flüssiger Bestandteile einer Temperatur von 40ºC bis 70ºC ausgesetzt wird.

9. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der geeigneten Vorrichtung um ein Biolumineszenz-Bildanalysesystem handelt.

10. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Zellen nach Anspruch 9, wobei der Fernsehkamerakopf des Biolumineszenz-Bildanalysesystems entweder sich verjüngende Fasern, eine Photostromverstärkungseinheit und eine Bildröhre oder sich verjüngende Fasern und eine gekühlte CCD-Fernsehkamera umfaßt.

11. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Biolumineszenz-Bildanalysesystem die Anzahl an lebensfähigen Mikroben nach einer Bildverarbeitung derart bestimmt, daß nicht von lebensfähigen Mikroben herrührende Hintergrundlumineszenz ausgelöscht und intensives Licht oberhalb der Schwellenintensität emittierende helle Flecken angezeigt werden.