DE2831559A1 - Verfahren zur bestimmung der somatischen zellen in milch mittels der leuchtkaefer-luciferin-luciferase-biolumineszenz unter labor- und praktischen bedingungen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der somatischen zellen in milch mittels der leuchtkaefer-luciferin-luciferase-biolumineszenz unter labor- und praktischen bedingungen

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DE2831559A1 DE19782831559 DE2831559A DE2831559A1 DE 2831559 A1 DE2831559 A1 DE 2831559A1 DE 19782831559 DE19782831559 DE 19782831559 DE 2831559 A DE2831559 A DE 2831559A DE 2831559 A1 DE2831559 A1 DE 2831559A1
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Description

5-1 590- Dr. T Λ
Anmelder:" l) Seppo Kolehmainen 2) Veikko Tarlckanen Ganzenstraat 11 Breulsweg 1 Zolder / Belgien Wylre / Niederlande
Verfahren zur Bestimmung der somatisehen Zellen in Milch mittels der Leuchtkäfer-Luciferin-Lueiferase-Biolumineszenz unter Labor- und praktischen Bedingungen
Die Erfindung betrifft die schnelle und genaue Bestimmung von somatisehen Zellen (Somazellen bzw. Körperzellen) (Leukozyten- und Epithel "Ze11en) in der Milch durch einfache Bestimmung des Adenosintriphosphats (ATP) aus den somatisehen Zellen mittels der "Leuchtkäfer-Ltieiferin-Luciferase-Biolumineszenzo
In der Veterinär-, landwirtschaftlichen Tierhaltungsund Molkereiindustrie ist der Nachweis der Mastitis (einer bakteriellen Infektion des Euters) bei Kühen von großer Bedeutung für das Wohlbefinden der Kühe selbst, für die Minirnalhaltung der wirtschaftlichen Verluste durch eine verminderte Milchproduktion sowie für den Schutz der menschlichen Bevölkerung gegen Übertragung von pathogenen Bakterien mit: der Milcho Die Mastitis wird nachgewiesen durch Bestimmung der Menge an somatisehen Zellen (Soma- bzw. Körperzellen).
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Gesunde Kühe haben einen Gehalt an somatischen Zellen, der normalerweise unterhalb 150.000 pro Milliliter liegt, wobei eine gewisse Schwankung als Folge des physiologischen Zustandes des Tieres auftreten kann. Bei einer chronischen subklinischen Mastitis überschreitet der Gehalt an somatischen Zellen 500.000 pro Milliliter und bei einer akuten Mastitis kann der Gehalt an somatischen Zellen bis zu mehreren Millionen pro Milliliter betragen. Die konventionellen Verfahren zum Auszählen der somatischen Zellen in der Milch beruhen auf den folgenden Prinzipien:
(1) Direkte mikroskopische Auszählung,
(2) Ausfällung von DNA (Desoxyribonucleinsäure) mittels Chemikalien wie Detergentien in den sogenannten "California Mastitis Tests" (CMT);
(3) Auszählung der Zellen mittels eines elektronischen Teilchen-Counters oder Auszählen der Zellen mittels eines Fluoreszenz-Counters.
Alle diese Verfahren haben bestimmte Nachteile:
Die direkte mikroskopische Auszählung ist langsam und zu mühsam für die große Anzahl von Proben in den modernen Großmolkereienj die CMT- und anderen Ausfällungsverfahren sind subjektiv und nur schwer zu automatisieren| die elektronischen Teilchen-Counter sind teuer und sie führen zu falschen Ergebnissen wegen der Fettkügelchen in der Milch, und die Fluor eszenz-Zeilen=Counter sind su teuer für kleine und
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mittlere Molkereien und Laboratorien.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein einfaches, schnelles, genaues und wirtschaftliches Verfahren zur Bestimmung der somatischen Zellen (Soma- bzw. Körperzellen) in Frischmilch (ungekochter Milch) zu entwickeln, das leicht automatisiert werden kann und das sich soxvohl für Feldtests (praktische Tests) auf den Bauernhöfen als auch für Bestimmungen im Labor von Molkereianlagen eignet. Ziel der Erfindung ist es ferner, eine automatische Vorrichtung anzugeben, mit deren Hilfe die somatischen Zellen (Soma- bzw. Körperzellen) in Milch bestimmt werden können. Die Bestimmung beruht auf der bekannten Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Messung von Adenosintriphosphat (ATP) aus Zellen (vgl. US-PS 3 745 090).
Erfindungsgemäß wird die Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Methode auf die selektive Bestimmung von somatischen Zellen in Frischmilch angewendet. Die Messung wird x\de folgt durchgeführt:
10 bis 100 ul, vorzugsweise 20 bis 50 μΐ Frischmilch (aufbewahrt zwischen 0. und -5 C, jedoch nicht langer als 36 Stünden) werden in eine Meß-Phiole einpipettiert. Es werden 10 bis 500 /il, vorzugsweise 50 bis 100 jul eines ein Nucleotid freisetzenden Reagens für socnatische Zellen (NRS, ein eingetragenes Warenzeichen der Firma Lumac System AG, Basel) (vgl. die vorläufige britische Patentanmeldung Nr. 22 992/77) zugegeben und geschüttelt. Die Phiole wird in ein Lumineszenz-Photometer eingesetzt und es werden 10 bis 1.000 μΐ,vorzugsweise 100 jLil, Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens in
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einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,0 und 8,2, vorzugsweise von 7,75, zugegeben, und es wird die durch die Probe erzeugte Lichtintensität gemessen. Die ATP-Konzentration oder die Anzahl der somatischen Zellen wird dann errechnet aus der Korrelation zwischen der gemessenen Probe und einem bekannten Standard.
Eine andere Meßmethode besteht darin, 20 bis 100 ul einer Milchprobe einer Küvette zuzusetzen, die 100 bis 500 ul einer Mischung von Luciferin-Luciferase in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,2, vorzugsweise von 7,75, und 0,1 % NRS-Reagens enthält. Nach dem Mischen der Probe mit dem Reagens ist die Mischung bereit für die Messung.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ATP selektiv aus somatischen Zellen freigesetzt, was natürlich wichtig ist, weil Frischmilch eine große Anzahl von normalen Milchbakterien enthalten kann, so daß die Freisetzung von ATP aus den Bakterien zu einem Fehler bei der Bestimmung der Anzahl der somatischen Zellen durch Leuchtkäfer-Biolumineszenz führen würde.
In der US-PS 3 745 090 sind andere Extraktionsverfahren für ATP beschrieben, diese stören aber entweder die Luciferin-Luciferase-Reaktion oder sie sind umständlich und schwer zu automatisieren.
Die bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen ATP-Ergebnisse korrelieren mit der Anzahl von Zellen,
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die mit einem elektronischen Teilchen-Counter ausgezählt worden sind, mit einem Korrelationskoeffizienten von 0,93 bis 0,97. Die Korrelation zu den CMT (California Mastitis Test) und dem Fluoreszenz-Zellen-Counter liegt ebenfalls zwischen 0,9 und 1,0 (vgl. Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung).
Die Bestimmung der somatischen Zellen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und unter Verwendung eines manuell betriebenen Lumineszenz-Photometers dauert 20 bis 40 Sekunden pro Probe, so daß das Verfahren einen hohen Durchsatz hat. Bei einem automatischen Instrument kann die Meßgeschwindigkeit bis zu 200 bis 500 Proben pro Stunde betragen. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der, daß es leicht auf dem Bauernhof mit einem tragbaren Meßgerät von den Landwirten selbst, von den Fahrern der Milchsammelbehälter-Lastwagen, von Tierärzten oder anderen mit der Hygiene von Milch oder dem Gesundheitszustand der Kühe befaßten Leuten durchgeführt werden kann. Die Messung ist so leicht, daß sie von jedermann ohne jede Übung durchgeführt und die Ergebnisse interpretiert werden können.
Die Vorrichtung zur Durchführung der Messung kann mit den verschiedensten Lumineszenzsystemen, beispielsweise durch Lumineszenzmessung von Peroxyd (ELO„) oder Superoxyden (0?) mit Luminol (3-Aminophthalhydrazid) von Flavin-tnononucleotid (FMN) oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid oder seinem phosphat in reduzierter Form (NADH oder NADPH) mit einer Photobakterium^Biolumineszenz und dergleichen 'in einem Biolumineszenz-Assay verwendet werden, vorzugsweise wird sie jedoch für die Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Biolumineszenz-Bestimmung von ATP9 beispielsweise die Bestimmung der Anzahl
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der somatischen Zellen in Frischmilch durch die ATP-Menge
in den Proben, oder durch Quantisierung eines anderen Organismus durch die ATP-Konzentration in den Proben verwendet.
Ein Beispiel für die Verwendung der Vorrichtung zur
Bestimmung der somatischen Zellen in Frischmilch wird nachfolgend näher beschrieben, wobei spezielle Reagentien verwendet werden, die ein langanhaltendes Lichtsignal ergeben, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung leicht aufgezeichnet werden kann:
Ein Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagens wird her-
gestelltj das 0,005 bis 0,02 Mol eines Mg -Salzes in einem Iris-, Glycylglycin , Mops- oder ähnlichen biochemischen
Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 bis 8,2, vorzugsweise jedoch LUMIT (Warenzeichen der Firma Lumac Systems AG in Hepes) -Puffer, der O9Ol Mol MgSO , 0,001 Versan -Chelat-Bildner
und 0,1% KRS (eingetragenes Warenzeichen der Firma Lumac
Systems AG) enthält, wonach O5,05 bis 1,0 Milliliter, vorzugsweise 0,1 bis Oj5 Milliliter einer transparenten Küvette zugesetzt werden«
10 bis 100 ul, vorzugsweise 50 iil, Frischmilch werden in die das Luciferin-Luciferase-HRS-Puffer-Reagens enthaltende Küvette einpipettiert und 10 bis 15 Sekunden lang gemischt. Die Küvette wird in die Reaktionskammer des Lumineszenz-Photometers eingesetzt und auf die Oberseite der Reaktionskammer wird eine Kappe aufgesetzt. Der Dunkelstrom an der Diode
wird mit dem Nulleinstellungs-Potentiometer auf Null eingestellt j die Kappe wird nach unten gedrückt und die Voltmeter-
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Ablesung nach dem Erreichen des Maximalwertes wird aufgezeichnet.
Der abgelesene Wert wird dann durch Vergleich des abgelesenen Wertes mit demjenigen eines bekannten Standards in den gewünschten Parameter umgewandelt oder das Instrument wird vor Durchführung der Messung der Probe mit einem bekannten Standard geeicht, so daß die abgelesenen Werte direkt die Anzahl der somatischen Zellen pro Milliliter angeben.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein einfaches, billiges Photometer, das sich für die Messung der Lumineszenz-Reaktion unter preiktischen Bedingungen (Feldbedingungen), wie z. B.· die Messung der somatischen Zellen in Milch, eignet. Das Photometer kann aber auch für die Messung der Aktivität eines Aktiv-Schlammes in Abwasserkläranlagen, der Biomasse von Wasserorganismen, der Biomasse von Erdbodenmikroben oder dergleichen, verwendet werden, wobei diese Messungen alle auf der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Bestimmung von ATP oder anderen Lumineszenz-Reaktionen, die lange genug (mehr als einige Sekunden) anhalten, um eine sichtbare Ablesung zu ermöglichen, beruhen.
Die Messung des durch Lumineszenz-Reaktionen, wie z. B. das I-euchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Biolumineszenz-System, erzeugtenLichts zur quantitativen Bestimmung von ATP wird mittels eines Photometers oder Photonen-Counters durchgeführt, Bei einem Photometer wird die Lichtintensität gemessen mit einem Detektor, wie z. B. einer Lichtveι stärkerröhre oder einer lichtempfindlichen Zelle, wie z. B, einer Silizium-
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ίο
oder Gallium-arsenit-Diode. Diese Detektoren wandeln die Lichtenergie in elektrischen Strom um, der unter Verwendung eines Analog- oder Digital-Voltmeters, eines Streifendiagrammschreibers oder eines Oszilloskops aufgezeichnet wird. In Photonen-Countemwird ein Lichtverstärker als Detektor verwendet und die Lichtintensität wird in Form von stark (auf das 4 g
/ 10 bis 10 -fache) verstärkten elektrischen Impulsen aufgezeichnet, die durch ein einzelnes Photon erzeugt werden, das auf die lichtempfindliche Kathode auftriffU
Das erfindungsgemäße Photometer wird durch das in der beiliegenden Zeichnung dargestellte Beispiel näher erläutert, Dabei zeigen:
Fig. 1 ein schematisch.es Diagramm der elektrischen Schaltung eines tragbaren Lumineszenz-Photometers und
Fig. 2 ein schematisches Diagramm der mechanischen Komponenten des Lumineszenz-Photometers zur Bestimmung der somatischen Zellen in Milch.
Das Instrument besteht im Prinzip aus einer Silizium-Photodiode, die in der Fig. 1 mit der Bezugsziffer (!) bezeichnet ist, vjelche die von der Probe (2) in einer Küvette(3,) emittierte Lichtintensität in einen elektrischen Strom umwandelt, der durch den Vorverstärker (4) verstärkt und von einem Analog-Voltmcter (5) in Form eines kontinuierlichen Signals aufgezeichnet wird.
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/ή
Der Aufbau des tragbaren Lumineszenz-Photometers ist in der Fig. 2 dargestellt. Die Probe (2) ist in einer transparenten Küvette (3) in deren lichtdichter Keaktionskammer (6) enthalten, die durch einen O-Ring (7) und eine Kappe (8), die aus einem inneren Pfropfen (9) besteht, der zum Herunterdrücken der Küvette (3) in der Weise verwendte wird, daß der Hebel (1O), der mit einem O-Ring (ll) einen lichtdichten Verschluß erzeugt, wenn die Kammer leer ist, nach unten gedrückt wird, um die Probe (2) vor dem Silizium-Dioden-Detektor zu senken für die Bestimmung der Lichtintensität der von der Probe in Gegenwart der Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Reagentien emittierten Biolumineszenz» Eine mit einem Gewinde versehene Kappe (12) dichtet die Reaktionskarnmer gegenüber dem Boden ab. Der aus der Diode (l) kommende elektrische Strom wird in dem Vorverstärker (4) und in dem Impulszähler-Kreislauf (13) verstärkt und von einem Analog-Voltmeter (5) angezeigt. Bevor die Messung des elektrischen Betriebsstromes mit dem Schalter (15) eingeschaltet wird, wird das Instrument manuell mit einem Potentiometer (16) auf Null gestellt und die Probe in einer Küvette wird in die Reaktionskammer eingeführt. Nachdem die Kappe (9) nach unten gedrückt worden ist, zeigt das Voltmeter (5) die Lichtintensität in Form eines Signals (die Intensität des einfallenden Lichtes zu dem gegebenen Zeitpunkt) an. Die Vorrichtung kann geeicht werden, um Werte anzuzeigen, welche direkt die Anzahl der Zellen oder die ATP-Konzentration oder irgend-ein anderes Substrat, das in den Lumineszenz-Systemen verwendet wird, angeben, durch Messung eines bekannten Standards und Einstellung des von dem Voltmeter abgelesenen Wertes, so daß dieser dem gemessenen Parameter entspricht, mittels eines einstellbaren verstärkenden Potentiometers (17).
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Claims (5)

  1. Anmelder: l) Seppo Kolehmainen 2) Veikko Tarkkanen Ganzenstraat 11 Breulsweg 1 Zolder / Belgien Wylre / Niederlande
    Patentansprüche
    Ii Verfahren zur Bestimmung der Anzahl der somatisehen Zellen in Milch, dadurch gekennzeichnet , daß man das in den somatischen Zellen enthaltene Adenosintriphosphat mittels der Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Biolumineszenz in einer Milchprobe bestimmt.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
    daß man die Milchprobe mit einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel behandelt, um aus den somatischen Zellen ATP selektiv freizusetzen.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die ATP-Konzentration in einem Lumineszenz-Photometer bestimmt nach der Zugabe von Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reagenz in einem Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,4 und 8,0 und einer Magnesium-Konzentration von 0,005 bis 0,02 Mol pro Liter„
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß man die ATP-Konzentration in die Anzahl der somatischen Zellen pro Milliliter umrechnet unter Anwendung eines Umwandlungsfaktors, der durch Messung eines be-
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    ORIGINAL INSPEGTEO
    kannten Standards bestimmt worden ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anzahl der somatischen Zellen auf dem Feld unter Verwendung eines tragbaren Photometer-Instrumentes mit Hilfe der ATP-Konzentration in einer Milchprobe bestimmt.
    9G98Q7/0757
DE19782831559 1977-07-19 1978-07-18 Verfahren zur bestimmung der somatischen zellen in milch mittels der leuchtkaefer-luciferin-luciferase-biolumineszenz unter labor- und praktischen bedingungen Withdrawn DE2831559A1 (de)

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