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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Detektion von nicht-fermentativen Bakterien, die in einer Probe
enthalten sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren
und eine Vorrichtung zur Detektion von fermentativen Bakterien und
nicht-fermentativen Bakterien, die in einer Probe enthalten sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur Bestimmung, ob die in einer Probe enthaltenen Bakterien fermentative
oder nicht-fermentative Bakterien sind. Die vorliegende Erfindung
betrifft auch ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung,
ob die hauptsächlichen
in einer Probe enthaltenen Bakterien fermentative oder nicht fermentative
Bakterien sind.
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2. Beschreibung des verwandten
Standes der Technik
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Bakterien
werden eingeteilt in fermentative Bakterien, welche ein saures Endprodukt
durch Abbau von Zucker produzieren und nicht-fermentative Bakterien,
welche nicht in der Lage sind, Zucker abzubauen.
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Als
Verfahren zur Detektion von fermentativen Bakterien kann ein Methyl-Rot-Reaktionstest
erwähnt werden.
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Wenn
Bakterien Zucker, der in einem Medium enthalten ist, abbauen, wird
ein saures Produkt produziert. In dem Methyl-Rot-Reaktionstest wird ein Methyl-Rot-Reagens
als pH-Indikator verwendet, wodurch die Ansäuerung des Mediums (d. h. eine
Absenkung des pHs des Mediums) detektiert wird durch eine Veränderung
der Farbe des hinzugefügten
pH-Indikators. Durch diese Veränderung
in der Farbe des Mediums kann man herausfinden, ob der Zucker in
dem Medium abgebaut worden ist oder nicht, wodurch man fermentative Bakterien
detektieren kann. Im Allgemeinen wird bei dem Klassifizieren von
Bakterien in fermentative Bakterien und nicht-fermentative Bakterien
der Methyl-Rot-Reaktionstest durchgeführt unter Verwendung eines
Mediums, welches rein kultivierte Bakterien enthält. Dann werden die Bakterien
eingeteilt in fermentative Bakterien und nicht-fermentative Bakterien
auf der Basis, ob fermentative Bakterien nachgewiesen worden sind
oder nicht.
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Das
oben erwähnte
Verfahren benötigt
jedoch das Kultivieren zur Untersuchung, ob die Bakterien Zucker
abbauen oder nicht, so dass es etwa zwei bis drei Tage benötigt, bevor
fermentative Bakterien nachgewiesen werden. Somit benötigt das
konventionelle Verfahren Kultivierungsarbeit, um fermentative Bakterien
zu detektieren. Solche Kultivierungsarbeit ist aufwendig und benötigt lange
Zeit.
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Als
Technik für
die automatische Analyse von Bakterien ohne Kultivierung der Bakterien
ist ein Verfahren, das in der Europäischen Patentveröffentlichung
Nr. 1136563 offenbart ist, bekannt. Nach diesem Verfahren wird,
durch Einwirkenlassen eines kationischen Tensids auf die Probe,
die die Bakterien enthält,
die Farbstoffdurchlässigkeit
der Bakterien verstärkt.
Dadurch wird die Färbbarkeit
der Bakterien erhöht.
Dann werden durch Durchführen
einer Fluoreszenzfärbebehandlung
und Detektieren der von den Bakterien ausgestrahlten Fluoreszenz
mit einem Durchflusszytometer die Bakterien in der Probe detektiert.
Unter Verwendung einer wie oben beschriebenen Technik kann man Bakterien
in einer Probe in einer vergleichsweise kurzen Zeitdauerautomatisch
detektieren. Man kann jedoch unter Verwendung eines solchen Verfahrens
die Bakterien in einer Probe nicht detektieren unter der weiteren
Klassifizierung der Bakterien in fermentative und nicht fermentative Bakterien.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur schnelleren und einfacheren Detektion von nicht-fermentativen
Bakterien im Vergleich zu herkömmlichen
Techniken zur Verfügung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren und eine Vorrichtung
zum einfacheren und schnelleren Nachweis von fermentativen und nicht-fermentativen
Bakterien im Vergleich zu konventionellen Techniken zur Verfügung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur schnelleren und einfacheren Bestimmung, ob die Bakterien, die
in einer Probe enthalten sind, fermentative oder nicht fermentative
Bakterien sind, im Vergleich zu herkömmlichen Techniken zur Verfügung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren und eine Vorrichtung
zur einfacheren und schnelleren Bestimmung, ob die in der Probe
hauptsächlich
enthaltenen Bakterien fermentative oder nicht-fermentative Bakterien
sind, im Vergleich zu herkömmlichen
Techniken zur Verfügung.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist
eine Ansicht, die die Konstruktion einer Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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2 ist
eine Abbildung, die eine Analytprobenvorbereitungsabschnitt der
Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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3 ist
eine Ansicht, die einen Messabschnitt der Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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4 ist
eine Ansicht, die einen Hüllflusszellenteil
der Bakterien-Alysiervorrichtung gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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5 ist
eine Ansicht, die die Beziehung zwischen einem Kontrollabschnitt
der Bakterien-Alysiervorrichtung und jedem Abschnitt der Vorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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6 ist
eine Ansicht, die den Fluss der Gesamtkontrolle der Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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7 ist
eine Ansicht, die den Analysierfluss in der Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt;
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8 ist
eine Modellansicht, die ein Beispiel eines zweidimensionalen Scattergramms,
das durch die Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, illustriert;
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9A bis 9D sind
Ansichten, die ein Beispiel eines zweidimensionalen Scattergramms,
das durch die Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, illustriert;
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10A bis 10C sind
Ansichten, die ein Beispiel eines zweidimensionalen Scattergramms,
das durch die Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, illustriert;
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11A bis 11D sind
Ansichten, die ein Beispiel eines zweidimensionalen Scattergramms,
das durch die Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, illustriert; und
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12 ist
eine Ansicht, die die Konstruktion einer Bakterien-Alysiervorrichtung
gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschreibt.
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Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
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Nachstehend
wird eine Bakterien-Alysiervorrichtung gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung beschrieben.
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1 ist
eine Ansicht, die eine Bakterien-Alysiervorrichtung 1 illustriert,
in welcher die äußere Erscheinung
der Vorrichtung in durchgezogenen Linien gezeigt wird, und die schematische
Konstruktion des Inneren der Vorrichtung in durchbrochenen Linien
gezeigt wird. Ein Flüssig-Kristall-Touchscreen 2 zur
Durchführung verschiedener
Eingaben und Anzeigen und Ausgabe der Messergebnisse, ein Probeneinsetzabschnitt
Deckel 3, ein Reagenseinsetzabschnitt Deckel 4,
und ein Startschalter 5 sind an der vorderen Oberfläche der
Bakterien-Alysiervorrichtung 1 angeordnet. Weiters ist
eine Kontrolleinheit 6, welche die Funktion der Vorrichtung und
den Analysiervorgang kontrolliert, angeordnet an der Oberseite des
Inneren der Bakterien-Alysiervorrichtung 1,
gezeigt in durchbrochenen Linien. Ein Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 zum
Vorbereiten einer Probenflüssigkeit
ist an der Vorderseite des unteren Teils angeordnet. Ein Messabschnitt 8 zum
Detektieren eines Signals aus der Probenflüssigkeit ist an der Rückseite
des unteren Teils angeordnet.
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2 ist
eine Ansicht, die den Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 illustriert.
Der Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 enthält einen Probeneinsetzabschnitt 9,
einen Reagens-Einsetzabschnitt 10, einen Färbeabschnitt 11,
eine Verteilungsvorrichtung 12, und eine Flüssigkeits-Transportvorrichtung 13.
Ein Benutzer öffnet
den zuvor erwähnten
Probeneinsetzabschnitt Deckel 3 von 1, um einen
Probenbehälter,
der eine Probe enthält,
in die Probeneinsetzabschnitt 9 einzusetzen. Der Benutzer öffnet auch
den Reagenseinsetzabschnitt Deckel 4 von 1,
um ein Mikroprobenröhrchen 14,
enthalend eine Färbeflüssigkeit
bzw. ein Mikroprobenröhrchen 15,
enthaltend eine Verdünnungsflüssigkeit,
in den Reagens-Einsetzabschnitt 10 einzusetzen.
Ein Mikroprobenröhrchen 16 wird
in den Färbeabschnitt 11 eingesetzt.
Des Weiteren wird die Probe gemischt mit der Färbeflüssigkeit und der Verdünnungsflüssigkeit
in dem Mikroprobenröhrchen 16 zum
Herstellen einer Analytprobe. Hier ist, obwohl dies in den Abbildungen
nicht dargestellt wird, die Färbeeinheit 11 ausgestattet
mit einem Temperaturregelmechanismus zum Halten der Lösung in
dem Mikroprobenröhrchen 16 bei
einer konstanten Temperatur, und einem Rührmechanismus zum Rühren der
Lösung
in dem Mikroprobenröhrchen 16.
Eine Verteilungsvorrichtung 12 ist adaptiert, um eine vorherbestimmte
Menge Flüssigkeit
durch die Spitze davon aufzusaugen und auszustoßen, und die Verteilvorrichtung 12 ist
ebenso adaptiert, um aufwärts,
abwärts,
nach rechts, links, vorne und hinten durch eine Antriebseinheit
(nicht dargestellt) bewegbar zu sein,. Die Flüssigkeits-Transporteinheit 13 ist
zusammengesetzt aus einem Saugrohr 17 zum Saugen einer Analytprobe,
einer Flüssigkeits-Transportröhre 18 zum
Transportieren der Analytprobe, welche durch das Saugröhrchen 17 aufgesaugt
wurde, zum Messabschnitt 8, der in 3 dargestellt
wird, und einer Pumpe 19 zum Saugen der Analytprobe und
Transportieren der Analytprobe zum Messabschnitt 8. Das
Saugröhrchen 17 wird
in das Mikroteströhrchen 16 eingeführt, welches
in Färbeabschnitt 11 eingesetzt
ist, um eine vorherbestimmte Menge der Analytprobe aufzusaugen.
Die aufgesaugte Analytprobe wird zum Messabschnitt 8 durch
die Flüssigkeits-Transportröhre 18 transportiert.
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3 ist
eine Ansicht, die den Messabschnitt 8 beschreibt. Der Messabschnitt 8 ist
ausgestattet mit einer Umhüllungs-Durchflusszelle 20,
eine Laserlichtquelle 21, eine Kondensierlinse 22,
Sammellinsen 23 und 24, Nadellöchern 25 und 26,
einem Filter 27, einer Fotodiode 28, und einer
Fotoverstärkerröhre 29.
Die Umhüllungsdurchflusszelle 20 dient
dazu, die Analytprobe, die in dem zuvor erwähnten Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 von 2 vorbereitet
wurde, hindurchfließen
zu lassen. Bezugnehmend auf 4 ist die
Umhüllungsdurchflusszelle 20 auch
ausgestattet mit einer Probendüse 30 zum
Strömen
der Analytproben-Flüssigkeit
nach oben in Richtung eines engen Lochabschnitts 33, einem
Hüllflüssigkeits-Einlass 31,
und einem Flüssigkeits-Auslass 32.
Sammellinsen 23 und 24 sammeln optische Informationen,
wie vorwärts
gestreutes Licht oder seitwärts-Fluoreszenzlicht,
das von jedem Teilchen in der Probe erhalten wird, welches vom Laserstrahl
getroffen wurde. Die Photodiode 28 empfängt und wandelt vorwärts gestreutes
Licht photoelektrisch um in ein elektrisches Ausgabesignal. Die
Fotoverstärkerröhre 29 empfängt und
wandelt seitwärts
Fluoreszenzlicht fotoelektrisch um in ein elektrisches Ausgabesignal.
Die Ausgabesignale werden jeweils zum Kontrollabschnitt 6 gesandt.
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5 ist
eine Ansicht, die Konstruktionen des Kontrollabschnittes 6 illustriert
sowie die Beziehung zwischen dem Kontrollabschnitt 6 und
jedem anderen Abschnitt der Vorrichtung.
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Der
Kontrollabschnitt 6 umfasst einen Mikrocomputer mit einer
zentralen Prozessiereinheit (CPU) und einer Speichervorrichtung,
wie ROM oder RAM, und einer Schaltung zum Verarbeiten der Signale,
die von dem Messabschnitt 8 geschickt wurden. Der Kontrollabschnitt 6 funktioniert
als Speicherabschnitt 34, ein Analysierabschnitt 35,
und ein Funktions-Kontrollabschnitt 36. Der Speicherabschnitt 34 speichert
Analyseprogramme zum Analysieren der Signale, die von den Teilchen
in der Probe erhalten wurden, und Kontrollprogramme zum Kontrollieren
der Funktionen jedes Teils der Vorrichtung. Des Weiteren speichert
der Speicherabschnitt 34 Daten der Signale, welche durch
den Messabschnitt 8 detektiert wurden und die Ergebnisse
der Verarbeitung durch die Analyseprogramme. Der Analyseabschnitt 35 analysiert
die Signale, die durch den Messabschnitt 8 detektiert wurden
entsprechend den Analyseprogrammen und erzeugt Daten bezogen auf
die Bakterien, die in der Analytproben-Flüssigkeit enthalten sind. Die
im Analyseabschnitt 35 erzeugten Daten werden auf dem Flüssigkristall-Touchscreen 2 ausgegeben.
Der Funktions-Kontrollabschnitt 36 kontrolliert
die Funktion jedes Abschnittes der Vorrichtung entsprechend den
Kontrollprogrammen, welche im Speicherabschnitt 34 gespeichert
sind.
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Nachfolgend
wird die Funktion der Vorrichtung im Detail beschrieben.
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Zunächst setzt
der Benutzer eine Probe und Reagentien zur Messung an die vorbestimmten
Positionen in dem Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 ein.
Die Probe kann eingesetzt werden in den Probeneinsetzabschnitt 9 des
erwähnten
Analytproben-Vorbereitungsabschnitts 7 von 2 durch Öffnen des
erwähnten
Probeneinsetzabschnitts Deckel 3 von 1.
Des Weiteren können
bezüglich
der Reagentien wie der Färbeflüssigkeit
und der Verdünnungsflüssigkeit
das Mikroteströhrchen 14,
enthaltend die Färbeflüssigkeit,
und Mikroteströhrchen 15,
enthaltend die Verdünnungsflüssigkeit,
jeweils in den Reagenseinsetzabschnitt 10 des Analytproben-Vorbereitungsabschnitts 7 durch Öffnen des
Reagenseinsetzabschnitts Deckels 4 eingesetzt werden.
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Flüssigkeit,
die Bakterien enthält,
wird als Probe verwendet. Z. B. kann eine Bakterienflüssigkeit,
erhalten durch Einsammeln einer Bakterienkolonie und Suspendieren
der Bakterien in eine Flüssigkeit,
Urin oder Blut enthaltend Bakterien, oder dergleichen, als Probe
verwendet werden.
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Die
Färbeflüssigkeit
enthält
einen Polymethin-artigen Fluoreszenzfarbstoff, dargestellt durch
die folgende Strukturformel. Dieser Farbstoff hat die Eigenschaft,
sich spezifisch an Nucleinsäuren
von Bakterien zu binden, so dass eine Färbeflüssigkeit, die diesen Farbstoff
enthält,
spezifisch Bakterien färben
kann.
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Die
Verdünnungsflüssigkeit
kann die folgende Zusammensetzung aufweisen. Reagenzzusammensetzung
(Verdünnungsflüssigkeit)
| Zitronensäure | 100
mM |
| Natriumsulfat | 90
mM |
| Amidosulfonsäure | 100
mM |
| NaOH | die
Menge, die pH 1,5 ergibt |
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Wenn
die Probe und die Reagenzien in dieser Weise eingesetzt werden und
der Startknopf 5 gedrückt wird,
wird die Gesamtkontrolle gestartet. 6 ist ein
Flussdiagramm, das den Fluss der Gesamtkontrolle durch die Kontrollprogramme
zeigt. Wenn der Startknopf gedrückt
wird, werden die Schritte S1 (Analytproben-Vorbereitung), S2 (Messung)
und S3 (Analyse) sukzessive ausgeführt. Der Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7,
Messabschnitt 8, und Analyseabschnitt 35 werden
durch Kontrollprogramme kontrolliert, wodurch eine Serie von Funktionen
automatisch ausgeführt
wird. Die oben erwähnten
Schritte S1, S2 und S3 werden nachstehend beschrieben.
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S1 (Analytproben-Vorbereitung)
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Die
Funktion des Analytproben-Vorbereitungsabschnitts 7 bei
der Analytproben-Vorbereitung wird in Bezug auf 2 beschrieben.
Zunächst
saugt die Verteilungsvorrichtung 12 eine Probe aus einem
Probenbehälter,
der in dem Probeneinsetzabschnitt 9 eingesetzt ist, und
stößt 50 μl in das
Mikroteströhrchen 16,
das in dem Färbeabschnitt 11 eingesetzt
ist, aus. Als nächstes
saugt die Verteilungs-Vorrichtung 12 eine
Verdünnungsflüssigkeit
aus dem Mikroteströhrchen 15,
welches in den Reagens-Einsetzabschnitt 10 eingesetzt
ist, und stößt 340 μl in das
Mikroteströhrchen 16,
welches in dem Färbeabschnitt 11 eingesetzt
ist, aus. Des Weiteren saugt die Verteilungsvorrichtung 12 eine
Färbeflüssigkeit
aus dem Mikroteströhrchen 14,
welches in den Reagens-Einsetzabschnitt 10 eingesetzt
ist, und stößt 10 μl in das
Mikroteströhrchen 16,
welches in den Färbeabschnitt 11 eingesetzt
ist, aus. Danach rührt
der Färbeabschnitt 11 die
Mischung für
30 Sekunden, während das
Mikroteströhrchen 16 bei
einer Temperatur von 42°C
gehalten wird. Dies bereitet eine Analytprobe im Mikroteströhrchen 16 vor.
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In
der oben beschriebenen Vorbereitung einer Analytprobe wird die Probe
unter sauren Bedingungen prozessiert durch Verwendung einer sauren
Verdünnungsflüssigkeit,
und die Bakterien in der Probe werden gefärbt. Fermentative Bakterien
produzieren ein saures Produkt bei dem Abbau von Zucker, wie bei
der Beschreibung des verwandten Standes der Technik beschrieben
wurde. Aus diesem Grund können
fermentative Bakterien selbst unter sauren Bedingungen überleben,
in welchen es Bakterien im Allgemeinen schwierig finden zu leben.
Auf der anderen Seite sterben nicht-fermentative Bakterien ab, oder
erleiden Schäden
an ihren Zellmembranen oder Zellwänden unter den sauren Bedingungen.
Daher erleiden, wenn eine Probe unter sauren Bedingungen behandelt
wird, nicht-fermentative Bakterien Schäden an ihren Zellmembranen
oder Zellwänden,
so dass die Farbstoffdurchlässigkeit
erhöht
wird. Dies ermöglicht
es, den Substanzen in den Zellen der nicht-fermentativen Bakterien
effizient an die Farbstoffe gebunden zu werden. Im Ergebnis werden nicht-fermentative
Bakterien einen höheren
Grad an Färbbarkeit
aufweisen als fermentative Bakterien. In dieser Ausführungsform
wird Fluoreszenzfärbung
durchgeführt,
so dass durch Detektieren von Fluoreszenz jedes Bakterium in der
Probe fermentative Bakterien und nicht-fermentative Bakterien einfach
unterschieden werden können
durch Unterschiede der Fluoreszenzintensität. In anderen Worten ist die
Fluoreszenzintensität
die von nicht-fermentativen Bakterien erhalten wird, höher als
die Fluoreszenzintensität,
die von fermentativen Bakterien erhalten wird. Hier ist die saure
Bedingung, die oben gezeigt wurde, vorzugsweise pH 1,0 bis 3,0,
am bevorzugtesten 1,0 bis 2,0.
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Wenn
die Analytprobe vorbereitet wurde, wird die Analytprobe aus dem
Mikroteströhrchen 16 des
Färbeabschnitts 11 durch
die Flüssigkeits-Transportvorrichtung 13 gesaugt,
und wird zur Umhüllungsdurchflusszelle 20 des
Messabschnittes 8 geschickt.
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S2 (Messung)
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Die
Funktion des Messabschnittes 8 bei der Messung wird in
Bezug auf 3 und 4 beschrieben werden.
Die in dem Analytproben-Vorbereitungsabschnitt 7 vorbereitete
Analytprobe wird zu der Umhüllungsdurchflusszelle 20 geleitet,
und die Probenflüssigkeit
wird durch die Probendüse 30 in
die Umhüllungsdurchflusszelle
ausgestoßen.
Gleichzeitig damit wird eine Hüllflüssigkeit
ausgestoßen
in die Umhüllungsdurchflusszelle
durch den Hüllflüssigkeits-Einlass 31.
Dadurch wird die Probenflüssigkeit
umgeben durch die Hüllflüssigkeit
innerhalb der Hüllflüssigkeits-Durchflusszelle und
wird weiter verengt durch den engen Lochabschnitt 33 zu
fließen.
Durch Verengen des Flusses der Probenflüssigkeit auf das Maß der Teilchengröße werden
die in der Probenflüssigkeit
enthaltenen Teilchen in einer Linie angeordnet, um durch den engen
Lochabschnitt zu fließen.
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Ein
Laserstrahl, der von der Laserlichtquelle 21 ausgestoßen wird,
wird durch die Kondensierlinse 22 verengt und auf den Probenfluss,
welcher durch den engen Lochabschnitt 33 fließt, gestrahlt.
Das vorwärts gestreute
Licht, das von jedem Teilchen in der Probe ausgestrahlt wird, welches
vom Laserstrahl erfasst wurde, wird durch die Sammellinse 23 gesammelt,
um durch die Lochblende 25 hindurchzutreten. Das Seiten-Fluoreszenzlicht
wird durch die Sammellinse 24 gesammelt, um durch den Filter 27 und
die Lochblende 26 hindurchzutreten. Dann wird das vorwärts gestreute
Licht aufgefangen und fotoelektrisch umgewandelt durch die Fotodiode 28,
und das Seiten-Fluoreszenzlicht wird aufgefangen und fotoelektrisch
umgewandelt durch die Fotoverstärkerröhre 29,
und jeweils ausgegeben als vorwärts
gestreutes Lichtsignal und Seiten-Fluoreszenz-Lichtsignal. Jedes
Signal wird zum Kontrollabschnitt 6 geschickt und wird
in dem Speicherabschnitt 34 gespeichert als Daten individueller
Teilchen.
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S3 (Analyse)
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Wenn
ein vorwärts
gestreutes Lichtsignal und ein Seiten-Fluoreszenz-Lichtsignal detektiert werden durch
die Messung von S2, analysiert der Analyseabschnitt 35 dann
jedes Signal entsprechend den Analyseprogrammen. Die Funktion der
Analyseprogramme in S3 wird beschrieben in Bezug auf das Flussdiagramm von 7.
Die Schritte in dem Flussdiagramm sind wie folgt.
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S301:
Die Daten des vorwärts
gestreuten Lichtsignals und des Seiten-Fluoreszenz-Lichtsignals,
von der Probenflüssigkeit
detektiert, werden aus dem Speicherabschnitt 34 ausgelesen.
Dann geht der Vorgang zu S302.
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S302:
Die vorwärts
gestreute Lichtintensität
(Fsc) und die Seiten-Fluoreszenz-Lichtintensität (FL) werden berechnet auf
der Basis des vorwärts
gestreuten Lichtsignals und des Seiten-Fluoreszenz-Lichtsignals, erhalten
von jedem Teilchen in der Probenflüssigkeit. Anschließend geht
das Verfahren zu S303.
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S303:
Ein Scattergramm wird hergestellt unter Verwendung des Fsc und FL
jedes Teilchens, welche in S302 berechnet wurden, als Parameter.
Dies wird wie folgt durchgeführt.
Zunächst
werden zweidimensionale Koordinaten entwickelt unter Verwendung
von Fsc und FL als Achsen, und dann wird die Koordinatenposition,
die jedem Teilchen in der Analytprobe entspricht, bestimmt auf der
Basis von Fsc und FL, welche in S302 berechnet wurden. In dieser
Weise wird ein Scattergramm hergestellt unter Verwendung von Fsc
und FL als Parameter. Dann folgt in dem Verfahren S304.
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S304:
Ein Bereich, in welchem nicht-fermentative Bakterien auftreten (dieser
wird bezeichnet als NF-Bereich) und ein Bereich, in welchem fermentative
Bakterien auftreten (dieser wird bezeichnet als F-Bereich) werden
auf dem hergestellten Scattergramm gesetzt. Die Art und Weise, in
welcher diese Bereiche auf dem Scattergramm gesetzt werden, ist
in 8 dargestellt. Der NF-Bereich und der F-Bereich,
die hier gesetzt werden, sind zuvor empirisch bestimmt durch Messen
von Analytproben, enthaltend die Bakterien, welche als nichtfermentative
Bakterien bestätigt
sind und Bakterien, die als fermentative Bakterien bestätigt sind.
Dies ermöglicht,
dass, wenn die hauptsächlichen
in der Probe enthaltenen Bakterien nicht-fermentative Bakterien sind,
die Punkte, die den nichtfermentativen Bakterien in der Probe entsprechen,
einen Cluster bilden und in dem NF-Bereich aufscheinen. Wenn auf
der anderen Seite die in der Probe hauptsächlich enthaltenen Bakterien
fermentative Bakterien sind, bilden die Punkte, die den fermentativen
Bakterien in der Probe entsprechen, einen Cluster und treten im
F-Bereich auf. Hier werden die Daten der Koordinaten in dem NF-Bereich
und dem F-Bereich, welche in dem Speicherabschnitt 34 gespeichert
sind, ausgelesen durch die Analyseprogramme in S304 und auf das
Scattergramm angewandt. Dann folgt in dem Verfahren S305.
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S305:
Die Anzahl der Punkte in dem NF-Bereich und dem F-Bereich wird gezählt. Dann
geht das Verfahren zu S306.
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S306:
Die Anzahl der Punkte, die in dem NF-Bereich auftreten und die Anzahl
der Punkte, die in dem F-Bereich auftreten, wird verglichen, um
zu bestimmen, in welcher der Regionen die Cluster der Punkte auftreten.
Zunächst
wird unter der Annahme, dass die Anzahl der Punkte, die in dem NF-Bereich
auftreten, NF ist und die Anzahl der Punkte, die in dem F-Bereich
auftreten, F ist, ein Wert A bestimmt durch die folgende Berechnungsformel: NF/(NF + F) = A
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Wenn
der Wert A, der durch die obige Formel berechnet wurde, größer oder
gleich einem vorherbestimmten Wert ist (nämlich falls die Kolonie der
Punkte in dem NF-Bereich auftritt), dann geht das Verfahren zu S307.
Wenn auf der anderen Seite der Wert A kleiner ist als der vorherbestimmte
Wert (nämlich
wenn die Kolonie der Punkte nicht in dem NF-Bereich auftritt), dann
geht das Verfahren zu S308.
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S307:
Das nicht-fermentative Bakterienzeichen X wird auf „1" gesetzt. Das Verfahren
geht dann zu S309 weiter.
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S308:
Das nicht-fermentative Bakterienzeichen X wird auf „0" gesetzt. Das Verfahren
geht dann zu S309 weiter.
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S309:
In S309 wird ein Verfahren zur Bestimmung, ob das nicht-fermentative
Bakterienzeichen X „1" ist oder nicht,
ausgeführt.
Wenn das nicht-fermentative Bakterienzeichen X „1" ist, dann geht das Verfahren zu S310,
wohingegen, wenn das nicht-fermentative Bakterienzeichen X nicht „1" ist, das Verfahren
zu S311 geht.
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S310:
Das in S303 und S304 hergestellte Scattergramm, die Zählergebnisse
der Anzahl von Punkten in dem NF-Bereich und dem F-Bereich, die
in S305 gezählt
wurden, und eine Nachricht, die besagt, dass „die hauptsächlichen
in der Probe enthaltenen Bakterien sind nicht-fermentative Bakterien", werden auf dem
Flüssigkristall-Touchscreen 2 angezeigt.
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S311:
Das in S303 und S304 hergestellt Scattergramm, die Zählergebnisse
der Anzahl der Punkte in dem NF-Bereich und dem F-Bereich, die in
S305 gezählt
wurden, und eine Nachricht, die besagt, dass „die hauptsächlich in
der Probe enthaltenen Bakterien sind fermentative Bakterien", werden auf dem
Flüssigkristall-Touchscreen 2 angezeigt.
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Das
Obige ist das Flussdiagramm der Messung dieser Ausführungsform.
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Wie
oben beschrieben, ist 8 eine Ansicht, um das Scattergramm,
das in S303 und S304 hergestellt wird, zu beschreiben. In dem Scattergramm
stellt die Abszisse FL dar, und die Ordinate stellt Fsc dar. Auf die
Abszisse hat die rechte Seite einen größeren Wert von FL. Auf der
Ordinate hat die obere Seite einen größeren Wert von Fsc. Die nichtfermentativen
Bakterien treten innerhalb des NF-Bereichs auf, welcher in dem Scattergramm
gesetzt wurde. Auf der anderen Seite treten die fermentativen Bakterien
innerhalb des F-Bereichs auf, welcher auf dem Scattergramm gesetzt
wurde. Hier haben, wie oben beschrieben, die nicht-fermentativen
Bakterien einen höheren
Wert an Fluoreszenzfärbbarkeit
als die fermentativen Bakterien. Daher ist die Fluoreszenzintensität, die von
den nicht-fermentativen Bakterien detektiert wird, höher als
die Fluoreszenzintensität,
die von den fermentativen Bakterien detektiert wird. Aus diesem
Grund wird der NF-Bereich an einer Position gesetzt, welcher höherer Fluoreszenzintensität entspricht
als der F-Bereich.
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Nachfolgend
wird ein Beispiel der Analyseergebnisse einer Probe unter Verwendung
der Bakterien-Analysevorrichtung 1 gezeigt werden.
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Messbeispiel 1
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Eine
Probe wurde wie folgt vorbereitet. Zunächst wurden Bakterien in einem
Agarosemedium kultiviert, um eine Bakterienkolonie zu bilden. Dann
wurde die vorgesehene Art von Bakterien von der Kolonie gesammelt,
und suspendiert in ein Herzinfusions-Flüssigmedium, so dass die Anzahl
der Bakterien eine Konzentration von etwa 105/ml
beträgt.
In diesem Beispiel wurde Bakterienflüssigkeit für jede von insgesamt 7 Arten von
Bakterien hergestellt, und als Probe verwendet. Unter diesen 7 Arten
von Bakterien sind 4 Arten von fermentativen Bakterien, umfassend
E. coli, K. pneumoniae, L. achidophilus und S. aureus. Die nichtfermentativen
Bakterien sind 3 Arten, umfassend P. aeruginosa, A. baumannii und
E. faecalis. Das Scattergramm, das erhalten wurde durch die Analyse
der Bakterienflüssigkeit
jeder der Bakterien, die durch das vorstehende Verfahren hergestellt
wurde, unter Verwendung der Bakterien-Analysiervorrichtung 1,
wird in 9 und 10 gezeigt.
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9A bis 9D sind
Scattergramme, erhalten unter Verwendung der Bakterienflüssigkeit
von fermentativen Bakterien als Probe. 9A ein
Scattergramm, erhalten durch Analysieren der Bakterienflüssigkeit
von E. coli. 9B zeigt ein Scattergramm, erhalten
durch Analysieren der Bakterienflüssigkeit von K. pneumoniae. 9C zeigt
ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren der Bakterienflüssigkeit
von S. aureus. 9D zeigt ein Scattergramm, erhalten
durch Analysieren der Bakterienflüssigkeit von L. achidophilus. In 9A, 9B, 9C und 9D wird
ein Cluster von Punkten in dem F-Bereich gesehen, wo fermentative
Bakterien auftreten.
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10A bis 10C sind
Scattergramme, erhalten unter Verwendung der Bakterienflüssigkeit
der nicht-fermentativen Bakterien als Proben. 10A zeigt ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren
der Bakterienflüssigkeit
von P. aeruginosa. 10B zeigt ein Scattergramm,
erhalten durch Analysieren der Bakterienflüssigkeit von A. baumannii. 10C zeigt ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren
der Bakterienflüssigkeit
von E. faecalis. In 10A, 10B und 10C ist ein Cluster von Punkten in dem NF-Bereich zu
sehen, wo nicht-fermentative Bakterien auftreten.
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Durch 9 und 10 wird
bestätigt,
dass die Cluster der nicht-fermentativen Bakterien in dem NF-Bereich
auftreten, wo nicht-fermentative Bakterien auftreten, und die Cluster
der fermentativen Bakterien in dem F-Bereich auftreten, wo fermentative
Bakterien auftreten. Daher können,
da die Positionen des Auftretens der fermentativen Bakterien und
nicht-fermentativen Bakterien auf dem Scattergramm sich erheblich
unterscheiden, die fermentativen Bakterien leicht von den nicht-fermentativen
Bakterien unterschieden werden.
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Der
Methyl-Rot-Reaktionstest, der als Stand der Technik in der obigen
Beschreibung gezeigt wurde, bedarf der Kultivierung zur Untersuchung,
ob die Bakterien Zucker abbauen oder nicht, um fermentative Bakterien
nachzuweisen. Aus diesem Grund benötigt er zwei bis drei Tage,
bevor fermentative Bakterien detektiert werden. Im Gegensatz eliminiert
die Bakterien-Analysiervorrichtung 1 die Notwendigkeit
der Kultivierung, um zu untersuchen, ob die Bakterien Zucker abbauen
oder nicht. Daher kann unter Verwendung der Bakterien-Analysiervorrichtung 1 die
vorbereitete Bakterienflüssigkeit
als Probe zur Messung verwendet werden, und die Ergebnisse können sofort
erhalten werden.
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Als
nächstes
wird ein Beispiel der Ergebnisse, erhalten durch Analysieren von
Urin als Probe, gesammelt von einem Patienten, unter Verwendung
der Bakterien-Analysiervorrichtung 1 beschrieben
werden.
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Messbeispiel 2
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Die
verwendeten Proben waren 4 Proben A bis D. Probe A ist Urin eines
Menschen, enthaltend E. coli (fermentatives Bakterium), Probe B
ist Urin eines Menschen, enthaltend S. aureus (fermentatives Bakterium), Probe
C ist Urin eines Menschen, enthaltend E. faecalis (nicht-fermentative
Bakterien), und Probe D ist Urin eines Menschen, enthaltend P. aeruginosa
(nicht-fermentative Bakterien).
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Die
Scattergramme, die erhalten wurden durch Analysieren der oben beschriebenen
4 Proben A bis D unter Verwendung der Bakterien-Analysiervorrichtung 1,
werden in 11A bis D gezeigt. 11A zeigt ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren
der Probe A. 11B zeigt ein Scattergramm,
erhalten durch Analysieren der Probe B. 11C zeigt
ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren der Probe C.
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11D zeigt ein Scattergramm, erhalten durch Analysieren
der Probe D. Bezüglich
der Proben A und B treten die Cluster von Punkten in allen Fällen in
dem F-Bereich auf, wo fermentative Bakterien auftreten. Auf der
anderen Seite, bezüglich
Proben C und D, treten die Cluster der Punkte in allen Fällen in
dem NF-Bereich auf, wo nicht-fermentative Bakterien auftreten.
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Die
Ergebnisse der Bestimmung, ob die hauptsächlichen Bakterien, die in
einer Probe enthalten sind, fermentative Bakterien oder nicht-fermentative
Bakterien sind, unter Verwendung der Bakterien-Analysiervorrichtung
1 auf
der Basis der Auftrittsregion von Clustern von Punkten in einem
Scattergramm, wird in der folgenden Tabelle gezeigt. Tabelle
1
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Wie
in Tabelle 1 gezeigt, wurden die hauptsächlich in dem Urin der Proben
A und B enthaltenen Bakterien als fermentative Bakterien bestimmt,
und die hauptsächlich
in dem Urin der Proben C und D enthaltenen Bakterien als nichtfermentative
Bakterien bestimmt. Darüber
hinaus stimmt in all diesen Fällen
der Proben A, B, C und D das Ergebnis der Bestimmung der Bakterienart
auf Basis des Analyseergebnisses mit der Art der Bakterien, welche
tatsächlich
in der Probe enthalten sind, überein.
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In
der oben beschriebenen Ausführungsform
können
die fermentativen Bakterien und die nicht-fermentativen Bakterien,
die in einer Probe enthalten sind, rasch detektiert werden, um zu
bestimmen, ob die hauptsächlich
in der Probe enthaltenen Bakterien fermentative Bakterien oder nicht-fermentative
Bakterien sind. Der Methyl-Rot-Reaktionstest,
der als Stand der Technik in der obigen Beschreibung gezeigt wurde,
bedarf der Kultivierung zur Untersuchung, ob die Bakterien Zucker
abbauen oder nicht, so dass es zwei oder drei Tage benötigt, bevor
fermentative Bakterien detektiert werden. Im Gegensatz eliminiert
die vorliegende Ausführungsform
die Notwendigkeit zur Kultivierung, um zu untersuchen, ob die Bakterien
Zucker abbauen oder nicht, so dass die hergestellte Bakterienflüssigkeit
als Messprobe verwendet werden kann und die Ergebnisse sofort erhalten
werden können.
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Des
Weiteren können
in der oben beschriebenen Ausführungsform
Blut oder Urin, erhalten von einem Patienten als Messprobe, so wie
sie sind, verwendet werden, ohne Herstellung einer Bakterienflüssigkeit
wie oben beschrieben. Dies ermöglicht,
dass man schnell bestimmen kann, ob die Hauptart der Bakterien,
die in einer Probe enthalten sind, fermentative Bakterien oder nicht-fermentative
Bakterien sind.
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Hier
ist die Bakterien-Analysiervorrichtung 1 der oben beschriebenen
Ausführungsform
eine Vorrichtung, in welcher alle Komponenten integriert sind, die
vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Konstruktion limitiert.
Z. B. kann sie eine Vorrichtung, wie in 12 gezeigt,
sein, in welcher ein Teil der Bestandteile separat zur Verfügung gestellt
wird. Eine Bakterien-Analysiervorrichtung 37 von 12 ist
hergestellt aus einem Hauptkörper
der Messvorrichtung 38 und einem PC 39. Des Weiteren
hat, obwohl in der Abbildung nicht gezeigt, der Messvorrichtung-Hauptkörper 38 einen
Startknopf, einen Analytproben-Vorbereitungsabschnitt zum
Vorbereiten einer Probenflüssigkeit,
einen Messabschnitt zum Detektieren von Signalen aus der Probenflüssigkeit,
und einen ersten Kontrollabschnitt, welcher das Funktionieren der
Vorrichtung kontrolliert. Der erste Kontrollabschnitt hat einen
ersten Speicherabschnitt, welcher Kontrollprogramme zum Kontrollieren
der Funktion von jeder Vorrichtung speichert und einen Funktions-Kontrollabschnitt
zum Kontrollieren der Funktion von jeder Vorrichtung gemäß den Kontrollprogrammen,
welche in dem ersten Speicherabschnitt gespeichert sind. Der PC 39 hat
einen Ausgabeschirm 40 zum Ausgeben und Anzeigen der Messergebnisse,
einen Eingabeabschnitt 41 zum Durchführen verschiedener Eingaben,
und einen zweiten Kontrollabschnitt 42, welcher einen Analysevorgang
kontrolliert. Der zweite Kontrollabschnitt 42 hat einen
zweiten Speicherabschnitt zum Speichern der Analyseprogramme und
der Ergebnisse des Prozessierens durch die Analyseprogramme und
einen Analyseabschnitt zum Durchführen der Analyse auf Basis
der Daten, die erhalten wurden durch die Messung. Der Messvorrichtungs-Hauptkörper 38 und
PC 39 von 12 sind über eine Verbindungsvorrichtung
verbunden. Die Funktion von jedem Abschnitt in dem Messvorrichtungs-Hauptkörper 38 wird
gemäß des ersten
Kontrollabschnittes des Messvorrichtungs-Hauptkörpers 38 kontrolliert.
Die Messdaten, die im Messvorrichtungs-Hauptkörper 38 erhalten wurden,
werden in dem zweiten Speicherabschnitt des PC 39 gespeichert
und durch den Analyseabschnitt analysiert.
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Des
Weiteren wird in der Analyse (S3) der Bakterien-Analysevorrichtung 1 der oben
beschriebenen Ausführungsform
der Bereich (F-Bereich), wo die Punkte, welche fermentativen Bakterien
entsprechen, auftreten, und der Bereich (NF-Bereich), wo die Punkte
entsprechend den nichtfermentativen Bakterien auftreten, beide auf
dem Scattergramm gesetzt; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht
darauf limitiert. Z. B. kann man auf dem Scattergramm nur den Bereich
(NF-Bereich), wo die Punkte, die den nichtfermentativen Bakterien
entsprechen, auftreten, setzen. In diesem Fall werden die nicht-fermentativen
Bakterien, die in einer Probe enthalten sind, detektiert durch Bestimmen,
ob die Punkte in dem NF-Bereich auftreten, welche auf dem Scattergramm
gesetzt wurde.
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Des
Weiteren wird in der Analyse (S3) der Bakterien-Analysiervorrichtung 1 der
oben beschriebenen Ausführungsform
bestimmt, ob die hauptsächlich
in einer Probe enthaltenen Bakterien fermentative oder nicht-fermentative
Bakterien sind; jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht darauf
alleine limitiert. Z. B. können
in dem Fall der Analyse einer „Probe
enthaltend nur eine Art von Bakterien", wie in Messbeispiel 1 verwendet, die
Bakterien der Probe klassifiziert werden in entweder fermentative
oder nichtfermentative Bakterien, da es klar ist, dass die Bakterien,
die in der Probe enthalten sind, nur von einer Art sind. Daher kann
in diesem Fall in der Analyse (S3) bestimmt werden, ob die Art der
Bakterien in der Probe fermentative oder nicht-fermentative Bakterien
sind.
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Zusätzlich kann
des Weiteren in der Analyse (S3) der Bakterien-Analysiervorrichtung 1 der
oben beschriebenen Ausführungsform
die Anzahl von fermentativen Bakterien und die Anzahl der nicht-fermentativen Bakterien,
die in einer Probe enthalten sind, berechnet werden. Auf dem Scattergramm
erscheinen die Punkte, die den fermentativen Bakterien entsprechen,
in dem F-Bereich, und die Punkte, die nichtfermentativen Bakterien
entsprechen, in dem NF-Bereich. Dies erlaubt, dass die Anzahl der
fermentativen Bakterien und die Anzahl der nicht-fermentativen Bakterien,
die in der Probe enthalten sind, berechnet werden auf Basis der
Anzahl der Punkte, die in der F-Region bzw. der NF-Region auftreten.
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Des
Weiteren kann in dem Fall des Durchführens einer Messung unter Verwendung
einer „Probe
enthaltend nur eine Art von Bakterien" die Anzahl von Bakterien berechnet
werden einzig aufgrund der Bakterien, die in dem Analyseschritt
bestimmt werden. Z. B. wird, falls in dem Analyseschritt bestimmt
wurde, dass die hauptsächlich
in einer Probe enthaltenden Bakterien nicht-fermentative Bakterien
sind, die Anzahl von nicht-fermentativen Bakterien enthalten in
der Probe berechnet auf Basis der Anzahl von Punkten, die in dem NF-Bereich
auftreten, ohne Berechnung der Anzahl von fermentativen Bakterien.
Auf der anderen Seite wird, falls in dem Analyseschritt bestimmt
wurde, dass die hauptsächlich
in der Probe enthaltenen Bakterien fermentative Bakterien sind,
die Anzahl der fermentativen Bakterien, die in der Probe enthalten
sind, berechnet auf Basis der Anzahl von Punkten in dem F-Bereich
auftreten, ohne Berechnung der Anzahl von nicht-fermentativen Bakterien.
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Des
Weiteren können,
in dem Fall des Durchführens
von Messungen unter Verwendung einer „Probe enthaltend Bakterien
und Teilchen, die nicht Bakterien sind", wie Urin, die Teilchen, die nicht
Bakterien sind (im Weiteren als Unreinheiten bezeichnet), zusammen
mit den Bakterien gefärbt
werden, und die Punkte, die den Unreinheiten entsprechen, können in
dem F-Bereich auftreten. Daher kann bei der Berechnung der Anzahl
von fermentativen Bakterien, die in der Probe enthalten sind, auf
Basis der Anzahl der Punkte, die in dem F-Bereich auftreten, die
korrekte Anzahl von fermentativen Bakterien nicht berechnet werden
infolge des Einflusses der Unreinheiten. Daher kann bei der Durchführung der
Messung unter Verwendung einer „Probe enthaltend Bakterien
und Unreinheiten" der
Analyseschritt nur die Anzahl von nicht-fermentativen Bakterien
berechnet werden, ohne die Anzahl der fermentativen Bakterien zu
berechnen. In diesem Fall wird die Anzahl der nicht-fermentativen
Bakterien, die in der Probe enthalten sind, berechnet auf Basis
der Anzahl der Punkte, die in dem NF-Bereich auftreten.
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Des
Weiteren kann, selbst wenn eine „Probe enthaltend Bakterien
und Unreinheiten" verwendet
wird für
die Messung, die Anzahl der fermentativen Bakterien bestimmt werden
unter der Voraussetzung, dass die gesamte Anzahl der Bakterien,
die in der Probe enthalten sind, bestimmt werden kann. In diesem
Fall wird in dem Analyseschritt die Anzahl von nichtfermentativen
Bakterien, die in der Probe enthalten sind, berechnet auf Basis
der Anzahl der Punkte, die in dem NF-Bereich auftreten. Dann wird
durch Abziehen der Anzahl der nicht-fermentativen Baktieren von
der Gesamtzahl der Bakterien, die zuvor bestimmt wurden, die Anzahl
der fermentativen Bakterien, die in der Probe enthalten sind, berechnet.
Hier kann die Gesamtzahl der Bakterien, die in einer Probe enthalten
sind, bestimmt werden, z. B. unter Verwendung einer Methode, die
in der Europäischen
Patentveröffentlichung
Nr. 1136563 offenbart ist.
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Die
in den Ansprüchen
enthaltenen Bezugszeichen limitieren nicht den Schutzbereich der
Ansprüche; ihre
einzige Funktion ist es, die Ansprüche leichter verständlich zu
machen.
