DE69635391T2

DE69635391T2 - Verfahren zur Untersuchung einer Zellprobe

Info

Publication number: DE69635391T2
Application number: DE69635391T
Authority: DE
Inventors: Basil Ian Shine; Thomas Adam Shine
Original assignee: Shine Thomas Adam Cambridge
Current assignee: Shine Thomas Adam Cambridge
Priority date: 1995-12-29
Filing date: 1996-12-27
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2016-12-28
Also published as: JP4160117B2; AU714953B2; EP0870187B1; JP2000502797A; DE69635391D1; ATE308746T1; US20020035879A1; EP1180678B1; DE69623650D1; EP1180678A2; CA2240573A1; ATE224050T1; EP0870187A1; US6422065B1; AU1384797A; WO1997024601A1; EP1180678A3; DE69623650T2; CA2240573C

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Prüfen einer Zellprobe oder einer Fluidprobe.
Viele Arten von Zellen sowie von künstlichen Zellen können nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geprüft werden, auch wenn der Test besonders zum Prüfen von roten und weißen Blutkörperchen geeignet ist.
Stand der Technik
Es ist wohlbekannt, dass bestimmte Krankheiten Anlass für Änderungen des Zustands des Blutes und im Besonderen der roten Blutkörperchen geben. Blutmerkmale wie Enthrozytenzahl, mittleres Zellvolumen, Hämoglobingehalt und Hämatokritwerte werden üblicherweise bei der Krankheitsdiagnose verwendet.
Die Messung von Zellvolumen ist eine der informativsten Untersuchungen in der klinischen Medizin. Zellgröße ist ein wichtiger Pathologieindikator und bildet in Verbindung mit Hämoglobin die grundlegende Klassifizierung von Anämien. Sie ist die Basis der Differenzierung von weißen Blutkörperchen und Leukämien, der Befundung der Prognose bei Krankheitswerten und ist eine unschätzbare Reihenuntersuchungsvorrichtung für die Thalassämien, der am weitesten verbreiteten genetischen Krankheit der Welt.
Bei der bestehenden Methodologie werden gute Zellgrößenmessungen bei der Mehrheit der Patienten erzielt, wobei sie lediglich bei denjenigen, deren Größe der roten Blutkörperchen erheblich von der normalen abweicht, und bei Patienten mit abnormer Serumosmolalität scheitert. Bei normaler Verteilung der Zellgröße weisen 4,56 % der Population rote Körperchen auf, die von der normalen Zellform um mehr als zwei Standardabweichungen abweichen. Diese abnormen Proben sind in Krankenhäusern überrepräsentiert, weil die Abweichungen öfter mit Krankheit assoziiert sind als diejenigen innerhalb normaler Grenzen. Folglich erzeugen klinische Laboratorien bei wenigstens 4,56 % der gemeldeten Ergebnisse inkorrekte Zellvolumenwerte, was ungefähr 100.000 inkorrekten Zellvolumenmessungen in den Vereinigten Staaten täglich entspricht. Bei der Mehrzahl der Patienten verursachen diese Ergebnisse keine signifikanten Probleme, jedoch führen die fehlerhaften Messungen gelegentlich zu Fehldiagnose und dem Tod des Patienten. Dieser Fehler wird jedoch selten erkannt, da bestehende automatisierte Verfahren ihn nicht erfassen können.
Eine normale menschliche Blutprobe ist isotonisch mit einer Lösung, die eine Osmolalität von ungefähr 290 mosm kg^–1 aufweist, und bei dieser Osmolalität hat das durchschnittliche rote Blutkörperchen in der Durchschnittsperson eine bikonkave Form. Es ist wohlbekannt, dass das Verringern der Osmolalität der Lösung, die ein rotes Blutkörperchen umgibt, unter ein kritisches Niveau diese Zelle veranlasst, anzuschwellen, dann zu reißen, wobei eine Schattenzelle gebildet wird, die langsam ihre Inhalte, fast ausschließlich Hämoglobin, in das umgebende Medium freigibt. Dieser Prozess wird als Hämolyse bezeichnet und kann unter Verwendung von Wasser (osmotisch) oder durch Detergensien, Gifte oder andere Chemikalien, thermische, mechanische oder elektrische Agensien induziert werden. Prüfungen zum Bestimmen von Zellvolumen werden typischerweise bei isotonischer Osmolalität durchgeführt.
Automatisierte Messungen von Zellen hängen sowohl von der Größe als auch von der Form der Zellen, die geprüft werden, ab. Da bestehende Instrumente Zellform nicht bestimmen können, kompensieren Instrumente, wie der Teilchenzähler, der unter der Handelsmarke Coulter Counter von der Coulter Electronics Inc. verkauft wird, bei der Berechnung von isotonischem Zellvolumen mit einem Term, der eine feste durchschnittliche Schätzung ist, die immer dann fehlerhaft ist, wenn die Zellform in einer Probe von der normalen Population abweicht. Gerade bei diesen abnormen Proben, die Pathologie anzeigen und bei denen Genauigkeit am stärksten benötigt wird, scheitert das Verfahren am häufigsten.
Zum Schätzen der Größe und der Zahl der Anzahl und Eigenschaften von roten Blutkörperchen in einer Probe sind mehrere handelsübliche Teilchenzähler erhältlich, die verwendet werden können. Diese Teilchenzähler agieren entweder durch Messen der elektrischen oder optischen Eigenschaften eines Zellstroms, der durch eine enge Röhre hindurchfließt. Die gemessene Eigenschaft ist normalerweise der Strom, der durch die Sus pension in der Röhre hindurchfließt, oder das elektrische Feld innerhalb der Röhre. Das erzeugte Signal hängt von mehreren Faktoren ab, zu denen die Zellgröße, die Zellform und die Eigenschaften der Zellmembran und der Unterschied zwischen der elektrischen Eigenschaft der Zelle und des suspendierenden Mediums zählen.
US 4.525.666 (Groves) stellt ein Verfahren bereit, bei dem ein Strom von membranumhüllten Teilchen, wie Zellen, in einer Teilchenanalysevorrichtung untersucht werden. Die Vorrichtung wird zum Bestimmen der elektrischen Abbaufeldstärke der Teilchen verwendet. Dies wird erreicht, indem die Teilchen durch wenigstens zwei erfassende Öffnungen hindurchgeleitet werden, über die hinweg elektrische Felder aufrechterhalten werden. Das beschriebene Verfahren nähert die Zellform einem Ellipsoid an, damit das Volumen berechnet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues Verfahren bereitgestellt, bei dem eine Probe von Zellen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, wobei die Zellen wenigstens eine messbare Eigenschaft haben, die sich von der des flüssigen Mediums unterscheidet, Analyse mit einem Verfahren unterzogen wird, das die folgenden Schritte einschließt:

(a) Leiten einer ersten Aliquote der Proben-Zellsuspension durch einen Sensor,
(b) Messen der wenigstens einen Eigenschaft der Zellsuspension, während jede einer Anzahl von Zellen der ersten Aliquote durch den Sensor hindurchtritt,
(c) zellenweises Aufzeichnen der Messung der Eigenschaft für die erste Aliquote von Zellen,
(d) Änderung wenigstens eines Parameters der Zellenumgebung, die das Potential hat, die wenigstens eine Eigenschaft der Zelle zu ändern, für die erste oder wenigstens eine andere Aliquote der Proben-Zellsuspension, um eine veränderte Zellsuspension herzustellen,
(e) Leiten der veränderten Zellsuspension durch einen Sensor,
(f) Messen der wenigstens einen Eigenschaft der veränderten Zellsuspension, während jede einer Anzahl von Zellen der veränderten Zellsuspension durch den Sensor hindurchtritt,
(g) zellenweises Aufzeichnen der Messung der wenigstens einen Eigenschaft für die veränderte Zellsuspension,
(h) Vergleichen der Daten aus den Schritten (c) und (g) als Funktion des Ausmaßes der Änderung des Parameters der Zellenumgebung und der Häufigkeitsverteilung der wenigstens einen Eigenschaft.

Durch Durchführen des Verfahrens der Erfindung und im Besonderen durch zellenweises Aufzeichnen der Eigenschaftsänderungsdaten für die Zellen können die Daten nachfolgend so bearbeitet werden, dass Unterpopulationen von Zellen in der Probe erkannt werden, die unter Auferlegung der Umgebungsparameteränderung unterschiedlich aufeinander reagieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Prüfen von Blutproben bereit, das das zellenweise Ermitteln von Daten ermöglicht. Zellenweise Verwendung der Daten ermöglicht das Messen neuer Parameter und das Ermitteln von Informationen zu der Verteilung von Zellen unterschiedlicher Größen in einer Population und Offenlegen von Subpopulationen von Zellen auf Basis ihrer anatomischen und physiologischen Eigenschaften.
Eine Messung von Reproduzierbarkeit ist die Standardabweichung der gemachten Beobachtungen. Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, Verbesserungen bereitzustellen, bei denen die Standardabweichung der erzielten Ergebnisse verringert ist, um klinische Verwendbarkeit sicherzustellen.
Eine Vorrichtung zum Prüfen einer Zellprobensuspension in einem flüssigen Medium nach dem Verfahren des ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung umfasst Datenverarbeitungseinrichtungen, die dazu programmiert sind, Daten aus den Schritten (c) und (g) als Funktion des Ausmaßes der Änderung des Parameters der Zellenumgebung und der Häufigkeitsverteilung der wenigstens einen Eigenschaft zu vergleichen.
Der Umgebungsparameter, der bei dem Verfahren geändert wird, kann eine Änderung sein, die dazu führt, dass ein messbarer Parameter der Zellen geändert wird. Das Verfahren ist am wertvollsten, wenn die Änderung des Umgebungsparameters die Größe, die Form oder eine andere anatomische Eigenschaft der Zelle ändert. Das Verfahren ist von besonderem Wert beim Erfassen einer Änderung des Volumens von Zellen als Folge einer Änderung von Osmolalität des umgebenden Mediums. Vorzugsweise ist daher die Umgebungsparameteränderung eine Veränderung, normalerweise eine Verringerung, der Osmolalität. Typischerweise ist die Umgebung der ersten Aliquote isotonisch und somit wird die Umgebung der veränderten Suspension in Schritt (g) hypotonisch gemacht, wie zum Beispiel durch Verdünnen eines Teils einer isotonischen Probensuspension mit einem hypotonischen Verdünnungsmittel.
Andere Umgebungsparameteränderungen, die untersucht werden können, umfassen Änderungen des pH-Werts, Änderungen der Temperatur, des Drucks, von lonophoren, Änderungen durch Kontakt mit lytischen Agensien, zum Beispiel Toxine, Zellmembranporen blockierende Agensien, oder Kombinationen dieser Parameter. Zum Beispiel könnte es nützlich sein, die Wirksamkeit von lytischen Agensien und/oder Porenblockern beim Ändern der Menge oder Geschwindigkeit von Zellvolumenänderung bei einer Änderung von Umgebungsparametern, wie Osmolalität, pH-Wert oder Temperatur, zu bestimmen. Des Weiteren können die Wirkungen von zwei oder mehr Agensien aufeinander, die den Transport von Bestandteilen in oder aus Zellen beeinflussen, durch diese Technik bestimmt werden. Es ist außerdem möglich, die Zellsuspension einer Änderung der Scherspannung während des Hindurchfließens der Zellsuspension durch die Erfassungszone auszusetzen, indem die Fließgeschwindigkeit durch den Sensor hindurch geändert wird, ohne einen der anderen Umgebungsparameter zu ändern oder in Verbindung mit einer Änderung anderer Umgebungsparameter. Eine Änderung der Scherspannung kann die Form der Zelle und somit die elektrische, optische oder andere Eigenschaft, die von dem Sensor gemessen wird, beeinflussen. Das Überwachen einer solchen Änderung bei der Verformung von Zellen kann wertvoll sein. Im Besonderen kann es von Wert sein, die Änderung bei der Verformbarkeit bei Änderungen, die durch Krankheit oder künstlich durch Ändern anderer Umgebungsparameter, wie chemische Bestandteile des Suspensionsmediums, pH-Wert, Temperatur oder Osmolalität, auferlegt werden, zu überwachen.
Vorzugsweise umfasst die Datenverarbeitungseinrichtung den internen Mikroprozessor eines Personalcomputers.
Wenn vollständige Daten zu der Verteilung der Zellgröße in einer bestimmten Population von Zellen verfügbar sind, die einem Hämolyseschock in einer breiten Palette von hypotonischen Lösungen bei Osmolalitäten knapp unterhalb der kritischen Osmolalität, die Lyse verursacht, unterzogen wurden, ist eine Lücke in den Populationen sichtbar. Auf einer 3D-Kurve oder bei einer alternativen Art der Darstellung der Daten, wie eine Konturabbildung, sind die Schattenzellen deutlich sichtbar und die unzerrissenen Zellen sind deutlich erkennbar, aber zwischen ihnen gibt es eine Region, die zum Beispiel durch Osmolalität und Zellgröße definiert ist, in der die Zellen weit verteilt sind. Die Existenz dieses Phänomens, die wir „Schattenlücke" genannt haben, wurde zuvor nicht erkannt und es wurde entdeckt, dass die Natur dieses Phänomens mit der Spezies und zwischen gesunden und kranken Individuen bestimmter Spezies variiert. Es ist ein Maß des Grades an Anisocytose (Größenheterogenität) und kann verwendet werden bei der Messung des Grades an Poikilozytose (Formheterogenität) der Zellpopulation, der oft als die Basis zum Klassifizieren aller Anämien verwendet wird.
Die Messungen der Zellparameteränderungen können als Spannungsimpulse gespeichert und abgerufen werden und sie können angezeigt werden als Einzelpunkte auf einer Anzeige von Spannung gegenüber der Osmolalität der Lösung, die die Parameteränderung verursacht. Wenn Beobachtungen unter Verwendung einer Suspension mit einer einzelnen Tonizität gemacht werden, zeigt die resultierende Kurve die Häufigkeitsverteilung der Spannung durch die Intensität der Punkte, die Zellen desselben Volumens darstellen.
Die Anzahl der Blutzellen in jeder Aliquote, die gezählt wird, beträgt typischerweise wenigstens 1000 und zellenweise Daten werden dann verwendet, um eine exakte Häufigkeitsverteilung der Größe zu erzeugen. Geeigneterweise kann diese Dichte sichtbarer gemacht werden, indem unterschiedliche Farben verwendet werden, um eine dreidimensionale Wirkung zu verleihen, die derjenigen ähnelt, die bei Radar-Regenbildern, die bei Wettervorhersagen verwendet werden, zu sehen ist. Alternativ könnte bei einer einzelnen Lösung einer Tonizität die gemessene Parameteränderung gegenüber der Anzahl von Einzelzellen, die dieselbe Änderung zeigen, angezeigt werden. Auf diese Weise kann eine Verteilung von Zellenvolumen oder Spannung in einer bestimmten Tonizität vorgegebener Osmolalität ermittelt werden.
Das Verfahren der Erfindung kann weiter verbessert werden, indem, statt Teile einer Probe jeweils einer von einer Reihe von hypotonischen Lösungen unterschiedlicher Osmolalität auszusetzen, um die einzelnen Aliquoten zu bilden, die Probe kontinuierlich in eine Lösung eingeleitet wird, deren Osmolalität kontinuierlich geändert wird, um einen kontinuierlichen Gradienten von Aliquoten zum Hindurchleiten durch die Erfassungszone zu erzeugen. Vorzugsweise werden identische Teile der geprüften Probe Lösungen jeder Osmolalität über den gesamten geprüften Bereich nach derselben Zeit von der Auferlegung der Umgebungsparameteränderung zu der Zeit des Hindurchleitens durch die Erfassungszone ausgesetzt. Diese Technik stellt sicher, dass die Zellen der exakten Konzentration ausgesetzt werden, die kritische Änderungen in dieser bestimmten Probe verursachen. Des Weiteren besteht eine Wirkung des Einleitens der geprüften Probe in einen sich kontinuierlich ändernden Osmolalitätsgradienten darin, Messungen zu erzielen, die äquivalent zum Behandeln einer bestimmten Zellprobe mit diesem sich kontinuierlich ändernden Gradienten sind. Diese Technik ist der Gegenstand von WO 97/24600.
Des Weiteren ist es bei der vorliegenden Erfindung möglich, eine bestimmte Blutprobe in verschiedenen Zeitintervallen zu untersuchen und die Ergebnisreihen zu vergleichen, um dynamische Änderungen bei Zellfunktion offen zu legen.
Diese dynamischen Änderungen haben offengelegt, dass Zellen im Lauf der Zeit langsam ihre Fähigkeit zum Funktionieren abbauen und dass sie sich aber außerdem auf unerwartete Weisen ändern. Die Größe und Form der Zellen in einer Blutprobe ändern sich auf eine komplizierte, nichtlineare, aber wiederholbare Weise, wobei manche der charakteristischen Änderungsmuster über den Verlauf von Tagen und bei aufeinanderfolgender Prüfung wiederholt werden. Die Muster, die sich im Laufe der Zeit herausbilden, zeigen Ähnlichkeit unter gleichen Proben und zeigen oftmals eine charakteristische Wellenbewegung. Das Änderungsmuster kann zwischen Individuen variieren, wobei die Gesundheit des Individuums widergespiegelt wird, oder das Muster kann innerhalb einer Probe variieren. Somit kann sich eine Probe, die bei erster Prüfung homogen ist, in zwei oder mehr Unterpopulationen teilen, die sich im Laufe der Zeit ändern, und ihre Existenz kann erfasst werden, indem die Probe einer breiten Palette von unterschiedlichen Tonizitäten ausgesetzt wird und die Zellgröße auf die beschriebene Weise aufgezeichnet wird.
Wenn die gesamte Serie von Schritten in zeitlich festgelegten Intervallen an weiteren Aliquoten der ursprünglichen Probe wiederholt werden und die resultierende Eigenschaftsänderung in einer Kurve gegenüber Osmolalität, Zeit und Häufigkeitsverteilung dargestellt wird, wird eine vierdimensionale Anzeige erzielt, die mit einer sich ändernden Wetterkarte verglichen werden kann. Die Änderungsgeschwindigkeit der Eigenschaft in Bezug auf die Zeit, die zur Durchführung jeder Prüfung benötigt wurde, muss so sein, dass Änderungen, die während der Prüfung auftreten, die Ergebnisse nicht wesentlich beeinflussen dürfen.
Es ist diese gleitende dreidimensionale Anzeige (wobei zeitliche Bewegung die vierte Dimension ist), die ein Muster bereitstellt, das für eine bestimmte Blutprobe charakteristisch ist. Das Muster umfasst die Dichte von bestimmten Zellspannungen und dadurch Größen, die Form des Bereichs, der Schattenzellen darstellt, und im Besonderen die Form und die Anordnung einer Lücke zwischen den ganzen Zellen und den Schattenzellen. Dieses Muster und seine Varianz mit den Spezies und der Gesundheit von Individuen innerhalb einer Spezies stellt eine Charakteristik bereit, die bei der klinischen Diagnose und anderen Disziplinen verwendet werden kann. Zellform ist eine Eigenschaft, die die Basis dieser tanzenden oder sich ändernden Anzeige ist. In den ersten wenigen Stunden wird die Zelle in der ursprünglichen Probe immer kugelförmiger und sie wird dann mehrere Stunden flacher, dann wieder kugelförmiger, erreicht eine Grenze und wird dann dünner und kann zuletzt wieder anschwellen. Diese Reihe kurioser Änderungen der Form tritt außerdem in einem Blutgerinnsel auf und ist die Basis der bisher verblüffenden Änderungen bei der Opazität des Hirns nach einem Schlaganfall, der durch magnetische Kernresonanz (NMR) beobachtet wurde, (1) Gomori, J. M., Grossman, R. I. et al, Radiology 157, 1985, S. 87 bis 93; (2) Bydder, G. M., Pennock, J. M., Porteous, R. et al, 1988, Neuro-radiology 30, S. 367 bis 371; (3) Alanen, A., Kormano, M., 1985, J. Ultrasound Med 4., 421 bis 425. Durch Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt, dass die Geschwindigkeit, mit der beobachtete Änderungen entweder in dem Gerinnsel oder in einer vollständigen Blutprobe stattfinden, durch den pH-Wert, die Temperatur und verfügbare Energie beeinflusst werden.
Das 3D-Muster ermöglicht das Erkennen der genauen Osmolalität, bei der bestimmte Zellen ihr maximales Volumen erreichen, d. h. wenn sie zu Kugeln werden. Mit geeigneter Kalibrierung und unter Verwendung der Spannungsimpulsstärke ist es möglich, das tatsächliche Volumen solcher Zellen präzise und genau zu definieren. Durch Veranlassen von Zellen, ihr Maximum zu durchlaufen, und Differenzierung wird die Erkennung des Punktes der Lyse, d. h. kugelförmige Zellen, bis auf das nächste 1/10 mosm kg^–1 erreicht. Wenn das mittlere Zellvolumen erforderlich ist, werden die Daten von den Spannungen und dadurch das Volumen bei isotonischer Osmolalität, korrigiert für den Anteil von Zellen, die leptozytotischer oder sphärozytischer als normal sind, und der Grad dieser Abweichung erfasst. Wenn Einzelzellvolumina erforderlich sind, werden sie direkt aus dem beobachteten Spannungsimpuls oder aus den Häufigkeitsverteilungsdaten mit Dispersionsstatistiken oder deren grafischer Darstellung ermittelt.
Bei einer bevorzugten Form der Erfindung offenbart, wenn die Messungen einer Blutprobe gegenüber einem kontinuierlichen Gradienten von Osmolalität und den Ergebnissen erfolgen, die als Muster oder Konturabbildung der Einzelzellmessungen angezeigt werden und die Verteilung von Zellen unterschiedlicher Größen durch die Dichte des Musters zeigen, das Wiederholen dieser Messung in Zeitintervallen und anschließendes Untersuchen von jeder in zeitlicher Folge, dass eine typische Zellprobe Unterpopulationen von Zellen enthalten kann, die sich im Lauf der Zeit auf andere Weise ändern als andere Zellen in dieser Probe. Die Untersuchung der Muster, die zu unterschiedlichen Zeitpunkten erzielt wurden, erfolgt vorzugsweise durch Computersequenzierung, die die Wirkung der dynamischen Änderungen an den Zellen in der Form eines sich bewegenden Bildes angibt. Unter Verwendung dieser Technik können zwei oder mehr Zellunterpopulationen verfolgt werden, um das Schicksal und die relative Proportion jeder Population zu bestimmen. Dies ist nützlich als Mittel zur Überwachung beispielsweise der Erholung des Knochenmarks bei einer Anämie, die behandelt wird, einer Leukämie, die Chemotherapie erhalten hat, eines Knochenmarkstransplantats, oder als Mittel zur Untersuchung der Lagerschädigung bei Blutkonserven.
Nach einem weiteren Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Diagnose von Abnormitäten in einer Blutkörperchenprobe bereitgestellt, das die Verwendung der Erfindung umfasst, wobei die Daten, die einzelzellweise oder als Zusammenfassung davon von einer experimentellen Quelle abgerufen wurden, mit Daten, die einzelzellweise von einer Standardprobe abgerufen wurden, verglichen werden. Aus der oben angegebenen Beschreibung ist ersichtlich, dass die Daten, die aus dem verbesserten Verfahren der vorliegenden Erfindung verfügbar sind, ein Muster und ein Verfahren zum Berechnen einer Anzahl von Einzelblutkörperchenparameter, die mit Standardproben verglichen werden können, bereitstellen. Dieser Vergleich stellt die Basis für eine breite Palette klinischer Diagnose bereit. Im Besonderen stellt das Muster oder die Konturabbildung, die durch die Durchführung von Messungen gegenüber einem kontinuierlichen Gradienten von Osmolalität erzielt wurden, ein Muster bereit, das ein großes Maß an diagnostischen Informationen und Zusammenfassungen solcher Daten angeben kann.
Die Aufmerksamkeit richtet sich außerdem auf die Verwendung von Daten, die durch Messungen erzielt werden, die in unterschiedlichen zeitlich festgelegten Intervallen durchgeführt werden. Durch Betrachten der Zellpopulation in diesen zeitlich festgelegten Intervallen und Erkennen der stattfindenden Änderungen in dem Muster können wertvolle diagnostische Informationen von erfahrenen Personen ermittelt werden. Erneut muss ein großes Maß an Arbeit erledigt werden, um bestimmte Änderungen bei diesem Muster zu erkennen und mit klinischen Bedingungen zu korrelieren. Es ist jedoch klar, dass sich die Existenz dieser Varianz beim Muster im Lauf der Zeit als ein signifikantes Diagnosehilfsmittel erweisen wird.
Das Verfahren der Erfindung kann in der Medizin verwendet werden, wie zum Beispiel bei der klinischen Diagnose zum Erkennen des Vorhandenseins von Krankheit oder zum Beurteilen der Remission und Prognose eines Krankheitszustands oder in Blutbanken zum Beurteilen des Zustands von Blutkonserven. Die Erfindung ist außerdem von Wert bei Veterinärpersonal. Erneut muss ein großes Maß an Arbeit erledigt werden, um bestimmte Änderungen bei diesem Muster zu erkennen und mit klinischen Bedingungen zu korrelieren. Es ist jedoch klar, dass sich die Existenz dieser Varianz beim Muster im Lauf der Zeit als ein signifikantes Diagnosehilfsmittel erweisen wird.
Das Verfahren der Erfindung kann in der Medizin verwendet werden, wie zum Beispiel bei der klinischen Diagnose zum Erkennen des Vorhandenseins von Krankheit oder zum Beurteilen der Remission und Prognose eines Krankheitszustands oder in Blutbanken zum Beurteilen des Zustands von Blutkonserven. Die Erfindung ist außerdem von Wert in der Veterinärmedizin zur Diagnose und in der Zoologie als Wegweiser für Taxonomie.
Diese Erfindung besitzt den Vorteil, dass sie subtile Änderungen bei der Morphologie roter Blutkörperchen und im Besonderen Zellformänderungen erfassen kann, fange bevor die Zelle große Änderungen zeigt, die durch bestehende Verfahren erfasst werden können. Zum Beispiel können große Änderungen bei der Dicke roter Blutkörperchen, die nicht quantifiziert werden können, aber normalerweise durch Lichtmikroskopie erfasst werden können, unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung quantifiziert werden. Weitere kleine Änderungen bei der Dicke roter Blutkörperchen können durch bestehende Verfahren nicht erfasst oder quantifiziert werden, können aber unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung sowohl erfasst als auch quantifiziert werden.
Bei der Erfindung wurde gezeigt, dass sie bei der klinischen Diagnose vieler Zustände mit dünnen Zellen nützlich ist und im Besonderen in Bezug auf:
Dünne Zellen oder Leptozyten

1. Hereditäre Stomatozytose
2. Mediterrane Stomatozytose
3. Kryohydrozytose
4. Adenindeaminase-Hyperaktivität
5. Obstruktive Lebererkrankung
6. Blutgruppe Rh Null

Bei dieser Erfindung wurde gezeigt, dass sie bei der klinischen Diagnose von sphärozytischen Zellen in einer Probe (d. h. Zellen, die stärker sphärische Form aufweisen als normal ist) nützlich ist und eine Indikation für eines der Folgenden sein kann:

1. ABO-hämolytische Erkrankung
2. Hereditäre Sphärozytose
3. Immunohämolytische Anämien (coombs-positive)
4. Transfusionsreaktion
5. Klostridieninfektionen
6. Verbrennungen
7. Gifte von Schlangen, Spinnen oder Bienen
8. Hypophosphatämie
9. Hypersplenie
10. Schwangerschaft

Diese Liste gibt eine Indikation des klinischen Werts der vorliegenden Erfindung, der in hohem Maße gesteigert wird, sobald die Änderungen quantifiziert werden können, und die subtileren Änderungen werden mit Krankheit assoziiert. Die Fähigkeit zum Messen des Grades an Dicke oder Dünne von Zellen eröffnet die Möglichkeit, das Fortschreiten der Krankheit zu untersuchen und den Wert von Behandlung zu beurteilen, besonders in einem frühen Stadium.
Andere Parameter, die durch das Verfahren der Erfindung erkennbar sind, können zum Erkennen anderer Spezies verwendet werden.
Alle bestehenden automatisierten Verfahren umfassen eine feste Formkorrektur bei der Behandlung von Sensormesswerten, die aus einer Einzelzellensuspension, bei der die Zellumgebung im Verlauf der Prüfung nicht verändert wird, entnommen wurden, die die Abweichung der Zellen von kugelförmigen Teilchen, die üblicherweise zum Kalibrieren der Instrumente verwendet werden, ausgleichen. Bei einer Berechnung von Zellvolumen wird jedoch, da die Zellform unbekannt ist, eine feste Korrektur von ungefähr 1,5 nach der Annahme, dass eine Probenzelle die Form einer bikonkaven Scheibe aufweist, in die Berechnung eingegeben. Diese Korrektur ist für die durchschnittliche Zelle in der durchschnittlichen Person bei isotonischer Osmolalität korrekt, aber sie ist inkorrekt bei vielen Krankheitskategorien, bei denen die angenommene feste Korrektur einen Fehler von bis zu 60 % bei der Schätzung von Zellvolumen induzieren kann. Eine Schätzung erfolgt anhand der In-vivo-Zellfonn, so dass eine wahre Schätzung von Zellvolumen oder anderen Zellparametern bei allen Formen erzielt wird.
Vorzugsweise ist die Eigenschaft der Zellen, die sich von dem flüssigen Medium unterscheidet, eine, die direkt mit dem Volumen der Zelle verbunden ist. Eine solche Eigen schaft ist elektrischer Widerstand oder Impedanz und dies wird wie bei dem normalen Counter Counter gemessen durch Bestimmen des Flusses von elektrischem Strom durch die Zellsuspension, während er durch eine Erfassungszone des Sensors hindurchfließt. Die Erfassungszone ist normalerweise ein Kanal oder eine Öffnung, durch die die Zellsuspension hindurchgeleitet wird. Es kann jeder Typ von Sensor verwendet werden, vorausgesetzt, dass der Sensor ein Signal erzeugt, das zu der Zellgröße proportional ist. Solche Sensortypen können von Spannung, Strom, Hochfrequenz, magnetischer Kernresonanz, optischen, akustischen oder magnetischen Eigenschaften abhängen. Am stärksten ist zu bevorzugen, dass der Sensor im Wesentlichen so ist wie in WO 97/24600 beschrieben.
Obwohl das Verfahren normalerweise an Blutkörperchen, wie zum Beispiel weiße oder üblicherweise rote Blutkörperchen, durchgeführt wird, kann es außerdem dazu verwendet werden, andere Zellsuspensionen zu untersuchen, die Pflanzen- oder Tierzellen oder Mikroorganismuszellen, wie zum Beispiel bakterielle Zellen, sein können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann, genauso wie sie auf Zellen anwendbar ist, wie oben beschrieben wurde, außerdem auf andere natürliche und synthetische Vesikel anwendbar sein, die eine Membran umfassen, die einen Innenraum umgibt, dessen Form oder Größe oder Verformbarkeit durch Verändern eines Umgebungsparameters verändert werden kann. Solche Vesikel können zum Beispiel als Membranmodelle oder als Arzneimittelliefervorrichtungen oder als Vorrichtungen zum Speichern und/oder Stabilisieren anderer aktiver Bestandteile oder zum Beinhalten von Hämoglobin in Blutersatzstoffen nützlich sein.
Bei dem Verfahren kann die Zeit zwischen der Initiierung der Veränderung der Umgebung zu dem Hindurchleiten der Zellen durch die Erfassungszone schwanken, beträgt jedoch vorzugsweise weniger als 1 Minute, wobei weniger als 10 Sekunden stärker zu bevorzugen ist. Die Zeit wird im Allgemeinen bei dem Verfahren gesteuert und wird vorzugsweise konstant gehalten. Wenn sie sich ändert, dann kann Zeit ein weiterer Faktor sein, der bei dem Berechnungsschritt von Schritt (h) berücksichtigt wird.
Auch wenn es möglich ist, dass das Verfahren der Erfindung lediglich aus der Behandlung von zwei Aliquoten der Probenzellsuspension besteht, ist es üblicher, dass das Verfahren die Schritte umfasst, eine andere Probenzellsuspensionsaliquote einer zweiten Veränderung an wenigstens einem Parameter der Zellumgebung auszusetzen, die geänderte Aliquote durch den Sensor hindurchzuleiten, die Änderung der Eigenschaft der Zellsuspension unter der geänderten Umgebung aufzuzeichnen, während jede einer Anzahl von Zellen der Aliquote durch den Sensor hindurchgeleitet wird, alle konkomitierenden Eigenschaften der Umgebung zusammen mit der Änderung zellenweise aufzuzeichnen und die Daten aus dem vorherigen Schritt (c) und dem vorhergehenden Schritt als Funktion des Ausmaßes der zweiten Umgebungsparameteränderung zu vergleichen. Normalerweise werden viele weitere Aliquoten auf eine ähnliche Weise behandelt. Je größer die Anzahl geprüfter Aliquoten ist, desto größer ist die potenzielle Genauigkeit, Präzision und Auflösung der Ergebnisse, die erzielt werden. Es ist außerdem möglich, lediglich eine einzelne Probensuspensionsaliquote einer Reihe von solchen Änderungen an wenigstens einem Parameter der Zellumgebung auszusetzen.
In ihrer einfachsten Form hängt die Prüfung von zwei Sensormessungen ab, von denen eine bei einem Maximum oder in der Nähe davon liegt. Die Umgebung, die erforderlich ist, um eine Zelle zum Erreichen einer maximalen Größe zu induzieren, kann jedoch vollständig unbekannt sein. Des Weiteren können die Umgebungsänderungen sequenziell, nichtsequenziell, zufällig, kontinuierlich oder unterbrochen sein, vorausgesetzt, die maximal erreichbare Zellengröße wird aufgezeichnet. Eine geeignete Weise, dies sicherzustellen, besteht darin, die Zelle in einer sich kontinuierlich ändernden Umgebung zu prüfen, so dass alle möglichen Zellgrößen einschließlich des Maximums aufgezeichnet werden.
Die zweite Änderung an der Zellumgebung ist normalerweise von derselben Art wie die erste Änderung. Sie kann sogar von demselben Ausmaß wie die erste Änderung sein, aber die Zeit zwischen der Initiierung der Änderung und dem Hindurchleiten der Zellen durch die Erfassungszone kann unterschiedlich sein, wodurch die Geschwindigkeit der Änderung der Eigenschaften der Zellen überwacht wird, wenn diese einer bestimmten Umgebungsparameteränderung ausgesetzt werden. Diese Technik kann außerdem zum Überwachen von Zellen verwendet werden, die über mehrere Jahre gelagert wurden.
Bei einer anderen Ausführung ist die zweite Umgebungsparameteränderung von derselben Art wie die erste Änderung, weist aber ein anderes Ausmaß auf. In einem solchen Fall wird bevorzugt, dass die Zeit zwischen der Initiierung der Änderung und dem Hindurchleiten der Zellen durch die Erfassungszone für jede Aliquote der Zellsuspension dieselbe ist. Vorzugsweise werden bei dieser Ausführung des Verfahrens zweite und nachfolgende Zellsuspensionsaliquoten sukzessiv steigenden Ausmaßen der Änderung des Umgebungsparameters ausgesetzt, so dass die Änderung der Eigenschaft ein Maximum erzeugt und dann abnimmt, während das Ausmaß der Umgebungsparameteränderung erhöht wird. Bei der bevorzugten Ausführung, bei der die Eigenschaft der Zellsuspension, die überwacht wird, direkt mit dem Volumen der Zellen verbunden ist und bei der die Umgebungsparameteränderung für die zweite und nachfolgende Aliquoten zu einer Volumenerhöhung der Zellen führt, wird vorzugsweise die Umgebungsänderung variiert, bis das Zellvolumen ein Maximum überschreitet.
Da die bevorzugte Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung darin besteht, rote Blutkörperchen zu analysieren, basiert die folgende Besprechung hauptsächlich auf der Untersuchung solcher Zellen. Es ist jedoch ersichtlich, dass das Verfahren wie oben angegeben auf andere Zelltypen und auf das Bestimmen anderer Informationen in Bezug eines Organismus aus einer Untersuchung solcher Zelltypen anwendbar ist.
Bei der aktuellen Praxis wird die Zellform, im Besonderen die Form roter Blutkörperchen, nicht durch ein automatisiertes Verfahren eingeschätzt.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht dem Benutzer, die Zellform zu bestimmen und andere Daten, wie Zellvolumen, Oberflächenbereich, Verhältnis Oberflächenbereich zu Volumen, Sphärizitätsindex, Zelldicke und Oberflächenbereich je Millimeter, abzuleiten. Abgesehen von Forschungs- und Versuchslaboratorien sind keine dieser Messungen aktuell in einem klinischen Labor verfügbar und bisher konnte keine innerhalb von 60 Sekunden abgeschlossen werden. Im Besonderen ermöglicht das bevorzugte Verfahren, bei dem die Probenzellsuspension einem Konzentrationsgradienten ausgesetzt wird, das automatische Erfassen oder einem Benutzer das genaue Erfassen, wann die Zellen eine im Wesentlichen kugelförmige Form unmittelbar vor der Lyse annehmen.
Das im Handel erhältliche Teilchenzählinstrument Coulter Counter erzeugt ein Signal im Verhältnis zu dem Volumen von Teilchen, die durch eine Erfassungszone hindurchgelei tet werden, typischerweise einen Spannungsimpuls für jedes Teilchen. Die Größe des Signals wird gegenüber kugelförmigen Latexteilchen bekannten Volumens kalibriert, um einen Umwandlungsfaktor zu erzeugen, um ein gemessenes Signal, typischerweise Spannung, in ein Teilchenvolumen, typischerweise Femtoliter, umzuwandeln. Bei Verwendung von Teilchenzählern dieses Typs zum Messen der Größe von Teilchen, die keine Kugeln sind, was für biologische Proben wie Blutplättchen, Fibroplasten oder rote Blutkörperchen, die die Form einer Scheibe haben, typisch ist, wird ein fester Formkorrekturfaktur zusätzlich zu dem Umwandlungsfaktor verwendet. Diese feste Formkorrektur, die auf theoretischen und empirischen Daten basiert, ist so konstruiert, dass eine korrekte Volumenschätzung erzeugt wird, wenn Teilchen gemessen werden, die nicht kugelförmig sind, da die Größe der Spannungsimpulse nicht allein mit dem Zellvolumen verbunden sind. Zum Beispiel erzeugen normale rote Blutkörperchen Sensorimpulse, die zu klein sind mit einem Faktor von ungefähr 1,5, wenn sie mit diesen Instrumenten gemessen werden, und daher wird eine feste Korrektur von 1,5 in die Zellvolumenberechnung eingegeben, um den korrekten Wert zu erzeugen. In der Anmeldung WO 97/24601 des Anmelders wird dieser feste Formkorrekturfaktor durch einen probenspezifischen Formkorrekturfaktor f(K_shape) ersetzt, der mit einer Formkorrekturfunktion erzeugt wurde.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, bei denen:
1 schematisch ein Instrument zeigt, das zur Probenentnahme und Prüfung von Blutkörperchen verwendet wird;
2 Geschwindigkeitsprofile für das Abgeben von Fluids aus Fluidzuführspritzen eines Gradientenerzeugerabschnitts des Instruments von 1 zeigt;
3 ein Blockdiagramm zeigt, das die Datenverarbeitungsschritte, die bei dem Instrument von 1 verwendet werden, darstellt;
4 ein Beispiel einer dreidimensionalen Kurve von Osmolalität gegenüber der gemessenen Spannung einer Blutprobe zeigt, die nach der vorliegenden Erfindung analysiert wurde;
5 ein anderes Beispiel einer dreidimensionalen Kurve von Osmolalität gegenüber der gemessenen Spannung zeigt, die die Häufigkeitsverteilung von Blutkörperchen in Intervallen darstellt;
6 ein Reihe von dreidimensionalen Kurven für eine Probe zeigt, die in stündlichen Intervallen geprüft wurde;
7 und 8 Ergebnisse für kugelförmige Latexteilchen als Teil einer Instrumentenkalibrierungsroutine zeigt;
9 übereinandergelegte Kurven von Osmolalität (X-Achse) gegenüber gemessener Spannung bzw. wahrem Volumen zeigt;
10a bis 10d die Ergebnisse der Prüfung eines gesunden Individuums zeigen;
11 Price-Jones-Kurven der in den 10a bis 10d gezeigten Ergebnisse zeigt; und
12 eine dreidimensionale Häufigkeitsverteilungskurve und Zellparameter für ein abnormes Individuum zeigt.
Ausführliche Beschreibung
1 zeigt schematisch die Anordnung einer Blutprobenentnahmevorrichtung zur Verwendung bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung. Die Blutprobenentnahmevorrichtung umfasst einen Probenherstellabschnitt (1), einen Gradientenerzeugerabschnitt (2) und einen Sensorabschnitt (3).
Eine vollständige Blutprobe (4), die in einem Probenbehälter (5) enthalten ist, fungiert als ein Probenvorrat für eine Probensonde (6). Die Probensonde (6) ist entlang der PTFE-Fluidleitung (26) über ein Mehrpunkt-Verteilventil (8) und ein Mehrpunkt-Verteilventil (9) mit einer Verdünnungspumpe (7) verbunden. Die Verdünnungspumpe (7) zieht physiologische Kochsalzlösung über Anschluss 1 des Mehrpunkt-Verteilventils (9) aus einem Vorrat (nicht gezeigt). Wie im Folgenden ausführlich beschrieben wird, wird die Verdünnungspumpe (7) gesteuert, um als Teil eines ersten Verdünnungsschritts in dem Probenentnahmeprozess eine Blutprobe zusammen mit einem Volumen physiologischer Kochsalzlösung in eine erste Titerkammer (10) hinein abzugeben.
Bei einem zweiten Verdünnungsschritt zieht die Verdünnungspumpe (7) eine verdünnte Blutprobe von der ersten Titerkammer (10) über das Mehrpunkt-Verteilventil (11) in die PTFE-Fluidleitung (12) und gibt diese Probe zusammen mit zusätzlichem Volumen an physiologischer Kochsalzlösung in einer zweiten Titerkammer (13) ab. Die zweite Titerkammer (13) stellt die Quelle für verdünnte Probe für den Gradientenerzeugerabschnitt (2), der im Folgenden ausführlich beschrieben wird, bereit.
Statt das gesamte Blut zu verwenden, kann eine vorverdünnte Blutprobe (14) in einem Probenbehälter (15) verwendet werden. In diesem Fall ist eine Probensonde (16) ist entlang der PTFE-Fluidleitung (30) über das Mehrpunkt-Verteilventil (11), die PTFE-Fluidleitung (12) und das Mehrpunkt-Verteilventil (9) mit der Verdünnungspumpe (7) verbunden. Bei einem zweiten Verdünnungsschritt zieht die Verdünnungspumpe (7) ein Volumen der vorverdünnten Probe (14) von dem Probenbehälter (15) über die Fluidleitung (30) und das Mehrpunkt-Verteilventil (11) in die Fluidleitung (12) und gibt diese Probe zusammen mit zusätzlichem Volumen an physiologischer Kochsalzlösung in der zweiten Titerkammer (13) ab, um die Quelle für verdünnte Probe für den Gradientenerzeugerabschnitt (2) bereitzustellen.
Der Gradientenerzeugerabschnitt (2) umfasst eine erste Fluidzuführspritze (17), die über das Multipunkt-Verteilventil (18) Wasser aus einem Vorrat zieht und Wasser entlang der PTFE-Fluidleitung (20) in eine Mischkammer (19) abgibt. Der Gradientenerzeugungsabschnitt (2) umfasst außerdem eine zweite Fluidzuführspritze (21), die die verdünnte Blutprobe über das Multipunkt-Verteilventil (22) aus der zweiten Titerkammer (13) in dem Probenherstellabschnitt (1) zieht und diese entlang der PTFE-Fluidleitung (23) in die Mischkammer (19) abgibt, wo sie mit dem Wasser aus der ersten Fluidzuführspritze (17) gemischt wird. Wie im Folgenden ausführlich erläutert wird, wird die Geschwindigkeit der Abgabe von Wasser von der ersten Fluidzuführspritze (17) und die Geschwindigkeit der Abgabe von verdünnter Blutprobe von der zweiten Fluidzuführspritze (21) an die Mischkammer gesteuert, um ein vorgegebenes Konzentrationsprofil der Probensuspension, die die Mischkammer (19) entlang der PTFE-Fluidleitung (24) verlässt, zu erzeugen. Die Fluidleitung (24) ist typischerweise bis zu 3 Meter lang. Ein geeigneter Gradientenerzeuger wird ausführlich in WO 97/24600 beschrieben.
Wie ebenfalls im Folgenden ausführlich erläutert wird, verlässt die Probensuspension die Mischkammer (19) entlang der Fluidleitung (24) und tritt in den Sensorabschnitt (3) ein, wo sie eine Erfassungszone (25) passiert, die Einzelzellen der Probensuspension erfasst, bevor die Probe über eine Reihe von Ablässen entsorgt wird.
Bei einer Routineprüfung wird das gesamte System zuerst gespült und mit physiologischer Kochsalzlösung auf geeignete Weise befüllt, um das Instrument zu reinigen, Taschen aus Luft und Rückständen zu entfernen und Verschleppung zu verringern.
Die Verdünnerpumpe (7) umfasst eine Fluidzuführspritze, die durch einen Schrittmotor (nicht gezeigt) angetrieben wird, und ist typischerweise eingerichtet, um einleitend 5 bis 10 ml physiologischer Kochsalzlösung aus einem Vorrat an physiologischer Kochsalzlösung (nicht gezeigt) über Anschluss 1 des Mehrpunkt-Verteilventils (9) in den Spritzenkörper hineinzuziehen. Eine geeignete Fluidzuführspritzen- und Schrittmotoranordnung wird ausführlich in der ebenfalls heute eingereichten gleichzeitig schwebenden Anmeldung des Anmelders (Bezugsnummer 80/4936/01 des Patentanwalts) beschrieben. Anschluss 1 des Mehrpunkt-Verteilventils (9) wird dann geschlossen und Anschluss 0 sowohl von dem Mehrpunkt-Verteilventil (9) als auch von dem Mehrpunkt-Verteilventil (8) wird geöffnet. Typischerweise werden 100 μl des vollständigen Blutes dann aus dem Probenbehälter (5) gezogen, um den Totraum in der Fluidleitung (26) einzunehmen. Anschluss 0 des Mehrpunkt-Verteilventils (8) wird dann geschlossen und Blut von der vollständigen Blutprobe (4), das in die Fluidleitung (27) hineingezogen wurde, durch die Verdünnungspumpe (7) über den Anschluss 1 des Mehrpunkt-Verteilventils (8) an den Ablass abgegeben.
In einem ersten Verdünnungsschritt wird Anschluss 0 des Mehrpunkt-Verteilventils (8) geöffnet und die Verdünnungspumpe (7) zieht ein bekanntes Volumen des vollständigen Blutes, typischerweise 1 bis 20 μl, in die PTFE-Fluidleitung (27) hinein. Anschluss 0 wird dann geschlossen, Anschluss 2 geöffnet und die Verdünnungspumpe (7) gibt die Blutprobe in der Fluidleitung (27) zusammen mit einem bekannten Volumen an physiologischer Kochsalzlösung in der Fluidleitung (27), typischerweise 0,1 bis 2 ml, in die erste Titerkammer (10) ab. Anschluss 2 des Multipunkt-Verteilventils (8) und Anschluss 0 des Mehrpunkt-Verteilventils (9) werden dann geschlossen.
Danach werden Anschluss 0 des Multipunkt-Verteilventils (11) und Anschluss 3 des Mehrpunkt-Verteilventils (9) geöffnet, um der Verdünnungspumpe (7) zu ermöglichen, die erste Probenverdünnung, die in der ersten Titerkammer (10) gehalten wird, anzuziehen, um den Totraum in der PTFE-Fluidleitung (28) einzunehmen. Anschluss 0 des Multipunkt-Verteilventils (11) wird dann geschlossen und Anschluss 1 geöffnet, um der Verdünnungspumpe (7) zu ermöglichen, erste Probenverdünnung, die in die Fluidleitung (12) hineingezogen wurde, über Anschluss 1 an den Ablass abzugeben.
In einem zweiten Verdünnungsschritt wird Anschluss 0 des Mehrpunkt-Verteilventils (11) wieder geöffnet und die Verdünnungspumpe (7) zieht ein bekanntes Volumen, typischerweise 1 bis 20 μl, der ersten Probenverdünnung in die Fluidleitung (12) hinein. Fluidleitung (12) umfasst eine Verzögerungsspule (29), die einen Vorrat bereitstellt, um das Verschmutzen der Verdünnerpumpe (7) durch die Probe zu verhindern. Anschluss 0 des Mehrpunkt-Verteilventils (11) wird dann geschlossen, Anschluss 3 geöffnet und die Verdünnungspumpe (7) gibt dann die erste Probenverdünnung in der Fluidleitung (12) zusammen mit einem bekannten Volumen an physiologischer Kochsalzlösung, typischerweise 0,1 bis 20 ml, in der zweiten Titerkammer (13) ab. Anschluss 3 des Multipunkt-Verteilventils (11) wird dann geschlossen. In diesem Stadium wurde die Probe vollständigen Blutes mit einem Verhältnis von typischerweise 10000:1 verdünnt. Wie im Folgenden erläutert wird, ist das Instrument automatisch eingerichtet, um den zweiten Verdünnungsschritt zu steuern, um die Verdünnung der Probensuspension so zu verändern, dass eine vorgegebene Zellzahl innerhalb einer vorgegebenen Toleranz zu Beginn einer Prüfroutine erreicht wird.
In dem Gradientenerzeugerabschnitt (2) wird die erste Fluidzuführspritze (17) mit Wasser aus einem Wasservorrat befüllt. Anschluss 3 des Mehrpunkt-Verteilventils (22) wird geöffnet und die zweite Fluidzuführspritze zieht ein Volumen der verdünnten Blutprobe von der zweiten Titerkammer (13) in den Spritzenkörper hinein. Anschluss 3 des Mehrpunkt-Verteilventils (22) wird dann geschlossen und Anschluss 2 sowohl von dem Mehrpunkt-Verteilventil (18) als auch von dem Mehrpunkt-Verteilventil (22) wird geöffnet, bevor die gesteuerte gleichzeitige Abgabe von Wasser und verdünnter Blutprobe in die Mischkammer (19) erfolgt.
2 zeigt, wie die Geschwindigkeit des Fluids, das von jeder der ersten und zweiten Fluidzuführspritze abgegeben wird, im Laufe der Zeit verändert wird, um einen vorgegebenen kontinuierlichen Gradienten von Osmolalität der Probensuspension, die die Mischkammer (19) entlang der Fluidleitung (24) verlässt, zu erreichen. Die Fließgeschwindigkeit der Probensuspension liegt typischerweise in der Region von 200 μl s^–1, wobei dies beim Durchführen von Messungen konstant gehalten wird. Dieses Merkmal wird in WO 97/24529 beschrieben. Wie in 2 gezeigt wird, beschleunigt ein Nockenprofil, das mit einem Nocken, der die Fluidzuführspritze (21) antreibt, verbunden ist, den Spritzenkolben zur Abgabe der Probe bei einer Geschwindigkeit V₁, während ein Nockenprofil, das mit einem Nocken, der die Fluidzuführspritze (17) antreibt, verbunden ist, den zugehörigen Spritzenkolben zur Abgabe der Probe bei einer geringeren Geschwindigkeit V₂ beschleunigt. Sobald eine konstante Fließgeschwindigkeit von jeder Zuführspritze zum Zeitpunkt T₀ eingerichtet wurde, veranlasst das Nockenprofil, das mit der Fluidzuführspritze (21) verbunden ist, die Probenabgabegeschwindigkeit dazu, linear über den Zeitraum T₂ – T₁ auf eine Geschwindigkeit V₂ zu sinken, während gleichzeitig das Nockenprofil, das mit der Fluidzuführspritze (17) verbunden ist, zum Zeitpunkt T₁ die Fluidabgabegeschwindigkeit dazu veranlasst, linear auf eine Geschwindigkeit V₁ zu beschleunigen. Während dieses Zeitraums bleibt die kombinierte Fließgeschwindigkeit der beiden Spritzen im Wesentlichen konstant bei ungefähr 200 μl s^–1. Abschließend werden die zwei Spritzen über den Zeitraum T₃ – T₂ gespült.
Sobald sowohl die erste Fluidzuführspritze (17) als auch die zweite Fluidzuführspritze (21) ihre Inhalte abgegeben haben, wird die erste Zuführspritze in Vorbereitung auf die nächste Prüfung mit Wasser wieder aufgefüllt. Wenn eine Blutprobe von einem anderen Subjekt verwendet werden muss, wird die zweite Fluidzuführspritze (21) mit physiologischer Kochsalzlösung aus einem Vorrat physiologischer Kochsalzlösung über Anschluss 1 des Mehrpunkt-Verteilventils (22) gespült, um den verschmutzten Körper der Spritze zu reinigen.
Die Probensuspension, die die Mischkammer (19) verlässt, wird entlang der Fluidleitung (24) zu dem Sensorabschnitt (3) geleitet. Ein geeigneter Sensorabschnitt wird ausführlich in WO 97/24600 beschrieben. Die Probensuspension wird zu einer Erfassungszone (25) geleitet, die ein elektrisches Feld umfasst, das angrenzend an eine Öffnung, die die Einzelzellen der Probensuspension passieren müssen, erzeugt wird. Wenn einzelne Blutkörperchen der Probensuspension durch die Öffnung hindurchtreten, wird die Reaktion des elektrischen Felds auf den elektrischen Widerstand von jeder Einzelzelle als ein Spannungsimpuls aufgezeichnet. Die Amplitude von jedem Spannungsimpuls wird zusammen mit der Gesamtzahl von Spannungsimpulsen für einen bestimmten Unterbrechungszeitraum, typischerweise 0,2 Sekunden, ebenfalls für nachfolgende Analyse aufgezeichnet und gespeichert, die einen Vergleich mit der Osmolalität der Probensuspension zu diesem Zeitpunkt, die gleichzeitig gemessen wird, beinhaltet. Die Osmolalität der Probensuspension kann außerdem ohne Messung anhand der Kenntnis des vorgegebenen kontinuierlichen osmotischen Gradienten bestimmt werden, der durch den Gradientenerzeugerabschnitt (2) erzeugt wird. Wie im Folgenden beschrieben wird, ist die Osmolalität (Druck) nicht erforderlich, um die Zellparameter zu bestimmen.
3 zeigt, wie Daten gesammelt und verarbeitet werden. In jedem Instrument befindet sich ein Hauptmikroprozessor, der für das Überwachen und Steuern des Instruments verantwortlich ist, wobei dedizierte Hardware oder kostengünstige integrierte Steuerungen für spezifische Aufgaben innerhalb des Instruments, wie das Betreiben von Verdünnern, Ventilen und Schrittmotoren oder das Digitalisieren und Übertragen eines Impulses an den Pufferspeicher, verantwortlich sind. Die Software, die das Instrument betreibt, ist in C und Assemblercode geschrieben und ist etwas weniger als 32 K lang.
Wenn eine Probe geprüft wird, wird die Amplitude und Länge von jedem Spannungsimpuls, der von dem Sensor erzeugt wird, auf 12 Bit genau digitalisiert und in einem von zwei 16K-Puffern zusammen mit der Summe der Amplituden, der Summe der Längen und der Anzahl der Impulsen, die geprüft wurden, gespeichert. Während das Instrument Daten für die Sensoren sammelt, wird ein Puffer mit den digitalisierten Werten gefüllt, während der Hauptmikroprozessor den vollen Puffer leert und verarbeitet. Diese Verarbeitung besteht aus dem Herausfiltern unerwünschter Impulse, Analysieren der Daten zum Änderm der Steuerung des Instruments und abschließendem Komprimieren der Daten, bevor sie für komplexe Analyse zu dem Personalcomputer gesendet werden.
Optionale Verarbeitung, die durch das Instrument durchgeführt wird, umfasst Digitalsignalverarbeitung von jedem Sensorimpuls, um das Filtern zu verbessern, die Genauigkeit der Spitzenerfassung zu verbessern und mehr Informationen zu der Form und Größe der Impulse bereitzustellen. Ein solches digitales Verarbeiten erzeugt ungefähr 25 16-Bit-Werte pro Zelle, wobei ungefähr 25 Megabyte an Daten pro Prüfung erzeugt werden.
Die Datenverarbeitung in dem Personalcomputer besteht aus einem benutzerdefinierten 400K-Programm, das in C und Pascal geschrieben ist. Der PC zeigt die Daten in Echtzeit an und analysiert sie in Echtzeit, steuert die Benutzerschnittstelle (Fenster, Menüs usw.) und speichert und druckt jede Probe.
Die Software wartet außerdem eine Datenbank zu jeder geprüften Probe, wobei schnelles Vergleichen von einer zuvor geprüften Probe ermöglicht wird. Zusätzlich überwacht die Software den Betrieb des Instruments zum Erfassen von Störungen und Fehlern, wie niedrige Fluidpegel, Systemabstürze oder der Umstand, dass der Benutzer das Einschalten des Instruments vergisst.
Der Spannungsimpuls, der von jeder Zelle der Probensuspension erzeugt wird, während sie durch die Öffnung der Erfassungszone (25) hindurchtritt, wird in grafischer Form auf einer Bildanzeigeeinheit des PC als eine Kurve von Osmolalität gegenüber gemessener Spannung angezeigt. Die Probensuspension wird mit einer Geschwindigkeit von 200 μls^–1 durch den Erfassungsabschnitt hindurchgeleitet. Der zweite Verdünnungsschritt wird gesteuert, um eine Anfangszellzahl von ungefähr 5000 Zellen pro Sekunde, gemessen am Anfang einer Prüfung, zu erreichen, so dass in einem Unterbrechungszeitraum von 0,20 Sekunden ungefähr 1000 Zellen erfasst und gemessen werden. Dies wird erreicht durch automatisches Verändern des Volumens physiologischer Kochsalzlösung, die durch die Verdünnungspumpe (7) aus der Fluidleitung (12) in dem zweiten Verdünnungsschritt abgegeben wird. Über einen Prüfungszeitraum von 40 Sekunden treten insgesamt 200 Unterbrechungszeiträume ein und dies kann als eine kontinuierliche Kurve in einer dreidimensionalen Form angezeigt werden, um die Häufigkeitsverteilung gemes sener Spannung bei einer bestimmten Osmolalität darzustellen, wovon ein Beispiel in den 4 und 5 gezeigt wird.
Die gemessene Zellspannung, die zellenweise gespeichert und abgerufen wird, wird gezeigt, indem sie auf einer Kurve von Spannung gegenüber der Osmolalität der Lösung, die diese Spannungsänderung verursacht, angezeigt wird. Die Verwendung von Einzelpunkten zum Anzeigen der gemessenen Parameteränderung für jede einzelne Zelle führt zu einer Anzeige, mit der die Verteilung von Zellen nach Spannung und dadurch nach Volumen in der Population für den gesamten Bereich von Lösungen, der von dem Osmolalitätsgradienten abgedeckt wird, angezeigt wird. Der Gesamteffekt ist eine dreidimensionale Anzeige, die als eine gemessene Eigenschaftsänderung in Bezug auf die Amplitude der gemessenen Spannungsimpulse gegenüber dem geänderten Parameter gezeigt wird, in diesem Fall die Osmolalität der Lösung, der die Zellen ausgesetzt wurden, und die Verteilung oder Dichte der Zellen bestimmter Größen innerhalb der Population, die der bestimmten Osmolalität ausgesetzt sind. Der Effekt besteht darin, eine Anzeige analog zu einer Konturabbildung zu erzeugen, die unter Verwendung von Farbe intensiviert werden kann, um die Bereiche größter Intensität anzuzeigen.
Wenn vollständige Daten zu der Zellgrößenverteilung innerhalb einer bestimmten Zellpopulation verfügbar sind, die einem Hämolyseschock in einer breiten Palette hypotonischer Lösungen bei Osmolalitäten genau unter einer kritischen Osmolalität, die Lyse verursacht, ausgesetzt wird, ist eine Lücke in den Populationen sichtbar. Wie in 4 gezeigt wird, sind Schattenzellen in der dreidimensionalen Kurve vollständig sichtbar oder erkennbar und die unzerrissenen Zellen sind deutlich erkennbar, aber zwischen ihnen gibt es eine Region, die durch Osmolalität und Zellvolumen definiert wird und in der relativ wenige Individuen erscheinen. Die Existenz dieses Phänomens, die wir als die „Schattenlücke" bezeichnet haben, wurde zuvor nicht erkannt.
Wenn die gesamte Reihe von Schritten in zeitlich festgelegten Intervallen an weiteren Aliquoten der ursprünglichen Probe wiederholt wird und die resultierende gemessene Spannung in einer Kurve gegenüber Osmolalität, Zeit und Häufigkeitsverteilung dargestellt wird, wird eine vierdimensionale Anzeige erzielt, die mit einer Änderung bei einer Wetterkarte verglichen werden kann. Diese gleitende dreidimensionale Anzeige, wobei ihre zeitliche Bewegung die vierte Dimension ist, stellt ein zusätzliches Muster bereit, das für eine bestimmte Blutprobe charakteristisch ist. Dies wird in der Bilderreihe in 6 gezeigt. Die in 6 gezeigten Bilder sind die Ergebnisse von Prüfungen, die in stündlichen Intervallen bei einer Temperatur von 37 °C durchgeführt wurden. Da die Messungen so genau sind, können die Wiederholungsergebnisse unter Verwendung von Computersequenzierungstechniken übereinandergelegt werden.
Wie gezeigt wird, verlieren Zellen im Lauf der Zeit langsam ihre Fähigkeit zum Funktionieren, aber sie ändern sich außerdem auf unerwartete Weisen. Die Größe und Form der Zellen in einer Blutprobe ändern sich auf eine komplizierte, nichtlineare, aber wiederholbare Weise, wobei manche der charakteristischen Muster im Verlauf von Tagen und bei aufeinanderfolgender Prüfung wiederholt werden. Die Muster, die sich im Laufe der Zeit herausbilden, zeigen Ähnlichkeit unter gleichen Proben und zeigen oftmals eine charakteristische Wellenbewegung. Das Änderungsmuster kann zwischen Individuen variieren, wobei die Gesundheit des Individuums widergespiegelt wird, oder das Muster kann innerhalb einer Probe variieren. Somit kann sich eine Probe, die bei erster Prüfung homogen ist, in zwei oder mehr Unterpopulationen teilen, die sich im Laufe der Zeit ändern, und ihre Existenz kann erfasst werden, indem die Probe einer breiten Palette von unterschiedlichen Tonizitäten ausgesetzt wird und der Spannungsimpuls auf die beschriebene Weise aufgezeichnet wird. Wie in 6 gezeigt wird, wird die Zelle nach den ersten wenigen Stunden in der ursprünglichen Probe immer kugelförmiger und sie wird dann mehrere Stunden flacher, dann wieder kugelförmiger, erreicht eine Grenze und wird dann dünner und kann zuletzt wieder anschwellen. Es wurde bestimmt, dass die Geschwindigkeit, mit der beobachtete Änderungen stattfinden, durch den pH-Wert, die Temperatur, verfügbare Energie und andere Faktoren beeinflusst wird.
Das dreidimensionale Muster stellt Daten bereit, die Erkennung der genauen Osmolalität ermöglichen, bei der bestimmte Zellen ihr maximales Volumen erreichen, wenn sie zu Kugeln werden. Bei geeigneter Kalibrierung, die im Folgenden ausführlich beschrieben wird, und unter Verwendung der Größe des Spannungsimpulses ist es möglich, das tatsächliche Volumen solcher Zellen präzise und genau zu definieren und danach eine Anzahl von anderen Zellparametern von klinischem Interesse abzuleiten.
Die Amplitude der Spannungsimpulse, die von dem Sensor (25) erzeugt werden, wenn Einzelzellen durch das elektrische Feld hindurchtreten, ist proportional zu dem Volumen jeder Zelle. Bevor jedoch eine Umwandlung durchgeführt werden kann, um eine Zellvolumenmessung bereitzustellen, bedarf das Instrument der Kalibrierung. Dies wird unter Verwendung kugelförmiger Latexteilchen bekannten Volumens und durch Vergleich mit Zellvolumina, die unter Verwendung herkömmlicher Techniken bestimmt wurden, durchgeführt.
Versuchsergebnisse haben gezeigt, dass die Abbildung gemessener Spannung in Bezug auf das sphärische Volumen von handelsüblich erhältlichen Latexteilchen eine lineare Funktion ist. Entsprechend muss lediglich eine einzige Größe von kugelförmigen Latexteilchen verwendet werden, um den korrekten Umwandlungsfaktor zu bestimmen. In einem ersten Kalibrierungsschritt wurde eine Probe, die Latexteilchen enthielt, die von der Bangs Laboratories Inc. hergestellt wurden und einen Durchmesser von 5,06 μm, d. h. ein Volumen von 67,834 m³, aufwiesen, durch das Instrument aufbereitet. Die dreidimensionale Kurve für die Latexteilchen wird in 7 gezeigt, wobei in 8 eine Kurve von Osmolalität gegenüber mittlerer Spannung gezeigt wird. Bei dieser bestimmten Prüfung erzeugte das Instrument eine mittlere Spannung von 691,97 mV. Das sphärische Volumen wird durch folgende Gleichung angegeben: Sphärisches Volumen = gemessene Spannung × KVolt wobei K_Volt der Spannungsumwandlungsfaktor ist.
Bei Umstellung ergibt sich aus dieser Gleichung:
was in diesem Fall ergibt:
Dieser Wert für K_Volt ist nur für das bestimmte geprüfte Instrument gültig und ist in einem Speicher in dem Instrument gespeichert.
Bei einem zweiten Kalibrierungsschritt wird ein Fomtkorrekturfaktor bestimmt, um dem Umstand Rechnung zu tragen, dass das durchschnittliche Blutkörperchen in dem durchschnittlichen Individuum eine bikonkave Form besitzt. Das Anwenden des vorgenannten Spannungsumwandlungsfaktor K_Volt setzt voraus, dass, wie die Latexteilchen, Blutkörperchen kugelförmig sind und daher ein inkorrektes Zellvolumen bei Zellformen außer der kugelförmigen ergeben würden. Bei der vorliegenden Erfindung wird eine variable Formkorrekturfunktion bestimmt, so dass das mittlere Volumen der Blutkörperchen bei einer Osmolalität bis zu der kritischen Osmolalität, die Lyse verursacht, extrem genau berechnet werden kann.
Um dies darzustellen, wurde eine Probe bei einer Reihe von genau bekannten Osmolalitäten geprüft und das Volumen der Blutkörperchen unter Verwendung eines Standardbezugsverfahrens, Hämatokrit, gemessen. Ein Teil derselben Probe wurde außerdem durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung unter Verwendung des Instruments von 1 geprüft, um die Spannungsimpulse von Einzelzellen bei den entsprechenden Osmolalitäten zu messen. Die Ergebnisse dieser Abläufe werden in Tabelle 1 gezeigt und als zwei übereinandergelegte Kurven von Osmolalität (X-Achse) gegenüber gemessener Spannung bzw. wahrem Volumen in 9 dargestellt.
Bei einer isotonischen Osmolalität von 290 mosm betrug das wahre Volumen gemäß Bestimmung durch die Hämatokrittechnik 92,0 fl, während die mittlere Spannung 670 mV betrug.
Das wahre isotonische Volumen der Zellen ergibt sich aus der Gleichung: Volumeniso = Spannungiso × KVolt × KForm wobei Spannung_iso die gemessene Spannung ist und K_Form ein Formkorrekturfaktor ist.
Bei Umstellung:
was in diesem Beispiel Folgendes ergibt:
Tabelle 1 zeigt den Formkorrekturfaktor K_Form für jede der anderen Aliquoten und demonstriert, dass der auf jede Probe anzuwendende Faktor unterschiedlich ist, wobei die maximale Formkorrektur bei isotonischen Osmolalitäten anzuwenden ist, bei denen die Blutkörperchen bikonkav statt sphärisch sind. Zum Automatisieren der Berechnung von K_Form bei einer Osmolalität von Interesse ist eine Formkorrekturfunktion erforderlich. Die folgende allgemeine Funktion beschreibt einen Formkorrekturfaktor basierend auf zwei Sensormesswerten, d. h. gemessene Spannungen:
f(K_Form) = f(SR1, SR2)
wobei SR1 ein Sensormesswert (gemessene Spannung) bei einer bekannten Form, typischerweise kugelförmig, ist und SR2 ein Sensormesswert (gemessene Spannung) bei einer Osmolalität von Interesse, typischerweise isotonisch, ist.
Analyse hat gezeigt, dass dies eine lineare Funktion ist und dass:
wobei K_a eine vorrichtungsabhängige Konstante ist, die wie folgt bestimmt wird:
K_Form bei einer Osmolalität von 290 mosm ist bekannt (siehe oben), wobei das Anwenden der Werte SR1 = 1432 mV, SR2 = 670 mV und K_Form = 1,4 auf die vorgenannte Gleichung Folgendes ergibt:
Bei Umstellung:
K_a = 0,7518
Dieser Wert von K_a ist für dieses Instrument konstant.
Das wahre isotonische Volumen einer Blutprobe wird bestimmt durch Vergleichen der gemessenen Spannung bei einem isotonischen Volumen von Interesse mit der gemessenen Spannung von Zellen derselben Blutprobe bei bekannter oder erkennbarer Form, am besten Zellen, die eine kugelförmige Form angenommen haben, wobei:
Bei der vorliegenden Erfindung kann der Punkt, an dem die Blutkörperchen kugelförmig werden, wenn sie einem vorgegebenen kontinuierlichen osmotischen Gradienten ausgesetzt werden, sehr genau bestimmt werden. Die 10a bis 10d zeigen die Ergebnisse für eine normale Blutprobe von einem gesunden Individuum. 10a zeigt eine dreidimensionale Kurve gemessener Spannung gegenüber Osmolalität, 10b zeigt eine grafische Darstellung von Osmolalität gegenüber der prozentualen Änderung gemessener Spannung für eine Reihe von Prüfungen einer Probe, 10c zeigt die Ergebnisse in einer tabellarischen Form und 10d zeigt übereinandergelegte grafische Darstellungen von mittlerer Spannung bzw. Zellzahl für die Prüfung gegenüber Osmolalität. Wie gezeigt wird, verringert sich die Zellzahl, die anfänglich 5000 Zellen pro Sekunden am Anfang einer Prüfung beträgt, über den Test hinweg auf Grund der Verdünnung der Probe in dem Gradientenerzeugerabschnitt (2). Die mittlerer Spannung steigt zu einem Maximum bei einer kritischen Osmolalität, bei der die Blutkörperchen eine kugelförmige Form erreichen, und verringert sich dann. Unter Verwendung von Standardstatistiktechniken können die Maxima der Kurve in 10b und daher die mittlere Spannung an den Maxima bestimmt werden. Die mittlere Spannung an diesem Punkt ergibt den Wert SR1 für die vorgenannte Gleichung. Es ist dann möglich, eine Osmolalität von Interesse und die zugehörige gemessene Spannung SR2 auszuwählen und das wahre Volumen der Zelle bei dieser Osmolalität zu berechnen. Typischerweise wird die isotonische Osmolalität gewählt, die ungefähr 290 mosm entspricht.
Bei der vorgenannten Prüfung bei 290 mosm gilt SR1 = 1432 mV und SR2 = 670 mV. Entsprechend:
K_Form290 = 1,40
und daher:
Volumen_iso = SR2 × K_Volt × K_Form
= 670 × 0,0980 × 1,40
= 91,92 fl,
und:
Volumen_sph = SR1 × K_Volt × K_Form
= 1432 × 0,098 × 1,0
= 140,34 fl,
Kenntnis dieses mittleren Volumens der kugelförmigen Zellen ermöglicht die Berechnung von sphärischem Radius als:
davon der sphärische Wert:
Nachdem Volumen_iso, Volumen_sph und der sphärische Zellradius bestimmt wurden, ist es möglich, eine Reihe von anderen Parametern zu berechnen. Im Besonderen:
1. Oberflächenbereich (OB)
Da der Oberflächenbereich (OB) bei allen Osmolalitäten eigentlich unverändert ist, kann, da die Zellmembran eigentlich unelastisch ist, und im Besonderen zwischen sphärisch und isotonisch, der Oberflächenbereich (OB) durch Einsetzen von r in den Ausdruck berechnet werden:
OB = 4Πr²
= 4Π × (3,22)²
= 130,29 μm²
2. Verhältnis Oberflächenbereich zu Volumen (VOBV)
Angesichts des Umstands, dass die Wände eines roten Blutkörperchens verformt werden können, ohne ihre Fläche zu verändern, ist, sobald der Oberflächenbereich (OB) für eine Zelle oder einen Satz Zellen einer bestimmten Form bekannt ist, der Oberflächenbereich für eine andere Form bekannt und somit kann das Verhältnis Oberflächenbereich zu Volumen (VOBV) für ein Volumen berechnet werden. Das VOBV ergibt sich aus dem Ausdruck:
3. Sghärizitätsindex (SI)
Die vorliegende Erfindung kann leicht das VOBV messen, was eine bisher weithin zitierte, jedoch selten gemessene Indikation für Zellform ist. Bei einer kugelförmigen Zelle hat sie den Wert 3/r, aber da Zellen derselben Form, aber unterschiedlicher Größen unterschiedliche VOBV-Werte aufweisen können, ist es wünschenswert, den Sphärizitätsindex (SI) zu verwenden, der eine dimensionslose Einheit ist, die von Zellgröße unabhängig ist und sich aus dem folgenden Ausdruck ergibt:
4. Zelldurchmesser (D)
Wenn die normale Zelle bei isotonischer Osmolalität die Form einer bikonkaven Scheibe aufweist, ist bekannt, dass das Verhältnis des Radius einer Kugel zu dem der bikonkaven Scheibe 0,8155 beträgt. Auf dieser Basis ergibt sich daher der Durchmesser D einer Zelle in der Form einer bikonkaven Scheibe aus:
Derselbe Parameter kann für alle anderen Osmolalitäten bestimmt werden. Die Häufigkeitsverteilung der Zelldurchmesser wird sowohl als Dispersionsstatistik als auch als eine Häufigkeitsverteilungskurve angegeben. Die vorliegende Erfindung stellt eine automatisierte Version des bekannten manuellen Ablaufs zur grafischen Darstellung einer Häufigkeitsverteilung isotonischer Zelldurchmesser, bekannt als Price-Jones-Kurve, bereit. Die vorliegende Erfindung ist in der Lage, eine Price-Jones-Kurve von Zelldurchmessern für eine Zellform und im Besonderen für isotonische und kugelförmige Zellen und Schattenzellen (einer Osmolalität) zu erzeugen und basiert typischerweise auf 250.000 Zellen. Dies wird in 10 gezeigt.
5. Zelldicke (ZD)
Wenn die Zelle die Form einer bikonkaven Scheibe aufweist, kann eine angenäherte Messung der Zelldicke aus der Querschnittsfläche und dem Volumen abgeleitet werden. Die Fläche kann selbstverständlich aus dem Radius der Zelle in sphärischer Form abgeleitet werden. Die Zelldicke kann daher wie folgt berechnet werden:
6. Oberflächenbereich je Milliliter (OBml)
Das Produkt des Oberflächenbereichs (OB) und der Zellzahl (RBZ) ist der Oberflächenbereich pro Milliliter (OBml), der für physiologischen Austausch verfügbar ist. Typischerweise weist eine gesunde erwachsene männliche Person einen Wert von 1.000.000 mm²/ml oder 1 m²/ml auf. Der Gesamtoberflächenbereich der proximalen Merenkanäl chen, die für die Säure-Basen-Regulierung der Körperflüssigkeiten verantwortlich sind, beträgt 5 m². Der Gesamtoberflächenbereich der roten Blutkörperchen, die außerdem eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Säure-Basen-Haushalts spielen, beträgt 4572 m² und ist fast 3 Größenordnungen größer. Die RBZ wird intern anhand der Kenntnis der Fließgeschwindigkeit der verdünnten Blutprobe, einer Zellzahl für jede Probe und der Verdünnung der ursprünglichen vollständigen Blutprobe berechnet. Typischerweise beträgt die RBZ ungefähr 4,29 × 10⁹ rote Blutkörperchen pro ml.
OBml = OB × RBZ (pro ml)
= 130,29 μm² × 4,29 × 10⁹ pro ml
= 0,56 m² ml^–1
Die vorgenannten Parameter werden berechnet und zusammen mit der charakteristischen Kurve für Osmolalität gegenüber prozentualer Änderung der Spannung in 10b angezeigt.
12 stellt die dreidimensionale Häufigkeitsverteilung einer Probe von einem Patienten mit einer HbCC-Erkrankung dar. Wie gezeigt wird, ist die Kurve stark abnormal.

Claims

Verfahren, bei dem eine Probe von Zellen, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, wobei die Zellen wenigstens eine messbare Eigenschaft haben, die sich von der des flüssigen Mediums unterscheidet, Analyse mit einem Verfahren unterzogen wird, das die folgenden Schritte einschließt: (a) Leiten einer ersten Aliquote der Proben-Zellsuspension durch einen Sensor, (b) Messen der wenigstens einen Eigenschaft der Zellsuspension, während jede einer Anzahl von Zellen der ersten Aliquote durch den Sensor hindurchtritt, (c) zellenweises Aufzeichnen der Messung der Eigenschaft für die erste Aliquote von Zellen, (d) Änderung wenigstens eines Parameters der Zellenumgebung, die das Potential hat, die wenigstens eine Eigenschaft der Zelle zu ändern, für die erste oder wenigstens eine andere Aliquote der Proben-Zellsuspension, um eine veränderte Zellsuspension herzustellen, (e) Leiten der veränderten Zellsuspension durch einen Sensor, (f) Messen der wenigstens einen Eigenschaft der veränderten Zellsuspension, während jede einer Anzahl von Zellen der veränderten Zellsuspension durch den Sensor hindurchtritt, (g) zellenweises Aufzeichnen der Messung der wenigstens einen Eigenschaft für die veränderte Zellsuspension, (h) Vergleichen der Daten aus den Schritten (c) und (g) als Funktion des Ausmaßes der Änderung des Parameters der Zellenumgebung und der Häufigkeitsverteilung der wenigstens einen Eigenschaft.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Änderung des Umgebungsparameters eine Veränderung der Osmolalität ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe kontinuierlich in eine Lösung eingeleitet wird, deren Osmolalität kontinuierlich geändert wird, um einen kontinuierlichen Gradienten von Aliquoten zum Hindurchleiten durch die Erfassungszone zu erzeugen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei identische Teile der geprüften Probe Lösungen jeder Osmolalität über einen Testbereich nach im Wesentlichen der gleichen Zeit von der Durchführung der Änderung des Umgebungsparameters bis zur Zeit des Hindurchtretens durch die Erfassungszone ausgesetzt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelleigenschaft elektrischer Widerstand oder Impedanz ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, das des Weiteren den Schritt des Darstellens der Ergebnisse der Analyse in Form einer dreidimensionalen Kurve umfasst.
Computerprogramm-Erzeugnis, das durch Computer ausführbare Befehle zum Durchführen des Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche umfasst.
Vorrichtung, die das Computerprogramm-Erzeugnis nach Anspruch 7 umfasst.