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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vorrichtungen
zur Analyse von Vollblutproben und auf Verfahren und Vorrichtungen
zur Bewertung von Bestandteilen innerhalb einer Vollblutprobe, wie
etwa weiße
Blutzellen, Blutplättchen usw.
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2. Hintergrundinformation
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Die
vor kurzem gemacht Fortschritte in der analytischen Hämatologie
haben die Quantität
und Qualität
der von einer Patientenblutprobe erhältlichen Informationen ansteigen
lassen. Im Ergebnis stieg das Interesse der medizinischen Gemeinschaft an
der Verwendung einer Blutprobe eines Patienten als ein diagnostisches
Werkzeug ebenfalls an. Die Verfahren zur Analyse von Blutproben
haben jedoch nicht in jedem Fall mit der erhältlichen Information Schritt
gehalten. Historisch wurden Blutproben durch Ausstreichen einer
geringen Menge nichtverdünnten Bluts
auf einem Objektträger,
Trocknen, Fixieren und Färben
und Untersuchung des Ausstrichs unter einem Mikroskop bewertet.
Mit einem derartigen Ausstrich können
angemessene Ergebnisse erzielt werden, aber die Genauigkeit und
Verlässlichkeit
der Daten hängt
stark von der Erfahrung und Technik des technischen Assistenten
ab. Außerdem
sind Blutausstriche arbeits- und kostenintensiv und daher im Allgemeinen
nicht für
kommerzielle Anwendungen bevorzugt.
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Ein
weiteres bekanntes Verfahren zur Untersuchung einer Vollblutprobe
umfasst das Verdünnen eines
Volumens des Vollblutes, Anordnen in einer Kammer und manuelles
Untersuchen der Zellbestandteile innerhalb der verdünnten Probe.
Die Verdünnung
ist notwendig, da die Anzahl und Konzentration der roten Blutzellen
(rote Blutkörperchen;
RBZ) im Vollblut erheblich die Zahl anderer zellulärer Bestandteile übertrifft.
In einer Vollblutprobe von einem typischen Individuum sind zum Beispiel
etwa 4,5 × 106 RBZ/Mikroliter (μl) der Blutprobe, aber nur etwa 0,25 × 106 Blutplättchen
und 0,007 × 106 weiße
Blutzellen (WBZ) pro μl
der Blutprobe. Um die Anzahl der WBZ zu bestimmen, muss die Vollblutprobe
innerhalb eines Bereichs von einem Teil Blut auf zwanzig Teile Verdünnungsmittel
(1:20) bis zu einer Verdünnung
von etwa 1:256 verdünnt
werden, in Abhängigkeit
von der genau verwendeten Technik, und es ist ebenfalls allgemein
notwendig, die RBZ mit einem oder mehreren Reagenzien selektiv zu
lysieren. Die Lyse der RBZ entfernt sie wirkungsvoll aus dem Gesichtsfeld,
so dass die WBZ gesehen werden können.
Um die Anzahl der Blutplättchen
zu bestimmen, muss die Blutprobe in einem Bereich von etwa 1:100 bis
etwa 1:50.000 verdünnt
werden. Die Blutplättchenauszählung erfordert
jedoch nicht eine Lyse der RBZ in der Probe. Ein Nachteil dieses
Verfahrens der Untersuchung einer Vollblutprobe ist, dass der Verdünnungsvorgang
zeitintensiv und teuer ist. Zusätzlich
steigert die Zugabe von Verdünnungsmitteln
zu der Vollblutprobe die Fehlerwahrscheinlichkeit innerhalb der
Probendaten.
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Ein
modernes Verfahren zur Untersuchung einer Blutprobe ist die Impedanz-
oder optische Durchflusszytometrie. Die Durchflusszytometrie umfasst das
Zirkulieren einer verdünnten
Blutprobe durch eine oder mehrere Auslassöffnungen mit geringem Durchmesser,
wobei jede daneben einen Sensor vom Impedanztyp oder vom optischen
Typ hat, welcher die zellulären
Bestandteile bewertet, wenn sie durch die Öffnung 1 hinter dem
anderen durchtreten. Hierbei muss wieder die Blutprobe verdünnt werden,
um die relativ zu der Anzahl der WBZ und der Blutplättchen riesige
Anzahl der RBZ auszugleichen. Obwohl nützlicher und gleichbleibender
als die vorher beschriebenen verfahren weist die Durchflusszytometrie
ebenfalls eine Anzahl von Nachteilen auf. Einige dieser Nachteile
stammen aus der zum Befördern
der Probe erforderlichen Rohrleitung und den Flüssigkeitskontrollen, notwendig
um die Flüssigkeitsrate
durch die Sensoreinrichtung zu steuern. Die genaue Steuerung des
Probenflusses ist für
den Betrieb des Durchflusszytometers wesentlich. Die Rohrleitung
innerhalb des Durchflusszytometers kann und tut oftmals lecken,
wobei sie möglicherweise
die Genauigkeit und die Sicherheit der Anlage aufs Spiel setzt.
Die Flüssigkeitsflusssteuerungen
und die Verdünnungsausstattung
auf der anderen Seite erfordern periodische Wiedereinstellung. Die
Notwendigkeit zum Wiedereinstellen veranschaulicht die Möglichkeit
ungenauer Ergebnisse und unerwünschter Betriebskosten,
die bei vielen derzeit erhältlichen
hämatologischen
Analysatoren vorhanden ist, welche Durchflusszytometer verwenden.
Ein weiterer Nachteil ist das erforderliche Reagenzvolumen. Auf
Grund der starken verwendeten Verdünnungsraten sind entsprechend
große
Volumina von flüssigen
Reagenzien notwendig. Das große
Reagenzienvolumen steigert die Untersuchungskosten und verursacht
ein Abfallbeseitigungsproblem.
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Ein
weiterer Ansatz der zellulären
Analyse ist volumetrisches Kapillarscannen, wie z.B. in den US Patenten
Nr. 5,547,849 und 5,585,246 behandelt, wobei eine relativ unverdünnte Vollblutprobe
in einer Kapillare mit bekanntem Volumen und bekannter Stärke angeordnet
und untersucht wird, während
das Blut in einem Ruhezustand ist. Diese Technik arbeitet mit dem
Vorhandensein von RBZ durch Begrenzen der abtastenden Wellenlängen auf
diejenigen, bei denen die RBZ relativ transparent erscheinen, und
es erfordert, dass die Probe so behandelt wird, dass die RBZ nicht
während
des Messvorgangs aggregieren. Folglich ist diese Technik auf die
Verwendung von Fluoreszenz mit langer Wellenlänge beschränkt und es wird keine Untersuchung
von RBZ und Blutplättchen
oder die Untersuchung einer zellulären Morphologie zur Verfügung gestellt.
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Was
erforderlich ist, ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung
einer Probe von im Wesentlichen unverdünntem, koagulationsgehemmtem
Vollblut, dass: 1) genaue Ergebnisse zur Verfügung stellen kann; 2) nicht
die Entfernung der RBZ vor der Analyse erfordert; 3) die Verwendung
eines weiten Bereichs von Lichtanregungsquellen zur Probenuntersuchung
erlaubt; 4) keine großen
Reagenzvolumina verwendet; 5) keinen Probenflüssigkeitsfluss während der
Analyse erfordert; 6) alle oder nahezu alle Zellen und Partikel
in der Probe analysieren kann; und 7) kostengünstig ist.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Es
ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur genauen Bewertung der Bestandteile einer Probe von im Wesentlichen
unverdünntem,
koagulationsgehemmtem Vollblut zur Verfügung zu stellen.
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Es
ist eine weitere Aufgabe, ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Vollblutprobe zur Verfügung zu stellen, das keine
wesentliche Verdünnung
erfordert.
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Es
ist eine weitere Aufgabe ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Vollblutprobe zur Verfügung zu stellen, die nicht
die Verwendung von großen
Volumina von flüssigen
Reagenzien erfordern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Vollblutprobe zur Verfügung zu stellen, die keinen
Probenflüssigkeitsfluss
während
der Bewertung erfordern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Vollblutprobe zur Verfügung zu stellen, welche nicht
die Entfernung der Mehrzahl der RBZ vor der Analyse erfordern.
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Es
ist eine weitere Aufgabe ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Probe zur Verfügung
zu stellen, welche die Bewertung nahezu aller Bestandteile der Probe
ermöglicht.
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Es
ist eine weitere Aufgabe ein Verfahren und eine Vorrichtung zur
Bewertung einer Vollblutprobe zur Verfügung zu stellen, die einfach
in der Verwendung sind.
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Diese
Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung für die Verwendung
bei der Bewertung und dem Erhalt von Informationen von einer ruhigen,
im Wesentlichen unverdünnten,
koagulationsgehemmten Vorblutprobe zu erhalten, welche in einer
Kammer enthalten ist. Der Ausdruck „im Wesentlichen unverdünnt", wie er in Verbindung
mit dieser Erfindung verwendet wird, beschreibt eine Blutprobe welche
nicht mehr als etwa 1:1 und bevorzugt viel weniger verdünnt ist.
Im Allgemeinen sind die einzigen Reagenzien, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
verwendet werden Farbstoffe, Färbemittel
und Koagulationshemmer, und diese Reagenzien werden nicht zum Zweck
der Verdünnung
der Probe, sondern werden eigentlich zugegeben, um eine Reaktion,
eine Wirkung oder ahnliches zu erzeugen, das die vorliegende Untersuchung
ermöglicht.
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Erfindungsgemäß wird ein
Verfahren nach Anspruch 1 zur Verfügung gestellt. Wie in dieser
Anmeldung verwendet, ist der Begriff Farbmittel als jedes Mittel
definiert, das ein messbares Signal durch Fluoreszenzimmission oder
durch Absorption von Licht einer spezifischen Wellenlänge erzeugt,
die durch die Vorrichtung quantifiziert werden kann.
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Ein
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist, dass ein Verfahren zur Untersuchung der Bestandteile einer
Probe von im Wesentlichen unverdünnten,
korrelationsgehemmten Vollblut vorgesehen wird, das genaue Informationen
zur Verfügung stellt.
Spezifischer verhindert das vorliegende Verfahren die Notwendigkeit
der Flüssigkeitsflusssteuerung
und der Probenverdünnung
und die damit verbundene Fehlerwahrscheinlichkeit.
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Ein
weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass Bestandteile innerhalb
einer koagulationsgehemmten Vollblutprobe ohne wesentliche Verdünnung der Probe
untersucht werden können.
Das vorliegende Verfahren erfordert den Zusatz einer relativ geringen Menge
eines wahrnehmbaren Farbmittels zu der Vollblutprobe, wodurch ermöglicht wird,
dass die Probe im Wesentlichen unverdünnt verbleibt. Der Aufwand
und die mit der Verdünnung
assoziierten Probleme, werden konsequenterweise vermieden. Zum Beispiel
können
bei dem vorliegendem Verfahren verwendbare Informationen mit einer
100 μl-Blutprobe
gemischt mit etwa 10 μl
eines in Saline verdünnten
Farbmittels, oder weniger als 1 μl
des trockenen Reagenzmittels, gewonnen werden.
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Ein
weiterer Vorteil ist, dass die vorliegende Erfindung keine großen Mengen
an Reagenzien erfordert, falls Bestandteile einer Probe einer im
Wesentlichen unverdünnten,
koagulationsgehemmten Vollblutprobe untersucht werden. Eine Fachperson wird
erkennen, dass das Senken der Reagenzienmenge hilft, die anfänglichen
Materialkosten der Analyse und die Kosten der Handhabung des verwendeten
Reagenz nach der Analyse zu senken.
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Ein
weiter Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass Probenflüssigkeitsfluss
nicht erforderlich ist. Das vorliegende Verfahren ermöglicht die
zu untersuchende Blutprobe während
eines ruhigen (oder „im Wesentlichen
bewegungslosen")
Zustands zu untersuchen. Die einzige Bewegung in der Blutprobe wird die
Brownsche Bewegung der geformten Bestandteile innerhalb der Probe
sein, wobei diese Bewegung die Verwendung der Vorrichtung dieser
Erfindung nicht behindert. Im Ergebnis werden Rohrleitungslecks
und Umwelt- und/oder Sicherheitsprobleme verbunden mit derartigen
Lecks vermieden. Zusätzlich
verhindert die Untersuchung der Probe in einem ruhigen Zustand ebenfalls
die Notwendigkeit von Flüssigkeitsflussteuerung
und daher die Kosten für die
Beschaffung und den Erhalt derartiger Steuerungen. Eine Fachperson
wird erkennen, dass die mit vielen Durchflusszytometern verbundenen
Erhaltungskosten beträchtlich
sind, und dass ein Vermeiden derartiger Kosten ein klarer Vorteil
ist.
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Diese
und andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung
werden deutlich im Licht der ausführlichen Beschreibung des besten Art
der Ausführungsbeispiele
davon, wie in den beigefügten
Zeichnungen dargestellt.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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Die 1 ist
eine schematische perspektivische Ansicht einer Probenkammer.
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Die 2 ist
eine schematische Querschnittansicht einer Probenkammer, welche
eine geneigte, flache zweite Wand hat. Ein Gradient der Dicke durch die
Ebene wird zwischen den ersten und den zweiten Wänden gebildet.
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Die 3 ist
eine schematische Querschnittansicht einer Probenkammer, welche
eine zweite flache Wand, angeordnet über einer ersten Wand mit einer
Mehrzahl von Stufen enthält.
Die Mehrzahl von Stufen stellt eine Mehrzahl von Kammerregionen
mit einer unterschiedlichen Dicke durch die Ebene zur Verfügung.
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Die 4 ist
eine schematische Querschnittansicht einer Probenkammer mit einer
flachen zweiten Wand, angeordnet über einer ersten Wand mit einer
Oberfläche,
die sich in einem Winkel zu der zweiten Wand erstreckt. Ein Gradient
der Dicke durch die Ebene wird zwischen den ersten und zweiten Wänden gebildet.
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Die 5 ist
eine schematische Ansicht einer Probenkammer, welche das sichtbare
opake Auftreten einer im Wesentlichen unverdünnten, koagulationsgehemmten
Vollblutprobe darstellt, bevor sich Geldrollen oder Lakunen gebildet
haben.
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Die 6 ist
eine schematische Ansicht einer Probenkammer, welche das Auftreten
von Geldrollen und Lakunen innerhalb einer im Wesentlichen unverdünnten, koagulationsgehemmten
Vollblutprobe darstellt, gebildet nach einer Ruheperiode innerhalb
der Kammer.
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BESTE ART
DER AUSFÜHRUNG
DER ERFINDUNG
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Das
Verfahren zur Untersuchung weißer Blutzellen
(WBZ), Blutplättchen
und anderer Vollblutbestandteile innerhalb einer Probe von im Wesentlichen
unverdünntem
koagulationsgehemmten Vollblut nach Anspruch 1 stellt viele Vorteile über bisher erhältliche
Bewertungsverfahren und Vorrichtungen zur Verfügung. Das vorliegende Verfahren
umfasst die Schritte von: a) Vorsehen einer Probenkammer 10;
b) Mischen eines nachweisbaren Farbmittels mit der Vollblutprobe;
Einsetzen der gemischten Probe in die Probenkammer 10;
d) ruhiges Halten der gemischten Probe in der Kammer 10 bis
sich Geldrollen 30 und Lakunen 32 (siehe 6)
innerhalb der Probe bilden; und e) Untersuchung eines oder mehrerer Zielbestandteile
innerhalb der Lakunen 32.
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Mit
Bezugnahme auf die 1 – 4 enthält die Probenkammer 10 eine
erste Wand 16 und eine transparente zweite Wand 18.
Die Wände 16, 18 sind
voneinander durch eine Dicke durch die Ebene 20 von bestimmbarer
Größe getrennt.
Wie hierin verwendet bezieht sich der Ausdruck „Dicke durch die Ebene" auf eine Sichtlinie,
die dem kürzesten
Abstand zwischen der Innenoberfläche 22 der
ersten Wand 16 und der inneren Oberfläche 24 der zweiten Wand 18 entspricht.
In einem ersten Ausführungsbeispiel
(2) sind die Wände 16, 18 im
Wesentlichen flach und parallel zueinander. In einem zweiten Ausführungsbeispiel
(2 und 4) nähern sich die Wände 16, 18 einander
an, wodurch ein Gradient der Dicke durch die Ebene 20 gebildet
wird. Die Wände 16, 18 des
zweiten Ausführungsbeispiels
können sich überkreuzen
(wobei in dem Fall die Dicke durch die Ebene 20 auf 0 geht)
oder die Wände 16, 18 können minimal
getrennt bleiben. In einem dritten Ausführungsbeispiel (3)
enthalten eine oder beide der Wände 16, 18 eine
oder mehrere Stufen 26. Jede Stufe 26 schafft
eine unabhängige
Region mit einer unterschiedlichen Dicke durch die Ebene 20.
In allen Ausführungsbeispielen
können,
wo es notwendig ist, Abstandhalter 28 verwendet werden,
um die Dicke durch die Ebene 20 zwischen den zwei Wänden 16, 18 zu
schaffen/zu erhalten, und die Wände 16, 18 (oder
die Stufenregionen 26) können im Wesentlichen flach
oder bogenförmig
sein.
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Die
Dicke durch die Ebene 20 zwischen den Wänden 16, 18 kann
mathematisch und/oder optisch oder durch Vergleich unter Verwendung
einer bekannten Referenz bestimmt werden. Wenn zum Beispiel die
Neigung oder Wände 16, 18 bekannt
ist und die Wände 16, 18 in
Kontakt sind (oder in einem gewissen Abstand getrennt sind; zum
Beispiel durch einen Abstandshalter 28) dann kann die Dicke
durch die Ebene 20 mathematisch an jedem gewählten Punkt
unter Angabe des Abstands vom Kontaktpunkt (oder des Abstandshalters 28)
berechnet werden. Die Dicke durch die Ebene 20 kann ebenfalls
unter Verwendung von optischen Techniken bestimmt werden einschließlich, aber
nicht drauf begrenzt, Interferometrie, konfokale Mikroskopie oder ähnliches.
Eine vollständige
Beschreibung der Verfahren zur Bestimmung der Dicke durch die Ebene 20 kann
in der US Patentanmeldung Nr. 09/248,135 (Anwaltsliste UFB-013)
gefunden werden. Unabhängig
davon welches Verfahren verwendet wird, kann die Dicke durch die
Ebene während
des Herstellungsverfahrens der Kammer 10 fixiert und bestimmt
werden, oder die Dicke durch die Ebene 20 kann zu einem
späteren
Zeitpunkt vor Einbringen der Probe oder nachdem die Probe eingebracht
wird (zum Beispiel beim Endverbraucher) bestimmt werden. Im Allgemeinen
diktieren die Größe des Zielbestandteils
und der Hämatokrit
der Probe die vorteilhafteste Dicke durch die Ebene 20.
Die Beziehung zwischen den Bestandteilen und der Dicke durch die
Ebene 20 wird im Folgenden ausführlich diskutiert.
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Die
Vollblutprobe wird mit einer Menge wenigstens eines nachweisbaren
Farbmittels gemischt, welche ausreichend das Sichtbarmachen der
Zellen oder Partikel erlaubt. Das nachweisbare Farbmittel kann jedes
Material sein, dass: 1) den Zielbestandteil innerhalb der Vollblutprobe
hervorhebt; und 2) im Wesentlichen die Vollblutprobe beim Mischen
nicht verdünnt.
Ein Beispiel eines nachweisbaren Farbmittels ist ein Fluoreszenz
hervorhebendes Supravitalfärbemittel,
wie etwa Acridinorange, basisches Orange 21 oder ein ähnlicher Farbstoff,
der unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops gesehen werden kann.
In einigen Fällen
kann ein einzelnes Farbmittel verwendet werden, um verschiedene
Bestandteile zu identifizieren. In anderen Fällen kann eine Mehrzahl von
Farbmitteln verwendet werden, um eine Mehrzahl von Bestandteilen
hervorzuheben. Andere Bestandteilsbewertungen, wie etwa die in der
US Patentanmeldung Nr. 09/249,721 (Anwaltsliste Nr. UFB-016) können gleichzeitig
durch Zugabe eines weiteren nachweisbaren Farbmittels durchgeführt werden.
Die Zugabe des nachweisbaren Farbmittels kann durch Zugabe einer
kleinen Menge des Farbmittels in flüssiger Form zu der Vollblutprobe
erfolgen, wodurch folglich eine minimale Verdünnung der Probe geschaffen
wird, oder das Farbmittel kann in einer getrockneten Form, wie etwa
einer kleinen Tablette, zugegeben werden. Ein alternatives Mittel
zur Mischung des nachweisbaren Farbmittels in die Vollblutprobe
ist, den Farbstoff auf einem Bereich der Probenkammer 10 zu
trocken. Falls die Vollblutprobe in die Kammer 10 eingebracht
ist, diffundiert das Farbmittel in die Probe.
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Eine
Menge der gemischten Vollblutprobe, groß genug um beide Kammerwände 16, 18 zu
berühren,
wird in die Kammer 10 eingebracht. Die Probe kann in die
Kammer 10 durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich der
Verwendung einer Blase, Kapillarwirkung usw. eingebracht werden.
Verfahren und Vorrichtungen welche das Potenzial der Probe verschüttet zu
werden minimieren, sind aus Umwelt- und Sicherheitsgründen bevorzugt.
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Mit
Bezugnahme auf die 5 und 6, wird
nach Aufnahme in die Kammer 10, die Probe für einen
kurzen Zeitraum ruhig gehalten, um die Bildung von Geldrollen 30 und
Lakunen 32 (siehe 6) zu ermöglichen.
Wie vorher erwähnt,
wird die einzige Bewegung in der Blutprobe die Brownsche Bewegung
der geformten Bestandteile der Probe sein, wobei diese Bewegung
nicht die Verwerdung der Vorrichtung dieser Erfindung behindert.
Die Geldrollen 30 sind Anhäufungen von roten Blutzellen
(RBZ), die sich spontan in im Wesentlichen bewegungsfreien, koagulationsgehemmten
Vollblut bilden. Die Lakunen 32 sind die zwischen den Geldrollen 30 verbleibenden
offenen Bereiche. Die Bildung von Geldrollen 30 und Lakunen 32 tritt
natürlicherweise
in koagulationsgehemmtem Vollblut auf, da die Anziehungskräfte, welche
die RBZ aggregieren, die anderen Bestandteile, wie etwa WBZ 34 und
Blutplättchen 36 (siehe 6),
in die Lakunen 32 drängen,
wo sie untersucht werden können.
Das im Wesentlichen bewegungsfreie Halten einer Vollblutprobe für etwa 15
bis 30 Sekunden ist im Allgemeinen angemessen, um die Bildung von
Geldrollen 30 und Lakunen 32 zu ermöglichen,
aber die Zeit kann von Probe zu Probe schwanken. Die Bildung der
Geldrollen 30 kann ebenfalls durch bekannte Aggregationsmittel
beschleunigt werden, wobei in diesem Fall Klumpen von RBZ als Aggregate
bezeichnet werden würden.
Beispiele für derartige
Aggregationsmittel sind Dextran, Polybrene und Mischung der beiden,
Antikörper
gegen herkömmlich
Antigene der roten Zellen und pflanzliche Lektine und ähnliches.
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Die
Dicke durch die Ebene 20 der untersuchten Vollblutprobe
ist kritisch bei der Bewertung der Probenbestandteile. Zum Beispiel
wenn eine 100μ (1μ = 1 × 10-6 Meter) dicke Schicht des im wesentlichen
unverdünnten,
koagulationsgehemmten Vollblutes mit einem Mikroskop untersucht
wird, wird die Probe opak erscheinen (wie in 5 dargestellt),
da Licht nicht angemessen durch die Schicht treten kann, unabhängig davon
ob die RBZ Geldrollen 30 bilden. Wenn jedoch die Probenschichtdicke
etwa auf weniger als 70 μ verringert
wird, bevorzugt auf zwischen 4 μ und
50 μ, wird
eine ausreichende Menge Licht durchtreten, so dass die Lakunen 32 als
klare Seen erscheinen, in denen die WBZ 34 und Blutplättchen 36 hervorgehoben
und untersucht werden können.
Die optimale Probenschichtstärke,
um die Bewertung der Bestandteile innerhalb der Lakunen 32 zu
ermöglichen,
wird von dem ursprünglichen
Hämatokrit
der Probe anhängen.
Der Hämatokrit,
der sich auf die Anzahl der RBZ als ein Prozentsatz der Vollblutprobe
bezieht, ist umgekehrt mit der optimalen Probenschichtstärke verbunden,
d.h. ein höherer
als typischer Hämatokrit
ist allgemein verbunden mit einem dünneren als typischen optimalen
Probenschicht. In allen Fällen
jedoch muss die Probenschicht dick genug sein, um eine ausreichende
Anzahl von Partikeln oder Zellen zur Verfügung zu stellen. Es ist zu
bemerken, dass nicht jeder einzelne interessante Bestandteil in
die Lakunen 32 gedrängt werden
kann. Es ist nicht hinderlich für
diese Erfindung, wenn eine statistisch oder klinisch nicht signifikante
Anzahl der Bestandteile durch die RBZ-Aggregate verdunkelt werden.
Es ist ebenfalls möglich, dass
ein oder mehrere interessante Bestandteile auf der Oberseite eines
Aggregats von RBZ liegen, aber da diese Bestandteile sichtbar sein
werden (im Falle eines vertikalen Mikroskops), werden sie vollständig durch
Fluoreszenz zu untersuchen sein.
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Der
Zielbestandteil kann unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken
untersucht werden. Wenn zum Beispiel der Zielbestanteil mit einem
Fluoreszenzfarbstoff gefärbt
ist, können
die Lakunen 32 mit einem kommerziell erhältlichen
Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Das Fluoreszenzmikroskop
wird den mit dem Zielbestandteil interagierenden Fluoreszenzfarbstoff
anregen, wodurch er innerhalb der Probe hervorgehoben wird. Die
mit dem Fluoreszenzmikroskop erzeugte Abbildung kann in einer Bildsondenröhre (zum
Beispiel einer CCD-Kamera) aufgenommen
und die Abbildung manuell untersucht werden, oder die Abbildung
kann digitalisiert und in einer elektronischen Datei gespeichert
werden. Die elektronische Datei kann unter Verwendung von Analysesoftware
bewertet werden, die die Fähigkeit
hat zum Beispiel bestimmte Bestandteile zu identifizieren, das Auftreten
eines bestimmten Bestandteils zu quantifizieren und die Eigenschaften
der Bestandteile zu bewerten. Ein Beispiel der kommerziell erhältlichen
Analysesoftware ist die verkauft durch Signal Analytics Corporation
of Vienna, VA, U.S.A., oder andere derartige Bildverarbeitungssysteme.
Eine vollständigere
Beschreibung eines derartigen Abbildungsuntersuchungssystems wird
in der ebenfalls durch die Anmelderin eingereichten US Patentanmeldung
Nr. 09/255,673 (Anwaltsliste, Nr. UFB-017) zur Verfügung gestellt.
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Die
folgenden Beispiele werden darstellen, wie einzelne Vollblutprobenbestandteile
unter Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung der vorliegenden
Erfindung untersucht werden können:
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Beispiel 1:
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Mit
Bezugnahme auf die 5 und 6 können WBZ 34 in
einer mit einer kleinen Mengen eines nachweisbaren Farbmittels gemischten,
koagulationsgehemmten Vollblutprobe in einer Probenkammer 10 mit
einer Dicke durch die Ebene 20 (siehe 2–4) überall in
der Kammer 10 oder in einem Abschnitt der Kammer 10,
in etwa gleich zu 20 μ,
untersucht werden. EDTA ist ein Beispiel eines koagulationshemmenden
Mittels, das verwendet werden kann und ein Fluoreszenz hervorhebendes
Supravitalfärbemittel
wie etwa Acridinorange, basisches Orange 21 oder ähnliche
sind Beispiele für
nachweisbare Farbmittel, die verwendet werden können. Eine Dicke durch die
Ebene 20 von etwa 20 μ wird
aus einer Anzahl von Gründen
gewählt.
Zunächst
enthält das
Bewertungsvolumen eine verwendbare Anzahl von WBZ 34 für die Bewertung
und zweitens stellt eine Dicke durch die Ebene 20 von 20 μ typischerweise
eine optimale Kammer zur Bildung der Geldrollen 30 zur
Verfügung.
Das Volumen der zu untersuchenden Probe wird typischerweise durch
den Querschnittsbereich des Untersuchungsfeldes 38 und
die Dicke durch die Ebene 20 der Probe definiert. Wie vorher
erwähnt,
kann die genaue Dicke durch die Ebene 20 eines Feldes 38 innerhalb
der Kammer 10 unter Verwendung von verschiedenen Techniken
optimiert werden, einschließlich
von Iterationsverfahren, wobei die Population eines Zielbestandteils
in einem bestimmten Feld 38 statistisch untersucht und andere
Felder 38 wenn notwendig untersucht werden, um die Population
ansteigen oder sinken zu lassen.
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Die 5 stellt
ein Feld 38 der Probe kurz nach Einbringen in die Kammer 10 dar,
wobei zu diesem Zeitpunkt die Probe opak erscheint, falls sie entweder
mit Durchlicht oder mehr bevorzugt durch epiilluminierende Fluoreszenz
untersucht wird. Das opake Auftreten wird durch die RBZ 35 verursacht,
welche eine überlappende
Masse vor der Bildung der Geldrollen 30 bilden. Abgesehen
von der opaken Erscheinung des Probenfelds 38 ermöglicht das
Farbmittel einige WBZ 34 schwach hervorzuheben. Die 6 zeigt
die gleiche Kammer 10 nach im Wesentlichen bewegungsfreien
Liegen für
etwa dreißig
(30) Sekunden. Die RBZ 35 haben sich spontan in Geldrollen 30 verklumpt,
wobei sie Lakunen 32 zwischen den Geldrollen 30 zurücklassen.
Es ist in diesen Lakunen 32, wo die anderen Vollblutprobenbestandteile (zum
Beispiel WBZ 34 und Blutplättchen 36) hervorgehoben
und bewertet werden können.
Wenn eine Zählung
der WBZ 34 gewünscht
ist, kann ein Feld 38 mit einem Querschnittsbereich von
einem Quadratmillimeter innerhalb der Region der Kammer 10 mit einer
Dicke durch die Ebene 20 von 20 μ (welche 0,02 μl Volumen
der Vollblutprobe enthalt) untersucht werden. Eine 0,02 μl-Probe wird
gewählt,
um die Anzahl der WBZ 34 angemessen zu halten; eine normale
Vollblutprobe enthält
etwa 7000 WBZ pro μl
Probe und eine 0,02 μl
Probe von normalem Vollblut enthält etwa
140 WBZ. Eine Anzahl dieser Felder 38 würden gezählt werden, bis genug Zellen
gezählt
werden, um eine Anzahl zu erhalten, die eine ausreichende statistische
Genauigkeit aufweist, was in der Praxis etwa 1000 Zellen sind. Wenn
zusätzliche
Informationen zu den WBZ 34 gewünscht sind, können die
WBZ 34 (Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten usw.) weiterhin
innerhalb des Kammervolumens bewertet werden. Wenn es zum Beispiel
erwünscht
ist, die Arten der WBZ 34 innerhalb der Vollblutprobe und/oder
ihre Häufigkeit
zu klassifizieren, könnten
die WBZ unter Verwendung einer Bildsondenröhre mit/ohne Analysesoftware
untersucht werden. Ein Differenzialblutbild könnte aus den gesammelten Daten
bestimmt werden. Eine vollständigere
Beschreibung dieses Verfahrens wird in der zusammen eingereichten
US Patentanmeldung Nr. 09/252,153 (Anwaltslistennummer UFB-011) gegeben.
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Wenn
die Regionen der Lakunen 32 der Probe teilweise opak nur
bei einer Dicke durch die Ebene der Kammer von 20 μ erscheinen,
vielleicht als ein Ergebnis eines höheren als typischen Hämatokrits, kann
es erwünscht
sein, ein Probenfeld 38 innerhalb der Probenkammer 10 zur
Bewertung mit einer Dicke durch die Ebene von weniger als 20 μ zu bewerten. Auf
der anderen Seite, wenn der Hämatokrit
der Probe niedriger als typisch ist, kann es vorteilhaft sein, ein
Probenfeld 38 mit einer Dicke durch die Ebene 20 größer als
20 μ zu
verwenden, da die Population jedes Bestandteils wahrscheinlich größer ist.
Die Dicke durch die Ebene 20 der Probe kann ebenfalls als
ein Verfahren zur Steigerung beziehungsweise Senkung der Population
der Bestandteile geändert
werden.
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Beispiel II
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Blutplättchen 36 in
einer koagulationsgehemmten Vollblutprobe können unter Verwendung der in
Beispiel I beschriebenen Technik untersucht werden. Da Blutplättchen in
viel höherer
Anzahl als WBZ 34 vorhanden sind, wird ein Kammerbereich
mit einer Dicke durch die Ebene 20 in einer Größenordnung
von etwa 5 μ verwendet.
Jedes Feld 38 mit einem Querschnittsbereich von einem Quadratmillimeter
innerhalb des Kammerbereiches mit einer Dicke durch die Ebene von
5 μ stellt
ein Probenvolumen von 0,005 μl
dar, und in einem normalen Individuum wird es daher etwa 1250 Blutplättchen 36 enthalten. Die
Blutplättchen 36 können unter
Verwendung der gleichen Fluoreszenz hervorhebenden Supravitalfärbemittel
und der Techniken, wie sie für
die WBZ 34 verwendet wurden, untersucht werden. Die Blutplättchen 36 können in
der gleichen Kammer 10 wie die zur Bewertung der WBZ verwendete,
untersucht werden, vorausgesetzt, dass die Kammer Bereiche von variierender
Größenordnung
der Dicke durch die Ebene hat, so wie jene vorher beschrieben mit
angeschrägten,
gestuften und/oder bogenförmigen
Wänden.
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Obwohl
diese Erfindung mit Bezug auf ausführliche Ausführungsbeispiele
davon gezeigt und beschrieben wurde, wird durch Fachleute verstanden werden,
dass vielfältige Änderungen
in Form und Einzelheiten davon gemacht werden können. Zum Beispiel wird die
Probenkammer als mit einer ersten und einer transparenten zweiten
Wand beschrieben. Wenn Lichtdurchlässigkeit anstelle von Fluoreszenz als
ein Mechanismus zur Abtastung der Probe verwendet wird, dann würden sowohl
die erste Wand als auch die zweite Wand transparent sein.