TW490561B - Method for performing blood cell counts - Google Patents

Description

490561 五、發明說明（ 發明背景 1 ·技術範圍 本發明係關於-種分析全血樣本的方法和裝置，盘 王血樣本内如白血球、血小板等成份的方法和裝置° 2 .背景資料 ^析血液學上的最新進展已加強了由病人血 ，料的量與質。因此，醫界對於使用病人血液樣本做^ 具的興趣也大增。然而，分析血液樣本的方法並益法 獲得一切資料。從歷史來看，血液樣本係由少量未稀釋血 液在=片上做成抹片、乾燥、固定和染色後，置於顯微 下硯察抹片進行估計。由如此製成的抹片可獲得合理 果，但數據的正確性和可信度則大多有賴於技術人員的 驗和技術。此外，血液抹片是勞力密集而且成本非常 貴，所以通常不受商業用途之歡迎。 另一種估計全血樣本的已知方法包括稀釋一體積量的 血，將其置於計數盤内，再以人工估計稀釋後樣本内的 份細胞。因爲全血的紅血球（RBC’S)數目和濃度遠超過其 成份細胞的量，所以需要稀釋。在典型個人全血樣本中 例如有約4·5 X 106個RBC，S/微升全血樣本；但每微升血 樣本只有約0·25 X 1〇6個血小板和〇 〇〇7 χ 1〇6個白血 (WBC’s)。爲了決定wbc計數，視使用之確實技術而定 白血球樣本必需稀釋成約1份血與2 〇份稀釋液（丨·· 2 〇 )至 1 : 256稀釋液的範圍内，而也通常需要以一種或多種試别 選擇性地溶解RBC’s。溶解RBC，s能有效地由視野中將其去 注 意 事 頁 鏡 結 經 筇 訂 全 成 它 液 球 约 劑 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱 490561 A7

除，因而見到WBC。爲了決定血小板計數，血液樣本必需 稀釋成約1 : 100至約i : 50,000的範圍内。不過，血小板 β十數不茜要溶解樣本中的RBC’s。此種評估全血樣本的方 法有一個缺點爲稀釋過程耗時且昴貴。而全血樣本添加稀 釋液後會增加樣本數據的誤差可能性。 評估血液樣本之最新方法爲阻抗或光學流速細胞計數 器。流速細胞計數器包括稀釋後的血液樣本在一個或多個 小直徑銳孔間循環，每個銳孔附近裝有阻抗型或光學型感 應器，當成份細胞通過銳孔單銼時感應器即進行評估成 伤。同樣地，血液樣本必需稀釋才能緩和比WBC，s和血小 板數目多很多的RBC，s。流速細胞計數器雖然比上述方法 方便和一致，但也有很多缺點。這些缺點中有一些是源於 舄要知樣本攜帶到傳感器的測鐘上，而且必需有控制液體 流經傳感器之速度的流速控制。精確控制樣本流速對於操 作流速細胞計數器是必要的。細胞計數器内的測錘時常會 漏，可把景> 響了儀器的準確性和安全。另一方面，液體流 速控制和稀釋儀器需要定期再校正。需要再校正代表著結 果可能不準確，而且許多目前使用流速細胞計數器之血液 分析儀中會出現預期外的操作成本。另一個缺點是所需試 劑的里。因爲使用的稀釋比率很大，所以就需要相當大量 的液體試劑。大量試劑·會增加試驗成本和產生廢棄物的問 題。 另一種細胞分析的方法是如美國專利第5,547,849和 5,585,246中記載的定量毛細掃瞄法，例如其中是將尚未稀 -5- 本紙張尺度剌中國國家標準（CNS)A4規格（21$

-I · I I I . (請先閱讀背面之注意事^^:填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 297公釐） 490561 A7 B7 五 、發明說明（ 3 釋的全血樣本置於已知量和厚度之毛細管&，並於血液呈 靜止狀態下檢驗。此技術係利用限制掃瞒波長使RBc,s似 乎呈現透明以處理RBC,S存在問題，而且需要處理樣本以 使測量過程中RBC，S不產生聚集。因此，此技術僅限於使 用波長較長的勞光，所以不必預先處理即可檢驗縦，5和 血小板或檢驗任何細胞型態。 冲估本負上未稀釋加抗凝固劑之全血樣本的方法 需要的是：υ能提供正確結果；2)在分析前不需要去 3)能使用大範圍激發光源檢驗樣本；4)不必使用 大T試驗；5)在分析期間不需要樣本 樣本中所有或幾乎所有的細胞二广：動；6)能分析 本。 ，]肥和顆粒；與7)有效控制 本發明之說明 經發：之目的係提供一種正確許估本質上未稀釋 口 I王血樣本成份的方法〇 本發明另一個目的係提供一種評 全血樣本的方法和裝£。 要稀釋 本發明另—個目的係提供一 即可評估全血樣本之方法和裝置“要使用大量液體試 本發明另一個目的係提供一種在評估 體流動即可評估之全血挺本的方法和裝置。…而要樣本液 本發明另一個目的係提供一種在分 份RBCs即可評估全血樣本之方法和裝^不〶要去除大部 本發明另—個目的係提供-種評估所有或幾乎所有樣本 置 除 成 但 之 劑 本纸^尺度適 -6 - 297公釐） 五、發明說明（） 成份之方法和裝置。 本發明另一個目的係提供一種使用簡易評估全血樣本的 方法和裝置。 本發明係關於一種用於檢驗和由置於計數盤内之靜止且 本〶上未稀釋經抗凝固的全血樣本中獲取資料之方法和裝 置。本文使用之「本質.上未稀釋」一詞是敘述僅約1 : 1稀 釋’而且取好更少稀釋的血液樣本。一般而言，操作本發 明方法中使用的唯一試劑爲染料，著色劑和抗凝固劑，但 添加k些4劑並非爲了稀釋樣本的目的而是爲了產生反 應、效果或能促進未來試驗之目的者。 根據本發明’評估本質上未稀釋經抗凝之全血樣本成份 的方法提供下列步碟，包括：a)提供—個樣本計數盤；b) 將敏感著色劑接入全血樣本Θ ; C )將混合樣本嵌入樣本 計數盤内；d)使該混合物靜置於計數盤内直到樣本内形 成錢狀_聯和腔隙；與e)評估腔隙内所沉積的標的成 至„根據本專利中请書中使用的定義，著色劑—詞係定 我馬把由裝置足量，會藉由射出螢光或藉由特定波長吸 收光而產生敏感訊號產生任何試劑。 、^發明万法的優點在於提供評估本質上未稀釋經抗凝固 心王血樣本成份的該方法會提供正確資料。特別言之， ，万法不需要控制液體流動和稀釋樣本，因此不會有相 關的誤差可能性。 方法另—個優點在於本質上不需要稀釋樣本即可 汗估經抗凝固全血樣本内的成份。本方法需要將非常少 -7- x 297公釐） 訂 線 5¾尺度適"iTiiii^7CNS)A4規格⑵〇 丄 A7 B7 五、發明說明（ 里的敏感耆色劑添加到全血樣本内，使樣本能維持本質 上未稀釋。結果也減少了費用和有關稀釋的問題。例 卞本發月方法中，能在參入大約10 ^ 1鹽水稀釋的著 1或1 " 1以下的染劑的1〇〇 ^ 1血液樣本内獲得有用資 料。 " 、=發明方法另—個優點在於評估本質上未稀釋經抗凝固 、—襄本成仏時不需要大量試劑。熟於此藝者會瞭解減 y =训里有助於減少分析最初物料成本和分析後處理用過 試劑之成本。 本發明另-個優點在^不需要樣本液體流動。本方法使 侍待評估之血液樣本呈靜止狀態(或「本質上不動」）。血 液樣本唯-的動作是樣本内成形成份的布朗運動，該動作 並不&曰本發明裝置的用途。結果，避免了管路渗漏和與 此，滲漏有關的任何環境和/或安全問題。此外，評估靜止 狀％樣本時也不需要控制液體流動以及產生和維持此種控 制的成本。齡此藝者會瞭解小心謹愼地維持與許多流動 細胞計數器錢的成本，而避免該些成本是明顯的優點。 本發明中&些和其E目的、特性與優點如附圖所示，按 照其最佳模式之具體實施例的詳細説明就會明白。 圖之簡短説明 圖1是樣本計數盤的視圖。 圖2是樣本計數盤的橫切面圖，其中包含傾斜平坦第二層 壁。在第一層和第二層間形成中間平面厚度梯度。 圖3是樣本計數盤的橫切面圖，其中包含平坦第二層壁位 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意

填 1 寫裝 本衣 頁 I

I I I訂 線 -8 - 本纸張尺㈣财關緒準（CNS)A伐 五、發明說明f ) 於有許多階梯之第一層壁上，這許多階梯提供許多不同中 間平面厚度的計數盤區域。 圖4疋第二層平坦壁置於有一面壁以角度延伸到第二層壁 之第一層壁上面的樣本計數盤橫切面圖。中間平面厚度梯 度在第一和第二層壁間形成。 圖5是樣本計數盤的圖型，其係説明形成錢形_聯和腔隙 則，可看到本質上未稀釋經抗凝固之全血樣本的透明外 圖6疋樣本计數盤的圖型，其係説明在盤内靜置期間後， 本質上未稀釋經抗凝固之全血樣本的透明外觀。 完成本發明之最佳模式 以下所敘述評估白血球（WBC，S)、血小板和本質上未稀 釋經抗凝固全血樣本内其它全血成份的方法提供許多目前 使用之評估方法和裝置所沒有的優點。本方法包括步驟：& 提供一個計數盤1〇 ; b)將敏感著色劑摻入全血樣本内；c) 使混合樣本嵌入樣本計數盤1〇内；d)使混合樣本靜置於盤 1〇内直到樣本内形成錢形申聯3〇和腔隙32(見圖6);和幻 評估一種或多種腔隙3 2内的標的成份。 關於圖1-4，樣本計數盤10包括第一層壁16和透明的第 二層壁18。壁16 : 18互由可決定寬度之中間平面厚度2〇 分開。本文中，「中間、面厚度」是指眼晴可看到的一條 線，其相當於第一層壁16之内面22和第二層壁Η之内面 2 4間的最短距離。第一個具體實施例（圖2 )中，壁1 $，1 $ 是本質上平坦且互相平行。第二個具體實施例（圖2和^ -9- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 297公釐） 490561 A7 ---------ΞΙ 五、發明說明f ) 中，壁16，18是傾斜聚集，因此形成中間平面厚度2〇梯 度。第二個具體實施例中的壁丨6，i 8會互相交又（在該例 中中間平面厚度20爲〇)或壁16，18會由最小空間分開。 第三個具體實施例（圖3)中，壁16，18中之一或皆包括一 或多個階梯2 6。每個階梯2 6會產生具有不同中間平面厚度 20的獨立區域。在所有的具體實施例中，取間隔裝置^可 專門用於產生/維持兩壁16，18間中間平面厚度2〇，而且 壁16，18(或階梯區域26)是本質上平坦或弧形的。 壁16，18間的中間平面厚度2〇能以數學和/或光學測 定，或比較性地使用已知參考値。若，例如已知壁ΐ6，Η 的斜率，而且壁16，18彼此接觸（或由已知數量分開；如 取間隔裝置28)後，即能選擇任何一點以數學計算中間平 面厚度2 0，獲得由接觸點（或取間隔裝置2 8 )開始的距離。 中間平面厚度20也能使用光學技術測定，包括但不限於干 涉儀、共焦顯微術或類似方法。測定中間平面厚度2〇之方 法較完整敘述於美國專利申請書第__(代理人資料編號 UFB-013號）。不論使用何種方法，計數盤中間平面厚度⑼ 可以在計數盤10的製造過程中固定和標明，或者中間平面 厚度20可以在立即嵌入樣本後稍晚一些，或嵌入樣本後 (如最終使用者時）須彳定。一般而言，最有利的中間平面厚 度2 0決足於樣本中標的成份和血球容積的大小。成份和中 間平面厚度20間的關係詳細討論於下。 全血樣本中摻入至少一種數量足以觀察到細胞或顆粒之 敏感著色劑。此敏感著色劑可以：υ分辨全血樣本内標的

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X --------------裝--- (請先閱讀背面之注意填寫本頁) ήπ· •線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -10- 五、發明說明f ) 成份；和2)混合時本質上不稀釋全血樣本之任 感著色劑的實施例有勞光顯著超活體染料，例如外二二 鹼：橙-2i，或使用螢光顯微鏡能觀察到的相似染劑：在 :些例子中，可使用單—種著色劑來確認數種成份。在立 它例子中，可使用很多著色劑來辨別許多成份 ： 份，例如該些記载於美國專利申請書第—」代理人 編號刪-〇16號）可同時藉由添加額外的其它敏感著色劑進 ㈣^利用將小量液態著色劑加進全血樣本中進行添加 敏感著色劑’ f使樣本獲#最少量稀#，或纟亦可添加乾 燥型式的著色劑，如小藥片。另一種將敏感著色劑摻進全 血樣本的方法是在樣本計數盤1〇區域上乾燥著色劑。當全 血樣本嵌入計數盤10内時，著色劑會擴散入樣本内。田 將所掺入多到足以與計數盤二層壁16，18接觸的全血樣 本量嵌入計數盤10内。樣本可利用一些方法嵌入計數盤1〇 内，包括使用氣囊、毛細作用等。爲了環境和安全的理 由，最好使用最不會使樣本灑出的方法和裝置。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 關於圖5和6 ’樣本嵌入計數盤1 〇内，經短時間靜置後， 會形成錢形串聯3 0和腔隙3 2 (見圖6 )。如上文所述，血液 樣本中唯一的運動是樣本成形成份之布朗運動，該運動不 會影響本發明裝置之用途。錢形串聯3 〇是本質上不動但抗 凝固全血樣本自然形成的一群紅血球（RBC，S)。腔隙是錢形 _聯3 0間留下的開放部份。由於使rbc，s聚集的吸引力會 追使其它成份，如WBC’s 34和血小板3 6(見圖6)進入能評 估該些成份的腔隙3 2内，所以錢形串聯3 0和腔隙3 2會自 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 五 、發明說明( 9 然在抗凝固全血中形成。保持全血樣本基本上不動約15-3 〇私後’通常錢形串聯3 0和腔隙3 2即形成，但各樣本的 時間不儘相同。錢形串聯3 0的形成也能由已知聚集劑促 成’在該例子中，RBC，s凝塊是指聚集物。此種聚集劑的 只施例有糊精、P〇lybrene和此兩種之混合物、對抗一般紅 血球抗原的抗體以及植物性外源凝集素和其類似物。 訂 待評估之全血樣本的中間平面厚度20在評估樣本成份時 很重要。舉例來説，若經由顯微鏡檢驗一層100 " (1" =1 X 10 6米）厚本質上未稀釋之抗凝固全血，不論是否使RBc，s 形成錢形串聯30，樣本會因光線無法適當穿透該層而呈不 透明（如圖5所示）。然而，若樣本層厚度降低至大約7 〇 a 以下時，而且最好降低至4 V和5 〇 "之間，足量光線就能 通過並使腔隙32呈現清澈湖狀，即可在其間分辨出和評估 WBC’s 34和血小板36。能在腔隙32内評估成份之最適宜樣 本層厚度視樣本最初的血球容積而定。血球容積指的是總 血量中RBC’s數目所佔的百分比，其係與最適宜樣本層厚 度成反比，即血球容積較高者通常最適宜較薄的樣本層。 不過，在所有例子中，樣本層必需厚到足以提供合理數目 的顆粒或細胞。値得注意的是’並非每一種待測成份皆可 以被迫進入腔隙32内。♦若統計或臨床上由RBC聚集遮蔽的 成份數微乎其微時，仍V使用本發明。也可能_種或多種 待測成份位於聚集的RBC上，但因爲這些成份可觀察到（在 直立顯微鏡下），所以彼等可由螢光充份評估。 標的成份可以使用-些技術評估。若，例如標的成份經 -12- ^^尺度綱巾關家鮮（CNS)A4規格⑵〇 X 297公髮)— 490561 五、發明說明（1Q ) 螢光染料著色後，腔隙32即能以市售螢光顯微鏡檢視。螢 光顯微鏡會顯示螢光染料與標的成份互相作用，因而在= 本間分辨出來。以螢光顯微鏡產生的影像能記錄於影像$ 解斋(如CCD相機)中，而以人工評估該影像，或者影像能 數據化並儲存於電子檔案中。電子檔案能使用例如有確2 特殊成份，説明特殊成份之發生，和評估成份特性之能力 的分析軟體加以解釋。市售分析軟體實施例有美國Ια， Vienra訊號分析公司販售的或其它類似影像處理系統。此 種影像評估系統更完成的敘述則參考申請專利者共同申請 之美國專利第-號（代理人資料編號UFB-017號）。" 以下實施例係説明如何能使用本發明方法和裝置評估個 人全血樣本成份。 實施例I : 經濟部智慧財產局員工消費合作社印f 關於圖5和6，抗凝固全血樣本内的RBC，s 34掺入少量敏 感著色劑後，置於中間平面厚度2〇大約爲2〇 A，評估整個 或部份計數盤10(見圖2_4)。EDTA是能用來做抗凝固劑的 實施例，而螢光顯著超活體染料、像吖啶橙、鹼性橙_2ι 或涵似物也疋可用來做爲敏感著色劑之實施例。選用中間 平面厚度2 0大約爲2 0 a的計數盤的理由如下。第一，供檢 查的評估量包含有效RBC，s 3 4數目，而第二，2〇 a的中間 平面厚度2 0 —般是提供形成錢形串聯的最適宜計數盤。待 評估的樣本量典型上是由評估視野38的橫切面和樣本中間 平面厚度2 〇所定義。如上文所述，可以使用一些技術使計 數盤10内視野38之正確中間平面厚度2〇更適中，包括在 -13- 297公釐） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 A7 B7 五、發明說明< 11 統计上反覆評估特殊視野3 8内之_ & & ^ A ^ 哞/士甘、日龄 “的成份族群的過程，而 汗估其視物時若有需要可増 圖5描繪樣本嵌入計數盤 ^秩群數 -¾ ^ yi ' 後备時的視野3 8 ’以透射光

TrJ大rBC，s35在形成錢形串聯3。前形成重疊團塊造 樣本視野38的外觀不透明，但著色劑會隱約辨識 :BC S 3 4。圖6顯7F本質上溶解並靜置大約3 〇秒後 :相同計數盤10。船35會自然群集於錢糊3〇 内，在錢形串聯30間留下腔隙32。在這些腔隙32内能分 辨和評估其它全血樣本成份（如，鞭，534和血小㈣）。 訂 線 若需要計數WBC 34，.則評估中間平面厚度2〇"(其係包含 、，w里的王血樣本）之计數盤10區域内橫切面爲1平方毫 米的視野3 8。選擇〇·〇2 ^ 1樣本以使WBC，s 34的數目合 里每^ 1正常全血樣本大約含有7,0〇〇個WBC，而每〇.〇2 A 1正^王血樣本含有約14〇個WBC，s。細胞數目夠（實際上 大約1000個細胞）計數這些視野38中的一些，才能獲得統 计上充份正確的數目。若求取額外的WBC，s 34資料，則需 進一步評估計數盤容積内的WBC，S 34(淋巴球、顆粒球、 單核球等）。舉例來説，若希望分出全血樣本内Wbc»s 34 的型態和/或其頻數，可以使用有/無分析軟體之影像分離 器評估。由所收集的資*料可決定分類計數。此方法較完整 敘述於共同申請專利之美國專利申請書第_(代理人資 料編號UFB-011號）。 若中間平面厚度20爲20//之計數盤中樣本的腔隙32區域 14 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） 490561 A7 五、發明說明 呈現部份不透明狀，可能是血球容積比一般高的結果，故 需要在中間平面厚度2 〇小於2 〇 a之樣本計數盤丨〇内評估樣 本視野3 8。另一方面，若樣本血球容積比一般低時，使用 中間平面厚度20大於20 "之樣本視野38較有利，因爲每種 成份的族群可能較多。改變樣本的中間平面厚度2〇也能做 爲增加或減少成份族群之方法。 實施例II : 抗凝固全血樣本内的血小板3 6可使用實施例J敘述的技術 評估。因爲血小板的量比WBC，S 34大很多，所以使用中間 平面厚度20大約爲5 a之計數盤區域。中間平面厚度2〇大 約爲5 a之計數盤區域内每個含丨平方毫米的橫切面面積之 視野3 8代表0.005 //的樣本量，故正常人因而含有約125〇 個血小板36。血小板36可使用相同螢光顯著超活體染料和 WBC’s 34使用的技術來評估。血小板％可以在評估wbc，s 34的相同計數盤10内評估，但前提是該計數盤區域的中間 平面厚度大小可以改變，像該些傾斜、階梯狀的和/或弧形 壁的中間平面厚度。 雖然本發明已顯示和敘述關於本發明之詳細具體實施 例，但該些熟於此藝者會瞭解在不悖離本發明精神和範圍 内可以做各種形式的變化和其詳細内容。例如，具有第一 層壁和透明第二層壁之*樣本計數盤。若不用榮光^用透射 做爲感應樣本的機制，則第一層壁和第二層壁皆呈透明。 --------------裝--- (請先閱讀背面之注意^6^^填寫本頁) 訂. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15-

Claims (1)

1. 490561 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利 本 A8 B8 C8 D8 1. 一種坪估實質上未稀釋之抗凝固全血樣本中白血球成份 和/或血小板成份之方法，該方法包括的步驟有： a)提供一個樣本計數盤，其係由第一層壁和透明的第 一層壁之間形成，該兩層壁是由該計數盤第一個區 域内的第一個中間平面厚度分離開來； b )製造著色劑和血液樣本之摻合物，其中該著色劑會 鑑別一種或多種該血液樣本中的成份，該摻合物是 在琢計數盤外部或内部製造，而且當摻合物位於該 。十數盤内邵時，該掺合物係與位於該計數盤第一區 域内之計數盤的第一和第二層壁接觸； c〇使琢摻合物靜置於該計數盤内，經過足以形成一個 或^個錢形串聯的一段預定時間，該錢形_聯與也 於孩靜置摻合物内形成的腔隙相連，且其中該成份 即留在該腔隙内； d) 檢視一個或多個位於該計數盤第一區域内的視野； 和 e) 評估孩視野中腔隙内出現的白血球成份和/或該血小 板成份。 2·根據申請專利範圍第！項之方法，其進一步包括在該計 數盤第二個區域内選擇性找出一個或多個視野，該第二 個區域具有比該奸數盤第一個區域中第一個中間平面厚 度大的第二個中間平面厚度。 3·根據申請專利範圍第丨項之方法，其進一步包括在該計 數盤第二個區域内選擇性找出一個或多個視野，該第二 -16 私紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事| •-裝--- f填寫本頁) · •線- 490561 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 個區域具有比該計數盤第一個區域中第一個中間平面厚 度小的弟二個中間平面厚度。 4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該第一個中間平 面厚度爲不大於70 μ。 5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該第一個中間平 面厚度是不小於4#。 6·根據申請專利範圍第1項之方法，其中該第一個中間平 面厚度是不大於50#。 7. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該掺合物是在計 數盤外製造的。 8. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該摻合物是在該 計數盤内製造的。 Γ請先I讀背面之注意事H --裝--- ▼填寫本頁) .線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）