JP2020079772A - 骨髄液分析方法、試料分析装置及びコンピュータプログラム - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態の骨髄液分析方法では、まず、骨髄液及び試薬を含む測定試料中の有核細胞数及び脂質粒子数を取得する。以下、骨髄液中の有核細胞数及び脂質粒子数の取得方法について説明する。
被検者から採取した骨髄液に、例えば、骨片、血球細胞の凝集などの細胞測定の障害となり得る固形の夾雑物があるときは、メッシュなどを用いて骨髄液をろ過してもよい。骨髄液には、必要に応じて、キレート剤及び/又は抗凝固剤が添加されてもよい。キレート剤としては、例えばEDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)塩が挙げられる。抗凝固剤としては、例えばヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩などが挙げられる。
本実施形態の分析方法に用いられる試薬は、有核細胞及び/又は脂質粒子の測定を可能にする試薬であれば、特に限定されない。試薬は、溶血剤及び蛍光色素の少なくとも1種を含むことが好ましい。好ましい実施形態では、試薬は、溶血剤及び蛍光色素を含む。この場合、試薬は、溶血剤及び蛍光色素の両方を含む一つの試薬であってもよい。また、個別に用意した、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との組み合わせであってもよい。蛍光色素は、水溶液中では保存安定性がよくない場合があるので、試薬は、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成されることが好ましい。
1.骨髄液中の有核細胞の測定に用いる溶血剤
有核赤血球及び白血球計数用試薬は、試料中の有核赤血球、及び白血球(好塩基球、及び好塩基球以外の白血球)の計数を可能にする。有核赤血球及び白血球計数用試薬は、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成される。上記の第1試薬としては、有核赤血球及び白血球計数用試薬が好適であるが、これに限定されない。
有核赤血球及び白血球計数用試薬の蛍光色素としては、例えば、以下の式(3)及び(4)のいずれか1つで表される化合物が挙げられる。蛍光色素は1種でもよいし、2種以上を用いてもよい。
1.骨髄液中の脂質粒子の測定に用いる溶血剤
白血球分類用試薬は、試料中の白血球を、3種類(顆粒球、リンパ球及び単球)、4種類(好中球及び好塩基球、好酸球、リンパ球、及び単球)、5種類(好中球、好塩基球、好酸球、リンパ球、及び単球)又は6種類(好中球、好塩基球、好酸球、リンパ球、単球、及び顆粒球形幼若球)に分類し計数するための試薬であるが、脂質粒子も計数できる。白血球分類用試薬は、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成される。上記の第2試薬としては、白血球分類用試薬が好適であるが、これに限定されない。
式(7)中、R23は、炭素数8〜25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり;R24は、酸素原子、−COO−又は
白血球分類用試薬の蛍光色素は、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー-1、エチジウムホモダイマー-2、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス[[3-[[4-[[(3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム)-2-イル]メチレン]-1,4-ジヒドロキノリン]-1-イル]プロピル]ジメチルアミニウム]・テトラヨージド(TOTO-1)、4-[(3-メチルベンゾチアゾール-2(3H)-イリデン)メチル]-1-[3-(トリメチルアミニオ)プロピル]キノリニウム・ジヨージド(TO-PRO-1)、N,N,N',N'-テトラメチル-N,N'-ビス[3-[4-[3-[(3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム)-2-イル]-2-プロペニリデン]-1,4-ジヒドロキノリン-1-イル]プロピル]-1,3-プロパンジアミニウム・テトラヨージド(TOTO-3)、2-[3-[[1-[3-(トリメチルアミニオ)プロピル]-1,4-ジヒドロキノリン]-4-イリデン]-1-プロペニル]-3-メチルベンゾチアゾール-3-イウム・ジヨージド(TO-PRO-3)、及び以下の式(8)で表される蛍光色素からなる群より選択できる。蛍光色素は1種でもよいし、2種以上を用いてもよい。
本実施形態では、有核細胞及び脂質粒子の測定にそれぞれ異なる溶解試薬及び染色試薬を用いている。しかし、これに限られず、有核細胞及び脂質粒子の測定を、共通の溶解試薬及び染色試薬を用いて行ってもよい。例えば、特許第4212827号に開示されている溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成される試薬を用いることで、共通の溶解試薬及び染色試薬で、有核細胞及び脂質粒子の測定を行うことができる。
本実施形態では、測定試料は、骨髄液と試薬とを混合することにより調製できる。試薬が溶血剤を含む場合、少なくとも骨髄液と溶血剤とが混合されて、測定試料が調製される。試薬中の溶血剤の作用により、骨髄液中の有核細胞は、蛍光色素で染色可能な状態となる。蛍光色素で染色可能な状態とは、細胞の細胞膜に、蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えた状態をいう。骨髄液に赤血球が混入していた場合は、溶血剤の作用により、赤血球を溶解できる。溶血剤の作用により、赤血球と同様に、赤芽球系細胞の細胞膜も破壊されるが、赤芽球系細胞の細胞核は保たれる。そのため、赤芽球系細胞は、染色可能な状態となり、FCMにより分類及び計数され得る。
本実施形態の分析方法では、有核細胞数及び脂質粒子数に基づいて、骨髄有核細胞密度に関する指標を取得する。好ましい実施形態では、骨髄有核細胞密度に関する指標は、FCM測定により取得した有核細胞数及び脂質粒子数を用いて取得される、骨髄有核細胞密度に関連する情報である。また、骨髄有核細胞密度に関する指標は、有核細胞数及び脂質粒子数を用いて取得される値そのものに限られず、その値を用いて判定を行った結果、例えば、過形成、正形成、低形成などを示す情報であってもよい。
当該技術分野では、塗抹標本の顕微鏡観察による骨髄有核細胞密度が、低形成、正形成又は過形成であるかを判定する。実施例に示されるように、本実施形態の分析方法で得られる骨髄有核細胞密度に関する指標は、塗抹標本の顕微鏡観察による骨髄有核細胞密度と良好に相関する。本実施形態の分析方法においては、有核細胞数及び脂質粒子数に基づいて、骨髄の状態を判定してもよい。あるいは、骨髄有核細胞密度に関する指標に基づいて、骨髄の状態を判定してもよい。例えば、骨髄有核細胞密度に関する指標に基づいて、「骨髄の状態が低形成であるか」、「骨髄の状態が正形成であるか」及び「骨髄の状態が過形成であるか」から選択される少なくとも1つの判定を行ってもよい。
以下、本実施形態に係る試料分析装置の一例を、図面を参照して説明する。
図2Aに示されるように、試料分析装置1は、測定部2と、解析部3とを備える。測定部2は、骨髄液を取り込み、骨髄液から測定試料を調製し、測定試料を光学測定する。解析部3は、測定部2の測定により得られた測定データを処理し、骨髄液の分析結果を出力する。しかし、本実施形態はこの例のみに限定されず、例えば、測定部2及び解析部3が一体的に構成された装置であってもよい。
図5を参照して、試料分析装置1の動作について説明する。まず、解析部3のCPU301が、ユーザからの測定実行の指示を、入力部309を介して受け付ける(ステップS101)。
図8Aを参照して、骨髄の状態が低形成であるかの判定処理について説明する。ここでは、骨髄有核細胞密度に関する指標として、有核細胞数に対する脂質粒子数の比(LP/NC)の値を取得した場合を例として説明する。しかし、本発明はこの例に限定されない。ステップS401において、CPU301は、取得したLP/NCの値と、ハードディスク304に記憶された第1の閾値とを比較する。測定値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップS402に進行する。CPU301は、骨髄の状態が低形成であるとの判定結果を取得し、ハードディスク304に記憶する。LP/NCの値が第1の閾値以下であるとき、処理は、ステップS403に進行する。CPU301は、骨髄の状態が正形成又は過形成であるとの判定結果を取得し、ハードディスク304に記憶する。以上で、CPU301は、判定処理を終了し、メインルーチンへ処理をリターンする。図5を参照して、CPU301は、判定結果を出力部310に出力して(ステップS110)、処理を終了する。
(1) 試薬
実施例1では、有核細胞を測定するための第1試薬と、脂質粒子を測定するための第2試薬とを用いた。第1試薬は、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成される、有核赤血球及び白血球計数用試薬であった。第2試薬は、溶血剤を含む溶解試薬と、蛍光色素を含む染色試薬との二試薬で構成される白血球分類用試薬であった。各試薬は、以下のようにして調製した。
・溶解試薬
ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド(LTAC:東京化成工業株式会社)、ポリオキシエチレン(20)ポリオキシプロピレン(8)セチルエーテル(PBC-44:日光ケミカルズ株式会社)、フタル酸水素カリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)、DL-リンゴ酸及びEDTA-2K(中部キレスト株式会社)を、以下の組成となるように混合した。溶媒には精製水を用いた。水酸化ナトリウムを用いて、試薬のpHを3.0に調整した。
2000 ppm LTAC
1000 ppm PBC-44
2 mM フタル酸水素カリウム
10 mM DL-リンゴ酸
0.2 g/L EDTA-2K
0.0324 g/L NaOH
蛍光色素のNK-3383(株式会社林原)をエチレングリコールに溶解した。染色試薬におけるNK-3383の濃度は、51.1 mg/Lであった。
・溶解試薬
LTAC(東京化成工業株式会社)、ポリオキシエチレン(30)セチルエーテル(BC30TX:日光ケミカルズ株式会社)、フタル酸水素カリウム(富士フイルム和光純薬株式会社)及びEDTA-2K(中部キレスト株式会社)を、以下の組成となるように混合した。溶媒には精製水を用いた。水酸化ナトリウムを用いて、試薬のpHを6.0に調整した。
685 ppm LTAC
1750 ppm BC30TX
40 mM フタル酸水素カリウム
0.2 g/L EDTA-2K
1.431 g/L NaOH
第2試薬の染色試薬として、ストマトライザー4DS(シスメックス株式会社)を用いた。
(2.1) 測定試料の調製
18名の被検者から採取した骨髄液(EDTA-2K添加骨髄液)を用いた。各被検者の骨髄液から一部を取り、常法にしたがって染色して塗抹標本を作製した。残りの骨髄液を孔径40μmのナイロンメッシュでろ過することにより、骨片を除いた。FCMを備えた自動血球分析装置XN-2000(シスメックス株式会社)により、骨髄液を次のようにして測定した。まず、骨髄液を第1骨髄液及び第2骨髄液に分けた。第一骨髄液(1μL)に第1試薬の溶解試薬(50μL)及び染色試薬(1μL)を添加し、40℃で20秒間インキュベートして、第1測定試料を調製した。第2骨髄液(1μL)に第2試薬の溶解試薬(50μL)及び染色試薬(1μL)を添加し、40℃で20秒間インキュベートして、第2測定試料を調製した。
第1測定試料に光を照射して、該試料中の個々の粒子から発せられる光学的シグナルを取得した。また、第2測定試料に光を照射して、該試料中の個々の粒子から発せられる光学的情報を取得した。実施例1では、光学的情報として、蛍光強度、側方散乱光強度及び前方散乱光強度を取得した。また、各測定試料の測定で取得した光学的シグナルに基づいて、スキャッタグラムを作成した。なお、骨髄液の分配、測定試料の調製及び測定は、XN-2000により自動的に行われた。
塗抹標本を顕微鏡で観察して、各被検者の骨髄有核細胞密度を取得し、骨髄の状態を判定した。その結果、低形成が7名、正形成が5名、過形成が6名であった。各被検者の骨髄液について、XN-2000により取得した有核細胞数及び脂質粒子数から、有核細胞数に対する脂質粒子数の比(脂質粒子数/有核細胞数)を算出した。顕微鏡観察に基づく骨髄有核細胞密度により分類された各被検者について、有核細胞数に対する脂質粒子数の比の分布を調べた。結果を図11に示す。
図11から分かるように、顕微鏡観察に基づく骨髄有核細胞密度と、自動血球分析装置による有核細胞数に対する脂質粒子数の比との相関は良好であった。上記の結果より、骨髄液をFCMで測定することにより、骨髄有核細胞密度に関連する情報として、有核細胞数に対する脂質粒子数の比を取得できることが示された。また、有核細胞数に対する脂質粒子数の比に基づいて、骨髄の状態を精度よく判定できることが示された。
2 測定部
3 解析部
5 試料調製部
6 検出部
61 フローセル
62 光源部
63 受光部
64 受光部
65 受光部
301 CPU
310 出力部
320 アプリケーションプログラム
321 可搬型記録媒体
Claims (26)
- 骨髄液中の有核細胞数及び脂質粒子数を計数する工程と、
前記有核細胞数及び前記脂質粒子数に基づいて、骨髄有核細胞密度に関する指標を取得する工程と、
を備える、骨髄液分析方法。 - 前記骨髄有核細胞密度に関する指標が、前記有核細胞数と前記脂質粒子数との比に関する値である、請求項1に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄有核細胞密度に関する指標が、有核細胞数に対する脂質粒子数の比の値である、請求項1又は2に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄有核細胞密度に関する指標を、表示する工程をさらに備える、請求項1〜3のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記有核細胞数及び前記脂質粒子数に基づいて、前記骨髄の状態を判定する工程をさらに備える、請求項1〜4のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄有核細胞密度に関する指標に基づいて、前記骨髄の状態を判定する工程をさらに備える、請求項1〜5のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄の状態を判定する工程において、低形成、正形成、及び過形成の少なくとも1つを判定する、請求項5又は6に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄の状態を判定する工程において、前記骨髄有核細胞密度に関する指標と、所定の閾値とを比較して前記骨髄の状態を判定する、請求項6又は7に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄の状態を判定する工程において、
前記有核細胞数に対する脂質粒子数の比の値が第1の閾値より高いとき、低形成であると判定し、
前記有核細胞数に対する脂質粒子数の比の値が第1の閾値より低く且つ第2の閾値より高いとき、正形成であると判定し、
前記有核細胞数に対する脂質粒子数の比の値が第2の閾値より低いとき、過形成であると判定する、請求項6〜8のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。 - 判定した前記骨髄の状態に関する情報を、表示する工程をさらに備える、請求項5〜9のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記有核細胞数及び脂質粒子数を計数する工程において、前記測定試料をフローサイトメトリ法で測定する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記骨髄液及び試薬を混合して測定試料を調製する工程をさらに備える、請求項1〜11のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記測定試料を調製する工程において、少なくとも前記骨髄液及び溶血剤を混合して前記測定試料を調製する、請求項12に記載の骨髄液分析方法。
- 前記測定試料を調製する工程において、さらに蛍光色素を混合して前記測定試料を調製する、請求項13に記載の骨髄液分析方法。
- 前記フローサイトメトリ法により取得した、蛍光信号情報、前方散乱光情報及び側方散乱光情報に基づいて、前記脂質粒子数を計数する、請求項11〜14のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。
- 前記有核細胞数及び脂質粒子数を計数する工程は、
前記骨髄液と、第1試薬とを含む第1測定試料を測定し、前記第1測定試料中の有核細胞数を計数する工程と、
前記骨髄液と、前記第1試薬とは異なる第2試薬とを含む第2測定試料を測定し、前記第2測定試料中の脂質粒子数を計数する工程と、
を備える、請求項1〜15のいずれか1項に記載の骨髄液分析方法。 - 前記第1試薬は、pH 2.0以上4.5以下の溶解試薬を含み、前記第2試薬は、pHが5.5以上7.0以下である溶解試薬を含む、請求項16に記載の骨髄液分析方法。
- 骨髄液から測定試料を調製する試料調製部と、
前記測定試料に含まれる粒子を検出する検出部と、
前記検出部により得られた情報に基づいて、前記測定試料中の有核細胞数及び脂質粒子数を計数する制御部と、を備え、
前記制御部が、前記有核細胞数及び前記脂質粒子数に基づいて、骨髄有核細胞密度に関する指標を取得する、
試料分析装置。 - 前記検出部は、
前記試料調製部によって調製された前記測定試料を流すよう構成されたフローセルと、
前記フローセル内を流れる前記測定試料に光を照射する光源部と、
前記測定試料に光が照射されたときに得られる光学的情報を取得する受光部と、
を備える、請求項18に記載の試料分析装置。 - 前記受光部により取得した、蛍光信号情報、前方散乱光情報及び側方散乱光情報に基づいて、前記脂質粒子数を取得する、請求項19に記載の骨髄液分析方法。
- 出力部をさらに備え、
前記制御部は、前記骨髄有核細胞密度に関する指標を前記出力部に出力する、請求項18〜20のいずれか1項に記載の試料分析装置。 - 前記骨髄有核細胞密度に関する指標が、前記有核細胞数と前記脂質粒子数との比に関する値である、請求項18〜21のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 前記制御部が、前記有核細胞数及び前記脂質粒子数に基づいて、前記骨髄の状態を判定する請求項18〜22のいずれか1項に記載の装置。
- 出力部をさらに備え、
前記制御部は、判定した前記骨髄の状態に関する情報を、前記出力部に出力する、請求項23に記載の試料分析装置。 - 骨髄液を分析するためのコンピュータプログラムであって、
前記骨髄液に含まれる粒子を検出する検出部により得られた情報に基づいて、骨髄液中の有核細胞数及び脂質粒子数を計数するステップと、
前記有核細胞数及び前記脂質粒子数に基づいて、骨髄有核細胞密度に関する指標を取得するステップと、
をコンピュータに実行させる、コンピュータプログラム。 - 請求項25に記載のコンピュータプログラムが記録されている記録媒体。
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