JP4359389B2 - 白血球百分率及び網状赤血球計数の決定 - Google Patents

Description

【０００１】
（技術分野）
本発明は、抗凝固全血の静止試料を分析する装置及び方法に関する。詳しくは、本発明は、白血球百分率、網状赤血球算定分析、核生成した（nucleated）赤血球の計数、及び稀な場合として癌細胞のような異常核生成した循環細胞を検出する能力を備えた、静止状態の血液試料を分析するための装置及び方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
分析血液学の最近の進歩は、患者の血液試料から入手できる情報の量を増大し、品質を向上させてきた。その結果、診断手段として患者の血液試料を用いることに対する医療機関の関心も深まってきており、抗凝固全血について行われている最も一般的な実施試験は、全血液算定、即ちＣＢＣであり、これは、細胞成分及び血小板の計算の外に、赤血球計測、網状赤血球算定、及び血液試料中に存在する白血球の種類の分類である白血球百分率（ＬＤＣ又は「Ｄｉｆｆ」）を、含んでいる一連の試験である。試料の一般的物理的性質、即ち種々の細胞又はそれらの数は、全試料に関連して定量的方法を用いて分析されなければならない。従来の装置及び方法では、これは正確な試料の計量及び希釈を必要とし、次に特定の測定装置によって行われることを必要とする。更に、その装置は、個々の細胞の定量的特徴を測定しなければならず、それは試料を高度に希釈し、次にその希釈材料を、電気的又は光学的手段を用いて細胞を測定する流動セルに通過させることを通常含んでいる。更に、定量的測定を用いて、特定の従属集団(sub-population)からなる全白血球を百分率で分類する。従属集団の数は、含まれる装置の精密さに依存し、それは２つ位に少ないか、又は７つより多い分類になる。
【０００３】
歴史的にはＣＢＣの鑑別段階（differential aspects）は、計算のために用いた方法とは別の方法を用いて行われてきた。例えば、ＣＢＣのＬＤＣ部分は、慣習的にはスライドの上に少量の未希釈血液を塗り、その乾燥固定塗布物を染色し、顕微鏡でその塗布物を検査することにより行われてきた。そのような塗布物から合理的な結果を得ることはできるが、データーの正確さ及び信頼性は、技術者の経験及び技術に大きく依存する。そのような塗布物の一つの問題は、細胞を殺し、固定しなければならないことである。これによって、結果が細胞分析のように生きた細胞に依存する多くの種類の超生体染色及び分析が不可能になる。更に、血液塗布を使用することは労力がかかり、コスト的に許容できず、従って一般に商業的用途にとっては好ましくない。
【０００４】
ＬＤＣを遂行する別の方法は、電気インピーダンス又は光学的流動血球計算を用いるものである。流動血球計算は、希釈した血液試料を小さな容器に通すことを含み、この場合電気的インピーダンス又は光学的センサーにより、それらが容器を連続的に通過する間に成分細胞を評価することができる。同じ装置を用いて同時に計算し、細胞計測データーを与えることもできる。ＷＢＣを評価するためには血液試料を希釈しなければならず、試料は、ＷＢＣに対し遥かに大きな数のＲＢＣを軽減するように処理しなければならない。上に記載した塗布法よりも一層便利で一貫性はあるが、流動血球計算も幾つかの欠点を有する。流動血球計算の一つの欠点は、センサーを通過する希釈血液試料の流速を制御する必要がある配管（plumbing）及び流体制御である。現在の流動血球計算器中の配管は漏れることがあり、屡々漏洩しているため、潜在的に装置の精度と安定性との妥協が必要である。これらの分析方法では、一般にどのような種類の形態計測分析も行うことがができない。なぜなら、各細胞の実像が得られないからであり、与えられた細胞からの全信号だけが分析されるだけであるからである。多くの現在の流動血球計算器の別の欠点は、内部流体流動制御及び自動化された希釈装置の精度に関係している。流動血球計算器の精度は、流体流動制御及び試料希釈装置の精度、及びそれらの正確に較正された状態を保つ能力に依存する。流動制御及び希釈装置は、周期的な再較正を必要とする。再較正が必要であることは、現在入手できる多くの流動血球計算器で存在する不正確な結果及び望ましくない操作コストの可能性があることを例示している。ジョンＬ．ハイネス(John L. Haynes)により著作され、出版された、Cotometry Supplement, 3: 7-17 (1988)に記載の文献には、インピーダンス及び光学の両方による流動血球計算の原理及びそのような技術の種々の研究分野への応用について記載されている。流動血球計算器で試験される血液試料は、どこでも１０：１〜５０，０００：１に希釈されている。
【０００５】
細胞分析に対する別の方法は、米国特許第５，５４７，８４９号及び第５，５８５，２４６号明細書その他に概略述べられている容量分析毛細管走査であり、この場合、全血の比較的希釈されていない試料を既知の体積及び太さの毛細管中に入れ、その血液が静止状態になっている間に試験する。この方法は、赤血球が比較的透明になる波長に走査波長を限定することにより、赤血球の存在を取扱い、赤血球が測定過程中、凝集しないように試料を処理する必要がある。従って、この方法は長波長蛍光を使用することに限定されており、網状赤血球又は核生成した赤血球の計算には使用されていない。更に、流動血球計算器の場合のように、形態学的な情報はそれらの走査からは得ることができない。ＣＢＣ又は関連試験を行うために入手できる数多くの商業的装置が存在するが、相当数のＣＢＣ試験を迅速に与える装置は複雑で高価であり、誤作動し易い。更に、特定の血液学的試験のために提案された数多くの方法があるが、それらはＣＢＣで期待される臨床的に有用な情報の全てを与えるものではない。
【０００６】
組織化学的染色と細胞形態学の組合せが不可能な点で、上記方法は全て一般に簡単な分析方式に限定されている。これらの種類の試験の両方を行うことができれば、その方法により認識することができるグループの数を増大する。
【０００７】
抗凝固全血の静止試料を検査するための方法及び装置で、ＬＤＣ、網状赤血球計算及び核生成赤血球の検出及び癌細胞のような異常循環核生成細胞のための正確な結果を与えることができ、試料分析中に試料採取室を通って試料流体を流す必要のない方法及び装置を持つことが望ましいであろう。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、室中に入れた実質的に希釈されていない静止抗凝固全血試料を検査し、それから情報を得るために用いられる方法及び装置に関する。本発明に関連して用いられる用語「実質的に希釈されていない」とは、希釈が約１：１以下、好ましくはそれより遥かに少ない血液試料を指す。本発明の方法を実施するのに用いられる試薬は、一般に色素（dyes）、染料（stains）及び抗凝固剤だけであり、これらの試薬は、たとえ液体の場合であっても、試料を希釈するようにデザインされたものではない。試料のヘマトクリットにより、約７〜約４０μの厚さを有する層状に形成される赤血球の凝集及び空隙の形成を深さが許容できる限り、固定された深さを有する室内で分析を行うことができる。しかし、深さを固定することは、広く変化する白血球数を有する試料を分析することを一層困難にし、網状赤血球を同時に計算することもこの型の室では不可能である。下に記載するように、変動する貫通面厚さ（through plane thichness）を有する室を用いるのが好ましい。その室の幾つかの領域は、室の全ての領域中に充分な毛細管力を生じ、室全体に亙って血液試料を分配させ、そのことが最終的に室中に静止血液試料を与える結果になる。分析時の血液試料中の動きは、血液試料を形成する成分のブラウン運動だけであり、その動きは本発明の利用性に障害を与えるものではない。この装置は相対向する試料収納壁を有する試料保持室を有し、それらの壁の少なくとも一つは透明であり、それらの壁は室の少なくとも一部分中で収斂（converge）しているのが好ましい。好ましい態様として、室の貫通面の厚さは、このように室中の領域が異なれば異なっている。本明細書中で用いられている用語「貫通面(through plane）」は、室のどの領域中でも収斂する壁の間の最短距離に相当する視覚の直線（a line of sight）に関連している。二つの壁の収斂度、即ち室中のどの特定の点でも二つの壁の間の距離は、後で記載するように、既知であるか又は室中に試料を入れた後、測定することができる。
【０００９】
室中の最も薄い領域は、試料中に存在する個々の赤血球の単層が、室に血液試料を満たした時に形成されるような大きさである。室のこの領域の厚さは、約２μ〜約７μであるのがよく、好ましくは約５μである。このようにして、赤血球の微分網状赤血球計数の測定値（red cells' differential reticulocyte counts）を室のこの領域で導くことができる。
【００１０】
室の薄い部分から、室の厚さは増大して次第に厚い領域を室の中に形成し、それらを用いて血液試料中の種々の型の白血球及び核生成した赤血球を微細に区別し、微分算定する。核生成した赤血球はほぼ小さなリンパ球の大きさになる傾向があるが、それより大きくなることがある。この領域中の室の厚さは約７〜４０μの範囲にあるのが典型的である。室は試料ホールダーの中に入っており、その中に血液試料を引き込むことができる。
【００１１】
分析すべき試料を、例えば蛍光染料（一種又は多種）でもよい着色剤と混合し、得られた混合物を室中に広げ、静止試料を形成し、それは室の壁の収斂性により変動する厚さを有する。着色剤（一種又は多種）を試料に添加し、然る後、その試料を室中へ導入するか、又は室の壁上に着色剤を乾式被覆するなどして、試料が室の中にある間に着色剤が試料に添加されるようにしてもよい。室中の問題の領域は、試料中の着色剤に蛍光を発光させる選択された波長（単数又は複数）を有する光源によって選択的に照射される。血液試料中の赤血球単層及び白血球及び連銭形の赤血球を含む室中の領域を、好ましくは光学的装置により走査し、それら走査結果をデジタル化し、分析する。蛍光によって決定された大きさ及びＲＮＡ含有量によりグループ分けされた血小板による血小板微分計数も、連銭形赤血球及び空隙が形成される室の領域について導くことができる。増大したＲＮＡを有する血小板は比較的若い血小板である。
【００１２】
本発明は、抗凝固全血の試料中の少なくとも三つの部分の白血球百分率算定を行うための方法において、赤血球集団の凝集及び個々の白血球の赤血球からの分離を、室中へ導入された実質的に希釈されていない抗凝固全血試料で行うことができるような大きさの試料採取室を与える工程を有する方法を与える。試料採取室では、蛍光着色剤（一種又は多種）と、抗凝固全血試料との混合物が形成される。着色剤（一種又は多種）は、全血中の少なくとも三つの異なった型の白血球、好ましくは五つの異なった型の白血球を鑑別顕示する働きをすることができる。その混合物を室中に分散させ、試料中の光学的視野中の開口プラズマ空隙内に一つ以上の個々の白血球の分離された静止グループを形成する。白血球は多量の赤血球から、後者が凝集するにつれて、大部分排除されることは理解されるべきである。しかし、本発明の目的から、白血球は赤血球凝集物の個々の赤血球の上に横たわり、白血球が走査装置で見える限り依然として検出及び評価をすることができる。少なくとも三つ、好ましくは五つ以上の異なった型の白血球を前記着色剤（一種又は多種）により鑑別顕示させる適当な照明条件下で、室中の分散混合物の視野毎のＸ−Ｙ−Ｚ走査を行うことにより、視野を光学的に走査する。混合物中で検出される鑑別顕示される細胞の全てを計算し、計算した細胞を、細胞の種類によりグループ分けする。同じ着色剤及び照明条件を用いて血液試料中の網状赤血球又は核生成した赤血球の算定を細胞中の核物質の存在により行う。網状赤血球の場合、細胞中の核物質は、細胞内ＲＮＡ、或る場合には細胞内ＤＮＡのような細胞の核の残遺物を構成する。網状赤血球中に存在する差別的に蛍光を発する細胞内物質は、「細胞内核生成物質の残遺物」として特徴付けることができる。網状赤血球及び非核生成赤血球のパラメーター分析を、個々の成熟赤血球及び成熟赤血球の単層のみならず網状赤血球がそれらの大きさにより見出すことができる予想される室の最も薄い領域中で行う。
【００１３】
従って、本発明の目的は、静止抗凝固全血試料中の或る核生成した血球及び血小板の微分血球計数を得るのに用いられる方法及び装置を与えることにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、白血球従属集団百分率算定；全白血球従属集団算定；網状赤血球算定；核生成赤血球算定；血小板算定；及び癌細胞のような異常核生成した循環細胞の検出；について実質的に希釈されていない全血試料を調べることができる、記載の特性を持つ方法及び装置を与えることである。
【００１５】
本発明のこれら及び他の目的及び利点は、図面に関連して行う本発明の幾つかの態様の次の詳細な記述から一層容易に明らかになるであろう。
【００１６】
（本発明の特定の態様についての詳細な説明）
図面に関し、図１は数字２で全体的に示した装置を模式的に例示した図であり、その装置２は、変動する貫通面厚さを有する試料の入った室１４を有する。装置２は、下方支持壁４を有し、それは単に例示のために、例えば、顕微鏡のスライドでもよい。装置は直線状シム(shim)６、及び上方壁８を有し、その壁は例示の目的から、例えば、顕微鏡スライドのカバースリップ(cover slip)でもよい。壁４及び８の少なくとも一方は透明であり、その間に配置された試料が透明壁４又は８を通って調べることができるようになっていなければならない。もし望むならば、壁４及び８の両方が透明でもよい。壁８は壁４の上に乗っているか、又はそれに非常に近い一つの縁１０を有し、反対側の縁１２はシムＳの上表面に配置されている。壁４と８の間が収斂状になっている結果、変動する貫通面厚さを有する室１４が形成され、図１から分かるように、壁８の縁１０から反対側の縁１２まで貫通面厚さは増大している。
【００１７】
図２は、最も薄い縁１０から最も厚い縁１２まで室１４の厚さがどのように変化しているかを示すグラフである。実線ＰＬ は、直線的な室の形状により生ずる厚さ対距離の関係を示しており、破線ＰＮ Ｌ は非直線状の室形態によって生ずる厚さ対距離の関係を示している。
【００１８】
図３は、室１４を組み込んだ装置２の平面図を模式的に表したものであり、検査される血液試料中に存在する異なった粒径に形成された成分が室１４中に、その室が試料で満たされた時に静止分布している状態を示す平面図である。数字１０は、室１４の薄い厚さの領域を示し、数字１２は、室１４の大きな厚さの領域を示している。図３に示した装置２の図では、三つの異なった厚さの領域Ａ、Ｂ及びＣが、描いた室１４の部分中に存在する。領域Ａは室１４中の小さな厚さの領域であり、領域Ｂは室１４中の中間的厚さの領域であり、領域Ｃは室１４中の最も大きな厚さの領域である。明らかにこの特別な数の異なった厚さの領域は、本発明の好ましい室１４の主たる特徴を単に例示するために用いられたものであり、本発明を限定するものではない。なぜなら、上で述べたように、室１４は本質的に無限の数の異なった厚さ領域を含むことができるからである。図３には三つの異なった視野１、３及び５も示されている。これらの視野１、３及び５は、顕微鏡のような光学的装置により見られる視野を例示するように、円で描かれている。図３に描いた例では、血液試料は室１４を満たしており、少なくとも数秒間静止している。室１４の最も薄い領域Ａには、単独３２又は単層３１状の平らにされた赤血球が見出される。領域Ａには僅かな血小板３０も見出すことができる。網状赤血球及び非核生成赤血球の算定を、後で記載するように、室１４の領域Ａ中で行うことができる。
【００１９】
領域Ｂの下方部分には、赤血球が連銭形又は他の凝集物３３を形成するのに充分な空間が存在し、それら赤血球は、連銭形の形成により赤血球が存在しないプラズマ空隙（lacunae）によって取り囲まれている。視野３には、白血球３４及び核生成した赤血球についても計算及び分類を可能にする充分な室体積が存在する。従って、この領域で白血球３４を表面レセプタ部位について分析し、型を調べ、体積を測定し、形態を調べ、白血球３４についての僅かな付加的情報を、領域Ｂの上部中の血液試料から誘導することができる。室の厚さが領域Ｃで示される厚さまで増大するに従って、赤血球凝集物３３は合流層を形成し、白血球を位置させる能力は低下するが、この領域は非常に低い白血球を計数する場合に用いることができる。
【００２０】
図４は、室１４の一部分の平面図であり、数字１２は室１４の厚い方の縁を示し、数字１０は室１４の薄い方の縁を示している。最も薄い部分１０の所の約０μから、その最も厚い部分１２の所の約２００μまで変化する変動厚さを有する室１４は、試料の単位体積当たりの血液試料粒子数について１００倍の動的範囲を可能にする。図４には四つの視野７′、７、９及び１１が模式的に示されている。視野７、９及び１１の各々には形成された成分３２が描かれており、視野７′には何も示されていない。視野７′、７及び９には空隙３５も描かれているが、視野１１にはない。
【００２１】
図５は、全体的に数字５４で示されている自動比色顕微鏡装置組立体の模式的図であり、装置２中に含まれている血液試料を走査するのに用いることができ、人間があまり介入しなくても血液試料中の異なった型の白血球、網状赤血球及び核生成した赤血球から発光する色の波長を比色分析することができ、それによってこれらの細胞の型を同定し、互いに区別することができる。装置組立体５４は、走査される血液試料中の異なった型の白血球、網状赤血球及び核生成赤血球の像を生じさせ、それらを保存又は伝送するように設計されている。装置組立体５４にはステージ５６が含まれ、それは試料ホールダー２に嵌合するクリップ５８を有し、試料ホールダー２の内容物を走査しながら、試料ホールダー２をＸ及びＹ方向に横に移動させることができる。
【００２２】
可逆電気モーター５９を用いて駆動スクリュー６０を反対方向に選択的に回転させ、試料ホールダー２がＸ及びＹ方向に横に移動できるようにしてある。このようにして、試料ホールダー２の全内容物を走査することができる。記載した装置組立体５４の自動的態様には、Ｚ方向に選択的に移動することができるＣＣＤカメラ６２、ビームスプリッター６４、及びレンズセット６６が含まれており、試料ホールダー組立体２中の試料の入った部分に焦点を結ぶことができるようにしてある。ＣＣＤカメラ６２は、選択的に回転できるフィルター円板７４の上に取付けられた複数の異なった発光波長フィルター６８、７０及び７２を通して試料の像を見、記録することができる。装置組立体５４には、ハロゲン光源のような高強度励起光源７５も含まれており、その光源は励起光ビームを試料ホールダー２の方へ向け、ビームスプリッター６４を通ってレンズセット６６により焦点を結ばせる。選択的に回転できるフィルター円板８２には、一連の励起光波長フィルター７６、７８及び８０を取付ける。励起光ビームは、ビームスプリッター６４により焦点レンズ６６の方へ反射され、レンズ６６により試料ホールダー２の上に焦点を結ぶ。このようにして、二つのフィルター円板７４及び８２により、励起光源のみならず発光光源の波長を選択的に制御し、変化させることができる。予めプログラムしたプロセッサーコントローラー８４は、試料ホールダー２の動き、フィルター円板７４及び８２の回転、及びＣＣＤカメラ６２の作動を選択的に制御するように作動することができる。このようにしてコントローラー８４は、余り人間の介入を必要とすることなく、装置組立体１２の完全に自動化された操作を可能にしている。
【００２３】
上で述べたように、室１４中の白血球百分率を求め、網状赤血球及び核生成した赤血球の微分計数を誘導することを含めた試料の検査を実施するため、室１４中の有用な領域について室１４を走査装置で調べた時、図４に示したように、７′、７、９及び１１のような視野が見えるであろう。
【００２４】
走査装置で臨床的に重要な数の有用な細胞を計測した時、それは異なった白血球百分率、及び網状赤血球及び核生成赤血球の分析を完全に行う。統計的に意味のある数の算定成分を構成するものの決定は、算定手順の予め定められた臨床的に許容できる誤差限界に依存する。この数はどのような成分を算定したかにより変化することは認められるであろう。
【００２５】
試料中に存在し、塩基性オレンジ２１のような着色剤で超生体的に染色される細胞である、白血球、核生成赤血球、及び核物質のリボソーム残遺物を含む網状赤血球は、４８５ｎｍ範囲の光により励起した時、５３０ｎｍ、５８５ｎｍ及び６６０ｎｍでの細胞の特性蛍光により、また５６０ｎｍの光により励起した時の６１０ｎｍでのそれらの蛍光により同定することができる。静止白血球は装置５４により前記室中でリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、及び好塩基球からなる鑑別された（differentiated）グループに分離することができる。アクリジンオレンジのような他の色素は、同様な分析を行うのに同様な波長で用いることができる。
【００２６】
種々の血球を分類し、鑑別する好ましい方法は、つぎの通りである。白血球を含み、大きな核生成赤血球を含んでいてもよい多数の視野を４８５ｎｍの励起波長で照射し、白血球及び核生成した全ての赤血球の位置を突き止める。この位置決めのアルゴリズムは、蛍光を発する視野中で白血球及び或る大きな核生成赤血球だけが、大きな対象物だけであることに基づいている。必要な数の白血球の位置を突き止め、五つの発光値を記録する。この場合Ｌ₁、Ｌ₂及びＬ₃は、夫々５３０ｎｍ、５８０ｎｍ、及び６６０ｎｍでの各細胞からの全発光であり、それら全発光は、細胞像からのピクセル強度を合計することにより測定される。ＡＬ₁は、４８５ｎｍで励起した時の、５３０ｎｍでの各細胞の平均ピクセル強度である。ＡＬ₅は、５６０ｎｍの光で細胞を励起した時の、６１０ｎｍで各細胞について測定された平均ピクセル強度である。Ａ₅₈₀は、４８８ｎｍで励起した時の５８０ｎｍでの発光により決定された細胞の領域である。このようにして細胞の型を区別するのに用いられたデーターには、光度測定データー（Ｌ₁、Ｌ₂、Ｌ₃)及び形態計測データー（ＡＬ₁、ＡＬ₅、Ａ₅₈₀)が含まれる。
【００２７】
図６は、二次元空間で表示されるような装置５４により映像された細胞を示し、この場合Ｙ軸はＬ _１ ／Ｌ _３ の比であり、Ｘ軸はＬ_２／Ｌ_３の比である。クラスター分析を用いて、細胞を三つの集団に分類し、クラスター４０は好中性球及び好酸性球を示し、クラスター４１は単球及びリンパ球を示し、クラスター４２は好塩基球を示す。これらは光度測定データーのみに基づいた細胞型の分離である。一層限定された分離を行うためには、形態計測データーを付加してクラスターを更に細分し、一層多くの型の細胞の同定を行えるようにする。
【００２８】
図７は、更に二次元クラスター分析にかけたクラスター４０を示し、ここでＸ軸はＡＬ₁／ＡＬ₅の比であり、Ｙ軸はＬ₁／Ｌ₃の比である。クラスター分析は、今度は好酸球４３及び好中性球４４を表す二つの別々のクラスターへ、最初のクラスター４０を分けることができる。
【００２９】
もしクラスター４１を、図８に示したような付加的クラスター分析にかけ、Ｘ軸をＡ₅₈₀とし、Ｙ軸を比Ｌ₁／Ｌ₃とすると、クラスター４１はその二つの成分、単球４６及びリンパ球４５に分離することができる。従って、上に記載した工程は、白血球集団を少なくとも五つの従属グループに分けることができる。同定し、算定した異なった型の白血球は、その方法中に走査された全白血球数の％として記録されるのが典型的である。
【００３０】
赤血球集団中に網状赤血球が存在することは、４８５ｎｍで励起した時の各赤血球からの５８５ｎｍ及び６６０ｎｍの蛍光の全強度を測定することにより決定され、正常な赤血球の蛍光よりも大きな全蛍光を有する細胞を網状赤血球として決定する。同様に、５３０ｎｍでの強い蛍光を示す赤血球は、核生成した赤血球であると考えられる。
【００３１】
上の例では、細胞の一般的特性の指標を与える超生体染色を用いているが、抗体のような特殊エピトープ結合剤を用いることも可能であり、それら抗体は蛍光染料で標識付けしてもよく、或は着色された粒子又は蛍光粒子で標識付けしてもよい。これらは、表面抗原又は他の結合器に基づく核生成細胞の従属集団を更に分離する働きをすることができる。これらの例は、リンパ球の一般的集団からＣＤ４及びＣＤ８リンパ球を区別する標識である。本発明の方法は、走査される血液試料中の視野中の赤血球の存在により悪影響を受けることはなく、従って、希釈又は種々の型の細胞の重力分離のような手のかかる試料調製を必要としない。大きさ、粒度、核生成物質含有量、表面レセプタ等のような形態計測情報を、本発明の方法により検出することができる。
【００３２】
本発明の記載した態様の多くの変化及び変更を、本発明の概念から離れることなく行うことができるので、特許請求の範囲で要求する以外に本発明を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 試料を受ける室を有する血液試料分析装置の模式的斜視図であり、その室は、貫通面厚さが変動する領域を有する。
【図２】 室中の貫通面厚さが最も小さな領域から、室中の他の貫通面厚さの領域までの室厚さと距離との関係をプロットしたグラフであり、実線は図１に示したような直線的な室の場合を表し、破線は非直線的に変化する厚さを持つ室の場合を表す。
【図３】 本発明に従って形成された厚さが変動する室の一部分の模式的平面図であり、静止血液試料中に形成された種々の大きさの成分が、どのように室中の種々の厚さ領域中へ分離され、室中の異なった視野中で個々に見ることができるようになるかを概略的意味で例示した図である。
【図４】 試料走査装置により計測することができる四つの異なった視野を示す室の一部分の模式的平面図である。
【図５】 室中に入れた抗凝固全血試料に形成された成分の或る特性を同定し、算定し、分析するのに用いることができる走査装置の模式的図である。
【図６】 特定の分析設定条件下の白血球グループのクラスター形成を示す二次元プロットの図である。
【図７】 第二の分析設定条件下の図６のクラスターの一つの従属グループ分けを示す二次元プロットの図である。
【図８】 第三の分析設定条件下の図６のクラスターの一つの従属グループ分けを示す二次元プロットの図である。

Claims (25)

1. 試料採取室（１４）中に入れられた抗凝固全血の試料について白血球百分率を測定する方法において、
   ａ） 前記試料採取室中に、少なくとも一種類の蛍光着色剤であって前記全血中の異なった型の白血球（３４）を鑑別顕示する働きをすることができる着色剤と、抗凝固全血との混合物を与える工程、
   ｂ） 前記混合物を前記室全体に、水平方向に細胞の大きさに応じて分散させ、試料中の光学的作用場内で一つ以上の個々の白血球の静止群を伴なった赤血球凝集物（３３）を形成させる工程、
   ｃ） 異なった型の白血球を前記着色剤により鑑別顕示させる適当な照明条件下で前記室中の前記分散混合物の多視野Ｘ−Ｙ−Ｚ走査を光学的に行う工程、
   ｄ） 異なった白血球従属集団を光度測定及び／又は形態計測により明確なクラスター（４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６）に分離して、前記走査工程で検出された白血球の従属集団を区別する工程、
   ｅ） 各従属集団クラスター中の白血球を算定し、分類する工程、及び
   ｆ） 前記分離工程により得られた各クラスター中の白血球の異なった従属集団の各々の百分率算定を行う工程、
   を特徴とする白血球百分率算定方法。
2. 室に、変動する貫通面厚さ、即ちＺ軸が与えられ、その厚さが、走査工程が行われる室の領域中、０〜５０μの範囲にある、請求項１に記載の方法。
3. 白血球を明確な静止クラスターへ分離し、それらクラスターにリンパ球、単球、顆粒球、好酸球、及び好塩基球が含まれる、請求項１に記載の方法。
4. 変動する貫通面厚さを有する楔型の試料採取室（１４）中に入れられた抗凝固全血の試料中の核生成した血球の微分算定を行う方法において、
   ａ） 前記試料採取室中に、少なくとも一種類の蛍光着色剤であって全血中の異なった型の核生成血球（３４）を鑑別顕示する働きをすることができる着色剤と、抗凝固全血との混合物を与える工程、
   ｂ） 異なった型の核生成血球を前記着色剤により鑑別顕示させる適当な照明条件下で前記室中の分散混合物の多視野Ｘ−Ｙ−Ｚ走査を光学的に行う工程、
   ｃ） 少なくとも一種類の核生成血球従属集団を光度測定及び／又は形態計測により明確なクラスター（４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６）に分離して、前記走査工程で検出された他の核生成血球から該核生成血球従属集団を区別する工程、
   ｄ） 前記核生成血球従属集団クラスター中の核生成血球を算定し、分類する工程、及び
   ｅ） 前記分離工程により得られた前記クラスター中の核生成血球の従属集団の各々の血球計数を得る工程、
   を特徴とする血球微分算定方法。
5. 血液試料中の網状赤血球中の核生成物質の残遺物を鑑別顕示する働きをすることができる一種類以上の蛍光着色剤と混合されて抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中の網状赤血球算定を行い、然も前記血液試料と着色剤とが厚さが変動する領域を中に有する楔型の観察室（１４）中に入れられている算定方法において、
   ａ） 視野を有する光学的装置（５４）により血液試料を走査する工程、
   ｂ） 前記静止血液試料中の視野（７′、７、９、１１）で、個々の赤血球又は赤血球の単層が含まれている視野の位置を定める工程、
   ｃ） 静止血液試料中の前記位置が指定された視野を、選択された波長の光で照射し、前記位置指定視野中の赤血球の核生成物質の残遺物を鑑別顕示する工程、及び
   ｄ） 前記視野中の鑑別顕示された赤血球を算定する工程、
   を特徴とする網状赤血球算定方法。
6. 血液試料中の白血球（３４）中の核生成物質を鑑別顕示する働きをすることができる一種類以上の蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料について白血球百分率算定を行い、然も、前記血液試料と着色剤とが種々の厚さの領域を中に有する楔型の観察室（１４）中に入れられている白血球百分率算定方法において、
   ａ） 視野（７′、７、９、１１）を有する光学的装置（５４）により血液試料を走査する工程、
   ｂ） 前記静止血液試料中の視野の位置を定め、走査し、然も前記視野には個々の白血球及び赤血球の凝集物（３３）が入っている工程、
   ｃ） 静止血液試料中の前記視野を、選択された波長の光で照射し、前記位置指定視野中の白血球の核生成物質を鑑別顕示する工程、及び
   ｄ） 前記位置指定され走査された視野中の全ての鑑別顕示された白血球を分類し、数をかぞえ、白血球百分率算定を行い、然も、前記分類工程が、前記鑑別顕示された白血球から出た発光の差に基づいている工程、
   を特徴とする白血球百分率算定方法。
7. 種々の型の白血球から発した種々の信号特性により、着色剤が白血球の型を互いに区別する働きをすることができ、それにより血液試料から白血球百分率算定を行うことができる、請求項６に記載の方法。
8. 分類工程が、発光の差から得られる光度測定及び形態計測による両方の細胞情報を用いることを含む、請求項６に記載の方法。
9. 血液試料中の白血球（３４）中の細胞内色素結合物質を鑑別顕示する働きをすることができる一種類以上の蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料について白血球百分率算定を行い、然も、前記血液試料と着色剤とが厚さが変動する貫通面領域を中に有する楔型の観察室（１４）中に入れられている白血球百分率算定方法において、
   ａ） 赤血球の凝集物（３３）から分離された少なくとも予め定められた数の個々の白血球が入った前記静止血液試料中の使用可能な視野（９）の位置を定める工程、
   ｂ） 白血球中に含まれている細胞内色素結合物質を微分顕示し、照射された白血球から光を発光させる少なくとも一種類の予め定められた波長の光で前記使用可能な視野を照射する工程、
   ｃ） 二つ以上の異なった波長で、前記照射された白血球から発した光を測定する工程、及び
   ｄ） 白血球の型を互いに区別するやり方で、発光した光の前記種々の波長を分析する工程、
   を特徴する白血球百分率算定方法。
10. 区別する工程を、発光した光から誘導された光度測定情報及び／又は形態計測情報を用いることにより行い、更に白血球のそのような区別された型のものを数える工程を含む、請求項９に記載の方法。
11. 核生成物質を含むか、又は核生成物質の細胞内残遺物を含む目的細胞で、蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、個々の分離された細胞の入った領域（Ａ）を含む楔型の観察室（１４）中に分散されている目的細胞の少なくとも一つの従属集団を同定し、然も前記領域が０μ〜４０μの範囲にある貫通面厚さを有する細胞従属集団同定方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野（１、３）を光学的に走査し、然も、前記領域は個々の赤血球（３２）、及び／又は赤血球の単層（３１）、及び／又は赤血球凝集物（３３）を含む工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により多数の既知の波長の核生成物質又は残遺物核生成物質の蛍光発光を起こさせる働きをすることができる一種類以上の予め定められた波長の光源で照射し、然も前記発光が細胞従属集団に特性的なものである工程、及び
    ｃ） 前記多数の既知の波長の前記発光を分析し、視野中の細胞の従属集団を同定する工程、
    を特徴とする細胞従属集団同定方法。
12. 観察室が、４０μより大きな貫通面厚さを有する付加的領域（ｃ）を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 着色剤が、超生体染色剤である、請求項１１に記載の方法。
14. 核生成細胞の従属集団が、白血球（３４）の従属集団である、請求項１１に記載の方法。
15. 核生成細胞の従属集団が、赤血球（３２）の従属集団である、請求項１１に記載の方法。
16. 着色剤が、核生成細胞の従属集団のエピトープに向けられ
    た結合粒子の一部分である、請求項１１に記載の方法。
17. 発光が、問題の従属集団を同定するのに用いることができる光度測定及び／又は形態計測特性を特徴とする、請求項１１に記載の方法。
18. 蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、赤血球の凝集物（３３）及び個々に分離された核生成球（３４）を含む領域（Ｂ）で、然も５０μ以下の貫通面厚さを有する領域を含む楔型の観察室（１４）中に分散された核生成血球の少なくとも一つの従属集団を同定する方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野を光学的走査装置（５４）で走査する工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により多数の既知の波長の蛍光発光を生じさせる働きをすることができる予め選択された波長の光源で照射し、然も前記発光が核生成した細胞の従属集団に特徴的なものである工程、及び
    ｃ） 前記多数の既知の波長の前記発光を分析し、視野中の核生成した細胞の従属集団を同定する工程、
    を特徴とする核生成血球従属集団同定方法。
19. 蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、個々に分離された核生成細胞（３４）を含む領域（Ｂ）で、然も５０μ以下の貫通面厚さを有する領域を含む楔型の観察室（１４）中に分散された核生成細胞の従属集団を同定する方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野（３、５）を、光学的走査装置（５４）で走査する工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により多数の既知の波長の蛍光発光を生じさせる働きをすることができる予め選択された波長の光源で照射し、然も前記発光が核生成した球の従属集団に特徴的なものである工程、及び
    ｃ） 前記多数の既知の波長の前記発光を分析し、視野中の核生成した細胞の従属集団を同定する工程、
    を特徴とする核生成細胞従属集団同定方法。
20. 蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、個々の赤血球（３２）及び／又は赤血球の単層（３１）及び／又は赤血球の凝集物（３３）を含む領域（Ａ、Ｂ）で、然も５０μ以下の貫通面厚さを有する領域を含む楔型の観察室（１４）中に分散された核生成細胞（３４）の目的従属集団を同定する方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野（１、３、５）を、光学的走査装置（５４）で走査する工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により一つ以上の既知の波長の蛍光発光を生じさせる働きをすることができる一つ以上の予め選択された波長の光源で照射し、然も前記発光が核生成した細胞の前記目的従属集団に特徴的なものである工程、及び
    ｃ） 前記既知の波長の前記発光を分析し、核生成した細胞の前記目的従属集団を同定し、区別する工程、
    からなる核生成細胞従属集団同定方法。
21. 観察室が、４０μより大きな貫通面厚さを有する付加的領域（Ｃ）を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、個々の赤血球（３２）及び／又は赤血球の単層（３１）を含む領域（Ａ）で、然も２０μ以下の貫通面厚さを有する領域を含む楔型の観察室（１４）中に分散された網状赤血球を同定する方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野（１、３）を、光学的走査装置（５４）で走査する工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により一つ以上の既知の波長の蛍光発光を生じさせる働きをすることができる一つ以上の予め選択された波長の光源で照射し、然も前記発光が、前記網状赤血球中に含まれた核生成物質の残遺物に特徴的なものである工程、及び
    ｃ） 前記既知の波長の前記発光を分析し、試料中の前記選択した領域中の前記網状赤血球を互いに区別決定する工程、
    を特徴とする網状赤血球同定方法。
23. 楔型の試料採取室（１４）中に入れられた抗凝固全血の試料について微分核生成血球算定を行う方法において、
    ａ） 前記試料採取室中に少なくとも一種類の蛍光着色剤と抗凝固全血との混合物を与え、然も前記着色剤が全血中の異なった型の核生成血球（３４）を微分顕示する働きをすることができる工程、
    ｂ） 異なった型の白血球を前記着色剤により微分顕示させる適当な照明条件下で前記室中の分散混合物の多視野Ｘ−Ｙ−Ｚ走査を光学的に行う工程、
    ｃ） 少なくとも一種類の核生成血球従属集団を明確なクラスター（４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６）に光度測定及び／又は形態計測により分離して、前記走査工程で検出された他の核生成細胞からの核生成血球の従属集団を区別する工程、
    ｄ） 前記核生成血球従属集団クラスター中の核生成血球を数え、分類する工程、及び
    ｅ） 前記分離工程により得られた前記クラスター中の核生成血球の従属集団の細胞算定を行う工程、
    を特徴とする微分核生成血球算定方法。
24. 血液試料中の網状赤血球中の核生成物質の残遺物を微分顕示する働きをすることができる一種類以上の蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中の網状赤血球算定を行い、然も前記血液試料と着色剤とが楔型の観察室（１４）中に入れられている網状赤血球算定方法において、
    ａ） 視野（７′、７、９、１１）を有する光学的装置（５４）により前記血液試料を走査する工程、
    ｂ） 前記静止血液試料中の視野の位置を定め、然もそれら視野（１、３）には個々の赤血球（３２）又は赤血球の単層（３１）が含まれている工程、
    ｃ） 静止血液試料中の前記位置が指定された視野を、選択された波長の光で照射し、前記位置指定視野中の赤血球の核生成物質の残遺物を微分顕示する工程、及び
    ｄ） 前記視野中の微分顕示された赤血球の数をかぞえる工程、
    を特徴とする網状赤血球算定方法。
25. 蛍光着色剤と混合された抗凝固全血の実質的に希釈されていない静止試料中に含まれており、個々の赤血球（３２）及び／又は赤血球の単層（３１）及び／又は赤血球の凝集物（３３）を含む領域（Ａ）を含む楔型の観察室（１４）中に分散された細胞又は他の形成された物体の目的従属集団を同定する方法において、
    ａ） 前記領域中の選択された視野を、光学的走査装置（５４）で走査する工程、
    ｂ） 前記選択された視野を、前記蛍光着色剤により一つ以上の既知の波長の蛍光発光を生じさせる働きをすることができる一つ以上の予め選択された波長の光源で照射し、然も前記発光が細胞及び他の形成された物体の前記目的従属集団を区別する働きをすることができる光度測定及び形態計測情報を与える工程、及び
    ｃ） 前記発光を分析し、細胞及び形成された物体の前記目的従属集団を光度測定及び形態計測の両方により同定し、区別する工程、
    を特徴とする目的従属集団同定方法。

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