JP4184258B2 - 光学式赤血球および白血球の弁別 - Google Patents
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Description
試料中の哺乳類の赤血球の容積、ヘモグロビン濃度、成熟度、および赤血球形状を決定し、同時にシステム標準化をモニタするための方法および装置が開示される。赤血球分析の前に、赤血球を他の細胞粒子から区別するための方法も開示される。方法は、広範囲の可視スペクトルに対して正確に適用することができる。全血試料は、中性pHの等張緩衝溶液に非イオン性界面活性剤を含む試薬溶液で処理され、赤血球は、選択された波長で単一ファイルにおける光のビームを通過し、1つの光損失信号、選択された角度間隔での1つの前方角度光散乱信号、および第3の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、あるいは、選択された角度間隔での2つの前方角度光散乱信号、および第3の側方角度光散乱信号の結果として得られる大きさによって、初期的なサイトグラムを獲得し、容積およびヘモグロビン濃度のグリッドラインを含む予め較正された三次元表面に、1点ずつサイトグラムを投影し、三次元グリッド表面への各投影された交差(インターセプト)の場所によって、赤血球容積およびヘモグロビン濃度の正確な値を決定する。
開示された装置の1つの実施態様は、米国特許第5,656,499号および第5,631,165号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置(METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUOMATED ANALYSIS)」に開示された、修正されたCELL DYN(登録商標)4000ヘマトロジーアナライザーである。本発明の開示された方法を行うために、CELL DYN(登録商標)4000システムデテクタおよびプリアンプボードは修正された。修正されたデテクタを示す図が、図1Aに表される。3つのゾーン(3リング)が形成される。中心矩形ゾーン(ゾーン1)は軸方向光損失(0度、ALL)用であり、中間ゾーン(ゾーン2、2.24から7.45度、IAS)は、3つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン(ゾーン3)は4.5から5.5度(IAS’)である。CELL DYN(登録商標)4000プリアンプボードも、図1Bに例示されるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての3つのリングから信号を電気的に加算することによってIAS出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ALLおよびIASであるか、またはIAS’およびIASである(または配線し直すならば、ALLおよびIAS’である)。ALLチャネルのゲインが4に設定されるのであれば、IAS’は、ALLの代わりに、出力へルートづけられる。IAS’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ(DIP)スイッチによって設定される。ALLおよびIASは、WBC/弁別のために使用され、ALLおよびIAS’の組み合わせ、またはIAS’およびIASの組み合わせのいずれかが、RBC/弁別のために使用される。三次元RBC/弁別分析ために使用される第3の角度が、側方散乱信号であり、これは、125度円錐から構成される。これは、本質的にレーザ光の垂直偏光を保存するため、側方偏光散乱(PSS)と呼ばれる。125度全角度円錐の同一側方収集システムも、米国特許第5,691,204号に開示された試薬のRNAステインによって染色された網状赤血球の蛍光信号を収集する。この特徴は、単一の試薬および単一の光源から、網状赤血球の識別を可能にし、且つ成熟RBCおよび網状赤血球の両方のV&HC測定を可能にするものであり、これは、本発明の独特な特徴である。
WBC/弁別試薬
WBC弁別分析およびNRBC定量化に使用されるCELL DYN(登録商標)4000WBC試薬の組成物は、米国特許第5,516,695号に開示されており、NRBC分析の方法は、米国特許第5,559,037号に開示されている。
CELL DYN(登録商標)4000希釈剤シースの組成物は、米国特許第5,656,499号に開示されており、CELL DYN(登録商標)4000網状赤血球試薬組成物および方法は、米国特許第5,691,204号に開示されている。希釈剤シースおよび網状赤血球試薬の両方は、システムに予め存在する流体素子工学構成のため、開示された方法をCELL DYN(登録商標)4000システムで行うためのものであるが、2つの試薬を1つの試薬に化合して、開示された方法を行うことができる。
開示されたRBC弁別分析を修正されたCELL DYN(登録商標)4000で行うために、36.1μlの全血試料が、試料吸引プローブによって、約10.513μlの希釈剤シースを含んでいるRBCカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第5,656,499号および第5,631,165号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されるように、試料の絶対RBC計数を電気的に決定する。次いで、約450μlの希釈された試料が、450μlの網状赤血球試薬を含んでいる網状赤血球カップ内に移され、ここで混合され、網状赤血球は染色される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。細胞のストリームは、シースによって囲まれた層流の流体力学的に集束された試料ストリーム内で、本質的に一度に1細胞ずつ、フローセルを通って流れる。フロー軸に垂直な光のビームが、ストリームを照射する。照射された容積における細胞からの光散乱信号は、開示された3リングデテクタ(IASおよびIAS’)によって、および偏光側方散乱(PSS)および緑蛍光(FL1)を検出する2つの光電子増倍管(PMT)によって検出される。これらのパルスの振幅は、デジタル化され、リストモードデータとして保管される。本実施態様において、約20,000細胞が8秒間に計数される。
第1に、図6Aに示されるFL1対IASサイトグラムにおいてRBCの左側に表れる信号は、血小板として識別される。第2のステップは、WBCおよびNRBC(もしあれば)を識別しラベルづけることであり、それらの信号は、FL1対IASサイトグラムにおいてRBCより上に表れる。FL1ヒストグラム(図6B)をスキャンして、サイトグラムにおけるRBCゲートの上部縁を決定する。ゲート内の事象は、成熟RBCおよび網状赤血球である。
本発明の方法は、十分に高いS/N比(染色された網状赤血球対染色されていない成熟RBC)を有するため、信号を分離するために数学的訂正は必要ない。先の開示(米国特許第5,691,204号)に記載されるように、ゲート内のRBC母集団のFL1ヒストグラムは、成熟RBCのピークに関してスキャンされ、このピークと第2のピーク(網状赤血球ピーク)との間の谷か、または傾斜の減少(網状赤血球「先端」)か、のいずれかに関してより高いFL1値でスキャンされ、そこで、網状赤血球を成熟赤血球から分離するために線が引かれる。この線より上の細胞は、網状赤血球とラベルづけられ、網状赤血球のパーセント(%R)は、合計RBC母集団の一部として決定され、RBCインピーダンス測定から決定されるように、この%Rに試料中のRBCの絶対濃度を掛けて、網状赤血球の絶対濃度を得る。
ゲートされたRBCの3つの散乱信号が分析され、標準化三次元表面に表示される。三次元表面構造の詳細は、下記に説明される。
最初に、MCVおよびMCHCに関する知られている参照値を備えた1セットの正常血液を、二重に流す。全読取値のMCVおよびMCHCの総平均が計算される。次いで、90fL(正規化された)のMCVおよび34(正規化された)のMCHC’を備えたRBC母集団の平均散乱信号が、チャネル125+/−3、すなわち各スケールの中心(CELL DYN(登録商標)4000は、全散乱チャネルに関する256チャネルリニアスケールを有する)になるように、各散乱チャネル(IAS、PSS、IAS’またはALL)に関するゲインが調整される。あるいは、適切な屈折率を有する安定したビーズか、または安定したヒトRBCが、標準化されたシステムの各散乱チャネル数の平均でラベル値割り当てされ、標準粒子として使用されることが可能である。
第1のステップとして、三次元マップの理論的モデルが、ミー散乱理論に基づいて構成される。知られているMCVおよびMCHCを備えた赤血球の散乱信号を、完全に表面に適合させるために微調整が行われる(これは、吸収のため、488nmでヘモグロビン溶液の屈折率を正確に測定することが困難であるため、誤りが発生する可能性があるからである)。ミー散乱理論は、垂直に照射された均質な球形に関するマクスウェルの方程式の解法に基づいている。理論は、一定の屈折率を有する球形によって散乱される強度の計算方法を提供する(Kerker、Bohren、およびHuffman)。理論は、下記の入力パラメータを必要とする。
a)球形の屈折率。これは、球形が吸収するときに、複素数である。
b)媒体の屈折率(媒体は、光を吸収してはならない)。
c)照射に使用される光の波長および偏光。
d)容積から計算することができる球形の直径。
i2=|S2(θ)|2
I=強度(相対数)
λ=波長(真空)
θ=レーザ方向と観察の方向との間の角度
φ=レーザ偏光と観察の方向との間の角度
i1、i2=2つの異なる偏光方向の強度
である。
CELL DYN(登録商標)4000前方散乱角度デテクタ(空中でIAS3度から10度)は、容積に対して不感受性である。理論は、収集角度が懸濁媒体内で規定されなければならないことを必要とする。媒体(CELL DYN(登録商標)4000希釈剤シース)の屈折率は、λ25℃ max488nmで1.339である。したがって、スネルの法則によって、希釈剤の収集角度は2.24から7.45である。図2Aおよび図2Bは、希釈剤における相対弁別クロス散乱対角度を表示する。弁別クロス散乱は、式2の積分より下の部分未満のものはない。
RBCが完全な球形であると仮定すると、3つの散乱信号、IAS、IAS’、およびPPS(またはALL、IAS’、およびPPS)は、主に、2つのRBCパラメータすなわちVおよびHCに応じる。すべての可能なVおよびHCの組み合わせが一緒に、空間に表面を形成する。空間におけるIAS’、ALL、およびPPSの表面の簡略にされた説明が、図3に示される。単一細胞のVおよびHCがどのように得られるかという原則を説明するために、三次元における表面の小さな部分のみが表示される。表面は実際には湾曲しているが、表面は平面であると仮定する。しかし、単一のRBCのVおよびHCを見出すために、同一の原則を表面に適用することができる。システムが完全に標準化されるときには、すべての球形RBCは、表面のまわりに非常に近接して分布される。鎌状細胞等の異常な形状のRBCは、表面からより離れている信号を生成する。このようにして、異常な細胞形状を識別するのに、RBC信号の表面からの距離を使用することができる。
ミー散乱理論は、知られている屈折率を有する完全球形からの信号を予測する。屈折率およびVの範囲に関する信号を計算することによって、表面上の点を見出すことができる。ミー理論は、信号強度の相対数のみを提供する。したがって、信号の三次元の正確なチャネル数は、これらを表面に正確に配置するために、ゲイン係数を掛けることによって計算されなければならない。これらの係数を見出すのを可能にするために、屈折率がヒト赤血球MCHCの臨床範囲内に入る3つの異なる炭化水素(ヘプタン、ノナン、およびドデカン)が使用された。3つの炭化水素の各々は、懸濁媒体内で強く混合されるときには、同一の屈折率を有する様々なサイズの滴を生成する。これらの3つのオイルの各々は、屈折率が異なるため(炭化水素は吸収がない)、互いに異なる、明確なV信号分布トラックを作る。次に、ミー理論によって作られる表面の正確度は、表面上のもっとも近接した点への実際の信号の距離を測定することによってチェックされる。たとえば、表面が3つの炭化水素によって生成される信号へ完全に適合するのであれば、3つのヒストグラムのピークの表面への距離はゼロである。
開示された装置は、修正されたCELL DYN(登録商標)4000(CD4000)システムである。CD4000デテクタおよびプリアンプボードは、白血球弁別(WBC/弁別)分析と赤血球弁別(RBC/弁別)分析との両方に同一のデテクタを使用するために、修正される。修正されたデテクタを示す図は、図1Aに見られる。3つのゾーンが形成される。中心矩形ゾーン(ゾーン1)は軸方向光損失(0度、ALL)用である。中間ゾーン(ゾーン2、2.24から7.45度、IAS)は、3つのサブゾーンに分割され、中心ゾーン(ゾーン3)は4.5から5.5度(IAS’)である。プリアンプボードは、図1Bに描かれるように修正された。修正されたプリアンプボードは、すべての3つのリングから信号を電気的に加算することによってIAS出力を形成する。この修正されたプリアンプボードからの可能な出力は、ALLおよびIASであるか、またはIAS’およびIASである(または配線し直すならば、ALLおよびIAS’である)。IAS’ゲインは、オンボードデュアルインラインパッケージ(DIP)スイッチによって設定される。ALLおよびIASは、WBC弁別のために使用され、ALLおよびIAS’か、またはIAS’およびIASかの組み合わせのいずれかが、RBC弁別分析のために使用される。三次元RBC弁別分析ために使用される第3の角度は、90度側方散乱である。
この実験のために、米国特許第5,656,499号および第5,631,165号、発明の名称「自動分析を行うための方法および装置」に記載されたCD4000システムが、例1に記載されたように、3リングデテクタおよび新しいプリアンプボードを備えて修正された。約112.5μlの正常全血試料が、試料吸引プローブによって、約10.513μlのCD4000希釈剤シースを含んでいるRBCカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、シース状インピーダンス開口部へ運ばれ、米国特許第5,656,499号および第5,631,165号に記載されるように、絶対RBC計数を電気的に決定する。約450μlの希釈された試料は、CD4000網状赤血球カップ内に移され、このカップは約450μlの網状赤血球試薬を含んでおり(米国特許第5,691,204号、1997年11月25日。「網状赤血球の迅速分析用の組成物および方法(Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes)」)、混合される。次いで、準備された試料は、検出のために、シース状光学式フローセルへ運ばれる。WBCおよびNRBCは、RBCゲートによって排除され、網状赤血球は、米国特許第5,656,499号および第5,631,165号に記載されるように、識別され定量化される。同時に、3つの散乱信号は、各事象に関しても測定され、標準三次元表面に表示される。図4Aおよび図4Bは、三次元表面にきっちりと重なり合う正常血液の正面図および側面図を示す。完全に標準化され較正されたシステムで、図4Bに示されるように、約50%の信号が表面より上になり、50%が表面より下になる。
鎌状細胞を含む臨床血液試料が、例2に記載された開示された装置を流れた。図5Aおよび図5Bは、それぞれ、試料の正面図および側面図を表示する。見ることができるように、異常な形状の鎌状細胞のため、細胞母集団はかなり分散しており、側面図は、信号が三次元表面から外れることを示す。各事象の表面からの距離に基づいて、本発明の方法は、異常な形状のRBCのパーセントを概算することができる。同一試料のTycko(バイエルH*1)による先行技術の二次元分布は、図5Cに表示される。図5Cから見ることができるように、二次元分布は、異常な細胞形状を球形の正赤血球から区別しない。その上、異常な形状を有するRBCの有意な数は、二次元マップから外れ、それによって容積測定から除外される。
高WBC試料およびWBCのRBCゲートからの分離および除外のCD4000サイトグラム(FL1対IAS)は、染色された網状赤血球および成熟RBCを含み、図6Aに示される。図4Aに示されるように、本発明の方法は、RBC/弁別分析の前に、WBCをRBC母集団からはっきりと識別し排除する。ゲートされた母集団のFL1ヒストグラムは、図6Bに示される。逆に、Tycko(バイエルH*1)によって開示された先行技術は、WBCをRBC母集団からはっきりと区別しないかまたは分離しない(図6C参照、先行技術による同一試料のRBC分布)。したがって、先行技術の方法は、様々な白血病の患者、特に、慢性リンパ球性白血病(CLL)の患者からの上昇WBC試料では、誤った赤血球MCVおよびMCHC結果を生成する可能性があるが、それは、CLLのリンパ球が、RBCと同じほど小さいだけではなく、RBCと同じほど小さい光散乱を生成するには壊れ易いからである。
小赤血球(図7A)、正赤血球(図7B)、および大赤血球(図7C)のRBC試料の細胞ヘモグロビン含有量(HC)対容積(V)の二変数分布が、本発明の方法によって分析された。2本の固定線が、正常範囲のまわりに垂直に且つ水平に引かれ、各試料におけるサイズおよびヘモグロビン含有量のRBC異常性の異なる組み合わせを識別し計数する。下記の表1a、1b、および1cは、各カテゴリーの細胞の概算されたパーセンテージを示す。提供された情報に基づいて、患者の状態の赤血球不同症、小赤血球症、大赤血球症、血色素減少症、および血色素増加症の重大度レベルを決定することができる。
平均細胞容積(MCV)の回帰統計およびプロット。図8Aは、本発明対Tycko(バイエルH*1)による先行技術の結果を表し、図8Bは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対CELL DYN(登録商標)4000MCV結果(流体力学的に集束された細胞を使用した電気インピーダンス測定)の結果を表す。
MCHCの回帰統計およびプロット。図9Aは、本発明対Tycko(バイエルH*1CHCM)による先行技術の結果を表示し、図9Bは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対CELL DYN4000MCHC(インピーダンスMCVおよびヘモグロビンのCELL DYN4000比色分析測定から計算された結果)の結果を表示する。
MCHの回帰統計およびプロット。図10Aは、本発明対Tycko(バイエルH*1MCH)による先行技術の結果であり、図10Bは、正常および臨床試料のセットにおける、本発明対CELL DYN(登録商標)4000MCH(インピーダンスRBC計数およびヘモグロビンの比色分析測定から計算された)の結果である。
開示された方法による正常および臨床試料のセットにおける平均網状赤血球容積(RETV)と合計RBCMCVとの比較が、図11Aに示され、開示された方法による正常および臨床試料の同一のセットにおける網状赤血球MCHC(RETHC)と合計RBCMCHCとの比較が、図11Bに示される。
約1.67μLの全血試料が、試料吸引プローブによって、約2800μlの上記例2に使用されたものと同一の希釈剤を含んでいるRBCカップ内に置かれ、混合される。次いで、希釈された試料は、アボットCELL DYN3200シース状光学式フローセルへ運ばれ、細胞1つずつの容積およびヘモグロビン測定に関する信号を収集する。アボットCELL DYN3200の光源は、5mワットヘリウムネオンレーザであり、そのデテクタは、1度から3度、および3度から10度2つの前方光散乱信号、および90度+/−30度の側方散乱信号を収集するように構成される。試料のFSCファイルは較正された三次元表面で分析され、本発明の開示された方法を使用して、ヘリウムネオンシステムに関して作られる。157個の正常および臨床試料、および、浸透圧検査からの66個の試料がシステムに流され、結果の比較は図12Aおよび図12Bに示される。浸透圧実験は、血液を希釈するために使用される両方の試薬(CELL DYN3200およびH*1)の塩濃度を変えることによって行われた。検査された浸透圧範囲は、175mOsm/Lから500mOsm/Lであった。
Claims (13)
- 個別の赤血球の容積Vおよびヘモグロビン含有量HCを決定するための三次元光学式方法であって、
a)抗凝固全血試料を、赤血球を球形づける球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
b)前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
c)各赤血球からの光ビームの方向に対して4.5°から5.5°の角度範囲で測定される第1の光散乱信号、2.24°から7.45°の角度範囲で測定される第2の光散乱信号、および90°の角度で測定される第3の光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
d)VおよびHCのグリッドラインを含み、第1の光散乱信号、第2の光散乱信号、および第3の光散乱信号の大きさによって規定され、かつ標準の光散乱信号によって予め較正された三次元表面に、各赤血球から測定された前記光散乱信号の三次元座標を投影するステップと、
e)前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、VおよびHCの値を決定するステップとを含む、方法。 - 前記光散乱信号が、各赤血球の容積およびヘモグロビン濃度によって決定され、前記ヘモグロビン濃度が、前記光ビームの波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じる、請求項1に記載の方法。
- 前記選択された波長が、400nmから800nmの範囲の可視光に対応する、請求項1に記載の方法。
- 前記三次元表面が、ミー散乱理論に基づいて計算され、前記光ビームの方向に対する前記光散乱信号の角度範囲、前記光ビームの波長、および前記波長におけるヘモグロビンの屈折率に応じる、請求項1に記載の方法。
- 前記試薬溶液が、核酸ステインをさらに含み、核酸ステインが、第4の蛍光信号によって、前記血液試料の成熟赤血球から網状赤血球を分離することを可能にする、請求項1に記載の方法。
- 白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、前方散乱および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項5に記載の方法。
- 白血球、血小板、および有核赤血球を含む他の細胞状粒子を除外するための赤血球ゲートをさらに含み、前記ゲートが、光損失および蛍光の二次元サイトグラムを作ることによって確立される、請求項5に記載の方法。
- 三次元表面グリッド方法が、前記網状赤血球の容積およびヘモグロビン濃度を決定するために適用される、請求項5に記載の方法。
- 前記三次元グリッド表面の法線方向で測定された、前記三次元グリッド表面から赤血球点のもっとも近い距離を決定し、前記赤血球点の決定されたもっとも近い距離が、所定の距離より長い場合に、赤血球を異常な形状の赤血球として識別することによって、異常な形状の赤血球を識別することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記血液試料の個別の赤血球の容積およびヘモグロビン濃度の二変数分布から、前記血液試料における大赤血球、小赤血球、血色素減少細胞、血色素増加細胞、またはそれらの組み合わせのパーセントを定量化することができる、請求項1に記載の方法。
- 前記三次元グリッド表面から細胞母集団の距離の対称性程度を決定し、決定された対称性程度が、所定の程度から外れる場合に、個別の赤血球の容積およびヘモグロビン含有量を決定するためのシステムが、標準から外れたとして識別することによって、システム標準化を継続してモニタすることを含む、請求項1に記載の方法。
- 個別の赤血球の容積Vおよびヘモグロビン含有量HCを決定するための三次元光学式方法であって、
a)抗凝固全血試料を、赤血球を球形づける球形剤および中性緩衝等張塩水を含む試薬溶液で処理するステップと、
b)前記試料から分離された赤血球を、選択された波長で光路に沿って方向づけられた光ビームを通過させるステップと、
c)各赤血球からの光ビームの方向に対して4.5°から5.5°の角度範囲で測定される第1の光散乱信号、0°の角度で測定される1つの光損失信号、および90°の角度で測定される第3の光散乱信号の結果として得られる大きさを測定するステップと、
d)VおよびHCのグリッドラインを含み、第1の光散乱信号、光損失信号、および第3の光散乱信号の大きさによって規定され、かつ標準の光散乱信号によって予め較正された三次元表面に、各赤血球から測定された前記光信号の三次元座標を投影するステップと、
e)前記三次元グリッド表面に各投影された交差の場所によって、VおよびHCの値を決定するステップとを含む、方法。 - 前記球形剤が、非イオン性界面活性剤である、請求項1または12に記載の方法。
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