CN102016578B - 利用红细胞内含有的血红蛋白的本征色素沉着来确定血样的血细胞比容的方法及设备 - Google Patents

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Abstract

提供了一种确定血液样本的血细胞比容的方法，该方法包括以下步骤：1)将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室(10)中，该腔室由第一和第二平板(12，16)的内表面(14，18)和在这两个平板之间延伸的高度(20)来限定，其中这两个平板都是透明的，并且该高度使得样本内的至少一些红细胞(22)接触两个平板的内表面并且静止样本内的一个或多个腔隙(24)在两个内表面之间延伸；2)对静止样本的至少一部分成像，该样本部分包含红细胞和一个或多个腔隙，基于每个图像单位来确定被成像的样本部分的光密度；3)选择和平均与接触内表面的红细胞对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的平均光密度值赋值为上限值100％；4)选择与一个或多个腔隙对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的光密度值赋值为下限值0％；以及5)通过根据上限值和下限值给被成像的样本部分的每个图像单位的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。

Description

利用红细胞内含有的血红蛋白的本征色素沉着来确定血样的血细胞比容的方法及设备
本申请要求以下美国临时专利申请的优先权：2008年3月21日提交的No.61/038,557和2008年3月21日提交的No.61/038,574，这些临时专利申请在此以引文方式整体并入本申请。
技术领域
本发明总的来说涉及分析血样的设备及方法，具体地讲，涉及确定血液样本的血细胞比容的设备及方法。
背景技术
内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组分的微粒数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常微粒。通常被测量、定量和识别的微粒包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。RBC分析包括确定RBC数目、大小、体积、形状、血红蛋白含量和浓度、以及血细胞比容(也被称为红细胞压积)。RBC分析还可以包括确定红细胞(诸如DNA，RNA)内是否存在某些成分和/或确定这些成分的浓度，包括检测RBC中是否存在和/或存在多少血液寄生虫(例如疟原虫)或者检测WBC中是否存在和/或存在多少细胞外的或利什曼原虫组织的睡病虫，以及检测是否存在和/或存在多少其他血液寄生虫。WBC分析可以包括确定WBC子类型的族群(population)频率，通常称为分类WBC计数，以及通知任何在健康的受试者中没有发现的异常细胞类型。血小板(或者在包括鸟、爬行动物和鱼的某些动物中为凝血细胞(thrombocyte)，该凝血细胞在功能上类似于哺乳动物的血小板，但是比哺乳动物的血小板大约10倍且是有核的)分析可以包括对血小板数目、大小、形状结构和体积的确定，包括确定样本中是否存在血小板或凝血细胞的凝块。
在诸如Wintrobe’s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已知的血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。用于细胞计数的手动方法通常涉及产生精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在计数室中被直观计数。手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外周涂片。离心检查方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个组分层。可以给每个组分层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及根据被测量的微粒检查被处理血液的精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中体积地(volumetrically)稀释样本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或电压，以确定当微粒以单行通过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束入射到以单行通过的微粒的光的强度和散射角的分析。还可以使用流式细胞测定法，该方法涉及利用荧光基团给悬浮中的感兴趣的微粒染色、用适当波长的光激发染色微粒、以及分析各个微粒/细胞的发光(emission)。
除了外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样本体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要求对仪器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许多方法产生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。另外，上述方法不适于确定其中红细胞尺寸非常小的鸟、爬行动物、鱼和某些哺乳动物中的全血计数(CBC)。
尽管从全血计数获得的复杂的血液信息量，但是通常仍然需要一个测试：血细胞比容。血细胞比容可告诉内科医生患者是否是由于流血或者营养原因(例如在处于生长阶段的孩子和生育年龄的妇女中相对常见的铁缺乏)、相关病情(例如慢性感染)、代谢疾病(例如尿毒症或者肿瘤疾病)以及药物影响导致的贫血。血细胞比容升高表示由于诸如其中血液被浓缩的脱水之类的病情导致的存在太多的红细胞。血细胞比容升高还可以表示红细胞质量的实际增大，这种情况出现的原因在于诸如红细胞增多症之类的病情、或者诸如服用过多合成类固醇之类的药物影响或者由于肺部疾病或者某些类型的先天性心脏病导致的慢性缺氧。血细胞比容的重要性和实用性使其成为被最频繁要求的对血液进行的测试之一。因此，容易的、准确的、便宜的以及能够快速获得的血细胞比容的确定是非常期望的，并且将对患者有益。一种仪器，其可以使用一次性分析腔室，除了毛细管流动之外可以不使用任何内部流体(即，与重力和方位无关)，以及可以用作手持式设备，这种仪器是非常有用的。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种确定血液样本的血细胞比容的方法。该方法包括以下步骤：1)提供基本上未稀释的血液样本；2)将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中这两个平板都是透明的，以及该腔室具有在两个平板的内表面之间延伸的高度，该高度使得样本内的至少一些红细胞(或者为单独的，或者为聚合的)接触平板的两个内表面以及使得静止样本内的一个或多个无RBC的区域在内表面之间延伸；3)对静止样本的至少一部分成像，该样本部分包含接触内表面的RBC和一个或多个无RBC的区域，以基于每个图像单位来确定被成像的样本部分的光密度；4)选择和平均与接触两个内表面的一些单独的RBC或者RBC聚合体对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的平均光密度值赋值为上限值100％；5)选择与一个或多个无RBC的区域对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的光密度值赋值为下限值0％；以及6)通过根据上限值和下限值给腔室中包含的被成像的样本部分的每个图像单位的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于确定静止地停留在分析腔室内的基本上未稀释的血液样本的血细胞比容的设备。该腔室由一对透明的平板限定，并且具有在两个平板的内表面之间延伸的高度。该腔室高度使得样本内的至少一些单独的或者聚合的RBC接触两个内表面并且使得静止样本内的一个或多个无RBC的区域在内表面之间延伸。该设备包括成像单元和可编程分析器。成像单元包括照明器和析像器，并且可用于对静止停留在腔室内的样本的至少一部分成像，所述的样本的至少一部分包含与内表面接触的RBC或RBC聚合体以及一个或多个无RBC的区域，并且产生表示该被成像的样本部分的图像信号。可编程分析器适于使用图像信号来基于每个图像单位确定被成像的图像部分的光密度值。该分析器还适于选择和平均与接触内表面的至少一些RBC和/或RBC聚合体光学对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的平均光密度值赋值为上限值100％。分析器还适于选择与一个或多个无RBC的区域光学对准的图像单位的光密度值，并且将这些图像单位的光密度值赋值为下限值0％，并且通过根据上限值和下限值给被成像的样本部分的每个图像单位的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。
本发明的一个优点在于本发明可以用来利用极少的样本量来确定血细胞比容值，该极少的样本量可以通过毛细管穿刺从病人直接获得，从而使得本发明对现场护理应用更加有用，或者可以根据需要从静脉样本获得该极少的样本量。
本发明的另一个优点在于可以在不依赖于对仪器的放大系数(图像/图像单位的尺寸)的了解并且不知道腔室高度的情况下确定血细胞比容值。因此，本发明的方法在可以使用的分析仪器和腔室的类型方面具有极大的通用性。
本发明的另一个优点在于其能够只使用血红蛋白的本征色素沉着来确定血液样本的血细胞比容，因此不需要添加任何染料或者着色剂。血红蛋白在几个不同波长下的高摩尔消光系数(molarextinction coefficient)使得能够确定在小到几微米的非常小的光路距离内的血红蛋白的相对或绝对浓度。
本发明的方法的另一个优点在于其对于外部和内部流体都适用，并且与重力或方位无关，因此该方法适于用在手持式设备中。
通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加显然。
附图说明
图1至图4是可用在本发明的方法中的分析腔室的截面示意图。
图5是具有多个分析腔室的条带的示意平面图。
图6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面图。
图7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面图。
图8是可与本发明的方法一起使用的分析设备的示意图。
图9是示出根据本发明的方法的框图。
具体实施方式
本发明的用于确定血液样本的血细胞比容的方法和设备能够在不需要对样本添加染料、试剂(除了在一些实施例中的抗凝血剂)或稀释剂或不需要精确地知晓样本的体积或者分析腔室的高度或体积的情况下确定血细胞比容。在一些实施例中，本发明的方法和设备包括添加使RBC聚合的试剂。诸如聚凝胺(polybrene)、抗血型糖蛋白抗体等之类的试剂几乎使得样本内的RBC立刻聚合。这些RBC聚合体中的至少一些将与腔室的相对内表面接触。在计算血细胞比容的过程中，以与单个细胞的光密度相同的方式使用在两个表面之间延伸的RBC聚合体的光密度。
本发明的方法利用了分析腔室，该分析腔室可用于静止地保持基本上未稀释的全血样本以进行分析。该腔室的典型大小可以保持大约0.2至1.0μl的样本，但是该腔室不限于任何特定的体积容量，该容量可以为适应分析应用而改变。在此使用的术语“基本上未稀释的”表示根本未被稀释的血液样本或者未被故意稀释的血液样本，但是为了进行分析，可以对血液样本添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂添加对样本稀释的程度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。通常，将在执行本发明的方法过程中使用的试剂只有抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)，在一些实例中是等容球状试剂(isovolumetric sphering agent)，或者是凝聚剂(aggregatingagent)，并且添加这些试剂的目的不是为了稀释样本。在某些情况下(例如，非常快速的分析)，不必添加抗凝血剂，但是在大多数情况下优选的是添加抗凝血剂以确保样本处于分析可接受的形式。术语“静止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔室故意移动；即，样本静止地处于腔室内。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样本的形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。
现在参照图1，分析腔室10由具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第二平板16限定。平板12、16都是足够透明的，以使得能够有足以执行如下所述的光密度分析的预定波长的光的量通过。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20，使得样本内的至少一些单个RBC 22均单独地接触两个内表面14、18，和/或样本内的一个或多个RBC聚合体23均接触腔室平板12、16的内表面14、18，以及静止样本内的一个或多个无RBC的区域(例如，腔隙)24在所述内表面之间延伸，如下将更详细地说明。本发明的方法可以利用具有上述特性的各种不同的分析腔室类型，因此不限于任何特定类型的分析腔室。具有平行的平板12、16的分析腔室简化了该分析，因此是优选的，但是并不是本发明所必需的；例如，可以使用这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于另一个平板成已知的非平行角度布置。
现在参照图2至图5，示出了一个可接受的腔室10的示例，该腔室10包括第一平板12、第二平板16、以及至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离物26可以是可布置在平板12和平板16之间的可用于将平板12和平板16彼此分隔的任何结构。在平板12和平板16之间延伸的隔离物26的尺寸28在此被称为隔离物26的高度28。隔离物26的高度28通常不精确地彼此相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业上可接受的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个示例，并且商业上可从例如Bangs Laboratories of Fishers，Indiana，U.S.A.获得。
在图3所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性大于第一平板12和第二平板16中的一个或者两个的材料组成。从图3可以看出，较大的隔离物26被压缩到大多数隔离物26接触平板12、16的内表面14、18的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平均的隔离物26的直径。在图4所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性小于第一平板12和第二平板16中的一个或两个的材料组成。在图4中，第一平板12由比球状隔离物26和第二平板16更有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离物26。在该实施例中，虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度20将非常接近平均的隔离物26的直径高度。分析显示使用该实施例可以将平均腔室高度20控制为小于4微米的腔室高度的上下1％或更好。除了受到上述的弹性特性(以及诸如隔离物的分布密度之类的其他因素)的限制，隔离物26和平板12、16可以由各种材料制备，只要平板12、16足够透明。由丙烯酸(acrylic)或者聚苯乙烯(polystyrene)组成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物26。可接受的隔离物的特定示例是由聚苯乙烯制成的球体，在商业上可以从例如Thermo Scientific of Fremont，California，U.S.A.目录编号为4204A获得4微米(4μm)直径的这种球体。参照图5，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括多个以规则的间隔布置的口30(例如，用作气孔)，并且平板12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材料32形成了可用于将样本34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。这个可接受的分析腔室的示例在美国专利申请公开No.2007/0243117、2007/0087442、以及2008年4月2日提交的美国临时专利申请No.61/041,783和2008年10月31日提交的美国临时专利申请No.61/110,341中详细地进行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。
另一个可接受的腔室10的示例布置在如图6和图7所示的一次性容器36中。腔室10形成在第一平板12和第二平板16之间。第一平板12和第二平板16都是透明的，以允许光穿过腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20。该腔室10的实施例在美国专利No.6,723,290中更详地进行了描述，该专利以引用方式整体并入本文。图2至图7所示的分析腔室表示可接受的用于本发明方法的腔室。然而，本发明的方法不限于这些特定实施例。
可接受的腔室高度是这样的一个高度，即，其中样本内的至少一些RBC单独地接触腔室平板的两个内表面，和/或一个或多个RBC聚合体接触腔室平板的两个内表面，和静止样本内的一个或多个无RBC区域(例如，腔隙)在所述内表面之间延伸。由于血液样本内的RBC 22的大小是被分析(例如人类、猴子、马、山羊、鱼、鸟等)的血液样本类型的函数，因此可接受的腔室高度将根据被测试对象而改变。基于典型的RBC大小和RBC在一定程度上可以变形(例如，上述的被部分压缩的球体)的事实，对于大多数动物品种来说，大约2至6微米(2-6μm)的腔室高度对于单个RBC是可接受的。可以分别在分别具有较大或较小腔室高度的腔室中执行其RBC基本上大于或小于人类RBC的动物品种的血细胞比容(hematocrit)分析。另外，利用RBC聚合体的血细胞比容分析的腔室高度可以由RBC聚合体的高度决定。
在一些应用中，在样本的至少一部分中加入等容球状试剂(例如，两性离子去污剂或者类似功能的试剂)以使至少一些RBC呈现基本上为球状的几何形状。球状试剂的一个特定示例是3-16去污剂，其是由美国的新泽西州的EMD Chemicals公司的一个机构Calibriochem生产的两性离子去污剂。添加到样本中的球状试剂的量足以使至少执行血细胞比容分析所需的多个RBC成为球状。该特定的量将取决于具体的试剂和测试环境，并且所属领域的技术人员无需进行过度实验就能够确定。处于自然形式的RBC通常是双凹圆盘状38(见图1)，而不是圆球形状40。因此，没有等容球状试剂的影响，一些圆盘状RBC将不会接触两个腔室平板。增大具有基本上为球状的几何形状的RBC 22数量将会增大与两个平板都接触的RBC的数量，这其中包括被腔室平板限制的可以用其他不同方法成为球状的一些细胞42。
使用分析设备来执行对静止地置于腔室内的样本的分析，该分析设备可用于对至少一部分样本进行成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本单位来确定样本的光密度的方式产生该图像。术语“基本单位”或者“图像单位”是指所定义的能够分辨样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处理的最小图元的像素是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少量像素。然而，本发明的方法不限于使用任何特定的分析设备。
现在参照图8，适于用于本发明方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、析像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46包括光源，并且通常包括用于控制光的光学器件，该光源选择性地产生整个波长范围内的光，该波长范围宽到足以用于进行血细胞比容分析(例如，大概400-670nm；在确定人类血液样本内的RBC的光密度(OD)方面，大约413nm和大约540nm的光尤其有效)。样本照明器46利用透光度来产生图像。例如可以通过将光源定位在停留于腔室10内的样本的一侧、引导光通过静止布置在腔室平板之间的样本、然后使用析像器捕获光来测量样本的透光特性。可接受的析像器48的示例是电耦合器件(CCD)类型的图像传感器，其将穿过样本的光的图像转换成为电子数据形式。互补金属氧化物半导体(“CMOS”)类型的图像传感器是另一种可以使用的图像传感器的示例，然而本发明不限于这些示例中的任意一个。可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并且连接至样本照明器46和析像器48。CPU适于(即，被编程为)选择性地执行进行本发明方法所必需的功能。应当注意，可以使用硬件、软件、固件或者其结合来实现可编程分析器50的功能。所属领域的技术人员将能够对处理单元进行编程以执行在此所述的功能，而不需要进行过度的实验。题目为“Apparatus for AnalyzingBiologic Fluids”且于2005年3月15日发布的美国专利No.6,866,823公开了这种分析设备44，该美国专利内容以引文方式整体并入本文。
分析设备适于针对被成像的样本部分基于每个单位来确定与检测到的光信号相关的OD值。所检测到的光信号(即，OD值)可被边缘检测算法(edge finding algorithm)用来识别RBC的位置和边界。与腔室的两个内表面都接触的RBC的OD分布类似于被部分压缩的球体的OD分布。与表面不接触的细胞的横向边缘的OD(相对而言)可以认为趋近于0。所确定的OD的值如下：1)在朝向RBC的中心的方向上行进时(即，随着通过细胞的光传输路径增大)增大；2)在RBC与顶表面和底表面接触时(即，当通过RBC的光传输路径恒定时)，达到最大值并且基本上保持恒定；以及3)在远离RBC的中心的方向上行进时(即，随着通过细胞的光传输路径减小)减小。RBC的OD分布的这种表征对于球状的RBC来说尤其均匀一致。
分析设备还适于确定与两个内表面都接触的一组RBC和/或RBC聚合体23的平均最大OD值。可以基于每个样本分析来确定与所述内表面接触的可接受组大小的一组RBC和/或RBC聚合体的构成，或者可以针对同一类型(例如，人类血液样本)的“n”个样本分析周期性地进行这种确定。例如，可以对被识别为与两个内表面都接触的一组RBC进行比较估计，以确定该组内的平均最大OD和OD的统计偏差。希望确定平均最大OD，这是因为细胞内的血红蛋白的OD即使在一个特定样本内也会根据细胞的不同而不同。如果标准偏差大于预定阈值，则可以选择与两个平板都接触的新的一组RBC，或者可以扩大现有的组，直到上述分析建立了这样一组RBC，即，该组RBC的平均最大OD具有可接受的标准偏差。例如，一组内的RBC的平均最大OD，如果大约为加上或减去该样本内与两个表面都接触的所有RBC的平均最大OD的百分之一(1％)，则处于可接受的标准偏差值内。然而，可以根据当前的应用和正在使用的特定统计分析(例如，标准误差等)来改变可接受的标准偏差值的构成。可以获得与RBC的OD相关的现有统计数据并且可以将其用于确定可接受的OD统计值。对一个特定组内的RBC的平均最大OD是否处于临床上可接受的标准偏差内的确定也是适应性的，这是由于，如上所述，公知的是在一个个体内的RBC族群通常在血红蛋白浓度上的变化很小，并且可以使用该结果的连续(running)标准偏差来确定在获得可接受准确性的平均值之前必须检查多少细胞；例如，对于来自具有正常血液特征的对象的样本，可接受的组大小可以仅仅为100个RBC，而来自具有异常血液特征的对象的样本可能需要分析1000个或更多个RBC。用于确立可接受的平均最大OD的、与两个内表面都接触的特定数目的RBC和/或RBC聚合体不限于样本内的任何具体数目或者百分比的RBC，并且可以包括与两个表面都接触的所有(例如，成千上万个)RBC。
在根据本发明的用于确定生物样本的血细胞比容的方法中，图9的框图示出了该方法的步骤，如上所述，基本上未稀释的全血样本被置于腔室中。在将样本引入腔室之前或者在将样本引入腔室时，将抗凝血剂(在一些实例中为等容球状试剂和/或凝聚剂)与样本混合。以干粉或半干粉形式(例如通过表面涂覆)添加的试剂尤其易于使用。但是，本发明不限于干粉形式的试剂，例如可以使用不会有意图地稀释样本的液态试剂。样本静止地停留在腔室中。在某些情况下(例如，非常快速的分析)，可以不必添加抗凝血剂，但是在大多数情况下，添加抗凝血剂是优选的，以确保样本处于分析可接受的形式。
使用分析设备，通过使光透射穿过样本并且检测透射光，来对静止停留在腔室内的样本的至少一部分成像。被成像的样本部分包括接触每个腔室平板的内表面的多个RBC和/或RBC聚合体、以及在腔室平板的内表面之间延伸的至少一个没有任何RBC的样本区域(无RBC的区域)。虽然不要求对停留在腔室内的整个样本进行成像，但是这是优选的，因为这么做通常会提供对样本(以及其所有组分)的更全面的分析并且伴随着准确性的提高，这是因为对于基本上未稀释的全血样本来说，腔室内的RBC和腔隙的分布通常是不均匀的。
通过分析设备，使用所述样本部分的图像来确定与内表面相接触的一组单个RBC或者RBC聚合体，以及由该组来确定具有可接受的标准偏差的平均最大OD。如上所述，该组的大小可以根据分析不同而有所不同，并且可以包括用以确定上述的具有可接受标准偏差的平均最大OD的迭代。给所确定的与内表面接触的单个RBC和/或RBC聚合体的平均最大OD值赋予一个任意的百分之百(100％)的上限值。
类似地，该分析设备还适于识别在两个腔室内表面之间延伸的一个或多个无RBC的区域(例如，腔隙)在腔室内停留的位置。确定无RBC的区域的OD值，或者如果多于一个无RBC的区域存在并且被分析，则可以确定无RBC的区域的平均OD。给一个(或多个)无RBC的区域的OD值赋予一个任意的百分之零(0％)的下限值。
通过根据上限值和下限值(即，根据RBC在整个腔室高度上延伸的那些区域和没有RBC的那些区域)给被成像的样本部分的每个单位的OD值赋予一个相对值来确定样本的血细胞比容。确定针对每个单位的百分数相对值的平均值。该平均相对值是介于100％(即，所有RBC)和0％(没有RBC)的样本的RBC体积的百分率。该百分率在定义上等于样本的血细胞比容；即，样本的红细胞压积。
本发明的方法的优点是不必使样本内的所有RBC都与每个腔室平板接触。可以仅使用与腔室的两个内表面都接触的一些RBC和/或RBC聚合体来执行该方法。不使用较小的RBC和RBC片段来校准该分析，但是测量它们对血细胞比容的贡献。另外，根据本发明的方法，可以确定样本的血细胞比容，而不需要知晓腔室内的样本的总面积或体积。因此，不需要使用具有被精确定义的高度的腔室，从而使得腔室的制造不那么昂贵。
虽然已经通过本发明的具体实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人员应当理解在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以在形式上或细节上进行各种变化。例如，上述在确定基本上未稀释的血液样本的血细胞比容的方面描述了本发明。实际上，本发明的优点之一是在不需要使用稀释剂的情况下分析血液。也就是说，在可选的实施例中，本发明可以用于由于各种原因已被稀释的血液，只要样本的稀释系数是已知的，或者是可以确定的。

Claims (24)

1.一种确定血液样本的血细胞比容的方法，包括以下步骤：
将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中这两个平板都是透明的，并且该腔室具有在两个平板的内表面之间延伸的高度，该高度使得样本内的至少一些红细胞接触两个平板的内表面并且静止样本内的一个或多个无红细胞的区域在两个内表面之间延伸；
对静止样本的至少一部分成像，该样本部分包含与两个内表面都接触的红细胞和一个或多个无红细胞的区域，以基于每个图像单位来确定被成像的样本部分的光密度值；
选择和平均与接触内表面的红细胞光学对准的图像单位的光密度值，并且给这些图像单位的平均光密度值赋予上限值100％；
选择和平均与一个或多个无红细胞的区域光学对准的图像单位的光密度值，并且给这些图像单位的光密度值赋予下限值0％；以及
通过根据上限值和下限值给被成像的样本部分的每个图像单位的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。
2.如权利要求1所述的方法，其中图像单位是像素。
3.如权利要求1所述的方法，其中样本内与两个内表面都接触的至少一些红细胞包括单独地与两个平板的内表面都接触的红细胞。
4.如权利要求1所述的方法，还包括步骤：在样本的至少一部分中掺合凝聚剂。
5.如权利要求4所述的方法，其中样本内与两个内表面都接触的至少一些红细胞包括聚合的红细胞，该红细胞聚合体接触两个平板的内表面。
6.如权利要求1所述的方法，其中对静止样本的至少一部分成像的步骤包括使一个或多个预定波长的光透射通过样本并且在其穿过样本之后对透射光进行捕获，其中所述光密度值与透射进入样本并且穿过样本的光有关。
7.如权利要求1所述的方法，还包括在样本的至少一部分中掺合等容球状试剂的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中等容球状试剂是两性离子去污剂。
9.如权利要求1所述的方法，其中对整个样本成像。
10.如权利要求1所述的方法，分析腔室的两个平板的内表面是平行的。
11.如权利要求1所述的方法，其中选择和平均与接触两个内表面的红细胞光学对准的像素的光密度值的步骤还包括以下步骤：确定与两个内表面都接触的至少一部分红细胞的平均最大光密度，以及确定所述的至少一部分红细胞内的光密度的标准偏差，并且在标准偏差等于或者小于预定值时使用平均最大光密度值作为与接触内表面的红细胞光学对准的像素的平均光密度值。
12.如权利要求11所述的方法，其中用与两个内表面都接触的不同的红细胞组来迭代地执行确定与两个内表面都接触的至少一部分红细胞的平均最大光密度的步骤，直到平均最大光密度的标准偏差等于或者小于预定值。
13.如权利要求12所述的方法，其中两个平板的内表面实质上是平行的，并且所述高度处于2微米到6微米的范围内。
14.如权利要求1所述的方法，其中在样本中添加抗凝血剂。
15.如权利要求1所述的方法，其中无红细胞的区域是腔隙。
16.如权利要求1所述的方法，其中血液样本实质上未被稀释。
17.如权利要求1所述的方法，其中血液样本是全血。
18.一种用于确定血液样本的血细胞比容的设备，包括：
分析腔室，适于静止地保持样本以进行分析，该腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中这两个平板都是透明的，并且该腔室具有在这两个平板的内表面之间延伸的高度，该高度使得样本内的至少一些红细胞与两个平板的内表面都接触并且静止样本内的一个或多个无红细胞的区域在两个内表面之间延伸；
成像单元，其包括照明器和析像器，该成像单元用于对静止地停留在腔室内的样本的至少一部分成像，所述的样本的至少一部分包含与内表面接触的红细胞和一个或多个无红细胞的区域，并且产生表示该被成像的样本部分的图像信号；以及
可编程分析器，适于使用图像信号来基于每个像素确定被成像的样本部分的光密度值，以及选择和平均与接触内表面的红细胞光学对准的像素的光密度值，并且给这些像素的平均光密度值赋予上限值100％，以及选择与一个或多个无红细胞的区域光学对准的像素的光密度值，并且给这些像素的光密度值赋予下限值0％，以及通过根据上限值和下限值给被成像的样本部分的每个像素的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。
19.如权利要求18所述的设备，其中可编程分析器适于控制成像单元对分析腔室成像。
20.如权利要求18所述的设备，其中适于选择和平均像素的光密度值的可编程分析器还适于确定与两个内表面都接触的红细胞的至少一部分的平均最大光密度，以及确定所述的红细胞的至少一部分内的光密度的标准偏差，以及在标准偏差等于或小于预定值时用平均最大光密度作为与接触内表面的红细胞光学对准的像素的平均光密度值。
21.如权利要求20所述的设备，其中适于确定红细胞的至少一部分的平均最大光密度的可编程分析器还适于用与两个内表面都接触的不同的红细胞组来迭代地执行这种确定，直到平均最大光密度的标准偏差等于或小于预定值为止。
22.如权利要求18所述的设备，其中两个平板的内表面实质上平行，并且所述高度处于2微米到6微米的范围内。
23.一种用于确定静止地停留在分析腔室内的血液样本的血细胞比容的设备，该腔室由一对透明的平板限定并且具有在两个平板的内表面之间延伸的高度，该高度使得样本内的至少一些红细胞与两个内表面都接触并且静止样本内的一个或多个无红细胞的区域在两个内表面之间延伸，该设备包括：
成像单元，其包括照明器和析像器，该成像单元用于对静止地停留在腔室内的样本的至少一部分成像，所述的样本的至少一部分包含与内表面接触的红细胞和一个或多个无红细胞的区域；以及
可编程分析器，其适于使用图像信号来基于每个像素确定被成像的样本部分的光密度值，以及选择和平均与接触内表面的红细胞光学对准的像素的光密度值，并且给这些像素的平均光密度值赋予上限值100％，以及选择与一个或多个无红细胞的区域光学对准的像素的光密度值并且给这些像素的光密度值赋予下限制0％，以及通过根据上限值和下限值给被成像的样本部分的每个像素的光密度值赋予相对值并且对这些相对值取平均来确定样本的血细胞比容。
24.一种用于确定血液样本的血细胞比容的方法，包括以下步骤：
将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中这两个平板都是透明的，并且该腔室具有在两个平板的内表面之间延伸的高度，该高度使得单层红细胞置于平板之间，多个这种红细胞接触两个平板并且包括置于红细胞之间的一个或多个无红细胞的区域；
对静止样本的至少一部分成像，该样本部分包含单层红细胞和一个或多个无红细胞的区域，以基于每个图像单位来确定被成像的样本部分的光密度值；
通过对基于被成像的样本的每个图像单位确定的光密度值求和，并且将所求出的和除以与被成像的样本对准的图像单位的总数，来确定被成像的样本的每个图像单位的平均血红蛋白光密度；
确定与红细胞光学对准的图像单位的每个图像单位的平均光密度值；以及
通过将被成像的样本的每个图像单位的平均血红蛋白光密度除以与红细胞光学对准的图像单位的每个图像单位的平均光密度值来确定血细胞比容。
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