CN102027369A - 单独和在聚合凝块中检测和计数血小板的方法及设备 - Google Patents
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Abstract
提供了一种用于对血液样本中的血小板进行计数的方法。该方法包括以下步骤：1)将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室内，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；2)在样本中掺合染色剂，该染色剂用于使血小板在曝光于一个或多个预定的第一波长的光时发出荧光；3)以第一波长的光照射包含血小板的样本的至少一部分；4)对样本成像，包括产生表示来自血小板的荧光发射的图像信号，该荧光发射具有强度；5)使用图像信号，通过血小板的荧光发射来识别血小板；6)确定在样本内识别出的单独的血小板的平均荧光发射强度值；7)使用样本内的血小板凝块的荧光发射、面积、形状和粒度中的一个或多个来识别样本内的血小板凝块；以及8)使用为样本内的单独的血小板确定的平均荧光发射强度值，对每个血小板凝块内的血小板进行计数。
Description
本申请要求于2008年3月21日提交的美国临时专利申请序列号为61/038,554(7564-0028)的优先权，其内容以引文方式并入。
技术领域
本发明总的来说涉及用于分析血液样本的设备及方法，具体地讲，涉及用于检测和计数血小板、以及从巨血小板中辨别出血小板和从血小板凝块中辨别出巨血小板的设备和方法。
背景技术
内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组分的数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常微粒。通常被测量、定量和识别的组分包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。
在哺乳动物中，血小板(也被称为凝血细胞(thrombocyte))是小的不规则形状的无核细胞碎片，其由巨核细胞的裂解产生。某些动物(例如，鸟、爬行动物和鱼)中的凝血细胞在功能上类似于哺乳动物的血小板，但是比哺乳动物的血小板大约10倍且是有核的。血小板分析可以包括对样本内的血小板的数目、大小、形状、结构和体积的确定，包括确定样本中是否存在血小板或凝血细胞的凝块。在某些自然形成的条件下，作为对身体所遭遇的损伤(例如，出血、组织损伤等)所作出的有用响应，血小板将在受试者内聚集成凝块。另一方面，采集在血液样本内形成的血小板凝块用来进行分析通常是无用的，并且可能妨碍血液样本的分析。抗凝血剂(例如，EDTA)可以用来防止血小板在样本内凝块，但是如果血液样本与抗凝血剂的混合存在延迟，则凝块仍会形成。一旦凝块形成，抗凝血剂通常不能将它们分成单独的血小板。在被分析的样本内存在血小板凝块通常是有问题的，这是因为它们将导致错误的低血小板计数，这将导致对患者的错误诊断和严重后果。
在诸如Wintrobe’s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已知的血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。手动方法通常涉及产生精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在计数室中被直观计数。用于细胞计数的手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外周涂片。离心检查方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个组分层。可以给组分层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及检查根据被测量的微粒而处理的血液的精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中体积(volumetrically)稀释样本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或电压，以确定当微粒以单行通过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束入射到以单行通过的微粒的光的强度和散射角的分析。还可以使用流式细胞测定法，该方法涉及利用附着于针对细胞或微粒类型上存在的表面抗原决定簇的抗体的荧光基团给悬浮中的感兴趣的微粒染色、用适当波长的光激发染色微粒、以及分析各个微粒/细胞的发光(emission)。
除了外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样本体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要求对仪器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许多方法产生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。另外，上述方法不适于确定其中红细胞和凝血细胞有核的鸟、爬行动物和鱼中的以及其中红细胞尺寸非常小并且可能与血小板混淆的某些哺乳动物中的全血计数(CBC)。
发明内容
根据本发明的一方面，提供了一种用于对基本上未稀释的血液样本中的血小板进行计数的方法。该方法包括以下步骤：1)将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室内，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；2)在样本中掺合染色剂，该染色剂用于使血小板在曝光于一个或多个预定的第一波长的光时发出荧光；3)以第一波长的光照射包含血小板的样本的至少一部分；4)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自血小板的荧光发射的图像信号，该荧光发射具有强度；5)使用图像信号，通过血小板的荧光发射来识别血小板；6)确定在所述的样本的至少一部分内识别出的单独的血小板的平均荧光发射强度值；7)使用所述的样本的至少一部分内的血小板凝块的荧光发射、面积、形状和粒度中的一个或多个来识别所述的样本的至少一部分内的血小板凝块；以及8)使用为样本内的单独的血小板确定的平均荧光发射强度值，对每个血小板凝块内的血小板进行计数。
本发明的优点在于本发明提供了血液样本内的精确血小板计数。大多数现有技术的血液分析仪通过假设样本内一定大小的组分实际上是血小板来对样本内的血小板数目进行计数。因此，大于正常尺寸血小板的巨血小板和血小板凝块可能在计数中没有被考虑并且可能被作为白细胞来计数。作为结果的较低血小板计数能够被错误地解释为血小板减少症。本发明识别巨血小板和血小板凝块，并且对血小板凝块内的血小板进行计数。因此，提供了一种比大多数现有技术的自动血液分析仪所提供的更加精确的血小板计数，并且避免了会导致错误的低血小板计数和错误的高白细胞计数的将巨血小板和血小板凝块计数为白细胞。
本发明的另一个优点在于本发明能够识别和计数血样样本内的巨血小板。
本发明的另一个优点在于本发明可以用来利用极少的样本量来确定血液样本的特性，该极少的样本量可以通过毛细管穿刺从病人直接获得，从而使得本发明对现场护理应用来说更加有用，或者可以根据需要从静脉样本获得该极少的样本量。
本发明的方法的另一个优点在于其对于外部和内部流体都适用，并且与重力和方位无关，因此该方法适于用在手持式设备中和微重力条件下。
通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加显然。
附图说明
图1至图4是可用在本发明的方法中的分析腔室的截面示意图。
图5是具有多个分析腔室的条带的示意平面图。
图6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面图。
图7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面图。
图8是可与本发明的方法一起使用的分析设备的示意图。
图9是以第一强度放大来成像的包含掺合有吖啶橙荧光染料的基本上未稀释的血液样本的腔室的一部分的彩色图像，其中基本上未稀释的血液样本已被从吸收了该染料的组分(例如，WBC、血小板等)产生荧光发射的波长的光照射过。
图10是以大于第一强度放大的第二强度放大来成像的图9所示的彩色图像。
图11是包含掺合有吖啶橙荧光染料的基本上未稀释的血液样本的腔室的一部分的彩色图像，其中基本上未稀释的血液样本已被从组分产生荧光发射的波长的光照射过，其示出了WBC、血小板凝块和血小板的不同的发光分布(emission profile)。
图12是包含掺合有吖啶橙荧光染料的基本上未稀释的血液样本的腔室的一部分的彩色图像，其中基本上未稀释的血液样本已被从组分产生荧光发射的波长的光照射过，其示出了血小板、巨血小板和网状细胞的不同的发光分布。
图13是包含掺合有吖啶橙荧光染料的基本上未稀释的血液样本的腔室的一部分的彩色图像，其中基本上未稀释的血液样本已被从组分产生荧光发射的波长的光照射过，其示出了血小板和网状细胞的不同的发光分布。该图像还包括根据图像编辑的WBC和在背景下微弱可见的RBC。
图14是图13所示的图像的黑白版本，其是通过用显示该图像的光密度的波长的光照射样本产生的。该图像示出了样本内的网状细胞和RBC的光密度分布，该光密度分布能够识别出网状细胞。
图15是根据本发明的一方面的方法的步骤的框图。
具体实施方式
本发明的方法总的来说利用了分析腔室，该分析腔室可用于静止地保持基本上未稀释的抗凝全血样本以进行分析。该腔室的典型大小可以保持大约0.2至1.0μl的样本，但是该腔室不限于任何特定的体积容量，该容量可以为适应分析应用而改变。在此使用的术语“基本上未稀释的”表示根本未被稀释的血液样本或者未被故意稀释的血液样本，但是为了进行分析，可以对血液样本添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂添加对样本稀释的程度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。通常，将在执行本发明的方法过程中使用的试剂只有抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)和染色剂。这些试剂通常以干粉形式来添加，其目的是不稀释样本。在某些情况下(例如，非常快速的分析-诸如可能发生在从患者手指采血或者从新生儿脚跟采血时)，不必添加抗凝血剂，但是在大多数情况下优选的是添加抗凝血剂以确保样本处于分析可接受的形式。术语“静止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔室故意移动。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样本的形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。
掺合到血液样本的至少一部分中的染色剂(colorant)(例如，染料、着色剂等)有助于对吸收该染色剂的组分(例如，血小板、WBC等)的识别和定量分析。当被某些波长(例如，大约470nm)的光激发时，染色剂发出特征波长(例如，530nm、585nm和660nm)的荧光。组分将要发出的荧光的特定波长是该组分和激发光的波长的特性。在一些实施例中，根据组分内的染色剂的浓度，染色剂还可以吸收一个或多个预定波长的光。可接受的染色剂的示例包括体外活体染料吖啶橙和astrozone orange。然而，本发明不限于体外活体染料。所属领域的技术人员会知道适当的染色剂的浓度范围，或者在无须过度实验的情况下能够确定适当的染色剂。
现在参照图1，分析腔室10由具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第二平板16限定。平板12、16都是足够透明的，以使得能够传输通过足量的预定波长的光，以执行如下所述的光密度分析。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20，该高度可以是已知的或者是可测量的。所示出的RBC 22置于腔室10内。
本发明的方法可以利用具有上述特性的各种不同的分析腔室类型，因此不限于任何特定类型的分析腔室。具有平行的平板12、16的分析腔室简化了该分析，因此是优选的，但是并不是本发明所必需的；例如，可以使用这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于另一个平板成已知的非平行角度布置。
现在参照图2至图5，示出了一个可接受的腔室10的示例，该腔室10包括第一平板12、第二平板16、以及至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离物26可以是可布置在平板12和平板16之间的可用于将平板12和平板16彼此分隔的任何结构。在平板12和平板16之间延伸的隔离物26的尺寸28在此被称为隔离物26的高度28。隔离物26的高度28通常彼此不完全相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业上可接受的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个示例，并且商业上可从例如Bangs Laboratories of Fishers，Indiana，U.S.A.获得。
在图3所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性大于第一平板12和第二平板16中的一个或者两个的材料组成。从图3可以看出，较大的隔离物26被压缩到大多数隔离物26接触平板12、16的内表面14、18的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平均的隔离物26的直径。在图4所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性小于第一平板12和第二平板16中的一个或两个的材料组成。在图4中，第一平板12由比球状隔离物26和第二平板16更有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离物26。在该实施例中，虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度20将非常接近平均的隔离物26的直径的高度。分析显示使用该实施例可以将平均腔室高度20控制为小于4微米的腔室高度的上下1％或更好。除了受到上述的弹性特性(以及诸如隔离物的分布密度之类的其他因素)的限制，隔离物26和平板12、16可以由各种材料制备，只要平板12、16足够透明。由聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate)组成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯(polystyrene)、聚碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物26。可接受的隔离物的特定示例是由聚苯乙烯制成的球体，在商业上可以从例如Thermo Scientific of Fremont，California，U.S.A.目录编号为4204A获得4微米(4μm)直径的这种球体。参照图5，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括多个以规则的间隔布置的多个口30(例如，用作气孔)，并且平板12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材料32形成了可用于将样本34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。这个可接受的分析腔室的示例在美国专利申请公开No.2007/0243117、2007/0087442、以及2008年4月2日提交的美国临时专利申请No.61/041,783和2008年10月31日提交的美国临时专利申请No.61/110,341中详细地进行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。
另一个可接受的腔室10的示例布置在如图6和图7所示的一次性容器36中。腔室10形成在第一平板12和第二平板16之间。第一平板12和第二平板16都是透明的，以允许光穿过腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20。该腔室10的实施例在美国专利No.6,723,290中更详地进行了描述，该专利以引用方式整体并入本文。图2至图7所示的分析腔室表示可接受的用于本发明方法的腔室。然而，本发明的方法不限于这些特定实施例。
不必为了本公开目的而知道腔室的确切高度。基于典型的细胞尺寸，对于大多数动物品种来说，大约2至6微米(2-6μm)的腔室高度是可接受的。大约3至5微米(3-5μm)的腔室高度20尤其适于分析人类血液。然而，本发明不限于任何特定的腔室高度，只要使用该腔室高度能够实现在此所述的方法即可。
使用分析设备来执行对静止地置于腔室10内的样本的分析，该分析设备可用于对样本的至少一部分进行照射和成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本单位来确定来自样本的所述部分的荧光发射和光密度的方式产生该图像。术语“基本单位”或者“图像单位”是指所定义的能够分辨样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处理的最小图元的像素是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少量像素。还可以以线性项(例如，在焦平面上每像素几微米)来描述成像设备的放大倍数，其中线性维度沿着应用于图像的正交网格的一个特定轴。在焦平面上被传感器像素捕获的实际样本面积因此是成像设备所应用的放大系数的函数。因此，已知成像设备的放大倍数是有用的，但不是必要的。与该像素有关的体积因此是每个像素的图像的面积与腔室高度的乘积。例如，如果放大倍数为每像素0.5微米，则占据200个像素的图像将具有50平方微米的面积，而体积则为50平方微米与腔室高度的乘积。
现在参照图8，适用于本发明的方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、析像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46包括光源，该光源选择性地产生某些期望波长的光。例如，可以使用发射期望波长(例如，420nm，440nm，470nm等)的光的LED。作为选择，可以使用产生宽波长范围(例如，大概400-670nm)的光的光源，虽然在一些情况下，这种光源可能需要滤波。分析设备44可以包括用于控制光的光学器件。样本照明器46包括透射光源和表面照明光源，每一个均可用于照射停留在腔室10内的样本中的一些或者全部。可接受的析像器48的示例是电耦合器件(CCD)类型的图像传感器，其将穿过样本的光的图像转换成为电子数据形式(即，信号)。互补金属氧化物半导体(“CMOS”)类型的图像传感器是另一种可以使用的图像传感器的示例，然而本发明不限于这些示例中的任意一个。可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并且连接至样本照明器46和析像器48。CPU适于(例如，被编程为)选择性地执行实现本发明方法所必需的功能。应当注意，可以使用硬件、软件、固件或者其结合来实现可编程分析器50的功能。所属领域的技术人员将能够对处理单元进行编程以执行在此所述的功能，而不需要进行过度的实验。题目为“Apparatus for Analyzing Biologic Fluids”且于2005年3月15日发布的美国专利No.6,866,823公开了这种分析设备44，该美国专利内容以引文方式整体并入本文。
该分析设备适于处理从对样本的至少一部分的照射产生的图像信号，以识别和计数样本内的组分。该图像信号包括基于每个像素的荧光发射和光密度。每个像素的发光强度及颜色和光密度共同建立了被照射样本部分的图像。在该共同的图像内，分析设备适于使用所选组分的荧光强度、颜色含量和荧光发射的光密度、以及在某些实例中还有所选组分的物理特性(例如，面积、边缘几何形状等)中的一个或多个来识别该组分的分布。该分析设备使用图像分布来在所选组分中进行区分，直到剩余组分表示目标组分(例如，血小板)为止，此时可以对该目标组分进行计数。
根据本发明的方法，基本上未稀释的全血样本被引入腔室10内，然后静止地停留在腔室10内。在将样本引入腔室前或者在将样本引入腔室时，在样本中掺合抗凝血剂和染色剂。染色剂被样本内的组分(例如，WBC、血小板和网状细胞)吸收。在一些应用中，在样本中加入等容球状试剂以使样本内的一些RBC或全部RBC呈现球状形状。可接受的等容球状试剂的一个示例是两性离子去污剂。球状试剂的一个特定示例是3-16去污剂，其是由美国的新泽西州的EMD Chemicals公司的一个机构Calibriochem生产的两性离子去污剂。添加到样本中的球状试剂的量足以使至少执行血细胞比容分析所需的多个RBC成为球状。该特定的量将取决于具体的试剂和测试环境，并且所属领域的技术人员无需进行过度实验就能够确定。自然的双凹圆盘状RBC和RBC相对于血小板的相对尺寸可以使样本内的血小板“隐藏”在样本内的RBC中；例如，在RBC的凹陷内。使RBC成为球状降低了血小板被隐藏在样本内的RBC中的可能性，并且增大了血小板被视为血浆内的独立单位的可能性，从而增大了对样本进行的定量血小板分析的准确性。
用使光透射穿过样本的分析设备44照射静止地停留在腔室内的样本的至少一部分。虽然不要求对停留在腔室内的整个样本成像，但是这是优选的，因为这样做通常能够提供对样本的更全面的分析并且伴随着准确性的提高。用已知能够激发来自组分的与被组分吸收的染色剂有关的荧光发射的波长的光来照射样本。当被大约470nm波长的紫光照射时用吖啶橙染色的组分产生荧光发射。图9至图13所示的照片示出了样本内发现的组分(例如，血小板、巨血小板、WBC、网状细胞、血小板凝块)的荧光发射。特定的发光取决于所使用的染色剂和被照射细胞的细胞内成分(例如，染色剂与细胞或血小板的成分相互作用会引起发光)。一些组分具有作为荧光光度标记的荧光发射(也称为“分布”)，所述荧光光度标记表示产生组合光的多个波长的荧光发射的特定比率(例如，特征的“红色/绿色”比率)，其对于该组分来说是相对唯一的，因此可以用来识别该组分。其他组分的荧光发射标记不能容易地将彼此区分开。为了区分这些组分，用被血红蛋白吸收的量稍微大于被血小板或血浆吸收的量的波长的光来照射样本。可以依照光密度来测量吸收量，然后可以利用光密度来区分包含血红蛋白的组分和不包含血红蛋白的组分。
由于图像的荧光发射部分是诸如所使用的染色剂的类型和样本内的染色剂的浓度之类的因素的函数，因此，对样本强度进行校准是有用的，但不是必须的。例如，对于给定的染色剂浓度，来自WBC的荧光发射平均来说大于来自血小板的荧光发射。这可以从为同一样本的图像的图9和10中清楚地看到。图10中的荧光发射的放大倍数大于图9中所使用的放大倍数。图9清楚地显示了来自WBC 40的荧光发射，而微弱地显示了来自血小板42的荧光发射。图10清楚地显示了WBC 40和血小板42，并且还显示了如何通过它们的荧光发射强度来将它们区分开。该校准识别出了关于该分析设备的WBC的相关强度水平和血小板的相关强度水平，并且相应地对分析设备进行了校准。
通过照射样本产生的荧光发射和透射光被转化成基于每个像素的图像信号，这些信号共同建立了被照射样本部分的图像。在该共同的图像内，分析设备适于使用荧光发射的荧光强度、颜色含量和光密度中的一个或多个来识别某些所选组分的分布。可以使用比较上述各个特性的算法来执行通过上述特性来识别组分分布的过程，以识别组分。一旦组分被识别，就可以对其进一步分析。例如，可以通过荧光发射分布来识别样本内的有代表性的多个血小板，并且可以共同地对它们进行分析来确定血小板的荧光发射强度的平均值。在一些实例中，组分荧光分布还用以使用荧光信号分布来确定组分的内部面积和边缘区域。可以对单独组分的面积进行平均，以确定平均面积值。可以分析边缘分布来获得平滑度和/或几何形状；例如，确定组分的边缘是否是圆形的、非圆形的、不规则的、等等。这些特性随后被用来对样本内的组分进行区分，直到剩余组分表示目标组分(例如，血小板)为止，此时可以对目标组分进行计数。
为了示出本发明的示例，在基本上未稀释的血液样本中掺合EDTA、吖啶橙和两性离子去污剂，并且将样本引入具有两个透明的平板的腔室内，用于确定样本内的血小板计数。包括RBC、网状细胞、WBC、血小板、巨血小板和血小板凝块的组分静止地停留在样本内。用470nm、413nm和540nm中的至少一种来照射样本。470nm照射产生来自吖啶橙的荧光发射。其他染色剂可能在被其他波长的光照射时发光。413nm和/或540nm的照射被用来通过血红蛋白的光密度来表示血红蛋白的存在，如下将讨论。获取被照射的样本的数字图像。
分析样本的图像以识别置于样本内的各种组分。例如，可以通过WBC的荧光标记(例如，由显著的红色细胞质荧光和绿色细胞核荧光组成的荧光发射图案)、WBC的荧光发射的相对强度、WBC占据的面积以及WBC的形状中的一个或多个来单独识别WBC(见图9-11)。从而，例如通过对图像进行滤波将WBC从样本的剩余物中区分出来，使得在图像中不再考虑WBC。
现在参照图12，可以通过巨血小板44的荧光分布、面积和形状中的一个或多个来识别巨血小板44。可以在背景中微弱地看到RBC45。巨血小板44的色度比与正常的血小板42的色度比类似，但是由于其微粒质量较大，所以发光强度较大。巨血小板44在尺寸上还明显地大于正常的血小板42并且是圆形的。正常的血小板42通常为不规则的形状。大多数正常尺寸的血小板的直径为1.5至3μm。相比之下，巨血小板44的直径大于7μm并且通常处在10μm至20μm范围内。巨血小板的识别和计数提供了重要的临床信息，这是因为巨血小板的存在可能是巨大血小板综合症(Bernard-soulier syndrome)和骨髓增生性疾病(myeloproliferative disorder)(例如，慢性骨髓白血病(CML)、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、以及特发性骨髓外化生)的指标。通过将巨血小板44的荧光发射(色度和强度)、面积和周界形状中的一个或多个与正常血小板的荧光发射值、面积和周界形状进行比较，其中包括比较平均的血小板强度和面积值，来识别样本内的巨血小板44。作为可用来识别巨血小板的标准的一个示例，可以对分析设备进行编程，使其具有一个或多个相对于正常血小板的比较标准(例如，基于平均的正常血小板面积或强度的标准偏差的平均血小板面积或强度的倍数，或者通过预定的面积或强度值等)。对于平均血小板面积，任何给定样本内的血小板面积的分布通常被描述成对数-正态分布函数，并且可以使用已知技术在统计学上进行确定。被识别出的巨血小板然后被分辨出来，并且取决于所期望的特定信息，巨血小板被包含在血小板计数中和/或被视为独立的组分族群。
网状细胞46发出的荧光分布类似于正常血小板发出的荧光分布，这是因为它们都包含核材料。图13中的照片示出网状细胞46和血小板42的荧光发射。圆形的黑色突出显示的部分是图像中放置WBC的图像部分，但是该图像被遮住。在某种程度上通过网状细胞46和血小板42的荧光发射能够将它们区分开，其中网状细胞46比血小板42看起来稍微明亮并且具有稍微多的红色。还可以用波长为413nm和/或540nm的光照射样本来辨别网状细胞46，这些波长的光被血红蛋白吸收的量显著地大于样本内存在的其他材料吸收的量，因此能够指示血红蛋白的存在。可以按照光密度来对血红蛋白的光吸收进行定量。图14示出了网状细胞的OD。使用荧光发射图案和OD中的一个或两个来将网状细胞从样本的剩余物中辨别出来。
在大多数血液样本中，在已经辨别出WBC、巨血小板和网状细胞之后剩余的具有荧光发射的组分即使不完全是也主要是血小板。可以对样本内的单独的血小板进行识别和计数。然而，在一些血液样本中，样本内的一部分血小板可能聚集成一个或多个凝块，这些凝块在尺寸上可以很大；例如，为WBC尺寸的1到4倍。图11的照片显示了血小板凝块48和WBC 40。通过血小板凝块48的荧光发射分布、通过它们的粒度、以及在某些情况下通过它们的面积和/或形状，可以从其他组分(例如，WBC 40、巨血小板44)中识别出和辨别出血小板凝块48，其中血小板凝块48的荧光发射分布的红色/绿色比率可以与WBC 40的区分开。例如，血小板凝块48可以与巨血小板区分开，这是因为血小板凝块为不规则的形状，而巨血小板为基本上圆形的形状。可以通过编程到分析设备中的图像分析软件来确定血小板凝块和巨血小板的相对圆度。检测样本内存在血小板凝块是重要的，这是因为存在将凝块计数为WBC和/或导致血小板减少症的错误诊断的可能性(从而错误地估计WBC计数)。这些潜在问题与现有的自动分析仪尤其相关。血小板凝块的存在是样本与EDTA不充分混合的指标。
一旦识别出血小板凝块，就能够确定凝块的累积荧光发射强度和凝块的面积。然后，可以通过用平均血小板发光强度除累积荧光发射强度来确定凝块内的血小板数目。该商值是可接受的对凝块内的实际血小板数目的近似。还可以通过用平均的血小板面积除凝块的面积来确定凝块内的血小板数目的近似。
虽然已经通过本发明的具体实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人员应当理解在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以在形式上或细节上进行各种变化。
Claims (14)
1.一种用于对具有多个血小板的血液样本中的血小板进行计数的方法，包括以下步骤：
将样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室内，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；
在样本中掺合染色剂，该染色剂用于使血小板在曝光于一个或多个预定的第一波长的光时发出荧光；
用第一波长的光照射包含血小板的样本的至少一部分；
对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自血小板的荧光发射的图像信号，该荧光发射具有强度；
使用图像信号，通过血小板的荧光发射来识别血小板；
确定在样本内识别出的单独的血小板的平均荧光发射强度值；
使用样本内的血小板凝块的荧光发射、面积、形状和粒度中的一个或多个来识别样本内的血小板凝块；
使用为样本内的单独的血小板确定的平均荧光发射强度值，对每个血小板凝块内的血小板进行计数。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述血液样本实质上未被稀释。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述血液样本是全血。
4.如权利要求1所述的方法，还包括步骤：对单独停留在样本内的血小板进行计数，并且将样本内的血小板的总数确定为每个血小板凝块内的血小板和单独停留在样本内的血小板的总和。
5.如权利要求1所述的方法，还包括步骤：识别样本内的巨血小板。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过荧光发射、面积和形状中的一个或多个来识别样本内的巨血小板。
7.如权利要求5所述的方法，还包括步骤：确定样本内的至少一个巨血小板的面积。
8.如权利要求7所述的方法，还包括步骤：确定在样本内识别出的单独的血小板的平均面积，并且将至少一个巨血小板的面积与平均血小板面积进行比较。
9.如权利要求7所述的方法，还包括步骤：确定在样本内识别出的单独的血小板的平均面积和单独的血小板的面积的统计偏差，并且将至少一个巨血小板的面积与基于单独的血小板的面积的统计偏差的值进行比较，以识别至少一个巨血小板。
10.如权利要求7所述的方法，还包括步骤：将至少一个巨血小板的面积与预定的值进行比较，以识别至少一个巨血小板。
11.如权利要求7所述的方法，还包括步骤：确定在样本内识别出的单独的血小板的平均面积，其中对每个血小板凝块内的血小板进行计数的步骤还包括使用样本内的单独的血小板的平均面积。
12.如权利要求1所述的方法，还包括步骤：
以一个或多个第二波长的光来照射包含血小板的样本的至少一部分；
对样本的至少一部分成像，包括产生表示样本内的一个或多个组分的光密度的图像信号；
使用图像信号，来确定样本内的一个或多个组分的光密度；以及
使用光密度来将血小板与一个或多个组分之间彼此区分开。
13.如权利要求1所述的方法，还包括步骤：通过用被血红蛋白吸收的一个或多个第二波长的光照射样本的至少一部分，来从包含血红蛋白的样本内的组分中分辨出血小板。
14.一种用于对血液样本内的血小板进行计数的设备，包括：
分析腔室，适于静止地保持样本以进行分析，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的，其中一定量的染色剂被置于腔室内，该染色剂用于使血小板在曝光于一个或多个预定的第一波长的光时发出荧光；
以第一波长的光照射包含血小板的样本的至少一部分；
成像单元，包括照明器和析像器，该成像单元用于对样本的至少一部分进行成像并且产生表示来自血小板的荧光发射的图像信号，该荧光发射具有强度；以及
可编程分析器，适于使用图像信号通过血小板的荧光发射来识别血小板，并且确定在样本内识别出的单独的血小板的平均荧光发射强度值，以及使用样本内的血小板凝块的荧光发射、面积、形状和粒度中的一个或多个来识别样本内的血小板凝块，以及使用为样本内的单独的血小板确定的平均荧光发射强度值来计数每个血小板凝块内的血小板。
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