ES2560098T3 - Método y aparato para detectar y contar plaquetas individualmente y en agregados - Google Patents

Método y aparato para detectar y contar plaquetas individualmente y en agregados Download PDF

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Abstract

Un método para enumerar plaquetas dentro de una muestra de sangre que tiene una pluralidad de plaquetas (42), que comprende las etapas de: depositar la muestra en una cámara de análisis (10) adaptada para contener de forma quiescente la muestra para análisis, la cámara (10) definida por un primer panel (12) y un segundo panel (16), paneles (12, 16) que son, ambos, transparentes; mezclar un colorante con la muestra, colorante que es operativo para hacer que las plaquetas (42) emitan fluorescencia tras la exposición a una o más primeras longitudes de onda de luz predeterminadas; iluminar al menos una parte de la muestra que contiene las plaquetas (42) a las primeras longitudes de onda; obtener imágenes de la al menos una parte de la muestra, incluyendo producir señales de imagen indicativas de emisiones fluorescentes desde las plaquetas (42), emisiones fluorescentes que tienen una intensidad; identificar las plaquetas (42) por sus emisiones fluorescentes, usando las señales de imagen; determinar un valor promedio de intensidad de emisión fluorescente para las plaquetas individuales (42) identificadas dentro de la muestra; identificar agregados (48) de plaquetas dentro de la muestra usando una o más de sus emisiones fluorescentes, área, forma y granularidad; enumerar plaquetas dentro de cada agregado plaquetario (48) usando el valor promedio de intensidad de emisión fluorescente determinado para las plaquetas individuales (42) dentro de la muestra.

Description

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DESCRIPCION
Metodo y aparato para detectar y contar plaquetas individualmente y en agregados Antecedentes de la invencion
1. Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un aparato y metodos para el analisis de muestras de sangre en general, y un aparato y metodos para detectar y enumerar plaquetas, y diferenciar plaquetas de plaquetas gigantes, y plaquetas gigantes de agregados plaquetarios, en particular.
2. Informacion antecedente
Los medicos, veterinarios y cientificos han examinado los fluidos biologicos del ser humano y de animales, especialmente la sangre, para determinar las cantidades de constituyentes asf como para identificar la presencia de partfculas inusuales que no se observan en sujetos sanos. Los constituyentes medidos, cuantificados e identificados generalmente incluyen eritrocitos (RBC), leucocitos (WBC) y plaquetas.
En mairnferos, las plaquetas (tambien denominadas trombocitos) son pequenos fragmentos celulares anucleares de forma irregular que se derivan de la fragmentacion de megacariocitos. Los trombocitos en ciertos animales (por ejemplo, aves, reptiles y peces) son de funcion similar a las plaquetas de marnfferos, pero son aproximadamente diez veces mas grandes y nucleados. Los analisis de plaquetas pueden incluir determinaciones del numero, el tamano, la forma, la textura y el volumen de las plaquetas dentro de la muestra, incluyendo la determinacion de la presencia de agregados de plaquetas o trombocitos dentro de la muestra. En ciertas condiciones que se dan en la naturaleza, las plaquetas se agregaran en agregados dentro de un sujeto como una respuesta util a un traumatismo (por ejemplo, hemorragia, traumatismo tisular, etc.) experimentado por el cuerpo. Los agregados plaquetarios que se forman dentro de una muestra de sangre recogida para analisis, por otro lado, tfpicamente no son utiles y pueden obstaculizar el analisis de la muestra de sangre. Pueden usarse anticoagulantes (por ejemplo, EDTA) para impedir que las plaquetas se agreguen dentro de una muestra, pero los agregados se pueden seguir formando si existe un retardo en la mezcla del anticoagulante con la muestra de sangre. Una vez que se forman los agregados, los anticoagulantes son tfpicamente ineficaces para separarlos en plaquetas individuales. Los agregados plaquetarios son, a menudo, problematicos dentro de una muestra que esta siendo analizada, dado que pueden causar recuentos plaquetarios erroneamente bajos, lo que puede causar diagnosticos erroneos y graves consecuencias para el paciente.
Las tecnicas de examen hematologico conocidas, descritas en detalle en textos tales como Wintrobe's Clinical Hematology 12a Edicion, generalmente dividen los metodos de examen en metodos de tipo manual, centnfugo y de impedancia. Los metodos manuales tfpicamente implican la creacion de un volumen determinado con exactitud de una muestra de sangre o fluido que se diluye cuantitativamente y se cuenta visualmente en una camara de recuento. Los metodos de examen manuales para enumeracion de celulas incluyen examinar un frotis periferico donde las cantidades relativas de los tipos de partfcula se determinan mediante inspeccion visual. Los metodos de examen centnfugo implican centrifugar la muestra, haciendo que la muestra se separe en capas constituyentes de acuerdo con las densidades relativas de los constituyentes. Las capas componentes pueden tenirse para mejorar la visibilidad o la deteccion. Los metodos de impedancia implican el examen de un volumen exacto de sangre que es tratada de acuerdo con la partfcula que es medida; por ejemplo, lisando RBC para enumeracion de las celulas nucleadas y diluyendo volumetricamente la muestra en un fluido conductor. El proceso tfpicamente implica monitorizar una corriente o tension aplicada a la muestra que pasa a traves de un estrecho pasaje para determinar el efecto que tienen las partfculas sobre la corriente/tension a medida que las partfculas pasan a traves en fila india. Otras tecnicas implican analizar la intensidad y el angulo de dispersion de la luz incidente en partfculas que pasan en fila india a traves de un haz de luz. Tambien pueden usarse metodos de citometna de flujo que implican tenir partfculas de interes en suspension con fluoroforos unidos a anticuerpos dirigidos contra epftopos superficiales presentes en tipos de celulas o de partfculas, excitar las partfculas tenidas con luz de longitudes de onda apropiadas, y analizar la emision de las partfculas/celulas individuales. Un ejemplo de un metodo de tipo flujo es el documento WO-98/02727, que describe un metodo y un aparato para realizar analisis automatizados.
Todos los metodos mencionados anteriormente, aparte del frotis periferico o la separacion centnfuga, requieren dispensar un volumen de muestra preciso. Las inexactitudes en el volumen de muestra daran como resultado errores cuantitativos de la misma magnitud en el analisis asociado. Con la excepcion de los metodos centnfugos, todos los metodos mencionados anteriormente tambien requieren que la muestra se mezcle con uno o mas reactivos o diluyentes lfquidos, y tambien requieren la calibracion del instrumento para obtener resultados exactos. En el caso de frotis perifericos, se necesita un alto grado de formacion para examinar apropiadamente el frotis. Una serie de los metodos mencionados anteriormente generan grandes volumenes de desechos contaminados que son caros de manipular. Adicionalmente, los metodos descritos anteriormente no son adecuados para determinar el hemograma completo (CBC) en aves, reptiles y peces, donde los eritrocitos y trombocitos son nucleados, y en ciertos mamfferos donde el tamano de los eritrocitos es muy pequeno y estos pueden confundirse con plaquetas.
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Sumario de la invencion
De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para enumerar plaquetas dentro de una muestra de sangre sustancialmente sin diluir. El metodo incluye las etapas de: 1) depositar la muestra en una camara de analisis adaptada para contener de forma quiescente la muestra para analisis, la camara definida por un primer panel y un segundo panel, paneles que son, ambos, transparentes; 2) mezclar un colorante con la muestra, colorante que es operativo para hacer que las plaquetas emitan fluorescencia tras la exposicion a una o mas primeras longitudes de onda de luz predeterminadas; 3) iluminar al menos una parte de la muestra que contiene las plaquetas a las primeras longitudes de onda; 4) obtener imagenes de la al menos una parte de la muestra, incluyendo producir senales de imagen indicativas de emisiones fluorescentes desde las plaquetas, emisiones fluorescentes que tienen una intensidad; 5) identificar las plaquetas por sus emisiones fluorescentes, usando las senales de imagen; 6) determinar un valor promedio de intensidad de emision fluorescente para las plaquetas individuales identificadas dentro de la al menos una parte de la muestra; 7) identificar agregados de plaquetas dentro de la al menos una parte de la muestra usando una o mas de sus emisiones fluorescentes, area, forma y granularidad; y 8) enumerar plaquetas dentro de cada agregado plaquetario usando el valor promedio de intensidad de emision fluorescente determinado para las plaquetas individuales dentro de la muestra.
En un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un aparato para iluminar plaquetas dentro de una muestra de sangre, de acuerdo con la reivindicacion 14.
Una ventaja de la presente invencion es que proporciona un recuento plaquetario exacto dentro de una muestra de sangre. La mayona de los analizadores hematologicos de la tecnica anterior cuentan el numero de plaquetas dentro de la muestra suponiendo que los constituyentes dentro de la muestra de cierto tamano son, de hecho, plaquetas. Las plaquetas gigantes y los agregados plaquetarios, ambos de los cuales son mayores que las plaquetas de tamano normal, pueden, por lo tanto, no ser considerados en el recuento y pueden contarse como leucocitos. El recuento plaquetario bajo resultante puede interpretarse erroneamente como trombocitopenia. La presente invencion identifica plaquetas gigantes y agregados plaquetarios y enumera las plaquetas dentro de los agregados plaquetarios. Como resultado, se proporciona un recuento plaquetario que es mas exacto que el proporcionado por la mayona de los analizadores hematologicos automatizados de la tecnica anterior y uno que evita contar las plaquetas gigantes y los agregados plaquetarios como leucocitos, lo que da como resultado recuentos plaquetarios falsamente bajos y recuentos de leucocitos falsamente altos.
Otra ventaja de la presente invencion es que permite la identificacion y enumeracion de plaquetas gigantes dentro de una muestra de sangre.
Otra ventaja de la presente invencion es que puede usarse para determinar caractensticas de una muestra de sangre usando un volumen de muestra extremadamente pequeno que puede obtenerse directamente del paciente mediante puncion capilar haciendola mas util para aplicaciones en centro asistencial o a partir de una muestra venosa, si se desea.
Otra ventaja del presente metodo es que opera libre de flrndica externa e interna, e independiente de la gravedad o la orientacion y, por lo tanto, es adaptable para uso en un dispositivo portatil o de mano en condiciones de microgravedad.
El presente metodo y las ventajas asociadas con el se volveran mas facilmente evidentes en vista de la descripcion detallada proporcionada a continuacion, incluyendo los dibujos adjuntos.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1-4 son representaciones esquematicas de seccion transversal de camaras de analisis que pueden usarse en el presente metodo.
La figura 5 es una vista en planta esquematica de una cinta que tiene una pluralidad de camaras de analisis.
La figura 6 es una vista en planta esquematica de un recipiente desechable que tiene una camara de analisis.
La figura 7 es una vista de seccion transversal esquematica de un recipiente desechable que tiene una camara de analisis.
La figura 8 es un esquema esquematico de un dispositivo de analisis que puede usarse con el presente metodo.
La figura 9 es una imagen en color de una parte de una camara que contiene una muestra de sangre sustancialmente sin diluir mezclada con un tinte de naranja de acridina fluorescente, que ha sido iluminada a una longitud de onda que produce emisiones fluorescentes a partir de los constituyentes (por ejemplo, WBC, plaquetas, etc.) que han absorbido el tinte, imagen obtenida a una primera amplificacion de intensidad.
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La figura 10 es la imagen en color mostrada en la figura 9, imagen obtenida a una segunda amplificacion de intensidad que es mayor que la primera.
La figura 11 es una imagen en color de una parte de una camara que contiene una muestra de sangre sustancialmente sin diluir mezclada con un tinte de naranja de acridina fluorescente, que ha sido iluminada a una longitud de onda que produce emisiones fluorescentes a partir de los constituyentes, ilustrando los diferentes perfiles de emision de WBC, agregados plaquetarios y plaquetas.
La figura 12 es una imagen en color de una parte de una camara que contiene una muestra de sangre sustancialmente sin diluir mezclada con un tinte de naranja de acridina fluorescente, que ha sido iluminada a una longitud de onda que produce emisiones fluorescentes a partir de los constituyentes, ilustrando los diferentes perfiles de emision de plaquetas, plaquetas gigantes y reticulocitos.
La figura 13 es una imagen en color de una parte de una camara que contiene una muestra de sangre sustancialmente sin diluir mezclada con un tinte de naranja de acridina fluorescente, que ha sido iluminada a una longitud de onda que produce emisiones fluorescentes a partir de los constituyentes, ilustrando los diferentes perfiles de emision de plaquetas y reticulocitos. La imagen tambien incluye WBC editados a partir de la imagen, y RBC observados vagamente en el fondo.
La figura 14 es una version en blanco y negro de la imagen mostrada en la figura 13 que se crea iluminando la muestra a una longitud de onda que muestra los valores de densidad optica de la imagen. Esta imagen ilustra los perfiles de densidad optica de reticulocitos y RBC dentro de la muestra, perfiles que permiten que los reticulocitos sean identificados.
La figura 15 es un diagrama de bloques de las etapas de un metodo de acuerdo con un aspecto de la presente invencion.
Descripcion detallada de realizaciones de la invencion
El presente metodo generalmente utiliza una camara de analisis que es accionable para contener de forma quiescente una muestra de sangre completa anticoagulada sustancialmente sin diluir para analisis. La camara esta tfpicamente dimensionada para contener aproximadamente de 0,2 a 1,0 |il de muestra, pero la camara no esta limitada a ninguna capacidad de volumen particular, y la capacidad puede variar para adecuarse a la aplicacion de analisis. La frase “sustancialmente sin diluir”, tal como se usa en el presente documento, describe una muestra de sangre que no esta diluida en absoluto o no ha sido diluida intencionadamente, pero a la que se le han anadido algunos reactivos para fines del analisis. En la medida en que la adicion de los reactivos diluye la muestra, si es que lo hace, dicha dilucion no tiene ningun impacto clmicamente significativo sobre el analisis realizado. Tfpicamente, los unicos reactivos que se usaran en la ejecucion del presente metodo son anticoagulantes (por ejemplo, EDTA, heparina) y colorantes. Estos reactivos se anaden generalmente en forma seca y no pretenden diluir la muestra. En ciertas circunstancias (por ejemplo, analisis muy rapido - tal como puede ocurrir cuando la sangre se toma a partir de puncion en el dedo de un paciente o puncion en el talon de un recien nacido), puede no ser necesario anadir el agente anticoagulante, pero es preferible hacerlo en la mayona de los casos para garantizar que la muestra esta en una forma aceptable para analisis. El termino “quiescente” se usa para describir que la muestra se deposita dentro de la camara para analisis, y no se mueve intencionadamente con respecto a la camara durante el analisis. En la medida en que el movimiento esta presente dentro de la muestra de sangre, este sera de forma predominante el debido al movimiento Browniano de los constituyentes formados de la muestra de sangre, movimiento que no es incapacitante del uso del dispositivo de esta invencion.
El colorante (por ejemplo, un tinte, tincion, etc.), que se mezcla con al menos una parte de la muestra de sangre, facilita la identificacion y el analisis cuantitativo de los constituyentes (por ejemplo, plaquetas, WBC, etc.) que absorben el colorante. El colorante emite fluorescencia a lo largo de longitudes de onda caractensticas (por ejemplo, 530 nm, 585 nm y 660 nm) cuando es excitado por la luz a lo largo de ciertas longitudes de onda (por ejemplo, aproximadamente 470 nm). Las longitudes de onda espedficas a las que un constituyente emitira fluorescencia son una caractenstica de ese constituyente y la longitud de onda o longitudes de onda de la luz de excitacion. En algunas realizaciones, el colorante tambien puede absorber luz a una o mas longitudes de onda predeterminadas en funcion de la concentracion del colorante dentro del constituyente. Los ejemplos de colorantes aceptables incluyen los tintes supravitales naranja de acridina y “naranja astrozone”. La invencion no esta limitada a tintes supravitales, Sin embargo. Un experto en la materia conocena intervalos de concentracion de colorantes apropiados, o podna determinarlos sin experimentacion excesiva.
Con referencia ahora a la figura 1, la camara de analisis 10 esta definida por un primer panel 12 que tiene una superficie interior 14, y un segundo panel 16 que tiene una superficie interior 18. Los paneles 12, 16 son ambos suficientemente transparentes para permitir la transmision de luz a lo largo de longitudes de onda predeterminadas a su traves en una cantidad suficiente para realizar el analisis de la densidad optica descrito a continuacion. Al menos una parte de los paneles 12, 16 son paralelas entre sf, y dentro de esa parte las superficies interiores 14, 18 estan
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El presente metodo puede utilizar diversos tipos de camaras de analisis diferentes que tienen las caractensticas mencionadas anteriormente, y no esta limitado, por lo tanto, a ningun tipo particular de camara de analisis. Una camara de analisis que tiene paneles paralelos 12, 16 simplifica el analisis y es, por lo tanto, preferida, pero no es requerida para la presente invencion; por ejemplo, podna usarse una camara que tiene un panel dispuesto en un angulo no paralelo conocido con respecto al otro panel.
Con referencia ahora a las figuras 2-5, se muestra un ejemplo de una camara aceptable 10 que incluye un primer panel 12, un segundo panel 16, y al menos tres separadores 26 dispuestos entre los paneles 12, 16. Los separadores 26 pueden ser cualquier estructura que puede disponerse entre los paneles 12, 16, accionable para alejar los paneles 12, 16 entre sf La dimension 28 de un separador 26 que se extiende entre los paneles 12, 16 se denomina en el presente documento como la altura 28 del separador 26. Las alturas 28 de los separadores 26 tfpicamente no son exactamente iguales entre sf (por ejemplo, tolerancias de fabricacion), pero estan dentro de la tolerancia aceptable comercialmente para medios de separacion usados en aparatos de analisis similares. Perlas esfericas son un ejemplo de un separador aceptable 26 y estan disponibles en el mercado de, por ejemplo, Bangs Laboratories de Fishers, Indiana, EE. UU.
En la realizacion de camara mostrada en la figura 3, los separadores 26 constan de un material que tiene mayor flexibilidad que uno o ambos del primer panel 12 y el segundo panel 16. Tal como puede verse en la figura 3, los separadores mas grandes 26 son comprimidos hasta el punto en el que la mayona de los separadores 26 estan tocando las superficies interiores de los paneles 12, 16, haciendo de este modo la altura de la camara justamente ligeramente menor que los diametros del separador medio 26. En la realizacion de la camara mostrada en la figura 4, los separadores 26 constan de un material que tiene menos flexibilidad que uno o ambos del primer panel 12 y el segundo panel 16. En la figura 4, el primer panel 12 esta formado a partir de un material mas flexible que los separadores esfericos 26 y el segundo panel 16, y recubrira los separadores 26 a la manera de una tienda. En esta realizacion, aunque pequenas regiones locales de la camara 10 pueden desviarse de la altura de camara deseada 20, la altura promedio 20 de la camara 10 sera muy cercana a la del diametro del separador medio 26. El analisis indica que la altura media de la camara 20 puede estar controlada al uno por ciento (1 %) o mejor a alturas de la camara de menos de cuatro micrometros usando esta realizacion. Sujetos a las caractensticas de flexibilidad descritas anteriormente (asf como otros factores tales como la densidad de distribucion de los separadores), los separadores 26 y los paneles 12, 16 pueden estar hechos de diversos materiales, siempre que los paneles 12, 16 sean suficientemente transparentes. Pelfculas de plastico transparentes que constan de polietilentereftalato son un ejemplo de paneles aceptables 12, 16, y perlas esfericas hechas de poliestireno, policarbonato, silicona, y similares, son separadores aceptables 26. Un ejemplo espedfico de un separador aceptable son esferas hechas de poliestireno que estan disponibles en el mercado, por ejemplo, de Thermo Scientific de Fremont, California, EE. UU., n.° de catalogo 4204A, de cuatro micrometros (4 |im) de diametro. Con referencia a la figura 5, el panel 12 que se va a disponer verticalmente por encima del otro incluye una pluralidad de orificios 30 dispuestos a intervalos regulares (por ejemplo, que actuan como respiraderos de aire), y los paneles 12, 16 se unen entre sf en puntos. En algunas realizaciones, el material de union 32 forma una pared de camara externa accionable para contener lateralmente la muestra 34 dentro de la camara de analisis 10. Este ejemplo de una camara de analisis aceptable se describe con mas detalle en las publicaciones de solicitud de patente estadounidense n.° 2007/0243117, 2007/0087442 y las solicitudes de patente provisional estadounidense numero 61/041.783, presentada el 2 de abril de 2008; y 61/110.341, presentada el 31 de octubre de 2008.
Otro ejemplo de una camara aceptable 10 esta dispuesta en un recipiente desechable 36, tal como se muestra en las figuras 6 y 7. La camara 10 esta formada entre un primer panel 12 y un segundo panel 16. Tanto el primer panel 12 como el segundo panel 16 son transparentes para permitir a la luz pasar a traves de la camara 10. Al menos una parte del primer panel 12 y el segundo panel 16 son paralelas entre sf, y dentro de esa parte las superficies interiores 14, 18 estan separadas entre sf por una altura 20. Esta realizacion de camara 10 se describe con mas detalle en la patente de Estados Unidos n.° 6.723.290. Las camaras de analisis mostradas en las figuras 2-7, representan camaras que son aceptables para uso en el presente metodo. El presente metodo no esta, sin embargo, limitado a estas realizaciones particulares.
No es necesario conocer la altura exacta de la camara para fines de la presente divulgacion. Una altura de la camara de aproximadamente dos a seis micrometros (2-6 |im) es aceptable para la mayona de especies animales en base a tamanos de celula tfpicos. Una altura de la camara 20 de aproximadamente tres a cinco micrometros (3-5 |im) es particularmente muy adecuada para analizar sangre humana. La presente invencion no esta, sin embargo, limitada a ninguna altura de la camara particular, siempre que la metodologfa descrita en el presente documento pueda conseguirse con dicha altura de la camara.
El analisis de la muestra dispuesta de forma quiescente dentro de la camara 10 se realiza usando un dispositivo de analisis que es accionable para iluminar y obtener imagenes de al menos una parte de la muestra y realizar un analisis de la imagen. La imagen se produce de una manera que permite emisiones fluorescentes desde, y la densidad optica de, la parte de la muestra a determinar por unidad. La expresion “por unidad” o “unidad de imagen”
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significa una unidad creciente definida a partir de la cual la imagen de la muestra puede diseccionarse. Un pixel, que generalmente se define como el elemento mas pequeno de una imagen que puede procesarse individualmente dentro de un sistema de imaginolog^a particular, es un ejemplo de una unidad de imagen, y una unidad de imagen puede incluir un pequeno numero de pfxeles en una unidad colectiva. El aumento de un dispositivo de imaginologfa tambien puede describirse en terminos lineales (por ejemplo, micrometros por pixel en el plano focal), donde la dimension lineal es a lo largo de un eje particular de una rejilla ortogonal aplicada a la imagen. El area real de la muestra capturada mediante pfxeles del sensor en el plano focal esta, por lo tanto, en funcion del factor de aumento aplicado por el dispositivo de imaginologfa. Por lo tanto, es util pero no necesario conocer el aumento del dispositivo de imaginologfa. El volumen asociado con ese pixel es, por lo tanto, el area de la imagen por pixel veces la altura de la camara. Por ejemplo, si el aumento era 0,5 micrometros por pixel, una imagen que ocupe 200 pfxeles tendna un area de 50 micrometros cuadrados, y un volumen de 50 micrometros cuadrados veces la altura de la camara.
Con referencia ahora a la figura 8, un ejemplo de un dispositivo de analisis 54 que puede adaptarse para uso con el presente metodo incluye un iluminador de muestras 56, un disector de imagenes 58, y un analizador programable 50. El iluminador de muestras 56 incluye una fuente de luz que produce selectivamente luz a lo largo de ciertas longitudes de onda deseadas. Por ejemplo, pueden usarse LED que emiten las longitudes de onda deseadas (por ejemplo, 420 nm, 440 nm, 470 nm, etc.). Como alternativa, puede usarse una fuente de luz que produce un intervalo de longitud de onda ancho (por ejemplo, aproximadamente 400 - 670 nm), aunque en algunos casos dicha fuente de luz puede requerir filtracion. El dispositivo de analisis 54 puede incluir componentes opticos para manipular la luz. El iluminador de muestras 56 incluye una fuente de luz de transmitancia y una fuente de luz de epi-iluminacion, cada una accionable para iluminar parte, o toda, de la muestra que reside dentro de la camara 10. Un ejemplo de un disector de imagenes aceptable 58 es un sensor de imagenes de tipo dispositivo de carga acoplada (CCD) que convierte una imagen de la luz que pasa a traves de la muestra en un formato de datos electronicos (es decir, una senal). Los sensores de imagenes de tipo semiconductor complementario de oxido metalico (“CMOS”) son otro ejemplo de un sensor de imagenes que puede usarse, y la presente invencion no esta limitada a ninguno de estos ejemplos. El analizador programable 50 incluye una unidad central de procesamiento (CPU) y esta conectado al iluminador de muestras 56 y al disector de imagenes 58. La CPU esta adaptada (por ejemplo, programada) para realizar selectivamente las funciones necesarias para realizar el presente metodo. Debe observarse que la funcionalidad del analizador programable 50 puede implementarse usando hardware, software, firmware, o una combinacion de los mismos. Un experto en la materia sena capaz de programar la unidad de procesamiento para realizar la funcionalidad descrita en el presente documento sin experimentacion excesiva. La patente de Estados Unidos n.° 6.866.823 titulada “Apparatus for Analyzing Biologic Fluids” y expedida el 15 de marzo de 2005, desvela dicho dispositivo de analisis 44.
El dispositivo de analisis esta adaptado para procesar las senales de imagen creadas a partir de la iluminacion de al menos una parte de la muestra a identificar y enumerar constituyentes dentro de la muestra. Las senales de imagen incluyen emisiones fluorescentes y valores de densidad optica por pixel. La intensidad y el color de las emisiones y la densidad optica por pixel establecen colectivamente la imagen de la parte de muestra iluminada. Dentro de la imagen colectiva, el dispositivo de analisis esta adaptado para identificar un perfil de constituyentes seleccionados, usando uno o mas de la intensidad fluorescente, el contenido de color y la densidad optica de las emisiones fluorescentes y, en algunos casos, caractensticas ffsicas (por ejemplo, area, geometna del borde, etc.) de los constituyentes. El dispositivo de analisis usa los perfiles de imagen para distinguir entre los constituyentes seleccionados hasta que los constituyentes restantes representan los constituyentes diana (por ejemplo, plaquetas), punto en el cual los constituyentes diana pueden enumerarse.
Segun el presente metodo, una muestra de sangre completa sustancialmente sin diluir se introduce en una camara 10, y seguidamente reside de forma quiescente dentro de la camara 10. Un agente anticoagulante y un colorante se mezclan con la muestra antes de su introduccion en la camara o tras la introduccion en la camara. El colorante es absorbido por los constituyentes (por ejemplo, WBC, plaquetas, reticulocitos) dentro de la muestra. En algunas aplicaciones, se anade un agentes esferizante isovolumetrico a la muestra para hacer que algunos o todos los RBC dentro de la muestra asuman una forma similar a la esferica. Un ejemplo de un agentes esferizante isovolumetrico aceptable es un detergente zwitterionico. Un ejemplo espedfico de un agente esferizante es el detergente Zwittergent® 3-16, que es un detergente zwitterionico producido por Calibriochem, una empresa de EMD Chemicals, Inc. de Nueva Jersey, EE. UU. La cantidad de agente esferizante anadida a la muestra es una cantidad adecuada para esferizar al menos un numero de RBC requerido para realizar el presente analisis de hematocrito. La cantidad espedfica dependera del agente particular y las circunstancias del analisis, que pueden ser determinadas por un experto en la materia sin experimentacion excesiva. La forma biconcava natural de los RBC, y el tamano relativo de los RBC con respecto a las plaquetas, puede hacer que las plaquetas dentro de una muestra se “oculten” entre los RBC en la muestra; por ejemplo, dentro de las concavidades de un RBC. Esferizar los RBC disminuye la probabilidad de que las plaquetas esten ocultas dentro de una muestra entre los RBC e incrementa la probabilidad de que dichas plaquetas puedan verse como individuos dentro del plasma y, por lo tanto, incrementa la exactitud de los analisis cuantitativos de plaquetas realizados sobre la muestra.
Al menos una parte de la muestra que reside forma quiescente dentro de la camara es iluminada por el dispositivo de analisis 54, que transmite la luz a traves de la muestra. Aunque no es un requisito que se obtengan imagenes de toda la muestra que reside dentro de la camara, es preferible, dado que hacerlo tfpicamente proporciona un analisis
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mas completo de la muestra y un incremento concomitante de la exactitud. La muestra se ilumina con longitudes de onda que se sabe que excitan una emision fluorescente a partir de los constituyentes en relacion con el colorante absorbido por los constituyentes. Los constituyentes tenidos con naranja de acridina producen una emision fluorescente cuando son iluminados con luz violeta a una longitud de onda de aproximadamente 470 nm. Las fotograffas mostradas en las figuras 9-13 ilustran las emisiones fluorescentes de los constituyentes (por ejemplo, plaquetas, plaquetas gigantes, WBC, reticulocitos, agregados plaquetarios) descubiertas dentro de la muestra. Las emisiones espedficas dependen del colorante usado y la composicion intracelular de la celula iluminada (por ejemplo, la interaccion del colorante con el contenido de la celula o la plaqueta crea las emisiones). Algunos constituyentes presentan emisiones fluorescentes que actuan como un distintivo fluorimetrico (tambien denominada un “perfil”), distintivo que representa una relacion particular de emisiones fluorescentes a lo largo de longitudes de onda que producen combinaciones de luz (por ejemplo, una relacion de “rojo/verde” caractenstica) que son relativamente unicas de ese constituyente y pueden usarse, por lo tanto, para identificar ese constituyente. Otros constituyentes presentan distintivos de emision fluorescente que no pueden distinguirse facilmente entre sf Para distinguir esos constituyentes, la muestra es iluminada con longitudes de onda de luz que son absorbidas por la hemoglobina en cantidades apreciablemente mayores de lo que senan absorbidas por las plaquetas o el plasma. La cantidad de absorcion puede medirse en terminos de densidad optica, y la densidad optica, a su vez, puede usarse para distinguir constituyentes que contienen hemoglobina de aquellos que no la contienen.
Dado que la parte de emision fluorescente de la imagen esta en funcion de factores tales como el tipo de colorante usado y la concentracion del colorante dentro de la muestra, es util, aunque no es necesario, calibrar la muestra para intensidad. Por ejemplo, para una concentracion dada de colorante, la emision fluorescente procedente de WBC es de promedio mayor que la emision fluorescente procedente de plaquetas. Esto puede verse claramente en las figuras 9 y 10, que son imagenes de la misma muestra. La amplificacion de la emision fluorescente en la figura 10 es mayor que la usada en la figura 9. La figura 9 muestra claramente las emisiones fluorescentes procedentes de los WBC 40, y muestra vagamente las emisiones procedentes de las plaquetas 42. La figura 10 muestra claramente tanto WBC 40 como plaquetas 42, y tambien muestra como cada una puede distinguirse por su intensidad de emision fluorescente. La calibracion identifica el nivel de intensidad asociado con los WBC y el nivel de intensidad asociado con las plaquetas para el dispositivo de analisis, y calibra el dispositivo de analisis en consecuencia.
Las emisiones fluorescentes y la luz transmitida producida iluminando la muestra se convierten en senales de imagen por pixel que establecen colectivamente la imagen de la parte de muestra iluminada. Dentro de la imagen colectiva, el dispositivo de analisis esta adaptado para identificar un perfil de ciertos constituyentes seleccionados, usando uno o mas de la intensidad fluorescente, el contenido de color y la densidad optica de las emisiones fluorescentes. El proceso de identificar los perfiles de los constituyentes mediante caractensticas mencionadas anteriormente puede realizarse usando algoritmos que comparan las diversas caractensticas para identificar el constituyente. Una vez que se ha identificado el constituyente, puede analizarse adicionalmente. Por ejemplo, un numero representativo de plaquetas pueden identificarse dentro de la muestra mediante su perfil de emision fluorescente y analizarse colectivamente para determinar un promedio de la intensidad de emision fluorescente para las plaquetas. En algunos casos, tambien se usan perfiles fluorescentes del constituyente para determinar las areas internas y las regiones de borde de los constituyentes usando los perfiles de senal fluorescente. Las areas de constituyentes individuales pueden promediarse para determinar un valor de area promedio. Los perfiles de borde pueden analizarse para suavidad y/o para geometna; por ejemplo, determinar si el borde de un constituyente es circular, no circular, irregular, etc. Estas caractensticas se usan posteriormente para distinguir constituyentes dentro de la muestra, hasta que los constituyentes restantes representan los constituyentes diana (por ejemplo, plaquetas), punto en el cual los constituyentes diana pueden enumerarse.
Para ilustrar un ejemplo de la presente invencion, una muestra de sangre sustancialmente sin diluir se mezcla con EDTA, naranja de acridina, y un detergente zwitterionico y se introduce dentro de una camara que tiene dos paneles transparentes con el fin de determinar un recuento plaquetario dentro de la muestra. Los constituyentes, incluyendo RBC, reticulocitos, WBC, plaquetas, plaquetas gigantes y agregados plaquetarios, residen de forma quiescente dentro de la muestra. La muestra se ilumina a 470 nm, al menos una de 413 nm y 540 nm. La iluminacion a 470 nm produce una emision fluorescente procedente del naranja de acridina. Otros colorantes pueden emitir luz tras la iluminacion a otras longitudes de onda. La iluminacion a 413 nm y/o 540 nm se usa para indicar la presencia de hemoglobina mediante su densidad optica, tal como se describira a continuacion. Se toman imagenes digitales de la muestra iluminada.
La imagen de la muestra se analiza para identificar diversos constituyentes dispuestos dentro de la muestra. Los WBC, por ejemplo, son identificados individualmente mediante una o mas de su distintivo fluorescente (por ejemplo, patron de emision fluorescente que consta de una fluorescencia citoplasmatica roja significativa y una fluorescencia nuclear verde), la intensidad relativa de sus emisiones fluorescentes, el area que ocupan y su forma (vease las figuras 9-11). Los WBC se distinguen, de este modo, del resto de la muestra; por ejemplo, filtrando la imagen, de modo que los WBC ya no se consideran dentro de la imagen.
Con referencia ahora a la figura 12, plaquetas gigantes 44 pueden identificarse dentro de la muestra mediante uno o mas de su perfil fluorescente, su area y su forma. Los rBc 45 pueden verse vagamente en el fondo. La relacion colorimetrica de una plaqueta gigante 44 es similar a la de una plaqueta normal 42, pero las emisiones son de mayor
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intensidad debido a la mayor masa de la parffcula. Las plaquetas gigantes 44 son tambien significativamente mas grandes que las plaquetas normales 42 y de forma circular. Las plaquetas normales 42 son ffpicamente de forma irregular. La mayona de las plaquetas de tamano normal son de 1,5 a 3 |im de diametro. Las plaquetas gigantes 44, en contraste, son mayores de 7 |im y habitualmente estan en el intervalo de 10 |im a 20 |im de diametro. La identificacion y enumeracion de plaquetas gigantes proporciona importante informacion clmica, dado que la presencia de plaquetas gigantes puede ser un indicador del smdrome de Bernard-Soulier y trastornos mieloproliferativos (por ejemplo, leucemia mielogena cronica (LMC), policitemia vera, trombocitopenia esencial (primaria), y metaplasia mieloide agnogena). Las plaquetas gigantes 44 dentro de la muestra se identifican comparando una o mas de sus emisiones fluorescentes (colorimetrica e intensidad), su area, y la forma de penmetro contra valores de emision fluorescente, el area y las formas del penmetro de plaquetas normales, incluyendo los valores promedio de intensidad y area de las plaquetas. Como ejemplo de criterios que pueden usarse para identificar plaquetas gigantes, el dispositivo de analisis puede estar programado con uno o mas criterios comparativos con respecto a plaquetas normales (por ejemplo, un multiplo del area o la intensidad promedio de las plaquetas en base a desviaciones ffpicas del area o la intensidad promedio de una plaqueta normal, o mediante un valor de area o intensidad predeterminado, etc.). Con respecto al area promedio de plaquetas, la distribucion de areas de plaquetas dentro de cualquier muestra dada se describe ffpicamente como una funcion logantmica normal y puede determinarse estadfsticamente usando tecnicas conocidas. Las plaquetas gigantes identificadas se distinguen a continuacion y, dependiendo de la informacion espedfica deseada, se incluyen en el recuento de plaquetas y/o se consideran como una poblacion de constituyentes independiente.
Los reticulocitos 46 emiten un perfil fluorescente que es similar al de las plaquetas normales debido al material nuclear que contienen. La fotograffa en la figura 13 muestra las emisiones fluorescentes de los reticulocitos 46 y las plaquetas 42. Las partes circulares oscurecidas son partes de la imagen donde se dispusieron WBC, pero cuya imagen fue enmascarada. Los reticulocitos 46 pueden distinguirse de las plaquetas 42 en cierta medida por su emision fluorescente, que aparece ligeramente mas brillante y tiene ligeramente mas rojo. Los reticulocitos 46 tambien pueden distinguirse iluminando la muestra con luz a longitudes de onda de 413 nm y/o 540 nm, longitudes de onda que son absorbidas por la hemoglobina en una cantidad sustancialmente mayor que cualquier otro material presente dentro de la muestra y es, por lo tanto, indicativa de la presencia de hemoglobina. La absorcion de luz de la hemoglobina puede cuantificarse en terminos de densidad optica. La figura 14 ilustra la DO de los reticulocitos. Los reticulocitos se distinguen del resto de la muestra usando uno o ambos de los patrones de emision fluorescente y la DO.
En la mayona de las muestras de sangre, los constituyentes con una emision fluorescente que quedan despues de que se han distinguido los WBC, las plaquetas gigantes y los reticulocitos son de forma predominante, si no completamente, plaquetas. Las plaquetas individuales dentro de la muestra pueden identificarse y enumerarse. En algunas muestras de sangre, sin embargo, una parte de las plaquetas dentro de la muestra pueden estar agregadas en uno o mas agregados, agregados que pueden ser de tamano muy grande; por ejemplo, de una a cuatro veces el tamano de un WBC. La fotograffa en la figura 11 muestra tanto agregados plaquetarios 48 como WBC 40. Los agregados plaquetarios 48 son identificables y distinguibles de otros constituyentes (por ejemplo, WBC 40, plaquetas gigantes 44) por su perfil de emision fluorescente que tiene una relacion rojo/verde que es distinguible de la de un WBC 40, por su granularidad, y en algunos casos por su area y/o forma. Por ejemplo, los agregados plaquetarios 48 son distinguibles de las plaquetas gigantes dado que los agregados plaquetarios son de forma irregular y las plaquetas gigantes son de forma sustancialmente circular. La relativa circularidad de tanto los agregados plaquetarios como las plaquetas gigantes puede determinarse mediante software de analisis de imagenes programado en el dispositivo de analisis. Detectar la presencia de agregados plaquetarios dentro de la muestra es importante debido a la posibilidad de que los agregados se cuenten como WBC (y de este modo eleven falsamente el recuento de WBC) y/o causen un falso diagnostico de trombocitopenia. Estos problemas potenciales son particularmente relevantes con los analizadores automatizados existentes. La presencia de agregados plaquetarios puede ser un indicador de mezcla inadecuada de la muestra con EDTA.
Una vez que se identifica un agregado plaquetario, pueden determinarse la intensidad de emision fluorescente integrada del agregado y el area del agregado. El numero de plaquetas dentro del agregado puede determinarse entonces dividiendo la intensidad de emision fluorescente integrada por la intensidad de emision de plaquetas promedio. El valor del cociente es una aproximacion aceptable del numero real de plaquetas dentro del agregado. Una aproximacion del numero de plaquetas dentro de un agregado tambien puede determinarse dividiendo el area del agregado por el area promedio de las plaquetas.
Aunque esta invencion se ha mostrado y descrito con respecto las realizaciones detalladas de la misma, los expertos en la materia entenderan que diversos cambios de forma y detalle pueden realizarse sin alejarse del alcance de la invencion.

Claims (13)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para enumerar plaquetas dentro de una muestra de sangre que tiene una pluralidad de plaquetas (42), que comprende las etapas de:
    depositar la muestra en una camara de analisis (10) adaptada para contener de forma quiescente la muestra para analisis, la camara (10) definida por un primer panel (12) y un segundo panel (16), paneles (12, 16) que son, ambos, transparentes;
    mezclar un colorante con la muestra, colorante que es operativo para hacer que las plaquetas (42) emitan
    fluorescencia tras la exposicion a una o mas primeras longitudes de onda de luz predeterminadas;
    iluminar al menos una parte de la muestra que contiene las plaquetas (42) a las primeras longitudes de onda;
    obtener imagenes de la al menos una parte de la muestra, incluyendo producir senales de imagen indicativas de
    emisiones fluorescentes desde las plaquetas (42), emisiones fluorescentes que tienen una intensidad;
    identificar las plaquetas (42) por sus emisiones fluorescentes, usando las senales de imagen;
    determinar un valor promedio de intensidad de emision fluorescente para las plaquetas individuales (42)
    identificadas dentro de la muestra;
    identificar agregados (48) de plaquetas dentro de la muestra usando una o mas de sus emisiones fluorescentes, area, forma y granularidad;
    enumerar plaquetas dentro de cada agregado plaquetario (48) usando el valor promedio de intensidad de emision fluorescente determinado para las plaquetas individuales (42) dentro de la muestra.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra de sangre esta sustancialmente sin diluir.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la muestra de sangre es sangre completa.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1,2 o 3 que comprende ademas la etapa de enumerar plaquetas que residen individualmente dentro de la muestra, y determinar un numero total de plaquetas dentro de la muestra como una suma de las plaquetas dentro de cada agregado plaquetario (48) y las plaquetas (42) que residen individualmente dentro de la muestra.
  5. 5. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas la etapa de identificar plaquetas gigantes (44) dentro de la muestra.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el que las plaquetas gigantes (44) dentro de la muestra se identifican mediante una o mas de emisiones fluorescentes, area y forma.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 5 o 6, que comprende ademas la etapa de determinar el area de al menos una de las plaquetas gigantes (44) dentro de la muestra.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas la etapa de determinar un area promedio para las plaquetas individuales (42) identificadas dentro de la muestra, y comparar el area de la al menos una plaqueta gigante (44) con el area promedio de las plaquetas.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas la etapa de determinar un area promedio para las plaquetas individuales (42) identificadas dentro de la muestra y una desviacion estadfstica de las areas de las plaquetas individuales (42), y comparar el area de la al menos una plaqueta gigante (44) con el un valor basado en la desviacion estadfstica de las areas de las plaquetas individuales para identificar la al menos una plaqueta gigante (44).
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas la etapa de comparar el area de la al menos una plaqueta gigante (44) con un valor predeterminado para identificar la al menos una plaqueta gigante (44).
  11. 11. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas la etapa de determinar un area promedio para las plaquetas individuales (42) identificadas dentro de la muestra, en el que la etapa de enumerar plaquetas dentro de cada agregado plaquetario (48) incluye ademas usar el area promedio para las plaquetas individuales (42) dentro de la muestra.
  12. 12. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas las etapas de:
    iluminar la al menos una parte de la muestra que contiene las plaquetas (42) a una o mas segundas longitudes de onda;
    obtener imagenes de la al menos una parte de la muestra, incluyendo producir senales de imagen indicativas de una densidad optica de uno o mas constituyentes dentro de la muestra;
    determinar la densidad optica de los uno o mas constituyentes dentro de la muestra, usando las senales de imagen; y
    distinguir las plaquetas (42) y los uno o mas constituyentes entre sf usando la densidad optica.
  13. 13. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, que comprende ademas la etapa de distinguir las plaquetas (42) de constituyentes dentro de la muestra que contienen hemoglobina iluminando la al menos una parte de la muestra con luz a una o mas segundas longitudes de onda que son absorbidas por la hemoglobina.
    5 14. Un aparato para enumerar plaquetas dentro de una muestra de sangre, que comprende: una camara de analisis
    (10) adaptada para contener de forma quiescente la muestra para analisis, la camara (10) definida por un primer panel (12) y un segundo panel (16), que son, ambos, transparentes, en el que una cantidad de colorante se dispone dentro de la camara (10), colorante que es operativo para hacer que las plaquetas (42) emitan fluorescencia tras la exposicion a una o mas primeras longitudes de onda de luz predeterminadas;
    10
    iluminar al menos una parte de la muestra que contiene las plaquetas (42) a las primeras longitudes de onda; una unidad de imaginologfa que incluye un iluminador (56) y un disector de imagenes (58), unidad que es accionable para obtener imagenes de al menos una parte de la muestra y producir senales de imagen indicativas de emisiones fluorescentes procedentes de las plaquetas (42), emisiones fluorescentes que tienen una intensidad; y 15 un analizador programable (50) adaptado para identificar las plaquetas (42) por sus emisiones fluorescentes, usando las senales de imagen, y determinar un valor promedio de intensidad de emision fluorescente para las plaquetas individuales (42) identificadas dentro de la muestra, e identificar agregados (48) de plaquetas dentro de la muestra usando una o mas de sus emisiones fluorescentes, area, forma y granularidad, y enumerar plaquetas dentro de cada agregado plaquetario (48) usando el valor promedio de intensidad de emision fluorescente determinado para las 20 plaquetas individuales (42) dentro de la muestra.
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