ES2597927T3

ES2597927T3 - Procedimiento para medir el área de una muestra dispuesta dentro de una cámara de análisis

Info

Publication number: ES2597927T3
Application number: ES09731372.0T
Authority: ES
Inventors: Niten V. Lalpuria; Stephen C. Wardlaw
Original assignee: Abbott Point of Care Inc
Current assignee: Abbott Point of Care Inc
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2017-01-24
Anticipated expiration: 2029-04-09
Also published as: US8326008B2; CA2720077A1; CN102027350A; WO2009126800A1; US20090257632A1; CN102027350B; JP5734838B2; EP2269033B1; EP2269033A1; US20130203107A1; CA2720077C; JP2011516890A; US8974732B2

Abstract

Un procedimiento para determinar el área de una cámara de análisis (10) cubierta por una muestra de fluido biológico (52) que reside en reposo dentro de la cámara (10), cuya cámara (10) tiene un primer panel (12) con una superficie interior (14), y un segundo panel (16) con una superficie interior (18), ambos de cuyos paneles (12, 16) son transparentes, comprendiendo el procedimiento las etapas de: iluminar la muestra (52) que reside dentro de la cámara de análisis (10) con una o más longitudes de onda operables para resaltar las interfaces (56) entre la muestra (52) y el aire, y para resaltar al menos un componente dentro de la muestra (52); obtener imágenes de la muestra (52) a lo largo de la una o más longitudes de onda, y producir señales de imagen representativas de la interacción de la una o más longitudes de onda con la muestra (52); caracterizado por que dicho procedimiento comprende además: determinar una ubicación de al menos una interfaz aire-muestra (56) entre la muestra (52) y el aire, usando las señales de imagen; determinar una ubicación de uno o más componentes (22) dentro de la muestra (52) con relación a la al menos una interfaz aire-muestra (56) usando las señales de imagen; determinar una o más regiones de muestra (58) que contienen al menos un componente (22) y dispuestas en un primer lado de la al menos una interfaz aire-muestra (56), y una o más regiones fuera de la muestra (60) que no contienen un componente y dispuestas en un segundo lado de la al menos una interfaz airemuestra (56), en el que la ubicación del uno o más componentes (22) con relación a la al menos una interfaz aire-muestra (56) se utiliza para determinar la una o más regiones de muestra (58) y/o la una o más regiones fuera de la muestra (60); y determinar un área de la cámara (10) que contiene la muestra (52), en el que la etapa de determinar un área de la cámara (10) comprende sumar un área asociada con cada unidad de imagen situada dentro de la región de muestra (58) o de la región fuera de la muestra (60).

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento para medir el area de una muestra dispuesta dentro de una camara de analisis ANTECEDENTES DE LA INVENCION

1. CAMPO TECNICO

La presente invencion se refiere a procedimientos para el analisis de muestras de fluidos biologicos en general, y a aparatos y procedimientos para determinar el area rellenada por la muestra dentro de una camara de analisis en particular.

2. Informacion de antecedentes

Los medicos, veterinarios y cientificos han examinado fluidos biologicos de animales y seres humanos, especialmente la sangre, con el fin de determinar las cantidades componentes, asf como para identificar la presencia de partfculas inusuales que no se observan en sujetos sanos. Los componentes generalmente medidos, cuantificados e identificados incluyen globulos rojos (eritrocitos), globulos blancos (leucocitos) y plaquetas.

El documento US 2007/0243117 A1 divulga una camara desechable para el analisis de fluidos biologicos. El documento WO 2005/029413 A1 divulga un procedimiento y un aparato para determinar el area o confluencia de una muestra.

Tecnicas de examen de sangre conocidas, descritas en detalle en textos medicos, como Hematologfa Clmica de Wintrobe, 12a edicion, por lo general dividen los procedimientos de investigacion en procedimientos manuales, por centrifugado, y por impedancia. Los procedimientos manuales tipicamente implican la creacion de un volumen determinado con precision de una muestra de sangre o fluido que se diluye cuantitativamente y se recuenta visualmente en una camara de recuento. Los procedimientos de examen manuales incluyen el examen de un frotis periferico donde las cantidades relativas de los tipos de partfculas se determinan mediante inspeccion visual. Los procedimientos de examen por centrifugacion implican centrifugar la muestra, causando que la muestra se separe en capas componentes de acuerdo con las densidades relativas de los componentes. Las capas componentes se pueden tenir para mejorar la visibilidad o la deteccion. Los procedimientos de impedancia implican el examen de un volumen exacto de sangre que se trata de acuerdo con el material en partfculas que se esta midiendo; por ejemplo, la lisis de los eritrocitos para la enumeracion de las celulas nucleadas y la dilucion volumetrica de la muestra en un fluido conductor. El proceso implica tfpicamente monitorizar una corriente o tension aplicada a la muestra que pasa a traves de un paso estrecho para determinar el efecto que las partfculas tienen en la corriente/tension cuando las partfculas pasan a traves del mismo en fila de a uno. Otras tecnicas implican el analisis de la intensidad y el angulo de dispersion de la luz incidente a las partfculas que pasan a traves de un haz de luz en fila de a uno.

Todos los procedimientos anteriormente mencionados, a excepcion del frotis periferico o la separacion por centrifugado, requieren dispensar un volumen exacto de muestra. Las imprecisiones en el volumen de la muestra daran como resultado errores cuantitativos de la misma magnitud en el analisis asociado. Con la excepcion de los procedimientos por centrifugado, todos los procedimientos mencionados anteriormente tambien requieren que la muestra se mezcle con uno o mas reactivos o diluyentes lfquidos, y tambien requieren la calibracion del instrumento para obtener resultados precisos. En el caso de los frotis perifericos, se necesita un alto grado de practica para examinar adecuadamente el frotis. Una cantidad de los procedimientos anteriormente mencionados genera grandes volumenes de residuos contaminados, lo que es caro de gestionar.

SUMARIO DE LA INVENCION

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un procedimiento para determinar el area de una camara de analisis cubierta por una muestra de fluido biologico que reside en reposo dentro de la camara. Este procedimiento se define en la reivindicacion 1.

Una camara de analisis que tiene un par de paneles transparentes separados por una altura uniforme proporciona un vehfculo conveniente para el analisis de la muestra. Para muchos analisis, es util (o necesario) conocer el volumen de la muestra que se esta analizando, pero es diffcil dispensar una cantidad de la muestra conocida con precision. Para evitar el problema de dispensar cantidades de muestra conocidas con precision, sena util medir el area de la pelfcula generada en la camara de analisis antes mencionada y multiplicar esa area por la altura de la camara para determinar el volumen de muestra anadido. Si la sangre (u otro fluido biologico) se distribuyera en formas geometricamente perfectas, esto sena relativamente facil, pero las muestras, al dispersarse a traves de la camara desde su punto de aplicacion, a menudo atrapan burbujas de aire o tienen bordes serpenteantes. La tarea de determinar el area de una muestra dentro de una camara es particularmente problematica para muestras de sangre que tienen un bajo numero de globulos rojos, donde el plasma relativamente claro se separara de la mayona de la muestra, y esta area relativamente incolora puede no estar incluida en los calculos de area, si la coloracion del area de la muestra es el unico criterio utilizado para el calculo del area. El presente procedimiento proporciona una

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forma precisa de determinacion del area de una muestra y por lo tanto del volumen en una camara de altura uniforme, y de ese modo proporciona una solucion a los problemas asociados con la dispensacion de un volumen de muestra preciso.

El presente procedimiento y las ventajas asociadas con el mismo se haran mas facilmente evidentes a la vista de la descripcion detallada proporcionada a continuacion, incluyendo los dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1 es una vista en seccion esquematica de una camara de analisis que contiene una muestra de sangre. La FIG. 2 es una vista en seccion esquematica de un modo de realizacion de una camara de analisis. La FIG. 3 es una vista en seccion esquematica de un modo de realizacion de una camara de analisis. La FIG. 4 es una vista en seccion esquematica de un modo de realizacion de una camara de analisis. La FIG. 5 es una vista plana esquematica de una camara de analisis. La FIG. 6 es una imagen esquematica de una muestra de sangre dispuesta dentro de una camara, iluminada para resaltar los globulos rojos dispuestos dentro de la muestra. La FIG. 7 es una imagen esquematica de una muestra de sangre dispuesta dentro de una camara, como se muestra en la FIG. 6, iluminada para resaltar las interfaces entre la muestra y el aire dentro de la muestra. La FIG. 8 es una imagen esquematica de una muestra dispuesta dentro de una camara, como se muestra en las FIGS. 6 y 7, con la region que contiene la muestra enmascarada digitalmente.

DESCRIPCION DETALLADA DE MODOS DE REALIZACION DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona uno o mas procedimientos para determinar el area de una muestra de fluido biologico que reside en reposo dentro de una camara de analisis. Dependiendo del analisis, la propia area de la muestra puede proporcionar informacion util y deseable. En otros analisis, el area se puede utilizar para determinar el volumen de la muestra dentro de la camara; por ejemplo, cuando se conoce o es determinable la altura de la camara, el volumen de la muestra se puede determinar utilizando el area y la altura conocida o determinable de la camara.

El presente (los presentes) procedimiento(s) se puede realizar con una camara de analisis que es operable para albergar en reposo una muestra de fluido biologico (por ejemplo, una muestra de sangre entera anticoagulada sustancialmente sin diluir) para su analisis. La camara esta tipicamente dimensionada para contener entre 0,2 ml y 1,0 ml de muestra, pero el procedimiento no se limita al uso con cualquier volumen de la camara particular y el volumen de la camara puede variar para adaptarse a la aplicacion de analisis. En aquellos casos en los que se lleva a cabo el presente procedimiento en una muestra de sangre entera dispuesta dentro de una camara, la muestra tipicamente esta "sustancialmente sin diluir", lo que significa que la muestra de sangre o bien no ha diluido en absoluto o no se ha diluido intencionadamente, pero se han anadido algunos reactivos a la misma para los propositos del analisis. En la medida en que la adicion de los reactivos diluya la muestra de sangre, en todo caso, dicha dilucion no tiene impacto clmicamente significativo en los analisis realizados. Un ejemplo de un reactivo que puede utilizarse con la muestra de sangre es un anticoagulante (por ejemplo, EDTA, heparina), que normalmente se anade en forma seca y no esta destinado a diluir la muestra. Los anticoagulantes no son necesarios para todos los analisis de sangre, sin embargo. En determinadas circunstancias (por ejemplo, un analisis muy rapido, tal como puede ocurrir cuando la sangre se extrae de una puncion en el dedo del paciente o en el talon de un neonato), puede que no sea necesario anadir el agente anticoagulante. El termino "en reposo" se utiliza aqrn para describir que la muestra se deposita dentro de la camara para su analisis, y no se mueve intencionadamente respecto a la camara durante el analisis. En la medida en que esta presente movimiento dentro de la muestra de sangre, este sera predominantemente debido al movimiento browniano de los componentes formados de la muestra de sangre, movimiento que no imposibilita la utilizacion del dispositivo de esta invencion.

A continuacion, con referencia a las FIGS. 1-3, un ejemplo de una camara de analisis 10 aceptable es una que incluye un primer panel 12 que tiene una superficie interior 14, y un segundo panel 16 que tiene una superficie interior 18. Los paneles 12, 16 son paralelos entre sf, y dentro de esas porciones las superficies interiores 14, 18 estan separadas una de otra por una altura 20, altura que puede ser conocida o medible. Se prefiere una camara de analisis que tiene paneles paralelos 12, 16 por al menos la razon de que la altura uniforme de la camara facilita una determinacion del volumen de muestra. No se requieren paneles de camara paralelos para determinar el area de la muestra, o para determinar el volumen de muestra, sin embargo; por ejemplo, se podna utilizar una camara que tiene un panel dispuesto en un angulo conocido no paralelo en relacion con el otro panel.

La camara 10 mostrada en las FIGS. 1-3 incluye al menos tres separadores 26 dispuestos entre los paneles 12, 16. Los separadores 26 pueden ser de cualquier estructura que se pueda disponer entre los paneles 12, 16, operable para separar entre sf los paneles 12, 16. Las alturas 28 de los separadores 26 normalmente no son exactamente iguales entre sf (por ejemplo, debido a tolerancias de fabricacion), pero estan dentro de la tolerancia aceptable comercialmente para medios de separacion utilizados en aparatos de analisis similares. Cuentas esfericas son un ejemplo de un separador 26 aceptable y estan disponibles comercialmente por parte de, por ejemplo, Bangs Laboratories de Fishers, Indiana, EE.UU.

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En el modo de realizacion mostrado en la FIG. 2, los separadores 26 consisten en un material que tiene una mayor flexibilidad que uno o ambos del primer panel 12 y el segundo panel 16. Como se puede observar en la FIG. 2, los separadores 26 mas grandes son comprimidos hasta el punto en el que la mayona de los separadores 26 estan tocando las superficies interiores de los paneles 12, 16, lo que hace que la altura de la camara sea tan solo ligeramente menor que los diametros promedio del separador 26. En el modo de realizacion mostrado en la FIG. 3, los separadores 26 consisten en un material que tiene menos flexibilidad que uno o ambos del primer panel 12 y el segundo panel 16. En la FIG. 3, el primer panel 12 esta formado de un material mas flexible que los separadores 26 esfericos y el segundo panel 16, y se superpondra a los separadores 26 de una forma de tienda de campana. En este modo de realizacion, aunque pequenas regiones locales de la camara 10 puede desviarse de la altura 20 deseada de la camara, la altura 20 promedio de la camara 10 sera muy similar a la del diametro promedio del separador 26. El analisis indica que la altura 20 promedio de la camara puede ser controlada al uno por ciento (1%) o mejor en alturas de camara de menos de cuatro micras utilizando este modo de realizacion. Sin perjuicio de las caractensticas de flexibilidad descritas anteriormente, los separadores 26 y los paneles 12, 16 se pueden hacer de una variedad de materiales, siempre que los paneles 12, 16 sean suficientemente transparentes. Pelfculas de plastico transparentes que consisten en acnlico o poliestireno son ejemplos de paneles 12, 16 aceptables, y perlas esfericas de poliestireno, policarbonato, silicona, y similares, son separadores 26 aceptables. Haciendo referencia a la FIG. 4, el panel 12 que ha de ser dispuesto verticalmente por encima del otro incluye una pluralidad de orificios 30 dispuestos a intervalos regulares (por ejemplo, al menos algunos de los cuales puede actuar como una salida de aire), y los paneles 12, 16 estan unidos entre sf en puntos. En algunos modos de realizacion, el material de union 32 forma una pared de la camara exterior operable para contener lateralmente la muestra 34 dentro de la camara de analisis 10. En otros modos de realizacion, uno o ambos paneles 12, 16 puede tener una superficie modificada hidrofobamente que funciona como una pared de la camara para contener lateralmente la muestra dentro de la camara de analisis 10. El material de union o la superficie modificada hidrofobamente puede incluir un colorante sensible que se puede utilizar para identificar la ubicacion de la periferia de la camara. Ejemplos de una camara de analisis aceptable se describen en mayor detalle en la publicacion de la solicitud de patente US 2007/0243117, 2007/0087442, y en la patente US 6.723.290. El presente procedimiento no esta, sin embargo, limitado a estos modos de realizacion particulares de camara.

El analisis de la muestra dispuesta en reposo dentro de la camara 10 se realiza utilizando un dispositivo de analisis que es operable para iluminar y obtener imagenes de al menos una parte de la muestra y realizar un analisis de la imagen. La imagen se produce de una manera que permite que uno o ambos de la absorbancia de la luz a traves de, y las emisiones fluorescentes desde, al menos, una porcion de la muestra se determinen por unidad de imagen. El termino "por unidad de imagen" tiene el significado de una unidad incremental de la cual la imagen de la muestra puede ser diseccionada. Un pixel que generalmente se define como el elemento mas pequeno de una imagen que puede ser procesado de forma individual dentro de un sistema de formacion de imagenes particular, es un ejemplo de una unidad de imagen, y una unidad de imagen tambien puede incluir un pequeno numero de pfxeles en una unidad colectiva. El aumento de un dispositivo de formacion de imagenes tambien puede ser descrito en terminos lineales (por ejemplo, micras por pixel en el plano focal), donde la dimension lineal es a lo largo de un eje particular de una cuadncula ortogonal aplicada a la imagen. Por consiguiente, el area real de la muestra capturada por pfxeles del sensor en el plano focal es una funcion del factor de aumento aplicado por el dispositivo de formacion de imagenes. Por lo tanto, el aumento del dispositivo de visualizacion debe ser conocido o determinable. Por consiguiente, el volumen asociado con ese pixel es el area de la imagen por pixel multiplicada por la altura de la camara conocida. Por ejemplo si el aumento fue de 0,5 micras por pixel, una imagen que ocupa 200 pfxeles tendna un area de 50 micras cuadradas y un volumen de 50 micras cuadradas multiplicado por la altura de la camara.

A continuacion con referencia a la FIG. 5, un ejemplo de un dispositivo de analisis 44 que se puede adaptar para su uso con el presente procedimiento incluye un iluminador de muestra 46, un disector de imagen 48, y un analizador programable 50. El iluminador de muestra 46 produce selectivamente luz a lo largo de ciertas longitudes de onda deseadas utilizando ya sea una fuente que emite luz a lo largo de determinadas longitudes de onda deseadas (por ejemplo, LEDs) o que emite luz a lo largo de un rango de longitud de onda amplio. Un iluminador 46 capaz de funcionar para producir luz a aproximadamente 413 nm y aproximadamente 540 nm es particularmente util para el analisis de muestras de sangre debido a la absorcion sustancial de luz que se produce dentro de la hemoglobina en estas longitudes de onda (es decir, un alto coeficiente de extincion molar (e) en longitudes de onda anteriormente mencionadas). La absorcion de la luz es un tipo de "interaccion" entre las longitudes de onda de la luz y la muestra. El iluminador de muestra 46 se puede configurar para producir la luz en un modo de transmitancia, o en un modo de epi-iluminacion, o ambos, con respecto a la camara 10, y el iluminador de muestra 46 es operable para iluminar parte, o la totalidad, de la muestra que reside dentro de la camara 10. En el modo de transmitancia, una parte de fuente de luz del iluminador de muestra 46 se coloca en un lado de la muestra que reside dentro de la camara 10 y se dirige la luz a traves de la muestra en reposo dispuesta entre los paneles de la camara, y despues de ello al disector de imagen 48.

Un ejemplo de un disector de imagen 48 aceptable es un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) que convierte una imagen de la luz que pasa a traves de la muestra en un formato electronico de datos (es decir, una senal). Los sensores de imagen del tipo de semiconductor complementario de oxido metalico (“CMOS") son otro ejemplo de un sensor de imagen que se puede utilizar, y la presente invencion no se limita a cualquiera de estos ejemplos.

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El analizador programable 50 incluye una unidad de procesamiento central (CPU) y esta conectado (al menos electronicamente y/u opticamente) al iluminador de muestra 46 y el disector de imagen 48. La CPU esta adaptada (por ejemplo, programada) para llevar a cabo de forma selectiva las funciones necesarias para llevar a cabo el presente procedimiento. Debe tenerse en cuenta que la funcionalidad de analizador programable puede implementarse utilizando hardware, software, firmware, o una combinacion de los mismos. Una persona experta en la tecnica sena capaz de programar la unidad de procesamiento para llevar a cabo la funcionalidad descrita en el presente documento sin excesiva experimentacion. La patente US 6.866.823 titulada "Aparato para analizar fluidos biologicos" y publicada el 15 de marzo de 2005, describe un dispositivo de analisis de este tipo.

El dispositivo de analisis 44 esta adaptado para: 1) iluminar la muestra dispuesta dentro de la camara de analisis con una o mas longitudes de onda operables para resaltar interfaces entre la muestra y el aire y al menos un componente dentro de la muestra; 2) obtener imagenes de la muestra a lo largo de las longitudes de onda, y producir senales de imagen representativas de la interaccion de las longitudes de onda con la muestra; y 3) determinar al menos una interfaz entre la muestra y el aire, usando las senales de imagen.

En algunos modos de realizacion, el dispositivo de analisis 44 esta adaptado ademas para determinar al menos una region de muestra y al menos una region fuera de la muestra, separadas una de otra por una o mas interfaces aire- muestra. Cada region de muestra contiene al menos un componente de la muestra. Cada region fuera de la muestra no contiene un componente de la muestra. La relacion espacial que implica regiones de muestra, regiones fuera de la muestra, e interfaces aire-muestra puede ser descrita de tal manera que una region de muestra esta dispuesta en un primer lado de una interfaz aire-muestra y una region fuera de la muestra se dispone en un segundo lado de la misma interfaz aire-muestra, en la que los lados primero y segundo son "opuestos" uno al otro. Tambien hay que senalar que las geometnas de las zonas de muestra y zonas de fuera de la muestra pueden variar ampliamente y rara vez se limitan a una sola lmea de demarcacion; por ejemplo, las muestras a menudo contienen burbujas de aire, etc. En consecuencia, las regiones de muestra y las regiones fuera de la muestra tambien pueden ser descritas como complementandose entre sf dentro de la camara de analisis. Como se indico anteriormente, los componentes dentro de una muestra de sangre incluyen, pero no estan limitados a, globulos rojos (eritrocitos), globulos blancos (leucocitos) y plaquetas. Si un colorante sensible se mezcla con plasma, tinte que hace que la presencia de plasma sea facilmente discernible, entonces el plasma puede tambien ser considerado como un componente de una muestra de sangre. En estos modos de realizacion, el dispositivo de analisis 44 esta adaptado ademas para determinar un area de la camara que contiene la muestra, utilizando al menos una de una region de muestra y una region fuera de la muestra.

En otros modos de realizacion, el dispositivo de analisis esta adaptado para: 1) localizar componentes dentro de la muestra, y proporcionar un enmascaramiento digital que enmascare una de las regiones de muestra o de fuera de la muestra; y 2) determinar un area de la camara que contiene la muestra, utilizando el area enmascarada. El termino enmascaramiento digital tal como se utiliza aqrn se refiere a un proceso de obtencion de imagenes binario en el que a todas las unidades de imagen (por ejemplo, pfxeles) en un area identificada (por ejemplo, una region de muestra) se les asigna un valor particular para distinguir aquellas unidades de imagen de las unidades de imagen que contiene los valores de la imagen representativos de la muestra iluminada de la que obtiene la imagen. Las unidades de imagen enmascaradas, que son facilmente distinguibles, pueden ser procesadas a continuacion; por ejemplo, sumadas para determinar un area.

En otros modos de realizacion, la presente invencion incluye un colorante depositado sobre al menos una superficie interior de la camara. El colorante (por ejemplo, un colorante fluorescente tal como naranja de acridina) mezclado con la muestra se puede detectar usando iluminacion, y se puede utilizar para determinar las interfaces aire-muestra. En aquellos casos en donde se utiliza un colorante fluorescente, la senal sensible es una emision fluorescente a una longitud de onda particular, creada por una fuente de luz de excitacion del colorante fluorescente a otra longitud de onda. La creacion de la emision fluorescente puede ser descrita como un resultado de la "interaccion" de la luz utilizada para iluminar la muestra.

Los siguientes ejemplos del presente procedimiento se describen en el contexto del presente procedimiento aplicado a una muestra de sangre entera anticoagulada colocada entre los dos paneles transparentes de una camara, paneles que estan separados por una altura uniforme. Estos ejemplos se proporcionan para ilustrar la utilidad del presente procedimiento, y el presente procedimiento no se debe interpretar como limitado a los mismos y, en particular, debe interpretarse como limitado a la determinacion del area de una muestra de sangre entera.

En un modo de realizacion del procedimiento, la muestra se ilumina y se obtiene la imagen usando una pluralidad de longitudes de onda de luz. Una o mas de las longitudes de onda elegidas resaltara uno o mas componentes diana dentro de la imagen de la muestra. Para sangre entera, puede ser usada una longitud de onda que es o bien alrededor de 415 nm o alrededor de 540 nm para resaltar eficazmente los eritrocitos porque la luz en estas longitudes de onda es bien absorbida por la hemoglobina contenida en los globulos rojos. Los eritrocitos "resaltados" pueden identificarse utilizando un valor umbral de densidad optica que es indicativo de la absorcion de luz asociada con la hemoglobina. Unidades de imagen que cumplen o superan el valor predeterminado de densidad optica (o menor que el umbral si se utilizan tecnicas de exclusion) se identifican como alineadas con un eritrocito.

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Como alternativa a la utilizacion de absorcion de luz por la hemoglobina, ciertos globulos rojos y otros componentes (por ejemplo, leucocitos y plaquetas) se pueden resaltar con un colorante fluorescente (por ejemplo, naranja de acridina) u otro colorante sensible mezclado con la muestra. Una ventaja de utilizar eritrocitos como un componente "diana" dentro de una muestra de sangre es que en terminos relativos, los eritrocitos son los componentes mas abundantes dentro de la muestra de sangre y, en consecuencia mas probable que se encuentre en cualquier region particular que contiene la muestra. La FIG. 6 es una imagen de una muestra de sangre 52 dispuesta dentro de una camara, en la que los eritrocitos 22 se han resaltado. La imagen incluye un par de partfculas separadoras 26, un eritrocito 22, y una pluralidad de bolsas de aire 54.

En este modo de realizacion, la muestra 52 tambien se ilumina con una o mas longitudes de onda elegidas para resaltar la interfaz 56 entre la muestra 52 y el aire. Cuando la muestra 52 se ilumina con esta longitud de onda, los contenidos de la muestra 52 son tfpicamente relativamente incoloros pero la interfaz entre la muestra y el aire este claramente indicada por la refraccion de la luz en la longitud de onda que se produce en la interfaz aire-muestra 56. Una amplia variedad de longitudes de onda se puede utilizar para identificar la interfaz aire-muestra. Cuando el fluido biologico que se analiza es sangre entera, una longitud de onda igual o superior a 600 nm, y mas preferiblemente de aproximadamente 700 nm, funciona bien para resaltar las interfaces aire-muestra. La FIG. 7 es la imagen de la muestra de sangre mostrada en la FIG. 6, con las interfaces aire-muestra 56 ahora resaltadas.

Como se indico anteriormente, una amplia variedad de longitudes de onda se puede utilizar para identificar la interfaz aire-muestra 56. En algunos casos, las longitudes de onda utilizadas para resaltar las interfaces 56 tambien se pueden utilizar para resaltar los componentes diana (por ejemplo, eritrocitos 22) dentro de la muestra 52. Como resultado, se pueden obtener imagenes de la muestra 52 con luz a una sola longitud de onda, obviando asf la necesidad de proporcionar luz a dos longitudes de onda diferentes.

Muestras de fluidos biologicos dispuestas dentro de una camara de analisis rara vez tienen interfaces aire-muestra 56 perfectamente rectas o curvas. Es mucho mas tfpico que una muestra 52 tenga una interfaz aire-muestra con una geometna irregular, no uniforme. Una variedad de tecnicas se pueden utilizar para localizar las interfaces aire- muestra dentro de las camaras, y la presente invencion no se limita a ninguna tecnica particular. Por ejemplo, una tecnica de segmentacion se puede utilizar para identificar las unidades de imagen (por ejemplo, pixel) dentro de la imagen que tienen una o mas caractensticas particulares (por ejemplo, una unidad de imagen que tiene una intensidad de luz de x%); es decir, utilizar las caractensticas como elementos identificadores. Los pfxeles que tienen esas caractensticas predeterminadas que son indicativas de una interfaz aire-muestra 56 se identifican y se asignan con relacion a la camara de muestra, identificando de este modo su posicion dentro de la imagen. Los pfxeles que tienen caractensticas que son indicativas de un componente diana (por ejemplo, eritrocito 22) tambien se identifican y localizan.

Las posiciones relativas de la una o mas interfaces aire-muestra 56 y los componentes diana (por ejemplo, eritrocitos 22) definen donde se encuentra la muestra 52 y donde no. Una vez que los lfmites de la(s) region(es) de la muestra 58 y la(s) region(es) fuera de la muestra 60 estan definidas, el area de cada region 58, 60 se puede determinar sumando el area asociada con cada unidad de imagen situada dentro de esa region 58, 50 en particular. Si se suman las areas de la unidad de imagen dentro de la(s) region(es) de la muestra 58, entonces el area total de las regiones de muestra 58 representa el area total de la muestra 52 dispuesta dentro de la camara. Debe apreciarse que en las FIGS. 6-8, la muestra se ve ocupando una sola region de muestra 58. En muchos casos, las muestras de fluido pueden asumir una pluralidad de regiones de muestra 58 independientes dentro de una camara particular.

En otra realizacion, una vez que las interfaces aire-muestra 56 y los componentes diana se localizan, la zona se puede determinar utilizando una tecnica de enmascaramiento binario digital que enmascara iterativamente de modo digital unidades de imagen dentro de las regiones de muestra. En un ejemplo de un procedimiento de enmascaramiento binaria digital, unidades de imagen contiguas con un componente se enmascaran en un procedimiento iterativo, en direcciones que se extienden hacia fuera del componente hasta que se encuentra una unidad de imagen ya enmascarada, o un lfmite de la camara. Ademas, las unidades de imagen contiguas con una interfaz aire-muestra 56, en el lado del componente de la interfaz tambien se enmascaran en un procedimiento iterativo, en una direccion que se extiende hacia fuera de la interfaz 56 hasta que se encuentra una unidad de imagen ya enmascarada, o un lfmite de la camara. El proceso continua iterativamente hasta que la totalidad o sustancialmente la totalidad de las unidades de imagen dentro de esa region respectiva de la muestra estan enmascaradas. La FIG. 8 ilustra una version enmascarada de la muestra de sangre mostrada en las FIGS. 6 y 7.

La presente invencion no se limita al ejemplo anteriormente descrito de una mascara de procedimiento de enmascaramiento binario digital. El procedimiento de enmascaramiento puede enmascarar alternativamente las regiones utilizando operaciones de procesamiento de imagenes, tales como algoritmos de localizacion de borde y similares.

El area de la region de muestra se puede determinar posteriormente sumando el area asociada con cada unidad de imagen enmascarada para llegar al area total de la region de muestra particular. El area total de las regiones de muestra representa el area total de la muestra dispuesta dentro de la camara. El area de las regiones de muestra tambien se puede determinar usando un procedimiento de contraste si el area total de la camara representada por

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imagen es conocida o determinable. En tales casos, el area de las regiones fuera de la muestra puede ser enmascarada y determinada y luego restada del area de imagen total para llegar al area de la region de muestra. El area total representada por imagen se puede determinar sumando el area por unidad de imagen de toda la imagen. Si el area total representada por imagen se forma simetricamente, el area de una porcion del area total representada por imagen puede ser determinada y se puede aplicar posteriormente el multiplicador apropiado para llegar al area total representada por imagen.

En algunos modos de realizacion, la identificacion de las interfaces aire-muestra se puede facilitar mediante la aplicacion de una capa seca de colorante sensible dentro de la camara. Una muestra que entra y viaja dentro de la camara capta una cantidad desproporcionada del colorante sensible (es decir, el naranja de acridina) en la interfaz aire-muestra. La concentracion de colorante sensible en la interfaz aire-muestra pone de manifiesto la interfaz y hace que sea mas facil de identificar.

Como se indico anteriormente, algunas camaras de analisis incluyen el separador de partfculas 26 para mantener una altura 20 uniforme de la camara. Tales partfculas se pueden formar con caractensticas (por ejemplo, tenido) que las hacen discernibles facilmente dentro de la imagen de la muestra. En el caso de que tales partfculas esten dispuestas dentro de una region de muestra, el area de cada una puede tenerse en cuenta en el calculo del area de la region de muestra (por ejemplo, en la region de enmascarado mostrada en la FIG. 8, el area asociada con las partfculas de separacion 26 no esta incluida en el area enmascarada de la muestra). El volumen de las partfculas 26 dentro de un area enmascarada tambien puede tenerse en cuenta dado el volumen conocido de los separadores.

En un modo de realizacion alternativo, se puede utilizar una camara que tiene una parte delimitada por una o mas barreras que forman un area conocida dispuesta entre ellas. Las barreras estan separadas por una distancia, y se posicionan dentro de la camara, para aumentar la probabilidad de que el area conocida se llene con la muestra.

Aunque la invencion se ha mostrado y descrito con referencia a modos de realizacion espedficos de la misma, debe entenderse por los expertos en la tecnica que pueden hacerse diversos cambios de forma y detalle sin apartarse del alcance de la invencion.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para determinar el area de una camara de analisis (10) cubierta por una muestra de fluido biologico (52) que reside en reposo dentro de la camara (10), cuya camara (10) tiene un primer panel (12) con una superficie interior (14), y un segundo panel (16) con una superficie interior (18), ambos de cuyos paneles (12, 16) son transparentes, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

iluminar la muestra (52) que reside dentro de la camara de analisis (10) con una o mas longitudes de onda operables para resaltar las interfaces (56) entre la muestra (52) y el aire, y para resaltar al menos un componente dentro de la muestra (52); obtener imagenes de la muestra (52) a lo largo de la una o mas longitudes de onda, y producir senales de imagen representativas de la interaccion de la una o mas longitudes de onda con la muestra (52); caracterizado por que dicho procedimiento comprende ademas:

determinar una ubicacion de al menos una interfaz aire-muestra (56) entre la muestra (52) y el aire, usando las senales de imagen; determinar una ubicacion de uno o mas componentes (22) dentro de la muestra (52) con relacion a la al menos una interfaz aire-muestra (56) usando las senales de imagen;

determinar una o mas regiones de muestra (58) que contienen al menos un componente (22) y dispuestas en un primer lado de la al menos una interfaz aire-muestra (56), y una o mas regiones fuera de la muestra (60) que no contienen un componente y dispuestas en un segundo lado de la al menos una interfaz aire- muestra (56), en el que la ubicacion del uno o mas componentes (22) con relacion a la al menos una interfaz aire-muestra (56) se utiliza para determinar la una o mas regiones de muestra (58) y/o la una o mas regiones fuera de la muestra (60); y

determinar un area de la camara (10) que contiene la muestra (52), en el que la etapa de determinar un area de la camara (10) comprende sumar un area asociada con cada unidad de imagen situada dentro de la region de muestra (58) o de la region fuera de la muestra (60).
2. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de enmascarar o bien la region de muestra (58) que contiene el uno o mas componentes (22) en el primer lado de la interfaz aire-muestra (56), o la region fuera de la muestra (60) en el segundo lado de la interfaz aire-muestra (56), segundo lado que es el opuesto al primer lado.
3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el area de la camara (10) que contiene la muestra (52) se determina mediante la suma de un area por unidad de imagen en al menos una de las regiones enmascaradas o no enmascaradas.
4. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que el area de la camara (10) que contiene la muestra (52) se determina mediante la suma del area de las unidades de imagen en la region fuera de la muestra y restandolas de un area de camara conocida.
5. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que la etapa de enmascarar comprende:

a) enmascarar iterativamente unidades de imagen que se extienden hacia fuera desde unidades de imagen alineadas con un componente (22), hasta que se encuentren una o mas de las unidades de imagen enmascaradas, interfaz aire-muestra (56), y una barrera lateral de la camara; y/o

b) enmascarar iterativamente unidades de imagen que se extienden hacia fuera desde unidades de imagen alineadas con la al menos una interfaz aire-muestra (56), hasta que se encuentren otras unidades de imagen enmascaradas o una barrera lateral la de camara.
6. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de enmascarar o bien la una o mas regiones de muestra (58) o la una o mas regiones fuera de la muestra (60).
7. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que el area de la camara (10) que contiene la muestra (52) se determina:

a) sumando el area de las unidades de imagen en cada una de la una o mas regiones de muestra (58); y/o

b) sumando el area de las unidades de imagen en cada una de la una o mas regiones fuera de la muestra (60) y restandolas de un area de camara conocida.
8. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que el enmascaramiento incluye un enmascaramiento digital binario de unidades de imagen dentro de la una o mas regiones de muestra (58) o regiones fuera de la muestra (60).
9. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que los componentes (22) son al menos uno de globulos rojos, globulos blancos y plaquetas.
10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que la etapa de iluminar la muestra (52) que reside dentro de la camara de analisis (10) incluye iluminar la muestra (52) con una primera longitud de onda y una segunda longitud de onda, segunda longitud de onda que es diferente de la primera longitud de onda.

5 11. El procedimiento de la reivindicacion 10, en el que la iluminacion de la muestra (52) utilizando las primeras

longitudes de onda hace que las interfaces entre la muestra (52) y el aire sean resaltadas en la imagen.
12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la segunda longitud de onda es una longitud de onda absorbida por la hemoglobina.

10
13. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la camara (10) incluye barreras laterales, barreras que incluyen un colorante sensible.
14. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de determinar un volumen de la 15 muestra (52) dispuesto dentro de la camara (10) usando el area determinada de la camara (10) que contiene la

muestra (52), y una altura de camara conocida o determinable.