JP3941668B2

JP3941668B2 - 細胞の観察方法

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Publication number: JP3941668B2
Application number: JP2002326477A
Authority: JP
Inventors: 浩文松崎
Original assignee: Panasonic Corp; Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp; Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2002-11-11
Filing date: 2002-11-11
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2022-11-11
Also published as: JP2004163499A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロプレートなどの容器に収容された細胞を顕微観察装置によって撮像して細胞画像を取得する細胞の観察方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生化学分野等の実験においては、マイクロプレートなどの容器中で培養された動植物細胞を顕微観察装置によって撮像し、細胞画像を取得することが行われる。この顕微観察装置による観察においては、観察対象の細胞に観察装置の焦点位置を自動的に合わせる合焦機能を備えたものを用いる場合が多い（例えば特許文献１参照）。これにより、多数の細胞試料を対象として観察を反復して実行する場合にも、目視により焦点合わせを行う必要がなく、効率的な観察作業が行える。
【０００３】
【特許文献１】
特開昭６１−１６４１５９号公報
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
観察対象となる細胞の各部分は、必ずしも同一平面内に位置しているとは限らず、撮像方向に厚みを持った層状に分布している場合がある。例えば、マイクロタイタープレートのウェル内で培養された試料を撮像する場合において、細胞本体はウェル底面近傍に分布し、取得された細胞画像において観察対象となる菌糸は細胞本体の分布面から幾分上方の位置に分布している場合が多い。
【０００５】
ところが、このような試料を対象として上述の合焦機能を用いて焦点合わせを行うと、本来の観察対象である菌糸から焦点位置が外れて、細胞と菌糸の中間位置に焦点が合わされる場合がある。この結果、本来の観察目的に叶った細胞画像が取得されず、観察精度が確保されないという問題点があった。
【０００６】
そこで本発明は、細胞画像において観察対象となる部分に正確に焦点を合わせることができる細胞の観察方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載の細胞の観察方法は、容器に収容された細胞を顕微撮像装置によって撮像して観察対象物を含む細胞画像を取得する細胞の観察方法であって、前記顕微観察装置の焦点を前記容器に収容された細胞が撮像可能な位置に合わせ、この状態で前記細胞を撮像して観察対象物である菌糸を含む細胞画像を取り込む第１の画像取込工程と、前記細胞画像において観察対象から除外する除外範囲である前記菌糸が含まれない範囲と観察対象に含める対象範囲である前記菌糸を含む範囲とを切り分けるためのマスク情報を、前記細胞画像をウエーブレット変換を用いて周波数変換することにより前記菌糸が存在する範囲を特定して生成するマスク情報生成工程と、前記細胞に対する前記焦点の位置を前記顕微観察装置の光軸方向に相対的に移動させて位置を変更し、この状態で前記細胞を再度撮像して細胞画像を取り込む第２の画像取込工程と、前記マスク情報に基づいて前記第２の画像取込工程で取り込んだ細胞画像の対象範囲を対象として合焦度を示す数値を出力し、この合焦度を示す数値がしきい値を超えているか否かを判定する合焦度判定工程とを有し、前記合焦度判定工程で合焦度を示す数値が前記しきい値を超えるまで前記第２の画像取込工程と前記合焦度判定工程を繰り返す細胞の観察方法であって、前記第２の画像取込工程で得られた細胞画像であって前記合焦度が前記しきい値を超えたときに取り込まれた細胞画像に対して、分析のための画像処理を行う。
【００１１】
本発明によれば、細胞画像において観察対象から除外する除外範囲と観察対象に含める対象範囲とを切り分けるためのマスク情報を細胞画像に基づいて生成し、このマスク情報によって切り分けられた対象範囲を対象として得られた合焦度に基づいて観察時の焦点位置を求めることにより、細胞画像において観察対象となる部分に正確に焦点を合わせることができる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（参考例）
図１は本発明の参考例の顕微観察装置の断面図、図２は本発明の参考例の顕微観察装置の観察対象の説明図、図３は本発明の参考例の顕微観察装置の処理機構を示す機能ブロック図、図４は本発明の参考例の細胞の観察方法におけるマスク情報生成処理の説明図、図５は本発明の参考例の細胞の観察方法における画像取込処理のフロー図、図６、図７は本発明の参考例の細胞の観察方法におけるフォーカスサーチの説明図、図８は本発明の参考例の顕微観察装置の表示画面を示す図である。
【００１３】
まず図１を参照して、顕微観察装置の構造を説明する。この顕微観察装置は、創薬スクリーニングにおいて試薬投与後の細胞の形態変化などの観察を目的として、容器に収容された細胞を対象とした顕微観察や顕微画像の撮影に用いられる。図１において、顕微観察装置１は基部１ａ上にフレーム１ｂを立設した構造となっており、フレーム１ｂの中間高さ位置には、観察対象の細胞を収容した容器であるマイクロタイタープレート４が載置される試料載置テーブル２が設けられている。
【００１４】
試料載置テーブル２の下方には、垂直な光軸ａを有する顕微光学系５が配置されており、光軸ａは基部１ａ内の下方に配置されたミラー６を介して、撮像手段であるカメラ７に水平方向から入射する配置となっている。カメラ７の撮像動作は、制御部９によって制御される。フレーム１ｂには照明部８が配設されており、照明部８によってウェル４ａ内の細胞を照明した状態で、カメラ７によって撮像することにより、観察対象の細胞の画像を取得することができる。取得された画像は制御部９に送られ、後述するように取得画像の合焦度を算出する演算や最適焦点位置を算出する演算などを含むフォーカス判定処理が行われる。
【００１５】
試料載置テーブル２は、ＸＹＺテーブル３によって水平方向および垂直方向に位置調整可能となっている。カメラ７による撮像において、制御部９によってＸＹＺテーブル３を制御して試料載置テーブル２の水平位置を調整することにより、任意のウェル４ａをカメラ７の撮像範囲に位置させることができる。また試料載置テーブル２のＺ方向位置を調整することにより、顕微光学系５の焦点位置に対してマイクロタイタープレート４を相対的に移動させることができる。ＸＹＺテーブル３のＺ軸移動機構は、顕微観察装置の焦点をマイクロタイタープレート４に収容された観察対象に対して相対的に移動させるフォーカス機構となっている。
【００１６】
そして前述のフォーカス判定処理結果に基づいて、制御部９がフォーカス機構を制御することにより、カメラ７の焦点をウェル４ａ内の観察対象に自動的に合わせるオートフォーカス動作が可能になっている。表示部１０は表示モニタであり、カメラ７によって撮像された画像のほか、制御部９によって行われる各種制御処理の操作画面を表示する。操作・入力部１１はキーボードやマウスなどの入力手段であり、操作コマンドやデータの入力を行う。
【００１７】
次に図２を参照して、マイクロタイタープレート４のウェル４ａ内における観察対象の状態について説明する。図２はマイクロタイタープレート４のウェル４ａの断面を示している。ウェル４ａには培地１２が注入されており、観察対象の細胞は培地１２内で培養される。この培養においては、細胞本体１３はウェル４ａの底面に密着した状態で繁殖し、細胞から派生する菌糸１４は培地１２内で細胞本体１３から分離して幾分上層の位置に存在する。
【００１８】
このような細胞を観察対象とする場合において、顕微観察装置１のオートフォーカス機能をそのまま用いて焦点合わせを行うと、観察視野全体のフォーカス係数が最も高くなる位置、すなわち細胞本体１３と菌糸１４の中間位置にカメラ７の焦点が合わされる。この結果、本来の観察対象が細胞本体１３もしくは菌糸１４のいずれかのみである場合には、いずれにも焦点が完全には合わず、良好な観察画像が得られない。参考例に示す顕微観察装置では、このような不具合を解決するため、以下に説明する構成および方法によって焦点合わせを行うようにしている。
【００１９】
次に図３を参照して制御部９の処理機能について説明する。図３において、破線枠内は制御部９によって行われる処理機能を示している。画像入力Ｉ／Ｆ２０は画像データを取り込むためのインターフェースであり、カメラ７によって撮像したデータをデータ変換する。データ変換された画像データは画像記憶部２１に記憶される。そして記憶された画像は画像処理部２５によって読み出され、ここで細胞画像中の菌糸の定量化などの分析を目的とした画像処理が実行される。
【００２０】
マスク情報生成部２２は、取得された細胞画像において観察対象から除外する除外範囲と、観察対象に含める対象範囲とを切り分けるためのマスク情報を、細胞画像に基づいて生成する処理を行う。このマスク情報生成処理は、後述するように、自動モードによるマスク設定と手動操作モードによるマスク設定とを選択して実行できるようになっている。自動モードによるマスク設定では、画像記憶部２１に記憶された画像をウェーブレット変換することによって抽出された観察対象の画像とその周辺部を囲む範囲を自動的に切り出してマスクを設定する。手動操作モードによるマスク設定では、表示部１０に表示された画像を観察者が目視観察し、画像中の観察対象に該当する映像を視認することにより適切と思われる範囲をマスクとして設定する。
【００２１】
生成されたマスク情報は画像処理部２５およびフォーカス判定部２３に送られる。画像処理部２５が前述の分析のための画像処理を実行する際には、このマスク情報によって特定された範囲のみが処理対象となる。フォーカス判定部２３は、画像記憶部２１から読み出された画像に対して、マスク情報生成部２２によって生成されたマスク情報を適用することによって切り分けられた範囲、すなわち画像中において観察対象物を含む範囲のみを対象として、カメラ７の焦点が最も観察対象物に良く合致するフォーカス位置を求めるフォーカス判定処理を行う。
【００２２】
判定結果はフォーカス制御部２４に送られ、フォーカス制御部２４は、フォーカス判定部２３のフォーカス判定結果に基づいてフォーカス機構３ａを制御する。これにより、ＸＹＺテーブル３は試料載置テーブル２上のマイクロタイタープレート４に収容された細胞のＺ方向の位置を、カメラ７の焦点位置に合わせるように移動する。
【００２３】
カメラ７で撮像された原画像や、画像処理部２５によって画像処理された処理画像は、表示処理２６によって必要なデータ処理が行われた後、表示部１０のモニタに表示される。入力処理部２７は、操作・入力部１１から入力されたコマンドやデータをフォーカス判定部２３や画像処理部２５に対して入力するためのデータ処理を行う。これにより後述する手動操作モードにおいて、表示部１０に表示された操作画面上で行った指示入力に従って、フォーカス判定部２３や画像処理部２５による処理を実行させることが可能となっている。
【００２４】
次に図４を参照して、上述のマスク情報生成を自動的に行う自動マスク設定処理について説明する。図４（ａ）に示す画面３０は、図２に示す観察試料をカメラ７によって撮像した原画像を示している。画面３０中には、ウェル４ａ内の細胞本体１３や菌糸１４を撮像した映像１３ａ，１４ａが表示される。図４（ａ）においては、映像１３ａ，１４ａは明瞭に識別可能に描かれているが、実際の撮像状態をそのまま表示した画面上では、背景の映像１３ａ中に存在する菌子の映像１４ａを識別するのは困難な場合が多い。このため、ここでは撮像によって得られた原画像をウェーブレット変換を用いて周波数変換することにより、菌子１４が存在する範囲、すなわち観察対象物が存在する範囲を特定するようにしている。
【００２５】
図４（ｂ）に示す画面３１は、原画像をウェーブレット変換して得られた周波数成分のうち、直流成分による圧縮画像を示している。この圧縮画像では、細い糸状の菌子１４の集合が、明瞭に識別可能なかたまり状の映像１４ｂとして表示され、これらの映像１４ｂの形状・位置から、図４（ｃ）に示すように原画像中における映像１４ｂの形状・位置を示す画像３２が生成される。そして画像３２において、映像１４ｂを所定のマージン幅で囲む整形された輪郭線３３を生成することにより、観察対象に含める範囲を除外範囲から切り分けるためのマスク情報が自動的に生成される。
【００２６】
次に細胞の観察方法について、図５のフローに即して図６，図７を参照しながら説明する。ここでは、マイクロタイタープレート４に収容された細胞を、図１に示す顕微撮像装置によって撮像して、観察対象物である菌子１４を含む細胞画像を取得する。図５において、まずマスク情報生成のための画像取込が行われる（ＳＴ１）。すなわち顕微観察装置１のカメラ７の焦点を、マイクロタイタープレート４のウェル４ａに収容された細胞が撮像可能な位置に合わせ、この状態で細胞を撮像して細胞画像を取り込む（第１の画像取込工程）。
【００２７】
次に取り込まれた画像を対象として、図４に示すマスク情報生成処理が実行される（ＳＴ２）。すなわち、細胞画像において観察対象から除外する除外範囲（菌糸１４が含まれない範囲）と、観察対象に含める対象範囲（菌糸１４を含む範囲）とを切り分けるためのマスク情報を、細胞画像に基づいて生成する（マスク情報生成工程）。これにより、図４（ｃ）に示すように、原画像中において菌子１４の映像１４ｂが存在する範囲を除いた範囲をマスキングして除外するためのマスク情報が生成される。そして以下に説明するフォーカスサーチにおいては、このマスク情報によって切り出され特定される範囲のみがフォーカス係数取得の対象となる。
【００２８】
次いで、フォーカス判定部２３によるフォーカスサーチが開始される。まずカメラ７のフォーカス位置（焦点位置）Ｆを、図６に示すフォーカスサーチ開始位置Ｐｓへ相対移動する（ＳＴ３）。この相対移動は、ＸＹＺテーブル３のフォーカス機構３ａによって試料載置テーブル２をＺ方向（光軸ａ方向）へ移動させることにより行われる。そしてカメラ７によってウェル４ａを撮像して画像を取り込み（第２の画像取込工程）、取り込まれた画像を対象としてフォーカス係数を取得する（ＳＴ４）。このとき、マスク情報によって切り出された範囲、すなわち観察対象の菌子１４が存在する対象範囲のみがフォーカス係数算出処理の対象となる。
【００２９】
この後、フォーカス位置が図６に示すフォーカスサーチ終了位置Ｐｅにあるか否かを判断し、未だフォーカスサーチ終了位置Ｐｅに到達していなければ、フォーカス位置を予め設定された移動ピッチＰだけサーチ方向に移動し（ＳＴ６）、その後（ＳＴ４）以降の処理を反復する。すなわち、（ＳＴ４）〜（ＳＴ６）は、細胞に対する焦点の位置を顕微観察装置１の光軸ａ方向に相対的に移動させて位置を変更し、この状態で細胞を再度撮像して細胞画像を取り込む第２の画像取込工程と、マスク情報に基づいて第２の画像取込工程で取り込んだ細胞画像の対象範囲を対象として合焦度を示す数値を出力する合焦度確認工程に相当する。
【００３０】
そして（ＳＴ５）にてフォーカスサーチ終了位置Ｐｅに到達したと判断されたならば、図７に示すように、上述のフォーカスサーチにて取得された複数のフォーカス係数ｆ（ｉ）から、最も高いフォーカス係数ｆＭを与えるフォーカス位置を求め、この位置を菌糸１４を観察するための最適な焦点の位置（最終フォーカス位置）として算出する（ＳＴ７）。すなわち、第２の画像取込工程と合焦度確認工程を複数回行うことによって、焦点の位置を異にする複数の合焦度を示す数値を入手し、これらの数値に基づいて最適な焦点の位置を求める（最適焦点位置算出工程）。
【００３１】
そして再度ＸＹＺテーブル３によってマイクロタイタープレート４を移動させてフォーカス位置を最終フォーカス位置へ移動させ（ＳＴ８）、カメラ７によって観察目的のための画像取込を行う（ＳＴ９）。すなわち、最適な焦点の位置に顕微観察装置１のカメラ７の焦点を合わせ、この状態で細胞を撮像して細胞画像を取り込む（第３の画像取込工程）。そしてここで得られた細胞画像は画像記憶部２１に記憶され、さらに画像処理部２６によって読み出されて、菌糸１４の定量化処理などの所定の分析のための画像処理が行われる。
【００３２】
この菌糸１４の分析を観察目的とした細胞の観察において、細胞本体１３と菌子１４のように培養状態において撮像方向に厚みを持った状態で分布している場合においても、細胞本体１３はマスク情報によって合焦処理の対象から除外されるため、本来の観察対象である菌糸１４に正しく焦点を合わせることができ、観察目的に叶った良好な合焦度が得られる。そしてフォーカス動作において、予め想定された範囲（フォーカスサーチ開始位置Ｐｓ〜終了位置Ｐｅ）の全域で合焦度を確認した結果から、最適焦点位置を求めるようにしていることから、良質の画像を入手することができる。
【００３３】
なお上記処理フローの例では、（ＳＴ２）のマスク情報生成処理を含めて全ての処理を自動モードで行う例を示しているが、次に説明するように、マスク手動設定を含めて全ての処理動作を手動操作によって行ってもよい。図８に示す画面３４は、手動操作画面を示しており、画面３４には、図４（ａ）に示す原画像を表示する画面３０とともに自動モードと手動操作モードを切り換えるモード切換スイッチ４０および手動操作モード時の操作スイッチを囲むスイッチ枠３５が表示されている。
【００３４】
モード切換スイッチ４０を操作して手動操作モードに切り換えることにより、スイッチ枠３５内の各操作スイッチが操作可能となる。画像取入スイッチ３６を操作することにより、図５の（ＳＴ１）に示す操作、すなわちカメラ７による撮像および画像記憶部２１への記憶を手動モードで行うことができる。マスク情報設定スイッチ３７を操作すると、以下に説明する手動操作によるマスク情報生成が可能となる。またフォーカススイッチ３８を操作することにより、図５の（ＳＴ３）〜（ＳＴ９）に示す処理が、手動モードによって設定されたマスク情報を用いて実行される。
【００３５】
そしてスイッチ３９は、手動モードによるマスク情報生成時のマスク形状選択スイッチである。ここでは２種類の形状要素（円・楕円および矩形）と、マスキング範囲（マスク形状として設定された図形の内側・外側のどちらをマスキングの対象とするか）の指定の組み合わせによって、４種類のマスク形状選択スイッチ３９ａ，３９ｂ，３９ｃ，３９ｄを選択できるようになっている。
【００３６】
手動モードによるマスク情報設定には、まずマスク情報設定スイッチ３７を操作する。そして図８（ｂ）に示すように画面３０に表示された原画像において、観察対象である菌子１４に相当すると思われる映像１４ａが識別されたならば、映像１４ａの周囲にマスクを設定する。すなわちマスク形状選択スイッチ３９を操作して、映像１４ａに対して適当と思われる形状要素を選択し、ポインタ４１の操作によって、マスクとして設定された図形の位置やサイズを、映像１４ａ似合わせて調整する。
【００３７】
図８（ｂ）の例では、縦長形状の映像１４ａに対し、マスク形状選択スイッチ３９ｃが選択され、映像１４ａに応じたサイズの楕円形の輪郭線４２が設定された状態を示している。すなわちマスク形状として円・楕円要素の形状が選定されており、内側を観察対象を含んだ有効範囲とし、外側を観察対象から除外された範囲としてマスクするパターンのマスクが設定されている。
【００３８】
（実施の形態）
図９は本発明の実施の形態の細胞の観察方法における画像取込処理のフロー図、図１０は本発明の実施の形態の細胞の観察方法におけるフォーカスサーチの説明図である。本実施の形態は、参考例と同様の観察対象を撮像する画像取込処理において、参考例と異なる方法でフォーカスサーチを実行するものである。
【００３９】
図９において、（ＳＴ１１）〜（ＳＴ１４）は、図５に示す（ＳＴ１）〜（ＳＴ４）と同内容の処理を示している。（ＳＴ１４）にて、第２の画像取込工程のの各フォーカス位置におけるフォーカス係数が取得されたならば、これらのフォーカス係数ｆ（ｉ）は条件範囲か否かを判定する（ＳＴ１５）。すなわち合焦度を示す数値が所定の範囲内にあるか否かが判定され（合焦度判定工程）、ここでは図１０のグラフに示すように、フォーカス係数ｆ（ｉ）が、良好な合焦度が確保されるしきい値としてのフォーカス値ｆｔｈを超えているか否かが判定される。
【００４０】
そしてここで、範囲内でないと判定されたならば、フォーカス位置が図６に示すフォーカスサーチ終了位置Ｐｅであるか否かを判断し（ＳＴ１６）、未だフォーカスサーチ終了位置Ｐｅに到達していなければ、フォーカス位置を予め設定された移動ピッチＰだけ移動する（ＳＴ１７）。そして（ＳＴ１４）以降の処理が反復され、（ＳＴ１５）にてフォーカス係数ｆ（ｉ）が条件範囲内である判定されるまで同様の処理を繰り返し行う。すなわち、合焦度判定工程で合焦度を示す数値が所定の範囲内になるまで第２の画像取込工程と合焦度判定工程を繰り返す。
【００４１】
そして（ＳＴ１５）にて、フォーカス係数ｆ（ｉ）は条件範囲内と判断されたならば、当該フォーカス位置にて撮像された画像は、良好な合焦度が保証されていることを示しており、フォーカスサーチ動作はこの段階で停止される。そしてこの撮像で得られた画像がそのまま画像記憶部２１に記憶され、さらに画像処理部２６によって読み出されて、菌糸１４の定量化処理などの所定の分析のための画像処理が行われる。すなわち、第２の画像取込工程で得られた細胞画像であって、合焦度が所定の範囲内になったときに取り込まれた細胞画像に対して、分析のための画像処理が行われる。
【００４２】
このフォーカスサーチにおいて、（ＳＴ１５）にて、フォーカス係数ｆ（ｉ）が条件範囲外と判定されたまま、（ＳＴ１６）にてフォーカスサーチ終了位置Ｐｅであると判断された場合には、撮像条件などに異常が存在すると判断し、エラー表示を行う（ＳＴ１８）。本実施の形態に示すフォーカスサーチによれば、予め想定された範囲（フォーカスサーチ開始位置Ｐｓ〜終了位置Ｐｅ）の全てについて必ずしも合焦度確認を行う必要としないことから、合焦に要する時間を短縮することができる。また、フォーカスサーチにおいて最後に取り込んだ画像をそのまま分析用や記録用の画像とすることができることから、撮像効率を向上させることが可能となっている。
【００４３】
なお、上記参考例や実施の形態においては、細胞画像において観察対象物である菌糸１４の周囲にマスクを設定するようにしているが、観察対象物が存在する範囲を除外した範囲を対象としてマスクを設定するようにしてもよい。そしてフォーカス判定処理に際しては、原画像からマスク範囲を除外する画像処理をまず行った後に、フォーカス判定を行う。この方法は、撮像対象のウェル４ａ内にゴミなどの異物が存在する場合に適用される。これにより、異物を含めた画像全体をフォーカス判定処理の対象とすることによる誤差を排除することができる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、細胞画像において観察対象から除外する除外範囲と観察対象に含める対象範囲とを切り分けるためのマスク情報を細胞画像に基づいて生成し、このマスク情報によって切り分けられた対象範囲を対象として得られた合焦度に基づいて観察時の焦点位置を求めるようにしたので、細胞画像において観察対象となる部分に正確に焦点を合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の参考例の顕微観察装置の断面図
【図２】本発明の参考例の顕微観察装置の観察対象の説明図
【図３】本発明の参考例の顕微観察装置の処理機構を示す機能ブロック図
【図４】本発明の参考例の細胞の観察方法におけるマスク情報生成処理の説明図
【図５】本発明の参考例の細胞の観察方法における画像取込処理のフロー図
【図６】本発明の参考例の細胞の観察方法におけるフォーカスサーチの説明図
【図７】本発明の参考例の細胞の観察方法におけるフォーカスサーチの説明図
【図８】本発明の参考例の顕微観察装置の表示画面を示す図
【図９】本発明の実施の形態の細胞の観察方法における画像取込処理のフロー図
【図１０】本発明の実施の形態の細胞の観察方法におけるフォーカスサーチの説明図
【符号の説明】
１顕微観察装置
２試料載置テーブル
３ＸＹＺテーブル
３ａフォーカス機構
４マイクロタイタープレート
７カメラ
１３細胞
１４菌糸
２２マスク情報生成部
２３フォーカス判定部

Claims

容器に収容された細胞を顕微撮像装置によって撮像して観察対象物を含む細胞画像を取得する細胞の観察方法であって、前記顕微観察装置の焦点を前記容器に収容された細胞が撮像可能な位置に合わせ、この状態で前記細胞を撮像して観察対象物である菌糸を含む細胞画像を取り込む第１の画像取込工程と、前記細胞画像において観察対象から除外する除外範囲である前記菌糸が含まれない範囲と観察対象に含める対象範囲である前記菌糸を含む範囲とを切り分けるためのマスク情報を、前記細胞画像をウエーブレット変換を用いて周波数変換することにより前記菌糸が存在する範囲を特定して生成するマスク情報生成工程と、前記細胞に対する前記焦点の位置を前記顕微観察装置の光軸方向に相対的に移動させて位置を変更し、この状態で前記細胞を再度撮像して細胞画像を取り込む第２の画像取込工程と、前記マスク情報に基づいて前記第２の画像取込工程で取り込んだ細胞画像の対象範囲を対象として合焦度を示す数値を出力し、この合焦度を示す数値がしきい値を超えているか否かを判定する合焦度判定工程とを有し、前記合焦度判定工程で合焦度を示す数値が前記しきい値を超えるまで前記第２の画像取込工程と前記合焦度判定工程を繰り返す細胞の観察方法であって、前記第２の画像取込工程で得られた細胞画像であって前記合焦度が前記しきい値を超えたときに取り込まれた細胞画像に対して、分析のための画像処理を行うことを特徴とする細胞の観察方法。