CN102027350B - 用于测量置于分析腔室内的样本的面积的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于确定分析腔室中被静止地停留在分析腔室内的生物流体样本覆盖的面积的方法。该腔室包括具有内表面的第一平板和具有内表面的第二平板，这两个平板都是透明的。该方法包括以下步骤：a)用一个或多个波长的光照射停留在分析腔室内的样本，所述的一个或多个波长的光可用于加亮样本与空气之间的界面和加亮样本内的组分；b)用一个或多个波长的光对样本成像，并且产生表示一个或多个波长的光与样本的相互作用的图像信号；c)使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面的位置；d)使用图像信号，确定样本内的一个或多个组分相对于所述的至少一个样本与空气之间的界面的位置；以及e)使用一个或多个组分和至少一个样本与空气之间的界面的位置来确定包含样本的腔室面积。

Description

用于测量置于分析腔室内的样本的面积的方法

本申请要求于2008年4月9日提交的美国临时专利申请序列号为61/043,567的优先权，其公开的主题以引文方式并入本文。

技术领域

本发明总的来说涉及用于分析生物流体样本的方法，具体地涉及用于确定分析腔室内被样本填充的面积的设备及方法。

背景技术

内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组分的数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常微粒。通常被测量、定量和识别的组分包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。

在诸如Wintrobe’s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已知的血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。手动方法通常涉及产生精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在计数室中被直观计数。手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外周涂片。离心检查方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个组分层。可以给组分层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及检查根据被测量的微粒而处理的血液的精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中体积(volumetrically)稀释样本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或电压，以确定当微粒以单行通过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束入射到以单行通过的微粒的光的强度和散射角的分析。

除了外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样本体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要求对仪器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许多方法产生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。

发明内容

根据本发明的一方面，提供了一种用于确定分析腔室中被静止地停留在腔室内的生物流体样本覆盖的面积的方法。该腔室包括具有内表面的第一平板和具有内表面的第二平板，这两个平板都是透明的。该方法包括以下步骤：a)用一个或多个波长的光照射停留在分析腔室内的样本，所述的一个或多个波长的光可用于加亮样本与空气之间的界面以及加亮样本内的组分；b)用一个或多个波长的光对样本成像，并且产生表示一个或多个波长的光与样本的相互作用的图像信号；c)使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面的位置；d)使用图像信号，确定样本内的一个或多个组分相对于所述的至少一个样本与空气之间的界面的位置；以及e)使用一个或多个组分和至少一个样本与空气之间的界面的位置来确定包含样本的腔室的面积。

具有由均匀高度分隔开的一对透明平板的分析腔室提供了用于分析样本的方便工具。对于很多分析，已知被分析样本的体积是有用的(或者是需要的)，但是很难分配精确已知的样本量。为了避免分配精确已知的样本量的问题，测量在上述分析腔室中产生的薄膜的面积并且将该面积乘以腔室高度来确定所添加的样本体积将是有用的。如果血液(或者其他生物流体)将以几何上完美的形状分布，则这将相对容易，但是由于从样本的应用角度考虑它们在腔室中蔓延，因此样本中通常捕获有气泡或者具有蜿蜒的边缘。确定腔室内的样本的面积的任务对于具有少量红细胞的血液样本来说尤其存在问题，在具有少量红细胞的血液样本中，相对透明的血浆将与绝大多数样本分离，并且如果样本面积的着色是用于样本面积计算的唯一标准，则在面积计算中可能不会包括这个相对无色的区域。本发明的方法提供了一种确定均匀高度的腔室中的样本面积从而确定样本体积的方法，因此提供了一种对与分配精确样本体积相关的问题的解决办法。

通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加显然。

附图说明

图1是包含血液样本的分析腔室的示意截面图。

图2是分析腔室实施例的示意截面图。

图3是分析腔室实施例的示意截面图。

图4是分析腔室实施例的示意截面图。

图5是分析腔室的示意平面图。

图6是置于腔室内的血液样本的示意图像，该血液样本被照射以加亮置于样本内的红细胞。

图7是如图6所示的置于腔室内的血液样本的示意图像，该血液样本被照射以加亮样本和样本内的空气之间的界面。

图8是如图6和图7所示的置于腔室内的样本的示意图像，其中样本包含被数字遮蔽的区域。

具体实施方式

本发明提供了用于确定静止地停留在分析腔室内的生物流体样本的面积的一种或多种方法。根据分析，样本面积本身能够提供期望的、有用的信息。在其他分析中，可以使用该面积来确定腔室内样本的体积；例如，在腔室高度已知或者可以确定的情况下，可以使用该面积和已知的或者可以确定的腔室高度来确定样本体积。

本发明的方法可以用分析腔室来执行，该分析腔室可用于静止地保持生物流体样本(例如，基本上未稀释的抗凝全血样本)以进行分析。该腔室的典型大小是保持大约0.2μl至1.0μl的样本，但是该方法不限于使用任何特定的腔室体积，并且该腔室体积可以为适应分析应用而改变。在对置于腔室内的全血样本执行本发明的方法的情况下，样本通常是“基本上未稀释的”，这表示血液样本根本未被稀释或者未被故意稀释，但是为了进行分析，其中可以添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂的添加对血液样本稀释的程度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。可以用在血液样本中的试剂的一个示例是抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)，该试剂通常以干粉形式来添加，其目的是不稀释样本。然而，并不是所有的血液分析都需要抗凝血剂。在某些情况下(例如，非常快速的分析-诸如可能发生在从患者手指采血或者从新生儿脚跟采血时)，不必添加抗凝血剂。在此使用的术语“静止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔室故意移动。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样本的形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。

现在参照图1至图3，一个可接受的分析腔室10的示例包括具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第二平板16。平板12、16都是足够透明的，以使得能够传输通过足量的预定波长的光，以执行如下所述的分析。在优选的实施例中，平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20，该高度可以是已知的或者是可测量的。至少由于均匀的腔室高度有助于样本体积的确定，所以具有平行的平板12、16的分析腔室是优选的。然而，为了确定样本面积或者确定样本体积，平行的腔室平板不是必须的；例如，可以使用这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于另一个平板成已知的非平行角度布置。

图1-3所示的腔室10包括至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离物26可以是可布置在平板12和平板16之间的、可用于将平板12和平板16彼此分隔的任何结构。隔离物26的高度28通常彼此不完全相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业上可接受的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个示例，并且商业上可从例如Bangs Laboratories ofFishers，Indiana，U.S.A.获得。

在图2所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性大于第一平板12和第二平板16中的一个或者两个的材料组成。从图2可以看出，较大的隔离物26被压缩到大多数隔离物26接触平板12、16的内表面的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平均的隔离物26的直径。在图3所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性小于第一平板12和第二平板16中的一个或两个的材料组成。在图3中，第一平板12由比球状隔离物26和第二平板16更有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离物26。在该实施例中，虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度20将非常接近平均的隔离物26的直径的高度。分析显示使用该实施例可以将平均腔室高度20控制为小于4微米的腔室高度的上下1％或更好。除了受到上述的弹性特性的限制，隔离物26和平板12、16可以由各种材料制备，只要平板12、16足够透明。由丙烯酸(acrylic)或者聚苯乙烯(polystyrene)组成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物26。参照图4，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括以规则的间隔布置的多个口30(例如，其中的至少一些可以用作气孔)，并且平板12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材料32形成了可用于将样本34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。在其他实施例中，一个或两个平板12、16可以具有疏水改性表面，该疏水改性表面类似于将样本横向地包含在分析腔室10内的腔室壁。结合材料或者疏水改性表面可以包括可感测的染色剂，该可感测的染色剂可以用来识别腔室边界的位置。一个可接受的分析腔室的示例在美国专利申请公开No.2007/0243117、2007/0087442、以及美国专利No.6,723,290中详细地进行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。然而，本发明的方法不限于这些特定的腔室实施例。

使用分析设备来执行对静止地置于腔室10内的样本的分析，该分析设备可用于对样本的至少一部分进行照射和成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本图像单位来确定通过所述的样本的至少一部分的光吸收和来自所述的样本的至少一部分的荧光发射中的一个或两个的方式产生该图像。术语“基本图像单位”是指能够分辨样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处理的最小图元的像素是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少量像素。还可以以线性项(例如，在焦平面上每像素几微米)来描述成像设备的放大倍数，其中线性维度沿着应用于图像的正交网格的一个特定轴。在焦平面上被传感器像素捕获的实际样本面积因此是成像设备所应用的放大倍数的函数。因此，应当已知或者可以确定成像设备的放大倍数。与该像素有关的体积因此是每个像素的图像的面积与已知腔室高度的乘积。例如，如果放大倍数为每像素0.5微米，则占据200个像素的图像将具有50平方微米的面积，而体积则为50平方微米与腔室高度的乘积。

现在参照图5，能够适用于本发明的方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、析像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46使用发出特定的期望波长的光的源(例如，LED)或者使用发出宽波长范围的光的源来选择性地产生某些期望波长的光。可用于产生约413nm和约540nm的光的照明器46尤其适于分析血液样本，这是因为血红蛋白内的光吸收基本上都在这些波长上发生(即，在上述波长上的高摩尔消光系数(ε))。光的吸收是光波和样本之间的一种“相互作用”。样本照明器46可以被配置为以相对于腔室10的透射模式、或表面照明模式、或者以这两种模式来产生光，并且样本照明器46可用于照射停留在腔室10内的样本的一些或者全部。在透射模式中，样本照明器46的光源部分定位在停留在腔室10内的样本的一侧并且引导光通过静止地置于腔室平板之间的样本，然后到达析像器48。

一个可接受的析像器48的示例是电耦合器件(CCD)，其将穿过样本的光的图像转换成为电子数据形式(即，信号)。互补金属氧化物半导体(“CMOS”)类型的图像传感器是另一种可以使用的图像传感器的示例，然而本发明不限于这些示例中的任意一个。

可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并且连接(至少电连接和/或光学连接)至样本照明器46和析像器48。CPU适于(即，被编程为)选择性地执行进行本发明方法所必需的功能。应当注意，可以使用硬件、软件、固件或者其结合来实现可编程分析器的功能。所属领域的技术人员将能够对处理单元进行编程以执行在此所述的功能，而不需要进行过度的实验。题目为“Apparatus for AnalyzingBiologic Fluids”且于2005年3月15日发布的美国专利No.6,866,823公开了这种分析设备，该美国专利内容以引文方式整体并入本文。

分析设备44适于：1)用一个或多个波长的光照射置于分析腔室内的样本，所述的一个或多个波长的光可用于加亮样本与空气之间的界面以及样本内的至少一个组分；2)以所述波长的光对样本成像，并且产生表示这些波长的光与样本之间的相互作用的图像信号；以及3)使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面。

在一些实施例中，分析设备44还适于确定通过一个或多个样本与空气之间的界面彼此分隔开的至少一个样本区和至少一个无样本区。每个样本区包含样本中的至少一个组分。每个无样本区不包含样本的组分。涉及样本区、无样本区和样本与空气之间的界面的空间关系可以被描述为：样本区置于样本与空气之间的界面的第一侧，而无样本区置于同一样本与空气之间的界面的第二侧，其中第一侧和第二侧彼此“相对”。还应当注意，样本区和无样本区的几何形状可以非常不同并且很少限于单一分界线；例如，样本通常包含气泡，等。因此，样本区和无样本区还可以被描述为：在分析腔室内互为补充。如上所述，血液样本内的组分包括但不限于红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。如果在血浆中掺合可感测的染料，该染料使得能够容易地辨别血浆的存在，则血浆可以被视为血液样本的一个组分。在这些实施例中，分析设备44还适于使用样本区和无样本区中的至少一个来确定包含样本的腔室面积。

在其他实施例中，分析设备适于：1)定位样本内的组分，从而提供对样本区或无样本区之一进行遮蔽(mask)的数字遮蔽；以及2)使用遮蔽面积来确定包含样本的腔室面积。在此使用的术语“数字遮蔽”指的是二进制成像法，在二进制成像法中，被识别区域(例如，样本区)中的图像单位(例如，像素)全部被给予一个特定值，以将这些图像单位从包含表示被成像的照射样本的图像值的图像单位中区分。然后可以进一步处理易于识别的被遮蔽的图像单位；例如，对被遮蔽的图像单位进行求和来确定面积。

在其他实施例中，本发明包括滴落在腔室的至少一个内表面上的着色剂。与样本掺合的着色剂(例如，诸如吖啶橙之类的荧光染料)可以使用照射来感测，并且可以用来确定样本与空气之间的界面。在使用了荧光着色剂的实例中，可感测的信号是特定波长的荧光发射，该特定波长的荧光发射是由光源以另一波长的光激发该荧光着色剂而产生的。荧光发射的产生可以被描述为用于照射样本的光和样本的“相互作用”的结果。

将本发明的方法应用于抗凝全血的样本，其中抗凝全血的样本位于腔室的两个透明的平板之间，这两个透明的平板以均匀高度分隔开，在这种情况下，来描述本发明的方法的以下示例。提供这些示例来显示本发明的方法的实用性，而不应当将本发明的方法解释为局限于此并且尤其不应当解释为局限于对全血样本的面积确定。

在该方法的一个实施例中，使用多个波长的光照射样本并且对样本成像。所选的一个或多个波长的光将加亮样本图像内的一个或多个目标组分。对于全血而言，大约415nm或大约540nm波长的光可以用来有效地加亮RBC，这是因为这些波长的光能够很好地被包含于红细胞内的血红蛋白吸收。可以使用表示与血红蛋白相关的光吸收的阈值光密度值来识别“加亮的”RBC。满足或超出预定的光密度值(或者如果使用排除技术，则为小于阈值)的图像单位被识别为与RBC相匹配。作为利用血红蛋白光吸收的一种替代，可以用与样本掺合的荧光着色剂(例如，吖啶橙)或其他可感测的着色剂来加亮某些RBC或其他组分(例如，WBC和血小板)。在血液样本内使用RBC作为“目标”组分的优点在于，相对而言，RBC是血液样本内数量最多的组分，因此在包含样本的任何特定区域最容易被发现。图6是置于腔室内的血液样本52的图像，其中RBC 22被加亮。该图像包括一对间隔物微粒26、RBC 22和多个大气泡54。

在该实施例中，还使用所选取的用来加亮样本52与空气之间的界面56的一个或多个波长的光照射样本52。当用该波长的光照射样本52时，样本52的内容通常相对无色，而通过在样本与空气之间的界面56处出现的该波长的光的折射来清楚地识别出样本与空气之间的界面。可以使用多种波长的光来识别样本与空气之间的界面。当被分析的生物流体是全血时，600nm或以上(优选为约700nm)波长的光能够很好地加亮样本与空气之间的界面。图7是图6所示的样本与空气之间的界面56被加亮了的全血样本图像。

如上所述，可以使用多种波长的光来识别样本与空气之间的界面56。在一些实例中，用来加亮界面56的波长的光还可以用来加亮样本52内的目标组分(例如，RBC 22)。因此，可以用一个波长的光对样本52成像，从而不需要提供两个不同波长的光。

置于分析腔室内的生物流体样本很少具有完美的直线或曲线的样本与空气之间的界面56。对于样本52而言，更常见的是其样本与空气之间的界面为不规则的、非均匀的几何形状。可以使用多种技术来定位腔室内的样本与空气之间的界面，并且本发明不限于任何特定的技术。例如，可以使用分割技术来识别图像内具有一个或多个特定特性的例如像素的图像单位(例如，光密度为x％的图像单位)；例如，将这些特性作为识别特征来使用。识别具有表示样本与空气之间的界面56的那些预定特征的像素并且相对于样本腔室进行映射，从而识别出它们在图像内的位置。同样，对具有表示目标组分(例如，RBC 22)的特征的像素进行识别和定位。

一个或多个样本与空气之间的界面56和目标组分(例如，RBC22)的相对位置定义了样本52位于哪里和不位于哪里。一旦定义了(一个或多个)样本区58和(一个或多个)无样本区60的边界，就可以通过对与位于每个微粒区58、60内的每个图像单位相关的面积进行求和来确定该区域58、60的面积。如果对(一个或多个)样本区58内的图像单位面积求和，则样本区58的总面积表示置于腔室内的样本52的总面积。注意，在图6至图8中，示出了样本占据单个样本区58。在很多实例中，流体样本可以呈现为一个特定腔室内的多个独立样本区58。

在另一个实施例中，一旦样本与空气之间的界面56和目标组分被定位，就可以使用数字二进制遮蔽技术来确定面积，所述数字二进制遮蔽技术对样本区内的图像单位累接地进行数字遮蔽。在数字二进制遮蔽法的一个示例中，在从组分延伸出的方向上，在累接过程中对与该组分相邻的图像单位进行遮蔽，直到遇到已经被遮蔽的图像单位或者腔室的边界为止。另外，在从样本与空气之间的界面56延伸出的方向上，在累接过程中，还对在界面56的组分侧的、与该界面相邻的图像单位进行遮蔽，直到遇到已经被遮蔽的图像单位或者腔室的边界为止。该过程累接地进行，直到各个样本区内的所有或者基本上所有的图像单位都被遮蔽为止。图8示出了图6和7所示的血液样本的被遮蔽形式。

本发明不限于用上述的数字二进制遮蔽法遮蔽的示例。可选地，所述遮蔽法还可以使用诸如边缘定位算法等之类的图像处理运算来对所述区进行遮蔽。

随后，可以通过对与每个被遮蔽的样本单位相关的面积进行求和来确定样本区的面积，以获得该特定样本区的总面积。样本区的总面积表示置于腔室内的样本的总面积。如果被成像的腔室的总面积已知或者可以确定，则还可以使用对比法来确定样本区的面积。在这种实例中，无样本区的面积可以被遮蔽和确定，然后从总成像面积中减去该求和所得的面积来获得样本区的面积。可以通过对整个图像的每个图像单位面积进行求和来确定总成像面积。如果总成像面积是对称形状的，则可以确定总成像面积的一部分的面积，随后可以应用适当的乘数来获得总成像面积。

在一些实施例中，通过在腔室内应用干燥的可感测的着色剂层有助于样本与空气之间的界面的识别。进入腔室并且在腔室内移动的样本在样本与空气之间的界面处所收集的可感测的着色剂(即，吖啶橙)的量不均衡。可感测的着色剂在样本与空气之间的界面处的聚集加亮了该界面并且使其更容易识别。

如上所述，一些分析腔室包括隔离物微粒26以保持均匀的腔室高度20。这种微粒可以被形成为具有使得它们在样本图像内易于辨别的特性(例如，被染色)。在这种微粒置于样本区内的情况下，在样本区面积计算中，可以考虑每个微粒的面积(例如，在图8所示的遮蔽区中，在样本的遮蔽面积中不包括与隔离物微粒26相关的面积)。假设已知隔离物的体积，则还可以考虑遮蔽面积内微粒26的体积。

在可替代的实施例中，可以使用这样一种腔室，其具有由一个或多个屏障(barrier)划界的部分，所述的一个或多个屏障形成了置于其间的已知面积。屏障分开一定的距离，并且位于腔室内，以提高已知面积被填满样本的可能性。

虽然已经针对本发明的详细实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人员将理解，可以在不脱离本发明的思想和范围的情况下在形式和细节上进行各种变化。

Claims (27)

1.一种用于确定分析腔室中被静止地停留在分析腔室内的生物流体样本覆盖的面积的方法，该腔室包括具有内表面的第一平板和具有内表面的第二平板，这两个平板都是透明的，该方法包括以下步骤：

用一个或多个波长的光通过透射模式或表面照明模式照射停留在分析腔室内的样本，所述的一个或多个波长的光用于加亮样本与空气之间的界面和加亮样本内的至少一个组分；

以所述通过透射模式或表面照明模式照射样本的一个或多个波长的光对样本成像，并且产生表示一个或多个波长的光与样本的相互作用的图像信号；

使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面的位置；

使用图像信号，确定样本内的一个或多个组分相对于所述的至少一个样本与空气之间的界面的位置；以及

使用一个或多个组分和至少一个样本与空气之间的界面的位置来确定包含样本的腔室面积。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤：对样本与空气之间的界面的第一侧的包含一个或多个组分的样本区、或者样本与空气之间的界面的第二侧的无样本区进行遮蔽，第二侧与第一侧相对。

3.根据权利要求2所述的方法，其中遮蔽的步骤包括对样本区或者无样本区内的图像单位进行数字二进制遮蔽。

4.根据权利要求3所述的方法，其中通过对被遮蔽区或者未被遮蔽区中的至少一个中的每个图像单位的面积进行求和来确定包含样本的腔室面积。

5.根据权利要求3所述的方法，其中通过对无样本区中的图像单位的面积进行求和并且从已知的腔室面积中减去该求和所得的面积来确定包含样本的腔室面积。

6.根据权利要求2所述的方法，其中遮蔽的步骤包括累接地对从与组分相匹配的图像单位向外延伸出的图像单位进行遮蔽，直到遇到已被遮蔽的图像单位、样本与空气之间的界面、以及腔室的横向屏障中的一个或多个为止。

7.根据权利要求2所述的方法，其中遮蔽的步骤包括累接地对从与至少一个样本与空气之间的界面相匹配的图像单位向外延伸出的图像单位进行遮蔽，直到遇到其他已被遮蔽的图像单位或者腔室的横向屏障为止。

8.根据权利要求1所述的方法，其中使用一个或多个组分和至少一个样本与空气之间的界面的位置来确定包含样本的腔室面积的步骤包括定义一个或多个样本区和一个或多个无样本区，每个样本区均包含一个或多个组分，每个无样本区均不包含组分，其中所述至少一个样本与空气之间的界面之一置于每个样本区和无样本区之间。

9.根据权利要求8所述的方法，还包括步骤：对一个或多个样本区或者一个或多个无样本区进行遮蔽。

10.根据权利要求8所述的方法，其中通过对一个或多个样本区中的每个样本区中的图像单位的面积进行求和来确定包含样本的腔室面积。

11.根据权利要求8所述的方法，其中通过对一个或多个无样本区中的每个无样本区中的图像单位的面积进行求和并且从已知的腔室面积中减去该求和所得的面积来确定包含样本的腔室面积。

12.根据权利要求8所述的方法，其中遮蔽的步骤包括对一个或多个样本区或者无样本区内的图像单位进行数字二进制遮蔽。

13.根据权利要求1所述的方法，其中组分是红细胞。

14.根据权利要求13所述的方法，其中对停留在分析腔室内的样本进行照射的步骤包括以第一波长和第二波长的光照射样本，第二波长与第一波长不同。

15.根据权利要求14所述的方法，其中使用第一波长的光照射样本使得图像中样本与空气之间的界面被加亮。

16.根据权利要求15所述的方法，其中第二波长是血红蛋白吸收的光的波长。

17.根据权利要求1所述的方法，其中组分是已被可感测的着色剂着色的白细胞和血小板中的一种或两种。

18.根据权利要求1所述的方法，其中腔室包括横向屏障，所述横向屏障包括可感测的着色剂。

19.根据权利要求1所述的方法，还包括步骤：使用所确定的包含样本的腔室面积和已知的腔室高度来确定置于腔室内的样本的体积。

20.一种用于确定分析腔室中被置于分析腔室内的生物流体样本覆盖的面积的方法，包括以下步骤：

将生物流体样本滴落在适于静止地保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板的内表面和第二平板的内表面限定，其中这两个平板都是透明的；

以用于加亮样本与空气之间的界面的一个或多个波长的光，和以用于与样本内的组分相互作用的一个或多个波长的光照射置于分析腔室内的样本；

以一个或多个第一波长和一个或多个第二波长的光对样本成像，并且产生表示第一波长和第二波长的光与样本的相互作用的图像信号；

使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面；

使用图像信号，确定样本内的一个或多个组分相对于所述的至少一个样本与空气之间的界面的位置；

对在样本与空气之间的界面的第一侧的包含一个或多个组分的样本区、或者在样本与空气之间的界面的第二侧的无样本区进行遮蔽，第二侧与第一侧相对；

使用被遮蔽的样本区和无样本区中的至少一个来确定包含样本的腔室面积。

21.根据权利要求20所述的方法，其中腔室包括由一个或多个屏障划界的部分，所述的一个或多个屏障形成置于其间的已知面积。

22.一种用于确定静止地停留在分析腔室内的生物流体样本的体积的方法，该腔室包括具有内表面的透明的第一平板和具有内表面的透明的第二平板、以及已知的或者能够确定的高度，该方法包括以下步骤：

用一个或多个波长的光照射停留在分析腔室内的样本，所述的一个或多个波长的光用于加亮样本与空气之间的界面和加亮样本内的至少一个组分；

以一个或多个波长的光对样本成像，并且产生表示一个或多个波长的光与样本的相互作用的图像信号；

使用图像信号，确定样本与空气之间的至少一个界面的位置；

使用图像信号，确定样本内的一个或多个组分相对于所述的至少一个样本与空气之间的界面的位置；

使用一个或多个组分和至少一个样本与空气之间的界面的位置来确定包含样本的腔室面积；以及

使用所确定的包含样本的腔室面积和已知或者能够确定的腔室高度来确定置于腔室内的样本的体积。

23.根据权利要求22所述的方法，其中组分是红细胞。

24.根据权利要求23所述的方法，其中照射停留在分析腔室内的样本的步骤包括以第一波长和第二波长的光来照射样本，第二波长与第一波长不同。

25.根据权利要求24所述的方法，其中使用第一波长的光照射样本使得图像中样本与空气之间的界面被加亮。

26.根据权利要求25所述的方法，其中第二波长是被血红蛋白吸收的光的波长。

27.根据权利要求22所述的方法，其中组分是已被可感测的着色剂着色的白细胞和血小板中的一种或两种。