CN104094118A - 通过显微图像自动识别全血样品中血小板的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

一种识别全血样品中的血小板的方法和设备。该方法包括步骤：a)将至少一种着色剂添加到全血样品中，该着色剂用于标记血小板；b)将所述全血样品置于由至少一个透明板限定的腔中；c)将静止地位于该腔内的所述样品的至少一部分进行成像以形成一个或多个图像；和d)采用分析仪识别所述样品中的一个或多个血小板，该分析仪适于基于所述图像中可定量确定的特征使用分析仪识别血小板，所述可定量确定的特征包括强度差异。

Description

通过显微图像自动识别全血样品中血小板的方法和设备
本申请要求2011年12月30日递交的序列号为61/581,887的美国临时专利申请的权益，其所公开的基本主题通过引用并入文中。
技术领域
本发明总体涉及通过显微图像对全血样品进行分析的方法和设备，尤其涉及自动分析血小板的方法和设备。
背景技术
医疗诊断通常包括分析病人的全血样品。较流行的诊断之一是全血细胞计数(被称为“CBC”)，其中，全血细胞计数为一系列包括“血小板计数”(即，凝血细胞计数)的测试。该血小板计数实际上是一种浓度测定，即，单位体积中的血小板数量。在一个成年人体内，正常的血小板计数通常约为每微升血液内有150000到450000个血小板。异常的血小板计数成为健康问题的一个指标，如，如感染、疾病等。如果血小板水平降低到每微升20000以下，则可能发生自发性出血，并且，这被认为具有威胁生命的风险。
以前，通过在载玻片上涂抹少量的未稀释血液或流式细胞术而实施血小板计数。对于涂片而言，该样品被涂覆到载玻片上，并且对位于该涂片内的血小板和其它的成分进行计数。基于该样品中的相关成分来估算血小板计数(即，该样品内每单位体积的血小板)。
通过电阻抗或光学流式细胞术分析仪来执行血小板计数，该血液样品必须被稀释然后穿过一个小容器，其中，当组成细胞连续地通过该容器时，电阻抗或者光学传感器可以估算样品中的组成细胞。根据样品内存在的成分，这些仪器的准确性可能会受到影响。在一个阻抗式计数仪中，例如，红细胞碎片可以被认为和视作血小板，而且巨大血小板可以被认为和视作红细胞(RBC)。在这两种情况下，自动的血小板计数的准确性都会受到影响。另外，样品的稀释必须精确，或者说，精度受到负面影响，并且已稀释的样品必须被妥善地进行事后分析处理。所需的处理稀释后的样品的内部管道经常需要维护，并且至多对设备的复杂度和成本明显有利。
所需要的是，用于对全血样品执行包括血小板计数的自动分析的装置和方法，其可克服现有技术的局限性，该局限性包括用于执行该分析所需的时间、用于执行该分析所需的操作员技术水平；并且，该装置和方法比已知的现有技术的方法和装置能够提供更广泛的适用性。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种识别全血样品中的血小板的方法。该方法包括步骤：a)将至少一种着色剂添加到该全血样品中，该着色剂用于标记血小板；b)将该全血样品置于由至少一个透明板限定的腔中；c)将静止地位于该腔内的所述样品的至少一部分成像以形成一个或多个图像；并且d)采用分析仪识别样品中的一个或多个血小板，该分析仪适于基于该图像中可定量确定的特征识别血小板，该可定量确定的特征包括强度差异。
根据本发明的另一方面，提供了一种识别全血样品中的血小板的设备。该设备包括一个分析盒和一个分析装置。该分析盒包括一个带有一对平面构件的分析腔，该平面构件中的至少一个是透明的。将至少一种着色剂添加到该全血样品中(如，在分析盒内)，该着色剂用于标记血小板。该腔可操作地保持该样品静止地位于这两个平面构件之间。该分析装置用于使静止地位于该腔内的该样品的至少一部分成像。该分析装置适于基于图像内的可定量确定的特征识别血小板，该可定量确定的特征包括强度差异。
根据本发明的实施方式，确定了在图像中局部区域内的强度差异。
根据本发明的实施方式，获取了血浆的图像强度。
根据本发明的实施方式，使用强度差异的定向对比度评估了血小板的候选者。
根据本发明的一方面，评估了该图像以确定该样品中存在一个或多个血小板簇。
根据本发明的一方面，识别该图像内的血小板候选者、并采用基于规则的分类器分析该图像内的血小板候选者，该分类器使用多个定量特征。
上面描述的本发明的各个方面和实施方式可以单独或组合使用，且本发明不限于任何特定的配置。如附图所示，根据下面提供的本发明的详细描述本发明的这些和其它的方面、实施方式、特征以及优点将变得显而易见。
附图说明
图1为根据本发明的可操作地执行血小板分析的分析装置的示意图；
图2为根据本发明的可使用的具有分析腔的分析盒的透视图；
图3为图2所示的盒的分解图；
图4为支承分析腔的托盘的顶部平面视图；
图5为分析腔的示意性剖面图；
图6为显示荧光成像下的样品中的血小板和白细胞的图像；
图7为显示胶线/样品的界面的图像；
图8为显示样品/空气的界面的图像；
图9为腔的样品入口区域的图像；
图10是血小板内的强度定向对比度的示意图解；
图11a-图11c是血小板候选者内的图像强度高斯分布的示意图；
图12是显示在荧光成像下的样品内的小珠的图像；
图13是正交网格的边界框内的血小板候选者的示意图；
图14是当前置于一个凸壳内的图14中显示的一个血小板候选者的示意图；
图15为示出用于通过样品图像识别在样品内的血小板的本发明方法的实施方式的流程图。
具体实施方式
参见图1和图2，本发明的各方面包括用于识别和枚举静止地位于分析腔内的血液样品中的血小板的方法和设备。分析腔通常容纳在盒20内，该盒被配置成与自动化分析装置22一起使用，其中，该自动化分析装置具有成像硬件和程控分析仪，该程控分析仪适于获取和分析该样品的图像，从而识别和计数该样品中的血小板。
参阅图2至图5，本发明不限于任意使用特定分析腔的实施方式。在美国专利No.7,850,916以及美国专利申请No.12/971,860、No.13/341,618和No.13/594,439中描述了可接受的分析腔(和附带的盒)的例子，其全部内容均被引用并入本文中。为了该公开内容，本发明将描述成使用美国专利申请No.13/594,439中描述的盒和分析腔。在专利申请No.13/594,439中公开的分析腔24包括一个上平面构件26和一个附接在托盘30上的底部平面构件28，托盘30可拆卸地安装在盒20内。在一些实施方式中，多个分离小珠31(如大小一致的小珠)被置于上平面构件26和底部平面构件28之间，且通常是与这些平面构件相对的表面接触。图2示出了组装的形式的盒20。图3示出盒20的分解图，盒20包括分析腔24和托盘30。图4是安装在托盘30上的分析腔24的顶视图，并示出腔24的X-Y平面视图。图5为腔24的示意性截面图，示出腔24的Z-X平面视图。腔24的高度32沿Z-轴延伸，并在这两个平面构件的相对的内表面34和内表面36之间延伸。对于全血样品分析而言，腔24的高度32优选地大约4微米(4μm)，但是腔24并不限于这一高度。
参照图1，与上述腔24可一起操作使用的分析装置22，通常包括物镜34、盒定位器36、一个或多个样品照明器38，一个或多个析像管40和程控分析仪42。物镜34和盒定位器36中的一个或两个可朝向彼此移动或可移动彼此远离，从而改变分析装置相对于腔24以及置于腔24内的样品的相对焦点位置。
样品照明器38使用沿着预定波长的光照射样品。例如，样品照明器38可包括落射荧光光源和透射光源。如下文将解释的，诸如吖啶橙(也称为“碱性橙15”或“ACO”)的着色剂当与全血混合且处于落射荧光光源(该光源通常发出在约450nm至490nm的范围内的光)发出的激发波长时，发出具有特定波长的光。约470nm的激发波长是尤其有用的。例如，透射光源可操作地产生与红光和绿光中相关的波长的光。产生的红光通常在约600nm至700nm的范围内，优选地红光约为660nm。产生的绿光通常在约515nm至570nm的范围内，优选地绿光约为540nm。使用析像管40捕获穿过样品传输的光或者样品发出的荧光，并且，代表所捕获的光的信号被发送至程控分析仪42，在程控分析仪处信号被处理成图像。以这样的方式制作图像：允许在每单位基础上确定图像内所捕获的透光率或荧光强度；例如“每单位基础”为增加的单位，其中样品图像可被分割(例如像素)。
可接受的析像管40的示例为电荷耦合器件(CCD)型图像传感器，该图像传感器使穿过样品的光(或来自样品的光)转化成电子数据格式图像。互补性金属氧化物半导体(“CMOS”)型图像传感器为可使用的图像传感器的另一示例。来自析像管40的信号为图像的每一像素提供信息，该信息包括或者可被推导出包括强度、波长和光密度。为强度值赋予例如0单位至4095单位(“IVU”)中的任意数值范围。光密度(“OD”)为相对于穿过基质传输的光量，所吸收的光量的度量；例如，“OD”值越高，则在透射期间所吸收的光量越大。可以光密度单位(“ODU”)或其分数定量描述OD；例如，毫ODU为ODU的千分之一。一个“OD”单位降低90％的光强度。作为定量值的“ODU”或“毫ODU”可用于通过透射光所获得的图像或通过透射光所衍生的图像。来自析像管40的信息被分成多个通道。例如，来自析像管40的信息可被分成三个通道。然而，本发明不限于三通道的实施方式。三个通道中的第一通道可针对与样品发出的第一波长(例如，540nm，呈现绿色)的光有关的信息。第二通道可针对与样品发出的第二波长(例如，660nm，呈现红色)的光有关的信息。第三通道可针对与穿过样品的第三波长(例如，413nm，该波长用于确定蓝光密度-“OD”)的光有关的信息。本发明不限于这些特定的波长或通道数目。
程控分析仪42包括中央处理单元(CPU)，且与盒定位器36、样品照明器38和析像管40进行通信。程控分析仪42适于(例如，被程控)发送和接收来自盒定位器36、样品照明器38和析像管40中的一个或多个的信号。例如，该程控分析仪42适于：1)发送和接收来自盒定位器36的信号以相对于光学器件、照明器38和析像管40中的一个或多个而定位盒和腔24；2)将信号发送给样品照明器38以产生规定波长(或可替选地多个波长)的光；和3)发送和接收来自析像管40的信号以捕获规定的时间段的光。应当注意，使用硬件、软件、固件或其组合可实现程控分析仪42的功能。本领域技术人员将能够对处理单元程控以执行本文所描述的功能，而不需过多的实验。
程控分析仪42进一步适于根据识别样品图像中的血小板的算法，处理从析像管40接收到的信号，并从与血小板类似但不是血小板的图像特征以及使得血小板模糊的背景特征中区分出血小板。
分析装置22适于对置于分析腔24内的基本上未稀释全血样品进行成像。该样品与一定量的用于染色该样品中包含的血小板的荧光染料(或其它着色剂)混合。向样品中添加和混合该染料可以发生在使样品成像前的任意时间；如，在通过毛细管流经过腔24之前在盒的通道内混合。染料渗过血小板并染色各个血小板。当激发时，染料产生与特定颜色相关的特定波长的荧光发射。血小板中的染料发出的光的具体颜色和强度通常是一系列因素的函数，包括：血小板中染料的浓度和血小板的pH。如下文即将描述的，荧光发射产生表示血小板的局部峰值发射区域，其从血小板发射出。
当对全血样品执行LDC时，可使用的可接受的着色剂的一个示例为吖啶橙(“ACO”)。ACO为荧光染料，当其与全血样品混合时，对样品内的血小板(以及WBC(白细胞)50和网状细胞)染色。本发明不限于使用ACO；可使用其它染料(例如碱性橙)代替ACO，或者结合ACO使用其它染料。以ACO作为示例，如果样品经受在470nm波长或大约470nm波长的激发光照射，则血小板内的ACO将发射大约540nm的光(呈现绿色)以及大约660nm的光(呈现红色)。
为了执行血小板计数，分析仪42适于(如通过算法被程序控制)以引导样品照明器38利用激发光(如约为470nm的光)和透射光(如约为413nm和660nm的光)照射静止地置于样品中的样品。当遇到激发光时，每个血小板中的荧光染料发射约为540nm的绿光和约为660nm的红光。使用析像管40捕获从该样品中发射出的荧光和通过该样品的透射光，将代表捕获光的信号发送到程控分析仪42，在此处将该信号处理成图像。以这样的方式生成图像：允许在每个单位基础上确定图像内捕获的荧光强度和透射强度。
程控分析仪42适于从析像管40中收集图像数据信号和处理这些图像数据信号以促进识别图像中显示的血小板。程控分析仪42还适于确定静止地置于所述分析腔24内的样品的体积。例如，算法适于识别分析腔24内的样品的边界，例如胶线44/样品46的界面(如，参见图7)和通常存在于样品46的边缘且未碰到胶线44的样品46/空气48的界面49(如，参见图8)，其中，胶线44形成腔24的横向边界。腔24的高度32是已知的或可确定的。一旦确定被样品46占用的腔24的面积(如，图像的各个像素具有相关的腔面积)，使用样品面积和与腔24的相关高度可以确定样品的体积。
在一些实施方式中，通过平滑算法对图像数据信号进行初始处理，该平滑算法过滤这些信号以使图像的背景部分更加均匀。可接受的平滑算法的一个示例为将形貌滤波器(如，图像打开滤波器)应用到图像数据。滤波器可用于减轻一些背景变化，且可用于去除图像中的大型明亮的物体，如白细胞50(“WBC”)。由于WBC 50内包含的材料，WBC 50(如RNA、DNA)可呈现为强度峰值，所述材料被用于增强血小板亮度的着色剂而加亮显示。图6示出图像内的血小板52和WBC 50。然而，基于WBC 50相对于血小板52的大的光强度，WBC 50可以与血小板52区分开来。从图像中消除WBC 50(如，通过分割处理)有助于血小板52的识别。
也可以分析图像数据以识别局部强度峰值。该局部峰值识别过程可以在“平滑”过程之前或之后执行，但是在确定局部峰值强度之前执行该平滑步骤首先消除一些潜在误差源。然而无需这种平滑步骤。可以使用各种不同的技术执行一个或多个规定的波长下的局部强度峰值的识别。如下描述的，图像强度可以基本上在整个样品中变化，其中，变化可归因于多种因素，如血浆强度变化、胶线近似、WBC浓度、RBC浓度等。可以通过定量地评估在局部基础上的强度差异(如峰值)来提高血小板识别的准确度。在此使用的术语“局部”是指静止地置于腔24内的样品内的限定的小区域，其中，这些小区域可根据预定的像素区域来限定，如一个5x5平方像素。一个5x5平方像素在评估血小板52时是有用的，因为在用于成像的分辨率下通常约2-3μm大小的血小板31处于5x5平方像素的范围内。然而，本发明不限于这种特定大小的“局部区域”。在这些局部区域的每一区域中，确定最大样品图像强度值。例如，样品可受到荧光激发光和所获得的样品图像的影响，该样品图像包括发射光强度；如在绿色荧光通道内的发射光强度。一旦确定了各个局部区域内的图像强度峰值，则可以用全局阈值消除低于该全局阈值的那些强度峰值(如，最大值)。这一识别过程建立了图像内的潜在表示血小板31的所有部分，这些部分在下文中分别被称为“血小板候选者”。一旦识别出所有的潜在血小板候选者，那么就可以进一步分析图像数据来消除这些不是血小板52的候选者，并识别出在图像内可能存在的血小板凝块。
与分析腔胶线44和样品/空气的界面49相邻的样品图像部分的图像强度可以通过由胶线44和样品/空气的界面49引起的光强度效应而被污染。例如，从图7中可看出，当该样品被照亮时，胶线44呈现为明亮的且具有高图像强度。该胶线44的高图像强度引发相邻的区域比它们原本具有更大的强度，继而增高了弄错血小板识别的可能性，或者由于整体强度而丢失血小板52的可能性。从图8中也可以看出，某些程度上同样的效应也发生在了样品/空气的界面49上。可以由分析仪42通过算法实施以解释在相邻图像部分内的强度污染(即，异常区域)的一种技术是，从血小板计数的考虑中去除这些相邻图像部分；如通过遮盖等。例如，通过估算相关历史数据确定去除多少样品图像。例如，去除与胶线相邻的约100像素行的样品图像通常适于足以清除由于胶线44造成的强度污染。类似地，与样品/空气的界面49相邻的约80像素行的样品图像通常适于足以清除由于该界面造成的强度污染。为了说明已清除的样品图像部分中存在的血小板52，可以基于在已清除区域局部的样品图像区域中确定的相对数量，来估算在这一区域内的血小板数量。
在一些实施方式中，处理器42内使用的算法可以进一步适于辨认血小板识别有问题的其他区域。例如，在一些情况下，分析腔24的区域可以具有抑制精确体积测定的差异。在这样的情况下，在那样的区域内进行精确的血小板计数(是一个体积函数)的能力可被折中。例如，图9显示了腔入口区域由于在该区域内样品过多造成的图像异常58。为了解释这种异常，该区域内的血小板52的数量可以基于位于该问题区域的样品区域中的血小板计数来估算。
另一个可以由分析仪42通过算法实施的促进血小板52识别的技术，是消除初始获取的图像中存在的背景。例如，可将滤波器应用于图像数据信号，以去除在强度上(如，绿光强度)低于预设全局阈值的变化。可能被认为是血小板52的低于全局阈值的局部强度最大值可以被消除，从而消除将那些强度峰值被误认为血小板52的可能性。例如，分割技术可作为一种清除背景的机制。本发明不限于任意特定的分割技术，可根据目前的应用而选择一种具体的技术。本发明也不限于使用分割技术来消除背景，也可以使用选择(即“拾取”)像素或者区别具有特定属性的像素的其他技术。
另一种可以由分析仪42通过算法实施的促进识别血小板52的技术包含获取(如，估算)样品局部区域内的血浆图像强度。血浆通常比RBC更亮(即，更高的图像强度)，但是没有血小板52亮。添加到样品中的至少一些荧光染料位于该血浆中，结果通过激发光照亮样品，在血浆内形成某种程度的发射光强度。然而，血浆中染料的分布在整个样品中可能不是均匀的。因此，在分析腔24内设置的样品中，血浆的图像强度可能会有很大变化。例如，表示样品的第一区域内的血浆的图像强度的成像数据与样品的第二区域内的血浆的图像强度的成像数据相比，可以差异高达30％-40％。在血浆强度中的均匀性的缺乏，使得在没有负面地影响血小板识别过程的情况下，难于统一获取血浆强度。在样品存在大量RBC 54的区域中，血浆强度的非均匀性特别有问题。如果不考虑血浆强度，则RBC区域内可见的小的血浆区域可呈现为局部强度峰值，其可能会被错误识别成血小板52。为了解决这一问题，该算法可适于在RBC区域内应用RBC遮盖来将RBC 54分割出来(或者从图像中将它们去除)，留下剩余的血浆区域。例如，RBC 54在图像信号数据的红色通道中没有表达。因此，使用红色通道遮盖形成的图像将会只显示血浆的强度和在RBC区域内的任意血小板52的强度。根据两种样品成分之间的强度上的差异(如，比周围像素高约20％的那些像素)，可定量地从局部血浆中区分出血小板52。在那些没有足够血浆的面积以不允许这类比较分析的RBC区域中，可以基于RBC 54本身的图像强度使用可替选的技术。例如，在那些区域内的估算的血浆图像强度可以基于下述估算：(RBC平均图像强度)+3*(RBC图像强度标准偏差)＝估算的血浆强度。本方法不限于这种特定的可替选技术。
在将一个或多个上面描述的技术应用于血小板候选者以及不考虑非血小板候选者(根据它们被识别的程度)后，可以通过评估每个独立候选者的特征来进一步分析剩余的候选者。可以由分析仪42通过算法实施的第一技术包括评估给定区域内候选者的强度峰值的方向对比度。该区域可以根据强度峰值周围的像素进行限定。例如，使用对于全血分析有用的分辨率(如，0.5μm/5像素)，潜在地代表血小板候选者的区域可被限定为，从强度峰值向外直到约三或四个(3或4)像素，四(4)个像素外的区域被限定为血小板候选者外的区域。本发明不限于这些区域限定，且可以被选择以适于当前的应用。在限定区域内，血小板52具有强度的方向对比度，其中，在朝向区域的边界的方向上，强度从区域的中心向外减小(即，从强度峰值向外，图10中概要地示出)。例如，峰值强度在中心为最大值，并且朝向该区域边界沿着向外延伸的斜坡减少。对于按照形成图像的像素而被逐步分割的图像，每个像素在朝区域边界的方向上具有强度的减少。这种强度递减存在于在该区域中心的最大强度值之外的多个方向上，但是并不是必须存在于所有方向上。该强度方向对比度的周向均匀性，可以通过定量地评估围绕该候选者的强度峰值每旋转“Y”度(如，每30度)时的像素的图像强度来评估。每像素强度降低的比率，也可以变化以适应当前应用。另外，第一强度减少百分比可用于样品的第一区域，第二较高的强度减少百分比可用于样品的血小板识别较为困难的其他区域；例如，在较高的血浆强度区域或RBC区域，使用较高的强度减少百分比。图10概略地描述了血小板候选者的强度峰值，其示出在朝向区域边界的单一方向上从区域中心向外的强度递减。
另一种通过算法评估单个候选者的特征的技术包括：定量确定在给定区域(根据方向对比度如上限定的区域)中围绕候选者强度峰值的强度递减的高斯分布。图11a至图11c概略地说明了强度峰值周围强度的三种不同的高斯分布。在图11a中，一种清晰地限定的强度峰值位于区域中心，且该强度分布均匀地远离该中心峰值减少；逐像素减少约4％的强度。这种强度分布在血小板图像中非常典型，且具有这种分布的血小板候选者被接受作为血小板图像。在图11b中，这种分布说明了在被近似相同的强度区域(例如，该中心像素之间的强度变化低于3％)包围的该区域中心内的强度峰值，该近似相同的区域反而被在向外方向上有相对大的强度减少的区域包围。这种强度分布(作为具有大强度峰值区域出现)在血小板图像中不太典型，且可能会作为被过分曝光的图像的函数。基于该图像的情况，具有这种类型的高斯分布的血小板候选者可以被接受作为血小板；如，在它们有利地与局部血小板强度值等比较时，被接受作为血小板。在图11c中，该分布说明了一种在该区域中心内的相对清晰的强度峰值，该区域环绕沿外方向的强度骤减。这种强度分布不是血小板的象征，且这些血小板候选者也没有被接受作为血小板52。可以对血小板候选者执行高斯分布分析和方向对比度分析中的一种或两种分析。
在基本上未稀释的全血样品中，血小板52可以聚集成簇，在图像中作为具有多个强度峰值的团显示出来。如果簇仅被视为单个血小板，则识别出的血小板52的数目将会比簇中实际存在的血小板的数目少。为了避免这种类型的错误，分析仪42可以在算法上适于识别血小板簇和将它们与单个血小板52区分开来。一种识别和区分出簇的方法包括上面描述的高斯分布分析。这种技术使用高斯分布分析内被定义为血小板候选者的区域(如，半径为“x”像素内的区域)的外部区域。为了识别簇，对比边界处像素的图像强度与局部血浆强度。如果一些候选者边界像素(如，50％)分别具有比局部血浆图像强度大的预定百分比的图像强度，则那么该候选者就被认为是簇。这是识别簇的一种方法的示例，本发明不限于这种特定实例。
一旦识别出簇，则可以使用多种技术来确定该簇中血小板52的数量。例如，可以应用算法以确定对于簇内的每个峰值的阈值图像强度值(Th)。该阈值图像强度值(Th)基于那个特定峰值的图像强度和局部血浆强度值进行确定。该阈值图像强度值(Th)比各个峰值强度值小，但是比局部背景强度值大。为了确定给定簇内血小板52的数量，通过算法应用一种“生长”技术以识别簇。在这种生长技术下，图像单元(如，像素)与峰值强度图像单元相邻且具有等于或大于阈值图像强度值(Th)的强度值，被识别作为簇的一部分。然后这一过程将同一阈值评估，应用到与被识别为簇的一部分的像素相邻的像素。重复这一过程，直到没有发现额外的具有比该阈值等级(Th)高的强度等级的相邻像素出现。
一旦该簇“成熟”了，确定在该簇内与每个成熟的血小板(即，各个个体从上面描述的图像强度峰值向外延伸)相关联的面积，并确定这些延伸区域的平均面积值(PLT平均成熟面积)。然后，对比该平均面积值(PLT平均成熟面积)与已知的平均正常血小板面积(PLT平均正常面积)。如果平均成熟面积(PLT平均成熟面积)大于平均人类血小板面积的多倍(如，α*人类血平均正常面积，其中α可能等于1.x)，则可以由簇的总面积(A簇)除以平均人类血小板面积(如，A簇/PLT平均正常面积)来限定该簇内的血小板52的数量。如果平均成熟面积(PLT平均成熟面积)小于上述平均人类血小板面积的多倍，则可以由簇的总面积(A簇)除以平均成熟血小板面积(如，A簇/PLT平均成熟面积)来限定簇内的血小板52的数量。
对于那些使用分析腔24的血小板分析，该分析腔24(例如在‘114申请中公开的腔)具有在其内设置的小珠31，小珠31可以这样出现在图像中：其具有围绕其边界的亮环，即，图像内高强度的环。图12显示的图像包括多个小珠31，每个小珠31具有在其边界小珠31周围的高图像强度的环。
为了避免与小珠31相关的可能的血小板识别误差(如，在亮环内、或者非常接近环、或者在环内)，分析仪42可用于使用基于规则的分类器基于多个特征评估与小珠31相关的强度峰值。然而，为了分析用于血小板52的小珠相邻区域，本发明不限于单独使用该分析仪。
作为初始步骤，在图像样品中识别小珠31。例如，在所形成的样品图像内可识别小珠31以确定样品体积，在该图像中小珠呈现为暗斑；如，在一些情况下，识别出来的小珠可以被遮盖以更清楚地呈现为暗斑，从而促进分析。然而，本发明不限于识别小珠31的这一技术。
一旦识别出小珠31，则识别小珠区域内的每个图像强度峰值，并将其视作血小板候选者。为了进一步评估血小板候选者，然后候选者可受到如上所述的“生长”技术的影响，以确定该候选者是否是血小板候选者或者可能是血小板簇。
对于被识别作为血小板候选者的每个强度峰值(例如，定位最靠近小珠31)，该候选者可使用基于规则的分类器进一步评估候选者。在该基于规则的分类器的步骤中，使用多个定量特征中的至少一些特征来分析每个血小板候选者，多个定量特征中包括：面积、标准化峰值强度值、标准化平均强度值、标准化估算血浆强度、圆度、范围(Extent)、坚实度(Solidity)、偏心率、长轴长度和短轴长度。这些定量特征是基于规则的分类器内可以使用的特征的例子，但本发明不限于这些特定特征。此外，本发明不限于使用任何特定数量的这些特征或这些特征的任意特定结合；如，在一些情况下，基于规则的分类器在分类过程中可以使用少到一个特征或多到所有特征。
例如，为了评估特定的血小板候选者，该分类器可以先考虑候选者面积。可以基于该图像中候选者血小板占用的像素的数目来分配该候选者面积的定量值。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的标准化峰值强度值的定量值。例如，如上文所述，图像强度值可被赋予例如0单位至4095单位(“IVU”)中的任意数值范围的值。在这种特征中，将所确定的值除以4095可对峰值图像强度值标准化。如上所述，该0-4095的强度范围是一种任意范围，且本发明不限于这种特定范围。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的标准化平均强度值的定量值。在这种特征中，将所确定的值除以4095来平均和标准化血小板候选者内的像素的图像强度值。这里再次地，该0-4095的强度范围是一种任意范围，且本发明不限于这种特定范围。
基于规则的分类器也适于考虑代表对于血小板候选者局部的血浆的标准化估算血浆强度的定量值。在这种特征下，以如上描述的方式相同或类似的方式，识别局部血浆区域，并确定那些血浆区域的代表性图像强度值；如，确定局部血浆区域的平均强度值。采用例如上面描述的方式，标准化局部血浆区域的代表性图像强度值；例如，将该值除以4095。
该基于规则的分类器还适于考虑代表血小板候选者的圆度的定量值。一种确定血小板候选者的圆度的方法包括使用下述等式：
其中，术语周长被定义为围绕血小板候选者边界的距离，而术语面积是血小板候选者的面积。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者范围的定量值。在这一特征中，确定代表在边界框60中也在“分割遮盖”62内的像素比例的定量值，该值被称为范围。“分割遮盖”62指边界框60内被血小板候选者所占用的区域。边界框60的一个示例是包围分割遮盖62的正交网格64内最小的框。图13概略地示出置于正交网格64的边界框60部分内的椭圆形血小板候选者的分割遮盖62。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的坚实度的定量值代表。在这一特征中，确定代表在凸壳66内也在分割遮盖62内的像素比例的定量值，该值也被称为坚实度。如上所述，该分割遮盖62指被血小板候选者占用的区域。该凸壳66可以被定义为最小框，例如，分割遮盖62可刚好放入该最小框内，其中，包66可能不正交对齐。图14概略地示出置于凸壳66内的图13中示出的椭圆形分割遮盖62。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的偏心率的定量值。在这种特征中，确定椭圆形焦点之间的距离和其长轴长度的比率的定量值。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的长轴长度的定量值。在这种特征中，确定与分割遮盖具有相同标准化的第二中心矩的椭圆形的长轴的长度(以像素表示)的定量值。
基于规则的分类器也适于考虑代表血小板候选者的短轴长度的定量值。在这种特征中，确定与分割遮盖具有相同标准化的第二中心矩的椭圆形的短轴的长度(以像素表示)的定量值。
在来自特定对象的样品总体内，每一特征的定量值可在某种程度上发生变化，且还也在对象之间发生变化。例如，本发明通过典型地利用多个特征评估血小板候选者，来解释这种变化性。通过使用多于一个特征来评估和识别血小板候选者，本方法降低了任何具体特征对评估的精确度产生负面影响的可能性。该变化性也可通过选择性调整与每一特征相关的基准定量值的幅值来说明。
在一些实施方式中，基于规则的分类器为基于学习模型的分类器。训练样品图像用于训练分类器，而受过训练的分类器反过来构建学习模型。一旦建立学习模型，则利用该模型评估与来自样品的血小板候选者图像相关的特征(例如，如上文所描述的那些特征)，以及基于那些特征包括或排除那些特征。
训练样品图像为根据经验采集的血小板图像；例如由专业技术人员采集的血小板图像。在一些实施方式中，训练样品图像可被分到各个特征相关的组中。出于训练目的，对于每一特征，选择血小板图像的数目以提供充分的数据，即提供充分的数据以使分类器受到训练从而对于分析类型来说具有可接受的精确度水平。在该实施方式内所使用的学习模型不限于任何特定尺寸的训练组。训练组经常可包含成百到成千个各类型的血小板特征以如实地表示在不同人、不同成像条件等中的变化性。
通过定量地评估训练组内的每一血小板图像可训练分类器(和建立学习模型)，以提供每一血小板的每一特征的基准定量值。然后，共同的基准定量值(或基准值的统计学表示)可用于建立学习模型。学习模型允许本申请基于实际的图像数据和该图像数据的自动解释进行调整从而提供所需的精确度。本发明不限于任何特定类型的学习模型。可接受类型的学习模型的示例包括诸如多层感知器的神经网络模型、诸如贝叶斯分类器的统计模型、诸如支持向量机(SVM)的线性模型。所有这些类型学习模型都是广为人知的，且本发明不限于其任意特定的实施方式。在一些实施方式中，可以使用这些模型(和/或其它模型)的组合。
在本发明的操作中，将未稀释的全血样品采集到例如图2-5所示的一次性盒中。包括一种或多种着色剂(例如ACO)和抗凝血剂(例如EDTA)的试剂，被添加到样品中以促进血小板分析。将与试剂混合的样品置于盒的分析腔部分中，在成像过程期间样品静止地位于该盒中。将盒插入(或者接合)到分析装置22中，通过盒固定器36将盒相对于物镜、样品照明器38和析像管40合适地定位，随后进行成像。
在多数情况下，分析装置22被程控以对静止地置于腔24内的全部样品进行成像。然而，在一些应用中，可对样品的一部分进行成像。成像方法可根据即将进行的应用而变化。对于上述的血小板分析，成像方法包括使样品受到荧光激发光源(例如来自落射荧光光源的约470nm的光)照射。激发光源导致与位于样品内的成分结合的着色剂发出两个不同的波长的荧光(例如，发出约660nm的红光，发出约540nm的绿光)。析像管40捕获来自样品的发荧光的光，并且提供了代表所捕获的光的强度和颜色(即，波长)的信号。该信号被处理成允许程控分析仪42基于信号形成样品图像的形式，该图像可被定量分析以执行血小板分析。
图15中显示的流程图提供了方法的示例，通过该方法，根据本发明如上所述被成像的样品中的血小板52能够被识别且枚举。本发明不需要图15中确定的所有步骤在所有的实施方式中都被执行，并且也不限于图15中示出的步骤的特定顺序。
图15中示出的第一步骤包括将血液体积遮盖应用于图像以确定被图像内的样品占用的面积，然后该面积可被用于确定分析腔24的样品的体积。也可以生成RBC遮盖以随后用来区分在特定区域内的血小板52。
第二步骤包括去除样品图像内的背景。如上文所述，图像的背景部分可以通过包括阈值法的多种技术来识别，并且一旦被识别出来，可以通过滤波器、分割技术等去除。
第三步骤包括通过识别图像给定区域中的局部强度最大值来识别图像强度峰值。
第四步骤包括识别样品图像或者图像部分中的WBC 50，并将这些不是血小板候选者的图像强度区域的区域排除在外。
第五步骤包括识别样品图像内的小珠31，并布置可用于表示小珠31的图像部分的遮盖。
第六步骤包括估算需要识别血小板52的局部区域中的血浆强度；如，局部血浆强度值可被用于区分血小板52引起的局部强度峰值与血浆引起的局部强度峰值。可以选择性地在样品内的特定区域执行这一步骤；如包含大量的RBC 54的区域。
第七步骤包括分析特定血小板候选者，以确定该候选者的图像强度峰值在从峰值向外延伸的一个或多个方向上是否具有方向对比度。
第八步骤包括分析特定血小板候选者的图像强度的高斯分布。如上所述，该高斯分布的性质提供了特定候选者为真正血小板的可能性相关的信息。
第九步骤包括去除样品图像中的由成像系统中存在的缺陷(如分析腔面板的划痕、面板上的碎屑等)而引起的成分。
第十步骤包括使用图像生长技术从候选者中识别出血小板52。这一技术可以被应用到多种不同类型的血小板候选者上。例如，该生长技术可以被应用到被识别为潜在血小板簇的血小板候选者上。上面描述的示例中，生长技术提供一种方式以评估被血小板候选者(或簇)占用的区域。该区域提供了随后可以被用来评估候选者是否实际上是血小板的信息。如果该候选者是簇，则该区域提供可以被用来确定位于该簇内的血小板52的数量的信息。
第十一步骤包括估算这些被确定为簇的候选者中的血小板52的数量。可用于估算簇内的血小板52的数量的数学方法的示例如上所述。本发明不限于这些特定算法。
第十二步骤包括对非常接近位于腔24内的分离小珠31的血小板候选者进行分类。如上所述，在本发明的一些实施方式中，程控分析仪42适应于一种算法，该算法包括可能包含学习模型的基于规则的分类器。使用分类器评估血小板候选者并枚举该识别出的血小板52。
一旦识别出真正的血小板52，则以单位体积值的血小板数量的方式、或以其它可用的形式，如第十三步骤所述，记录在所确定的样品体积内的血小板52。
尽管已经根据详细实施方式示出和描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本发明可进行形式和细节上的各种修改。

Claims (24)

1.一种用于识别全血样品中的血小板的方法，包括如下步骤：
将至少一种着色剂添加到所述全血样品中，该着色剂用于标记血小板；
将所述全血样品置于由至少一个透明面板限定的腔中；
将静止地置于所述腔中的所述样品的至少一部分进行成像以形成一个或多个图像；和
采用分析仪识别所述样品中的一个或多个血小板，所述分析仪适于基于所述图像内可定量确定的特征，使用分析仪来识别所述血小板，该可定量确定的特征包括强度差异。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述识别步骤包括：确定所述图像内的局部区域内的强度差异。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述识别步骤包括将全局阈值应用于所述图像内的强度差异。
4.如权利要求1所述的方法，还包括识别异常图像部分和估算在所述异常图像部分内的血小板数量。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述识别步骤包括获取血浆的图像强度。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述识别步骤包括使用强度差异的方向对比度来评估血小板候选者。
7.如权利要求6所述的方法，还包括确定峰值强度差异和确定在所述图像内在远离所述峰值延伸的方向上强度递减的值。
8.如权利要求7所述的方法，还包括确定所述强度递减的周向均匀性。
9.如权利要求7所述的方法，还包括确定所述强度递减的高斯分布。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述识别步骤包括评估所述图像以确定所述样品中的一个或多个血小板簇的存在。
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述识别步骤包括识别所述图像中的血小板候选者和使用基于规则的分类器分析一个或多个所述血小板候选者，所述基于规则的分类器使用多个定量特征。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述强度差异为所发射的荧光的强度差异。
13.一种用于识别全血样品中的血小板的设备，包括：
分析盒，所述分析盒包括带有一对平面构件的分析腔，所述平面构件中的至少一个是透明的，所述盒用于将至少一种着色剂添加到所述全血样品中，所述着色剂用于标记血小板，且所述腔用于保持所述样品静止地置于平面构件之间；和
分析装置，所述分析装置用于将所述静止地置于所述腔内的样品的至少一部分进行成像，该分析装置适于基于所述图像内的可定量确定的特征来识别所述血小板，该可定量确定的特征包括强度差异。
14.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于确定所述图像内的局部区域内的强度差异。
15.如权利要求14所述的设备，其中，所述分析装置适于将全局阈值应用于所述图像内的强度差异。
16.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于识别异常图像部分和估算所述异常图像部分的血小板数量。
17.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于获取血浆的图像强度。
18.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于使用强度差异的方向对比度来评估血小板候选者。
19.如权利要求18所述的设备，其中，所述分析装置适于确定峰值强度差异和确定在所述图像内在远离所述峰值延伸的方向上强度递减的值。
20.如权利要求19所述的设备，其中，所述分析装置适于确定所述强度递减的周向均匀性。
21.如权利要求19所述的设备，其中，所述分析装置适于确定所述强度递减的高斯分布。
22.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于评估所述图像以确定所述样品中一个或多个血小板簇的存在。
23.如权利要求13所述的设备，其中，所述分析装置适于识别所述图像中的血小板候选者和使用基于规则的分类器分析一个或多个所述血小板候选者，所述基于规则的分类器使用多个定量特征。
24.如权利要求13所述的设备，其中，所述强度差异为所发射的荧光的强度差异。
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