CN102084241A - 使用荧光淬灭和/或漂白分析个体细胞或微粒的方法及设备 - Google Patents

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Abstract

提供一种用于分析血液样本的方法，包括以下步骤：a)提供具有一个或多个第一组分以及一个或多个第二组分的血液样本，第二组分与第一组分不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和第二组分的荧光发射以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；f)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的荧光值；g)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的光密度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定的荧光值和光密度值来识别第一组分和第二组分。

Description

使用荧光淬灭和/或漂白分析个体细胞或微粒的方法及设备
本发明要求于2008年3月21日提交的美国临时专利申请序列号为61/038,578的优先权，其公开的主题以引文方式并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于分析血液样本的设备和方法，具体地讲，涉及用于检测、识别和计数样本内的诸如细胞或微粒之类的组分的设备和方法。
背景技术
内科医生、兽医和科学家检查人类和动物的生物流体(尤其是血液)，以确定组分的数量以及识别是否存在在健康的受试者中没有发现的异常组分。通常被测量、定量和识别的组分包括红细胞(RBC)、白细胞(WBC)和血小板。RBC分析可以包括确定RBC数目、大小、体积、形状、血红蛋白含量和浓度、以及血细胞比容(也被称为红细胞压积)。RBC分析还可以包括确定红细胞(诸如DNA，RNA)内是否存在某些成分和/或确定这些成分的浓度，包括检测RBC中是否存在和/或存在多少血液寄生虫(例如疟原虫)或者检测WBC中是否存在和/或存在多少细胞外的或利什曼原虫组织的睡病虫，以及检测是否存在和/或存在多少其他血液寄生虫。WBC分析可以包括确定WBC子类型的族群(population)频率，通常称为分类WBC计数，以及通知任何在健康的受试者中没有发现的异常细胞类型。血小板(或者在包括鸟、爬行动物和鱼的某些动物中为凝血细胞(thrombocyte)，该凝血细胞在功能上类似于哺乳动物的血小板，但是比哺乳动物的血小板大约10倍且是有核的)分析可以包括对血小板数目、大小、形状结构和体积的确定，包括确定样本中是否存在血小板或凝血细胞的凝块。
在诸如Wintrobe’s Clinical Hematology第12版的医学文献中详细描述的已知的血液检查技术通常将检查方法分为手动、离心和阻抗型方法。手动方法通常涉及产生精确确定的血液或流体样本的体积，该血液或流体样本被定量稀释并且在计数室中被直观计数。手动检查方法包括检查其中通过目测确定微粒类型的相对量的外周涂片。离心检查方法涉及对样本进行离心，使得根据组分的相对密度将样本分成多个组分层。可以给组分层染色，以增强可见性或检测性。阻抗型方法涉及检查根据被测量的微粒而处理的血液的精确体积；例如溶解RBC来计数有核细胞以及在导电流体中体积(volumetrically)稀释样本。该过程通常涉及监视施加给通过窄通道的样本的电流或电压，以确定当微粒以单行通过时微粒对电流/电压的影响。其他技术涉及对通过光束入射到以单行通过的微粒的光的强度和散射角的分析。还可以使用流式细胞测定法，该方法涉及利用附着于针对细胞或微粒类型上存在的表面抗原决定簇的抗体的荧光基团给悬浮中的感兴趣的微粒染色、用适当波长的光激发染色微粒、以及分析各个微粒/细胞的发光(emission)。
除了外周涂片或离心分离之外，上述所有方法都要求滴涂精确的样本体积。样本体积的不精确将导致相关分析中同一数量的定量误差。除了离心方法之外，上述所有方法还都要求样本与一种或多种液体试剂或稀释剂混合，并且为了获得精确的结果还要求对仪器进行校准。在外周涂片的情况下，需要高度训练来正确地检查涂片。上述的许多方法产生大量的污染物，而处理这些污染物是昂贵的。另外，上述方法不适于确定其中红细胞和凝血细胞有核的鸟、爬行动物和鱼中的以及其中红细胞尺寸非常小并且可能与血小板混淆的某些哺乳动物中的全血计数(CBC)。
可以通过检查人类或动物的血液确定的信息量是巨大的。确定RBC指数尤其有用；例如，单个细胞大小、单个细胞血红蛋白含量和浓度、以及样本内的RBC的族群统计。如上述引用的Wintrobe的文献中的讨论所表明，对于上述参数中的每种参数的平均和离差统计(例如，变异系数)还可以提供重要信息，这已经使得外科医生能够对RBC紊乱进行更好地分类。
发明内容
提供一种用于分析静止的血液样本内的组分的方法及设备。根据本发明的一个方面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步骤：a)提供具有一个或多个第一组分以及一个或多个第二组分的基本上未稀释的血液样本，其中，第二组分与第一组分不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和第二组分的荧光发射以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；f)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的荧光值；g)使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的光密度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定的荧光值和光密度值来识别第一组分和第二组分。
根据本发明的另一方面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步骤：a)提供具有一个或多个第一微粒以及一个或多个第二微粒的基本上未稀释的血液样本，其中，第二微粒与第一微粒不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一微粒和第二微粒在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；d)以第一波长和第二波长的光照射包含第一微粒和第二微粒的样本的至少一部分；e)对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一微粒和第二微粒的荧光发射以及第一微粒和第二微粒的光密度的图像信号；f)使用图像信号，确定第一微粒和第二微粒中的每一微粒的一个或多个荧光发射值；g)使用图像信号，确定第一微粒和第二微粒中的每一微粒的一个或多个光密度值，该光密度是微粒所吸收的染色剂的函数；以及h)使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一微粒和第二微粒。
根据本发明的又一方面，提供一种用于分析血液样本的方法，该方法包括以下步骤：a)提供具有一个或多个第一组分以及一个或多个第二组分的基本上未稀释的血液样本，其中，第二组分与第一组分不同；b)将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的；c)将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定波长的光时发出荧光；d)以恒定方式用所述波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分一段时间；e)在该段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分成像，并且产生表示针对每个分立时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；f)使用针对每个分立时间点的图像信号，确定静止地置于样本内的第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值，以及针对第一和第二组分中的每一组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变化率；以及g)使用所确定的第一和第二组分中的每一组分的荧光发射值的变化率来识别第一组分和第二组分。
本发明的一个优点在于本发明可以用来利用极少的样本量来确定血液样本的特性，该极少的样本量可以通过毛细管穿刺从病人直接获得，从而使得本发明对现场护理应用更加有用，或者可以根据需要从静脉样本获得该极少的样本量。
本发明的方法的另一个优点在于其对于外部和内部流体都适用，并且与重力和方位无关，因此该方法适于用在手持式设备中和微重力条件下。
通过下面提供的包括附图的详细描述，本发明的方法及与其有关的优点将更加显然。
附图说明
图1至图4是可用在本发明的方法中的分析腔室的截面示意图。
图5是具有多个分析腔室的条带的示意平面图。
图6是具有分析腔室的一次性容器的示意平面图。
图7是具有分析腔室的一次性容器的示意截面图。
图8是可与本发明的方法一起使用的分析设备的示意图。
图9是用图解法示出针对中性粒细胞的作为时间的函数的荧光衰减量的图表。
图10是用图解法示出针对淋巴细胞的作为时间的函数的荧光衰减量的图表。
具体实施方式
本发明的方法利用了分析腔室，该分析腔室可用于静止地保持基本上未稀释的抗凝全血样本以进行分析。该腔室的典型大小可以保持大约0.2至1.0μl的样本，但是该腔室不限于任何特定的体积容量，该容量可以为适应分析应用而改变。在此使用的术语“基本上未稀释的”表示根本未被稀释的血液样本或者未被故意稀释的血液样本，但是为了进行分析，可以对血液样本添加一些试剂。如果添加有试剂的话，就该试剂添加对样本稀释的程度来说，在临床上这种稀释对所进行的分析没有显著的影响。通常，将在执行本发明的方法过程中使用的试剂只有抗凝血剂(例如，EDTA、肝素)和染色剂。这些试剂通常以干粉形式来添加，其目的是不稀释样本。在某些情况下(例如，非常快速的分析)，不必添加抗凝血剂，但是在大多数情况下优选的是添加抗凝血剂以确保样本处于分析可接受的形式。术语“静止”用来描述样本被滴落在腔室内以进行分析，并且在分析过程中该样本不会相对于腔室故意移动；即，样本静止地处于腔室内。就血液样本内存在运动的程度来说，血液样本的形成组分的布朗运动占主导，该运动不会破坏本发明的设备的使用。
掺合到血液样本的至少一部分中的染色剂(colorant)(例如，染料、着色剂等)有助于对吸收该染色剂的组分(例如，WBC和其他包含细胞的核，包括血小板的微粒，其他包含DNA和/或RNA的组分-例如，细胞内或细胞外的血液寄生虫-等)的定量分析。细胞和微粒可以统称为样本内的“组分”。当被某些波长(例如，大约470nm)的光激发时，染色剂发出特征波长(例如，530nm、585nm和660nm)的荧光。细胞将要发出的荧光的特定波长是该细胞和激发光的波长的特性。作为细胞内的染色剂的浓度的函数，染色剂还吸收一个或多个预定波长的光。可接受的染色剂的示例包括体外活体染料吖啶橙和astrozone orange。然而，本发明不限于体外活体染料。
现在参照图1，分析腔室10由具有内表面14的第一平板12和具有内表面18的第二平板16限定。平板12、16都是足够透明的，以使得能够传输通过足量的预定波长的光，以执行如下所述的光密度分析。平板12、16的至少一部分是彼此平行的，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20，该高度可以是已知的或者是可测量的。所示出的RBC 22置于腔室10内。
本发明的方法可以利用具有上述特性的各种不同的分析腔室类型，因此不限于任何特定类型的分析腔室。具有平行的平板12、16的分析腔室简化了该分析，因此是优选的，但是并不是本发明所必需的；例如，可以使用这样一种腔室，即，该腔室的一个平板相对于另一个平板成已知的非平行角度布置。
现在参照图2至图5，示出了一个可接受的腔室10的示例，该腔室10包括第一平板12、第二平板16、以及至少三个布置在平板12和平板16之间的隔离物26。隔离物26可以是可布置在平板12和平板16之间的可用于将平板12和平板16彼此分隔的任何结构。在平板12和平板16之间延伸的隔离物26的尺寸28在此被称为隔离物26的高度28。隔离物26的高度28通常不精确地彼此相等(例如，存在制造公差)，但是处于商业上可接受的用于类似分析设备中的分隔装置的公差内。球状珠是可接受隔离物26的一个示例，并且商业上可从例如Bangs Laboratories of Fishers，Indiana，U.S.A.获得。
在图3所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性大于第一平板12和第二平板16中的一个或者两个的材料组成。从图3可以看出，较大的隔离物26被压缩到大多数隔离物26接触平板12、16的内表面14、18的程度，从而使得腔室高度仅仅稍微小于平均的隔离物26的直径。在图4所示的腔室实施例中，隔离物26由弹性小于第一平板12和第二平板16中的一个或两个的材料组成。在图4中，第一平板12由比球状隔离物26和第二平板16更有弹性的材料形成，并且将以帐篷式(tent-like)的方式覆盖隔离物26。在该实施例中，虽然腔室10的小局部区域可能偏离期望的腔室高度20，但是腔室10的平均高度20将非常接近平均的隔离物26的直径高度。分析显示使用该实施例可以将平均腔室高度20控制为小于4微米的腔室高度的上下1％或更好。除了受到上述的弹性特性(以及诸如隔离物的分布密度之类的其他因素)的限制，隔离物26和平板12、16可以由各种材料制备，只要平板12、16足够透明。由丙烯酸(acrylic)或者聚苯乙烯(polystyrene)组成的透明塑料薄膜是可接受的平板12、16的示例，并且由聚苯乙烯、聚碳酸酯(polycarbonate)、硅酮(silicone)等制成的球状珠是可接受的隔离物26。可接受的隔离物的特定示例是由聚苯乙烯制成的球体，在商业上可以从例如Thermo Scientific of Fremont，Californi a，U.S.A.目录编号为4204A获得4微米(4μm)直径的这种球体。参照图5，垂直布置在另一个平板上方的平板12包括多个以规则的间隔布置的口30(例如，用作气孔)，并且平板12和平板16在多个点处结合在一起。在一些实施例中，结合材料32形成了可用于将样本34横向地包含在分析腔室10内的外腔室壁。这个可接受的分析腔室的示例在美国专利申请公开No.2007/0243117、2007/0087442、以及2008年4月2日提交的美国临时专利申请No.61/041,783和2008年10月31日提交的美国临时专利申请No.61/110,341中详细地进行了描述，这些文献在此以引用方式整体并入本文。
另一个可接受的腔室10的示例布置在如图6和图7所示的一次性容器36中。腔室10形成在第一平板12和第二平板16之间。第一平板12和第二平板16都是透明的，以允许光穿过腔室10。第一平板12和第二平板16的至少一部分彼此平行，在该部分内，内表面14和内表面18彼此间隔开高度20。该腔室10的实施例在美国专利No.6,723,290中更详地进行了描述，该专利以引用方式整体并入本文。图2至图7所示的分析腔室表示可接受的用于本发明方法的腔室。然而，本发明的方法不限于这些特定实施例。
样本内的一些WBC将很可能接触腔室平板的两个内表面，而其他的则不会接触。不要求这些WBC接触内表面，并且不必为了本发明的目的而知道腔室的确切高度。基于典型的WBC大小和WBC在一定程度上可以变形(例如，在腔室内表面之间被部分压缩)的事实，对于大多数动物品种来说，大约2至6微米(2-6μm)的腔室高度是可接受的。大约3至5微米(3-5μm)的腔室高度20特别好地适于分析人类血液。可以在分别具有较大或较小的腔室高度的腔室中执行对WBC实质上大于或小于人类WBC的动物品种的分析。
使用分析设备来执行对静止地置于腔室10内的样本的分析，该分析设备可用于对样本的至少一部分照射和成像并且对该图像进行分析。以容许基于基本单位来确定来自样本的所述部分的荧光发射和光密度的方式产生该图像。术语“基本单位”或者“图像单位”是指所定义的能够分辨样本图像的增量单位。通常被定义为在特定成像系统内能够单独处理的最小图元的像素是图像单位的一个示例，并且图像单位还可以包括集合单位形式的少量像素。还可以以线性项(例如，在焦平面上每像素几微米)来描述成像设备的放大倍数，其中线性维度沿着应用于图像的正交网格的一个特定轴。在焦平面上被传感器像素捕获的实际样本面积因此是成像设备所应用的放大系数的函数。因此，已知成像设备的放大倍数是有用的，但不是必要的。与该像素有关的体积因此是每个像素的图像的面积与腔室高度的乘积。例如，如果放大倍数为每像素0.5微米，则占据200个像素的图像将具有50平方微米的面积，而体积则为50平方微米与腔室高度的乘积。
现在参照图8，适用于本发明的方法的分析设备44的示例包括样本照明器46、析像器48、以及可编程分析器50。样本照明器46包括光源，该光源选择性地产生某些期望波长的光。例如，可以使用发射期望波长(例如，420nm，440nm，470nm等)的光的LED。作为选择，可以使用产生宽波长范围(例如，大概400-670nm)的光的光源，虽然在一些情况下，这种光源可能需要滤波。分析设备44可以包括用于控制光的光学器件。样本照明器46包括透射光源和表面照明光源，每一个均可用于照射停留在腔室10内的样本中的一些或者全部。可接受的析像器48的示例是电耦合器件(CCD)，其将穿过样本的光的图像转换成为电子数据形式(即，信号)。可编程分析器50包括中央处理单元(CPU)并且连接至样本照明器46和析像器48。CPU适于(即，被编程为)选择性地执行实现本发明方法所必需的功能。题目为“Apparatus for Analyzing Biologic Fluids”且于2005年3月15日发布的美国专利No.6,866,823公开了这种分析设备44，该美国专利内容以引文方式整体并入本文。
该分析设备适于：1)对样本的至少一部分成像，并且基于每个像素，产生表示来自被成像的样本的荧光发射和被成像的样本的光密度的图像信号；2)使用图像信号，确定所有静止地停留在样本部分内的第一类型的一个或多个组分和第二类型的一个或多个组分的荧光值；3)确定被成像的第一和第二类型的组分中的每一个的光密度值；以及4)使用所确定的荧光值和光密度值，来识别第一类型的组分和第二类型的组分。
根据本发明的方法，基本上未稀释的全血样本被引入腔室10内，然后如上所述，静止地停留在腔室内。在将样本引入腔室前或者在将样本引入腔室时，在样本中掺合抗凝血剂和染色剂。染色剂被样本内的细胞(例如，WBC和血小板)吸收。此后，当单独讨论WBC时，同样的过程适用于单独讨论血小板或者样本内的其他组分。静止地停留在腔室内的样本的至少一部分被发射穿过样本的光的分析设备44照射。虽然不要求对停留在腔室内的整个样本成像，但是这是优选的，因为这么做通常会提供对样本的更全面的分析并且伴随着准确性的提高。
用已知能够激发来自细胞的与被WBC吸收的染色剂有关的荧光发射的波长的光来照射样本。当被大约470nm波长的紫光照射时用吖啶橙染色的WBC产生荧光发射。特定的发光取决于所使用的染色剂和被照射细胞的细胞内成分(例如，染色剂与细胞的RNA和/或DNA相互作用会引起发光)。一些WBC具有作为荧光标记的荧光发射，荧光标记对于该WBC来说是相对唯一的，因此可以用来识别该WBC。其他WBC具有不易于彼此区分开的荧光发射标记。可以将具有那些“共享的”发射标记的WBC分组成第一类型的WBC或者第二类型的WBC，但是仍然需要某事物来区分这两种WBC类型。
在样本被照射引起荧光发射的同时(或者在顺序上为其后)，样本还被染色剂所吸收的一个或多个波长的光照射。用吖啶橙染色的WBC由于存在吖啶橙例如吸收大约420nm波长的光。可以以光密度(OD)方式描述的吸收量是WBC内的染色剂的浓度和局部条件(例如，pH)的函数。当暴露于相同量的染色剂时，WBC吸收染色剂的倾向作为细胞的生物学特性的函数而在一些WBC细胞类型之间有所不同。例如，WBC内的不同生物学特性(例如，核材料、细胞质等)将吸收不同浓度的染料。每个细胞类型的这些不同的生物学特性，以及与此相关的这些特性所吸收的染色剂的不同浓度可以被用来区分某些细胞类型。作为细胞内的染色剂的浓度的函数，细胞的OD可以被用来区分和识别不同的细胞类型。在一些应用中，细胞之间的OD的差异能够提供足够信息来实现细胞识别。在其他情况下，使用细胞的荧光标记和OD来实现识别。
为了示出本发明的示例，基本上未稀释的血液样本被掺合有吖啶橙并且被引入到具有两个透明的平板的腔室内。样本静止地存在，并且样本内的多个WBC接触腔室的两个内表面。以470nm和420nm波长的光照射样本。470nm波长的光照射产生荧光发射。420nm波长的光照射被染色剂吸收。获得被照射的样本的数字图像。在存在于被成像的样本内的整个WBC族群内识别包括中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(eosinophil)的一组WBC，该组在图像内是“分离的”；例如，通过对图像进行滤波，使得只能看见这个组。中性粒细胞和嗜酸性粒细胞被识别，这是因为这些WBC类型中的每一个在激发时都产生由显著的红色细胞质荧光和绿色细胞核荧光组成的标记荧光图案。然而，该组内的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的荧光发射彼此间非常类似，从而很难区分这两种类型的WBC。
为了区分该组内的这两种类型的WBC，比较分离的WBC的光密度。平均来说，嗜酸性粒细胞内吸收的吖啶橙的浓度大于中性粒细胞内吸收的吖啶橙的浓度，虽然荧光可能是相同的。这是因为相对于中性粒细胞内的染色剂的荧光来说，嗜酸性粒细胞内的染色剂的荧光被淬灭，这是由嗜酸性粒细胞的细胞内容物的特有属性导致的。例如，使用预定的OD截断值(cutoff value)可以将这两种不同类型的WBC区分成分离的子组；例如，OD大于截断值的分离组内的细胞被归入嗜酸性粒细胞，而OD值小于截断值的那些细胞被归入中性粒细胞。
作为选择，可以通过将这两种类型的WBC的测量到的OD值与存储在分析设备内(例如，在查找表中，等等)的根据经验获得的OD值进行比较来区分这两种类型的WBC。
进一步地，可以通过确定单个细胞的细胞质荧光与细胞质OD的比率(荧光/OD)来将这两个WBC子组彼此区分开。为了产生该比率，可以确定和平均针对特定细胞的基于每个像素的荧光发射值和光密度值，该平均值可以用于产生该比率。可以使用其他方法，例如确定每个像素的比率并且对每个像素的比率进行平均，来确定该比率。荧光与OD的比率定量地表示特定细胞内的着色剂的荧光的淬灭。具有较低比率的细胞显示出荧光信号的“淬灭”。可以统计估计分离组内的所有细胞的比率，以确定两个族群之间的分离点。统计上低于分离点的细胞是嗜酸性粒细胞，这是因为荧光与OD的比率低于与中性粒细胞族群相关的比率。类似地，统计上高于分离点的细胞是中性粒细胞，这是因为荧光与OD的比率高于嗜酸性粒细胞族群的比率。
在上述荧光/OD比率分析的另一个实施例中，可以只使用来自被检查细胞的上述平均OD值和荧光发射值(或者OD值和处于大于50％的百分比内的荧光发射值)来确定所述比率。具体地讲，暴露于染色剂的特定细胞中的第一区域(例如，核区域)中的染色剂浓度可能小于第二区域(例如，细胞质区域)中的染色剂浓度。因此，细胞的第二区域(例如，细胞质)的OD将大于细胞的第一区域(例如，核)的OD。类似地，来自细胞的特定区域的荧光发射可能大于来自另一区域的荧光发射。有选择地使用荧光发射/OD值中代表较大的发射强度或OD的一部分值，将获得改进的噪声信号比，这将有助于分析。这方面利用了染色剂通常优选地分布在例如细胞的细胞质内的颗粒(granule)内的事实。
在本发明的另一个实施例中，用激发荧光发射的一定波长(例如，470nm)的光的恒定发射来“漂白(bleaching)”掺合有染色剂的细胞，并且在一段时间内的分立时间点感测发射光的强度，从而可以将样本内的细胞彼此区分开。来自一个特定细胞类型的荧光发射强度的降低的平均速度对于该细胞类型来说是恒定的，但是在多种细胞类型之间该平均速度有所不同。因此，可以使用光发射强度的下降速度来区分细胞类型。例如，图9示出了暴露于光致漂白的各个中性粒细胞的绿色荧光发射的衰减速度52、54、56，以及这些中性粒细胞的绿色荧光发射的平均衰减速度58。图10示出了暴露于同样的光致漂白的各个淋巴细胞的绿色荧光发射的衰减速度60、62，以及这些淋巴细胞的绿色荧光发射的平均衰减速度64。图9和图10所示的曲线清楚地显示出不同细胞类型的不同衰减速度，以及可以使用不同的衰减速度来识别出被分析的细胞的类型。还可以使用光发射强度的下降速度来通过其他特征(诸如，年龄)区分细胞；例如，某一类型的细胞，但是年龄不同，将具有特有的光发射强度的下降速度，该特有的光发射强度的下降速度可以用来区分各种不同的年龄组。
虽然已经通过本发明的具体实施例示出和描述了本发明，但是所属领域的技术人员应当理解在不脱离本发明的思想和范围的情况下可以在形式上或细节上进行各种变化。

Claims (32)

1.一种用于分析血液样本的方法，包括以下步骤：
将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的，所述样本具有一个或多个第一组分和一个或多个第二组分，其中，第二组分与第一组分不同；
将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定的第一波长的光时发出荧光，并且该染色剂用于吸收一个或多个预定的第二波长的光；
以第一波长和第二波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；
对所述的样本的至少一部分成像，包括产生表示来自第一组分和第二组分的荧光发射以及第一组分和第二组分的光密度的图像信号；
使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值；
使用图像信号，确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个光密度值，所述光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及
使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分。
2.如权利要求1所述的方法，其中血液样本实质上未被稀释。
3.如权利要求1所述的方法，其中血液样本是全血。
4.如权利要求1所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由白细胞和微粒组成的组中。
5.如权利要求4所述的方法，其中第一组分和第二组分均是白细胞的类型。
6.如权利要求5所述的方法，其中基于每个像素来确定第一组分中的每一个和第二组分中的每一个的一个或多个荧光发射值。
7.如权利要求6所述的方法，其中每个第一组分和每个第二组分中的至少一个是使用从该组分内的一个区域确定的荧光发射值来识别的，该区域的荧光发射值相对于该组分的其他区域中的荧光值来说高于平均强度。
8.如权利要求7所述的方法，其中基于每个像素来确定第一组分中的每一个和第二组分中的每一个的一个或多个光密度值。
9.如权利要求8所述的方法，其中每个第一组分和每个第二组分中的至少一个是使用从该组分内的一个区域确定的光密度值来识别的，该区域的光密度值相对于该组分的其他区域中的光密度值来说高于平均大小。
10.根据权利要求7所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个的至少一部分内的光密度值进行平均的步骤；以及
其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将所确定的每个组分的平均光密度值与预定的光密度值进行比较。
11.如权利要求10所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
12.如权利要求5所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个的至少一部分内的光密度值进行平均的步骤；以及
其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将所确定的光密度值与经验数据进行比较以将第一组分和第二组分区分开。
13.如权利要求12所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
14.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括为特定细胞来确定所确定的荧光发射值与所确定的光密度值的比率。
15.如权利要求14所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的组中。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述比率是为一个细胞确定的荧光发射值的平均与为该细胞确定的光密度值的平均的比。
17.如权利要求14所述的方法，还包括为第一组分和第二组分中的每一个来确定所确定的荧光发射值与所确定的光密度值之间的比率并且对该比率进行统计估计以识别第一组分和第二组分的步骤。
18.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤仅仅利用了第一组分和第二组分中的每一个的细胞质区域的荧光发射和光密度。
19.如权利要求5所述的方法，其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括对被成像的样本内的实质上所有的组分的荧光发射值进行比较。
20.如权利要求19所述的方法，其中第一组分和第二组分具有实质上类似的荧光发射值的图案。
21.如权利要求20所述的方法，还包括对所确定的第一组分和第二组分中的每一个的至少一部分内的光密度值进行平均；以及
其中使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分的步骤包括将为第一组分中的至少一个和第二组分中的至少一个确定的平均光密度值与预定的光密度值进行比较。
22.如权利要求4所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的微粒。
23.如权利要求22所述的方法，其中第一微粒和第二微粒选自由血小板和血液寄生虫组成的组中。
24.一种分析血液样本的方法，包括以下步骤：
将样本滴落在适于静止保持样本以进行分析的分析腔室中，该腔室由第一平板和第二平板限定，这两个平板都是透明的，所述样品具有一个或多个第一组分和一个或多个第二组分，其中，第二组分与第一组分不同；
将染色剂掺合到样本中，该染色剂用于使第一组分和第二组分在暴露于预定波长的光时发出荧光；
在一段时间内，以恒定方式用所述波长的光照射包含第一组分和第二组分的样本的至少一部分；
在所述的一段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分成像，并且产生表示每个分立时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；
使用每个分立时间点的图像信号来确定静止地置于样本内的第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值，以及针对第一组分和第二组分中的每一组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变化速度；以及
使用所确定的第一组分和第二组分中的每一组分的荧光发射值的变化速度来识别第一组分和第二组分。
25.如权利要求24所述的方法，其中血液样本实质上未被稀释。
26.如权利要求24所述的方法，其中血液样本是全血。
27.如权利要求24所述的方法，其中第一组分和第二组分选自由白细胞和微粒组成的组中。
28.如权利要求27所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的白细胞。
29.如权利要求27所述的方法，其中第一组分和第二组分是每一种类型的微粒。
30.如权利要求29所述的方法，其中第一微粒和第二微粒选自由血小板和血液寄生虫组成的组中。
31.一种分析血液样本的设备，包括：
腔室，适于静止地保持样本；
照明器，用于以一个或多个荧光激发波长的光和一个或多个吸收波长的光来照射样本；
析像器，用于对样本进行成像，并且产生表示来自置于样本内的第一组分和第二组分的荧光发射和置于样本内的第一组分和第二组分的光密度的图像信号，其中第一组分和第二组分不同；以及
分析设备，适于使用图像信号来确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值，和使用图像信号来确定第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个光密度值，该光密度是组分所吸收的染色剂的函数；以及使用所确定的荧光发射值和光密度值来识别第一组分和第二组分。
32.一种分析具有第一组分和第二组分的血液样本的设备，其中第一组分和第二组分不同，该设备包括：
腔室，适于静止地保持样本；
照明器，用于在一段时间内，以恒定方式用一个或多个荧光激发波长的光来照射包含一个或多个第一组分和一个或多个第二组分的样本的至少一部分；
析像器，用于在所述的一段时间内的分立时间点对所述的样本的至少一部分进行成像，并且产生表示每个分立时间点的来自第一组分和第二组分的荧光发射的图像信号；以及
分析设备，适于使用每个分立时间点的图像信号来确定静止地置于样本内的第一组分和第二组分中的每一组分的一个或多个荧光发射值，和针对第一组分和第二组分中的每一组分确定分立时间点之间的荧光发射值的变化速度；以及使用所确定的第一组分和第二组分中的每一组分的荧光发射值的变化速度来识别第一组分和第二组分。
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