ES2634715T3 - Método y aparato para la identificación automatizada de plaquetas en una muestra de sangre completa a partir de imágenes de microscopio - Google Patents

Abstract

Un método para identificar plaquetas (52) dentro de una muestra de sangre completa, que comprende: 5 añadir al menos un colorante a la muestra de sangre completa, colorante que puede marcar plaquetas (52); colocar la muestra de sangre en una cámara (24) definida por al menos un panel transparente (26, 28); captar la imagen de al menos una parte de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la cámara (24) para crear una o varias imágenes; e identificar una o varias plaquetas (52) dentro de la muestra utilizando un analizador adaptado para identificar las plaquetas (52) en base a características determinables cuantitativamente dentro de la imagen utilizando un analizador, características determinables cuantitativamente que incluyen diferencias de intensidad; en el que la etapa de identificación incluye representar una intensidad del plasma en la imagen.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y aparato para la identificacion automatizada de plaquetas en una muestra de sangre completa a partir de imagenes de microscopio

Antecedentes de la invencion

1. Campo tecnico

La presente invencion se refiere a metodos y a aparatos para realizar analisis en muestras de sangre completa a partir de imagenes de microscopio en general, y a la version automatizada de los mismos que comportan plaquetas en particular.

Antecedentes

Los diagnosticos medicos a menudo incluyen el analisis de una muestra de sangre completa de un paciente. Uno de los diagnosticos mas habituales es un conteo sangumeo completo (denominado “CSC”), que es un conjunto de pruebas que incluye un “conteo de plaquetas” (es decir, un conteo de trombocitos). El conteo de plaquetas es realmente una determinacion de concentracion; es decir, el numero de plaquetas por volumen. En un adulto, un conteo de plaquetas normal vana generalmente entre aproximadamente 150.000 y 450.000 plaquetas por microlitro de sangre. Un conteo de plaquetas anormal puede ser indicio de un problema de salud; por ejemplo, infeccion, enfermedad, etc. Si los niveles plaquetarios caen por debajo de 20.000 por microlitro, puede producirse un sangrado espontaneo y se considera un riesgo potencialmente mortal.

Tradicionalmente, los conteos de plaquetas se han realizado o bien untando una pequena cantidad de sangre no diluida en un portaobjeto o mediante citometna de flujo. En el caso del portaobjeto, la muestra se aplica a un portaobjeto y las plaquetas y otros componentes que residen en el portaobjeto se cuentan. El conteo de plaquetas (es decir, las plaquetas por volumen en la muestra) se calcula en funcion de los componentes relativos en la muestra.

Para realizar un conteo de plaquetas por impedancia o citometna de flujo optica, la muestra de sangre debe diluirse y despues enviarse a traves de un recipiente pequeno en el que los sensores de impedancia u opticos puedan evaluar las celulas componentes en la muestra a medida que atraviesan el recipiente en serie. La exactitud de estos dispositivos puede sufrir, dependiendo de los componentes presentes en la muestra. En un conteo por impedancia, por ejemplo, los fragmentos de globulos rojos pueden interpretarse y contarse como plaquetas, y las plaquetas gigantes pueden interpretarse y contarse como globulos rojos (hematies). En ambos casos, la exactitud del conteo de plaquetas automatizado sufre. Ademas, la dilucion de la muestra debe ser precisa o la exactitud se ve afectada negativamente, y la muestra diluida debe desecharse adecuadamente despues del analisis. El circuito interno necesario para manipular la muestra diluida suele requerir mantenimiento y en el mejor de los casos contribuye notablemente a la complejidad y el coste del dispositivo.

Lo que se necesita es un aparato y metodo para realizar analisis automatizados sobre una muestra de sangre completa, incluido un conteo de plaquetas, que pueda superar las limitaciones de la tecnica anterior, incluido el tiempo necesario para realizar el analisis, el nivel de conocimientos del operador necesario para realizar el analisis, y que pueda proporcionar una mayor versatilidad que los metodos y aparatos conocidos de la tecnica anterior.

Sumario de la invencion

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para identificar plaquetas en una muestra de sangre completa como se reivindica en la reivindicacion 1.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invencion, se proporciona un aparato para identificar plaquetas en una muestra de sangre completa como se reivindica en la reivindicacion 8.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, se determinan diferencias de intensidad en regiones locales dentro de una imagen.

De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, los candidatos plaquetarios se evaluan utilizando un contraste direccional de una diferencia de intensidad.

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se evalua la imagen para determinar una presencia de uno o varios grupos de plaquetas en la muestra.

De acuerdo con un aspecto de la presente invencion, se identifican y analizan candidatos plaquetarios en la imagen utilizando un clasificador basado en reglas que utilice una pluralidad de caractensticas cuantitativas.

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Los aspectos de la presente invencion descritos anteriormente y las realizaciones pueden utilizarse individualmente o combinados entre s^ y la presente invencion no se limita a ninguna configuracion particular. Estos y otros aspectos, realizaciones, caractensticas y ventajas de la presente invencion seran evidentes teniendo en cuenta la descripcion detallada de la invencion que se proporciona a continuacion, y tal como se ilustra en los dibujos adjuntos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 es una vista esquematica de un dispositivo de analisis que puede realizar un analisis plaquetario de acuerdo con la presente invencion.

La Figura 2 es una vista en perspectiva de un cartucho de analisis que tiene una camara de analisis que puede utilizarse con la presente invencion.

La Figura 3 es una vista despiezada del cartucho mostrado en la Figura 2

La Figura 4 es una vista planar desde arriba de una bandeja que sujeta una camara de analisis.

La Figura 5 es una vista esquematica en seccion de una camara de analisis.

La Figura 6 es una imagen que muestra plaquetas y globulos blancos en una muestra bajo imagen fluorescente. La Figura 7 es una imagen que muestra una interfaz de lmea de cola / muestra.

La Figura 8 es una imagen que muestra una interfaz de muestra / aire.

La Figura 9 es una imagen de una region de entrada de la muestra de una camara.

La Figura 10 es una ilustracion esquematica del contraste direccional de la intensidad en una plaqueta.

Las Figuras 11 a-11c son ilustraciones esquematicas de distribuciones de Gauss de la intensidad de la imagen en un candidato plaquetario.

La Figura 12 es una imagen que muestra una perla en una muestra bajo captacion de imagen fluorescente.

La Figura 13 es una vista esquematica de un candidato plaquetario en un cuadro delimitador de una cuadncula ortogonal.

La Figura 14 es una vista esquematica del candidato plaquetario que se muestra en la Figura 14, colocado ahora en una envolvente conexa.

La Figura 15 es un diagrama de flujo que ilustra una realizacion del presente metodo para identificar plaquetas en una muestra mediante imagenes de la muestra.

Descripcion detallada de la invencion

Haciendo referencia a las Figuras 1 y 2, los aspectos de la presente invencion incluyen un metodo y un aparato para identificar y enumerar plaquetas en una muestra de sangre que reside de forma quiescente en una camara de analisis. La camara de analisis se incluye generalmente en un cartucho 20 que se configura para su uso con un dispositivo de analisis 22 automatizado, dispositivo que tiene hardware de captacion de imagenes y un analizador programable adaptado para adquirir y analizar imagenes de la muestra y, por tanto, identificar y enumerar plaquetas en la muestra.

Haciendo referencia a las Figuras 2-5, la presente invencion no se limita al uso con cualquier realizacion de camara de analisis particular. Ejemplos de camaras de analisis aceptables (y los cartuchos que las acompanan) se describen en la patente de Estados Unidos n.° 7.850.916, y las solicitudes de patente estadounidense con n.° de serie 12/971.860; 13/341.618; y 13/594.439. Para los fines de esta divulgacion, se describira la invencion como si utilizara el cartucho y la camara de analisis descritos en la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 13/594,439. La camara de analisis 24 desvelada en la Solicitud '439 incluye un miembro planar 26 superior y un miembro planar 28 de base fijado a una bandeja 30 que se monta de forma desmontable en el cartucho 20. En algunas realizaciones, una pluralidad de perlas 31 separadoras (por ejemplo, perlas de tamano uniforme) se colocan entre los are miembros planares 26, 28 superior y de base, generalmente en contacto con las superficies opuestas de los miembros planares. La Figura 2 muestra el cartucho 20 en forma montada. La Figura 3 muestra una vista despiezada del cartucho 20, que incluye la camara de analisis 24 y la bandeja 30. La Figura 4 es una vista desde arriba de la camara de analisis 24 montada sobre la bandeja 30, y muestra una vista plana X-Y de la camara 24. La Figura 5 es una vista transversal esquematica de la camara 24, que ilustra una vista plana Z-X de la camara 24. La altura 32 de la camara 24 se extiende a lo largo del eje Z, extendiendose entre las superficies interiores opuestas 34, 36 de los miembros planares. Para los analisis de muestras de sangre completa, la altura 32 de la camara 24 es preferentemente de aproximadamente cuatro micrones (4pm), pero la camara 24 no se limita a dicha altura.

Haciendo referencia a la Figura 1, un dispositivo de analisis 22 que puede usarse con la camara 24 descrita anteriormente, incluye generalmente una lente objetivo 34, un posicionador 36 del cartucho, uno o varios iluminadores 38 de la muestra, uno o varios disectores 40 de la imagen, y un analizador 42 programable. Uno o ambos de la lente objetivo 34 y el posicionador 36 del cartucho pueden acercarse o alejarse entre sf para cambiar una posicion focal relativa del dispositivo relativo a la camara 24 y la muestra colocada en el interior.

El iluminador 38 de la muestra ilumina la muestra utilizando luz desde longitudes de onda predeterminadas. Por ejemplo, el iluminador 38 de la muestra puede incluir una fuente de luz de epifluorescencia y una fuente de luz de transmision. Como se explicara mas adelante, un colorante tal como Naranja de Acridina (tambien denominado “Naranja Basico 15” o “NDA”) emite luz a longitudes de onda particulares cuando se mezcla con sangre completa y

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se somete a una longitud de onda de excitacion desde la fuente de luz epifluorescente, una fuente que habitualmente produce luz en el intervalo de aproximadamente 450-490 nm. Una longitud de onda de excitacion a aproximadamente 470 nm es particularmente util. La fuente de luz de transmision puede producir luz a longitudes de onda asociadas con luz roja y verde, por ejemplo. La luz roja se produce generalmente en el intervalo de aproximadamente 600-700 nm, prefiriendose luz roja a aproximadamente 660 nm. La luz verde se produce generalmente en el intervalo de aproximadamente 515-570 nm, prefiriendose luz verde a aproximadamente 540 nm. La luz transmitida a traves de la muestra, o que fluoresce desde la muestra, se captura utilizando el disector 40 de la imagen, y una senal representativa de la luz capturada se envfa al analizador 42 programable, donde se procesa en una imagen. La imagen se produce de una forma que permite determinar la transmitancia luminosa o la intensidad de fluorescencia capturada dentro de la imagen sobre una base unitaria; por ejemplo, siendo “sobre una base unitaria” una unidad incremental de la cual puede diseccionarse la imagen de la muestra, tal como un pixel.

Un ejemplo de un disector 40 de la imagen aceptable es un sensor de imagen de tipo dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) que convierte la luz que pasa a traves de (o desde) la muestra en una imagen con formato de datos electronicos. Los sensores de imagen del tipo semiconductores complementarios de oxido metalico (“CMOS”) son otro ejemplo de un sensor de imagen que puede utilizarse. Las senales del disector 40 de la imagen proporcionan informacion para cada pixel de la imagen, informacion que incluye, o que puede obtenerse para incluir, intensidad, longitud de onda y densidad optica. A los valores de Intensidad se les asigna una escala arbitraria de, por ejemplo, 0 unidades a 4095 unidades (“UVI”). La densidad optica (“DO”) es una medida de la cantidad de luz absorbida en relacion con la cantidad de luz transmitida a traves de un medio; por ejemplo, cuanto mayor sea el valor “DO”, mayor es la cantidad de luz absorbida durante la transmision. La DO puede describirse cuantitativamente en unidades de densidad optica (“UDO”) o fracciones de las mismas; por ejemplo, una MiliUDO es un 1/1000° de una UDO. Una unidad de “DO” disminuye la intensidad de la luz en un 90 %. Una “UDO” o “MiliUDO” como valor cuantitativo puede utilizarse para imagenes adquiridas u obtenidas mediante luz de transmision. La informacion del disector 40 de la imagen puede separarse en multiples canales. Por ejemplo, la informacion del disector 40 de la imagen puede separarse en tres canales. Sin embargo, la presente invencion no se limita a una realizacion de tres canales. Un primero de los tres canales puede dirigirse hacia la informacion relativa a la luz emitida desde la muestra a una primera longitud de onda (por ejemplo, 540 nm, que aparece verde). Un segundo canal puede dirigirse hacia la informacion relativa a la luz emitida desde la muestra a una segunda longitud de onda (por ejemplo, 660 nm, que aparece roja). Un tercer canal puede dirigirse hacia la informacion relativa a la luz que atraviesa la muestra a una tercera longitud de onda (por ejemplo, 413 nm, que se utiliza para determinar densidad optica - “DO” - azul). La presente invencion no se limita a estas longitudes de onda o numero de canales en particular.

El analizador 42 programable incluye una unidad central de proceso (CPU) y esta en comunicacion con el posicionador 36 del cartucho, el iluminador 38 de la muestra, y el disector 40 de la imagen. El analizador 42 programable se adapta (por ejemplo, se programa) para enviar y recibir senales desde uno o varios del posicionador 36 del cartucho, el iluminador 38 de la muestra, y un disector 40 de la imagen. Por ejemplo, el analizador 42 se adapta para: 1) enviar y recibir senales desde el posicionador 36 del cartucho para situar el cartucho y la camara 24 relativos a uno o varios de los sistemas opticos, el iluminador 38, y el disector 40 de la imagen; 2) enviar senales al iluminador 38 de la muestra para producir luz a longitudes de onda definidas (o, como alternativa, a multiples longitudes de onda); y 3) enviar y recibir senales desde el disector 40 de la imagen para capturar luz por periodos de tiempo definidos. Cabe senalar que la funcionalidad del analizador 42 programable puede implementarse utilizando hardware, software, firmware, o una combinacion de los mismos. Un experto en la materia sena capaz de programar la unidad de proceso para realizar la funcionalidad descrita en el presente documento sin excesiva experimentacion.

El analizador 42 programable tambien se adapta para procesar las senales recibidas desde el disector 40 de la imagen de acuerdo con algoritmos que identifican plaquetas dentro de la imagen de la muestra, y para distinguir plaquetas de caractensticas de la imagen que son similares a las plaquetas, pero no son plaquetas, y de caractensticas de fondo que ocultan las plaquetas.

El dispositivo de analisis 22 se adapta para captar la imagen de una muestra de sangre completa sustancialmente no diluida colocada dentro de la camara de analisis 24. La muestra se mezcla con una cantidad de colorante fluorescente (u otro colorante) que puede tenir las plaquetas contenidas dentro de la muestra. La adicion y mezcla del colorante con la muestra puede producirse en cualquier momento antes de la captacion de la imagen de la muestra; por ejemplo, mezclarse en los canales del cartucho antes de pasar al interior de la camara 24 por flujo capilar. El colorante impregna y tine las respectivas plaquetas. El colorante, tras la excitacion, produce una emision de luz fluorescente a longitudes de onda particulares asociadas con colores particulares. El color o los colores espedficos y la intensidad de la luz emitida por el colorante dentro de la plaqueta son habitualmente una funcion de una serie de factores, incluidos: la concentracion del colorante dentro de la plaqueta, y el pH de la plaqueta. Como se describira mas adelante, la emision de luz fluorescente produce regiones de emision maxima localizadas que representan la plaqueta desde la cual se estan emitiendo.

Un ejemplo de un colorante aceptable que puede utilizarse al realizar un conteo de plaquetas en una muestra de sangre completa es Naranja de Acridina (“NDA”). NDA es un colorante fluorescente que, al mezclarse con una muestra de sangre completa, tine las plaquetas (y los leucocitos 50 y reticulocitos) dentro de la muestra. La presente invencion no se limita a utilizar NDA, y pueden utilizarse otros colorantes (por ejemplo, Naranja Astrazon) en lugar

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de NDA o en combinacion con NDA. Utilizando NDA como un ejemplo, si la muestra se somete a una luz de excitacion a, o aproximadamente a, una longitud de onda de 470 nm, la NDA dentro de la plaqueta emitira luz a aproximadamente 540 nm (que aparece en verde) y luz a aproximadamente 660 nm (que aparece en rojo).

Para realizar el conteo de plaquetas, el analizador 42 se adapta (por ejemplo, se programa con un algoritmo) para dirigir el iluminador 38 de la muestra para iluminar la muestra que reside de forma quiescente dentro de la muestra con luz de excitacion (por ejemplo, luz a aproximadamente 470 nm) y luz de transmision (por ejemplo, luz a aproximadamente 413 nm y a aproximadamente 660 nm). Tras encontrar la luz de excitacion, el colorante fluorescente dentro de cada plaqueta emite luz verde a aproximadamente 540 nm y luz roja a aproximadamente 660 nm. La luz fluorescente emitida desde la muestra y la luz de transmision que atraviesa la muestra se captura utilizando el disector 40 de la imagen, y una senal representativa de la luz capturada se envfa al analizador 42 programable, donde se procesa en una imagen. La imagen se produce de una forma que permite que la intensidad de fluorescencia y transmision capturada dentro de la imagen se determine sobre una base unitaria.

El analizador 42 programable se adapta para recoger senales de los datos de la imagen desde el disector 40 de la imagen y procesar dichas senales de los datos de la imagen para facilitar la identificacion de las plaquetas mostradas dentro de la imagen. El analizador 42 programable tambien se adapta para determinar el volumen de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara de analisis 24. Por ejemplo, el algoritmo se adapta para identificar penmetros de la muestra dentro de la camara 24 tal como interfaces de lmea de cola 44 / muestra 46 (por ejemplo, ver la Figura 7), lmeas de cola 44 que forman lfmites laterales de la camara 24, e interfaces 49 muestra 46 / aire 48 (por ejemplo, ver la Figura 8) que existen habitualmente en los bordes de la muestra 46 que no encuentran una lmea de cola 44. La altura 32 de la camara 24 se conoce o puede determinarse. Una vez determinada el area de la camara 24 ocupada por la muestra 46 (por ejemplo, cada pixel de la imagen tiene un area de la camara asociada), puede determinarse el volumen de la muestra utilizando el area de la muestra y la altura asociadas con la camara 24.

En algunas realizaciones las senales de los datos de la imagen se procesan inicialmente con un algoritmo de suavizado que filtra las senales para hacer las partes del fondo de la imagen mas uniformes. Un ejemplo de un algoritmo de suavizado aceptable es el que aplica un filtro morfologico (por ejemplo, un filtro de apertura de imagen) a los datos de la imagen. El filtro puede aliviar algunas variaciones del fondo y puede utilizarse para suprimir objetos brillantes grandes de la imagen tales como globulos blancos 50 (“leucocitos”). Los leucocitos 50 pueden aparecer como picos de intensidad debido al material contenido dentro de los leucocitos 50 (por ejemplo, ARN, ADN) que resalta el colorante utilizado para resaltar las plaquetas. La Figura 6 ilustra plaquetas 52 y leucocitos 50 dentro de una imagen. Sin embargo, los leucocitos 50 pueden distinguirse de las plaquetas 52 en base a su gran intensidad de luz en comparacion con las plaquetas 52. Suprimir los leucocitos 50 de la imagen (por ejemplo, mediante un proceso de segmentacion) facilita la identificacion de las plaquetas 52.

Los datos de la imagen tambien se analizan para identificar picos de intensidad local. Este proceso de identificacion de picos locales puede realizarse antes o despues del proceso de “suavizado”, pero realizar la etapa de suavizado en primer lugar elimina algunas posibles fuentes de error antes de la determinacion de la intensidad de picos locales. Sin embargo, esta etapa de suavizado no es obligatoria. La identificacion de los picos de intensidad local en una o varias longitudes de onda definidas puede realizarse utilizando una diversidad de tecnicas diferentes. Como se describira mas adelante, la intensidad de la imagen puede variar sustancialmente por toda la muestra, pudiendo atribuirse las variaciones a factores tales como la variacion de la intensidad del plasma, la proximidad de la lmea de cola, la concentracion de leucocitos, la concentracion de hematies, etc. La exactitud de la identificacion de plaquetas se mejora evaluando cuantitativamente las diferencias de intensidad (es decir, los picos) de forma local. El termino “local”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a pequenas areas definidas dentro de la muestra que residen de forma quiescente dentro de la camara 24, pudiendo definirse las areas en terminos de una region de pfxeles predeterminada; por ejemplo, un cuadrado de pfxeles de 5x5. Un cuadrado de pfxeles de 5x5is es util al evaluar plaquetas 52 porque una plaqueta 31 tfpica de aproximadamente 2-3|jm de tamano encaja en el cuadrado de pfxeles de 5x5 a la resolucion utilizada para la captacion de imagenes. Sin embargo, la presente invencion no se limita a “regiones locales” de este tamano particular. En cada una de estas regiones locales, se determina un valor maximo de intensidad de la imagen de la muestra. Por ejemplo, la muestra puede someterse a una luz de excitacion fluorescente, y adquirirse una imagen de la muestra, incluyendo la imagen la intensidad de luz emitida; por ejemplo, intensidades de luz emitidas dentro del canal fluorescente verde. Una vez determinados los picos de intensidad de la imagen en las respectivas regiones locales, puede aplicarse un umbral global para eliminar los picos de intensidad (por ejemplo, maximos) por debajo del umbral global. Este proceso de identificacion establece todas las partes dentro de la imagen que pueden representar potencialmente una plaqueta 31, denominandose cada una de dichas partes en adelante un “candidato plaquetario”. Una vez identificados todos los posibles candidatos plaquetarios, los datos de la imagen se analizan mas a fondo para eliminar aquellos candidatos que no son plaquetas 52, y para identificar los grupos de plaquetas que pueden estar presentes dentro de la imagen.

La intensidad de la imagen de las partes de la imagen de la muestra que estan proximas a las lmeas de cola 44 de la camara de analisis y la interfaz (o interfaces) 49 muestra/aire pueden contaminarse por los efectos de la intensidad de la luz causados por las lmeas de cola 44 y la interfaz (o interfaces) 49 muestra/aire. Por ejemplo, como puede verse en la Figura 7, cuando la muestra se ilumina las lmeas de cola 44 aparecen brillantes, con una elevada

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intensidad de la imagen. La elevada intensidad de la imagen de las lmeas de cola 44 provoca que las areas proximas tengan mas intensidad que la que tendnan de otro modo, aumentando as^ la posibilidad de una identificacion de plaquetas erronea, o la posibilidad de que las plaquetas 52 se pierdan debido a la intensidad global.

El mismo efecto se produce en cierta medida en la interfaz 49 muestra/aire como puede verse en la Figura 8. Una tecnica que puede implantarse algontmicamente mediante el analizador 42 para representar la contaminacion por intensidad en las partes proximas de la imagen (es decir, areas anomalas) es eliminar la consideracion de dichas partes proximas de la imagen durante el conteo de plaquetas; por ejemplo, mediante enmascaramiento, etc. La determinacion de cuanta imagen de la muestra se suprime puede hacerse, por ejemplo, evaluando datos historicos relevantes. Por ejemplo, la supresion de aproximadamente 100 lmeas de pfxeles de la imagen de la muestra proxima a una lmea de cola suele ser adecuada para eliminar la contaminacion por intensidad atribuible a dicha lmea de cola 44. De forma similar, la supresion de aproximadamente 80 lmeas de pfxeles de la imagen de la muestra proxima a una interfaz 49 muestra/aire suele ser adecuada para eliminar la contaminacion por intensidad atribuible a dicha interfaz. Para representar las plaquetas 52 presentes en las partes suprimidas de la imagen de la muestra, el numero de plaquetas en dicha area puede calcularse en base a numeros de plaquetas relativos determinados en regiones de la imagen de la muestra espedficas del area suprimida.

En algunas realizaciones, puede adaptarse aun mas el algoritmo utilizado dentro del procesador 42 para reconocer otras areas donde el reconocimiento de plaquetas es problematico. Por ejemplo, en algunos casos una region de una camara de analisis 24 puede tener discrepancias que inhibiran una determinacion precisa del volumen. En ese caso, puede verse afectada la capacidad para hacer un conteo de plaquetas preciso (que es una funcion del volumen) en dicha area. La Figura 9, por ejemplo, muestra una region de entrada de la camara que tiene imagenes con anomalfas 58 a causa de una muestra excesiva en el area. Para representar dichas anomalfas, puede calcularse el numero de plaquetas 52 en el area en base a conteos de plaquetas en areas de la muestra espedficas del area problematica.

Otra tecnica para facilitar la identificacion de las plaquetas 52 que puede implantarse algontmicamente mediante el analizador 42 es una supresion del fondo existente dentro de la imagen adquirida inicialmente. Por ejemplo, puede aplicarse un filtro a las senales de los datos de la imagen que suprima las variaciones de intensidad (por ejemplo, intensidad de la luz verde) por debajo de un umbral global predeterminado. Los maximos de intensidad local por debajo del umbral global que podnan identificarse de otro modo como plaquetas 52 pueden eliminarse, eliminando asf la posibilidad de que dichos picos de intensidad se identifiquen incorrectamente como plaquetas 52. Por ejemplo, pueden utilizarse tecnicas de segmentacion como mecanismo para suprimir el fondo. La presente invencion no se limita a ninguna tecnica de segmentacion particular, y puede elegirse una tecnica espedfica en vista de la aplicacion que nos ocupa. La presente invencion tampoco se limita a utilizar una tecnica de segmentacion para suprimir el fondo, y puede utilizar otras tecnicas que seleccionan (es decir, “escogen”) pfxeles o que distinguen de otro modo pfxeles con caractensticas particulares.

Otra tecnica para facilitar la identificacion de las plaquetas 52 que puede implementarse algontmicamente mediante el analizador 42 conlleva representar (por ejemplo, calcular) la intensidad de la imagen del plasma dentro de areas locales de la muestra. El plasma habitualmente aparece mas brillante (es decir, con mas intensidad de imagen) que los hematfes, pero no tan brillante como las plaquetas 52. Al menos parte del colorante fluorescente anadido a la muestra puede residir dentro del plasma y, como consecuencia, iluminar la muestra con luz de excitacion crea cierto nivel de intensidad de la luz emitida dentro del plasma. Sin embargo, puede que la distribucion de colorante dentro del plasma no sea uniforme dentro de toda la muestra. En consecuencia, la intensidad de la imagen del plasma puede variar significativamente dentro de la muestra colocada dentro de la camara de analisis 24. Por ejemplo, los datos de las imagenes indican que la intensidad del plasma en la imagen dentro de una primera area de la muestra puede variar hasta un 30-40 % a partir de la intensidad de la imagen del plasma en una segunda area de la muestra.

La falta de uniformidad dentro de la intensidad del plasma hace que sea diffcil representar uniformemente la intensidad del plasma sin que el proceso de identificacion de plaquetas se vea afectado negativamente. La falta de uniformidad de la intensidad del plasma es particularmente problematica en regiones dentro de la muestra donde residen grandes cantidades de hematfes 54. Si la intensidad del plasma no se representa, pueden aparecer pequenas areas de plasma visibles dentro de las regiones de hematfes como picos de intensidad local que entonces podnan identificarse erroneamente como plaquetas 52. Para solucionar esta cuestion, el algoritmo puede adaptarse para aplicar una mascara de hematfes en las regiones de hematfes para separar los hematfes 54 (o suprimirlos de otro modo de la imagen), dejando las demas areas de plasma. Por ejemplo, los hematfes 54 no tienen expresion en el canal rojo de los datos de las senales de imagenes. Por lo tanto, una imagen formada utilizando una mascara de canal rojo solamente mostrara la intensidad del plasma y cualesquiera plaquetas 52 que esten dentro de la region de los hematfes. Entonces, las plaquetas 52 pueden distinguirse cuantitativamente del plasma local gracias a la diferencia de intensidad (por ejemplo, aquellos pfxeles que sean aproximadamente un 20 % mayores que los pfxeles circundantes) entre los dos componentes de la muestra. En las regiones de hematfes que no tienen suficientes areas de plasma para permitir este tipo de analisis comparativo, puede utilizarse una tecnica alternativa basada en la intensidad de la imagen de los propios hematfes 54. Por ejemplo, la intensidad del plasma de la imagen estimada en dichas regiones puede basarse en el siguiente calculo: (intensidad de la imagen media de los hematfes) +

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3*(desviacion estandar de la intensidad de la imagen de los hematfes) = intensidad del plasma estimada. El presente metodo no se limita a esta tecnica alternativa particular.

Despues de aplicar una o varias de las tecnicas descritas anteriormente a los candidatos plaquetarios y de eliminar la consideracion de los candidatos no plaquetarios (en la medida en que se identifiquen), los demas candidatos pueden analizarse mas a fondo evaluando las caractensticas de cada candidato individual. Una primera tecnica que puede implantarse algontmicamente mediante el analizador 42 conlleva evaluar el contraste direccional del pico de intensidad del candidato dentro de un area determinada. El area puede definirse en terminos de los pfxeles que rodean el pico de intensidad. Por ejemplo, utilizando una resolucion que sea util para un analisis de sangre completa (por ejemplo, 0,5|jm/pfxel), el area que potencialmente representa al candidato plaquetario puede definirse como de hasta aproximadamente tres o cuatro (3 o 4) pfxeles por fuera desde el pico de pico de intensidad, y el area fuera de los cuatro (4) pfxeles puede definirse como fuera del candidato plaquetario. La presente invencion no se limita a estas definiciones del area, que pueden seleccionarse para adaptarse a la aplicacion que nos ocupa. Las plaquetas 52 tienen un contraste de intensidad direccional dentro del area definida, en la que la intensidad disminuye por fuera desde el centro del area (es decir, por fuera desde el pico de intensidad, mostrado diagramaticalmente en la Figura 10) en una direccion hacia el penmetro del area. Por ejemplo, la intensidad del pico esta en un maximo en el centro y disminuye a lo largo de una pendiente que se extiende por fuera hacia el penmetro del area. En terminos de la imagen, que se segmenta por etapas mediante los pfxeles que forman la imagen, cada pixel tiene una disminucion de intensidad que se desplaza en la direccion hacia el penmetro del area. Esta disminucion de intensidad incremental existe en una pluralidad de direcciones fuera del valor de intensidad maximo en el centro del area, pero no necesariamente en todas las direcciones. La uniformidad circunferencial del contraste de intensidad direccional puede evaluarse evaluando cuantitativamente la intensidad de la imagen de los pfxeles cada “Y” grados de rotacion (por ejemplo, cada 30 grados) alrededor del pico de intensidad del candidato. La velocidad de disminucion de la intensidad por pixel tambien puede variar para adaptarse a la aplicacion que nos ocupa. Ademas, puede utilizarse un primer porcentaje de disminucion de intensidad en una primera region de la muestra, y un segundo porcentaje mayor en otras regiones de la muestra en las que la identificacion de plaquetas es mas diffcil; por ejemplo, utilizar un porcentaje de disminucion de intensidad mayor en regiones de mayor intensidad del plasma, o en regiones de hematfes. La Figura 10 representa diagramaticalmente un pico de intensidad de un candidato plaquetario, que ilustra una disminucion de intensidad incremental desde el centro del area por fuera en una sola direccion hacia el penmetro del area.

Otra tecnica para evaluar algontmicamente las caractensticas de un candidato individual conlleva determinar cuantitativamente una distribucion de Gauss de la disminucion de intensidad incremental que rodea al pico de intensidad del candidato en un area determinada (area que se ha definido anteriormente en relacion con el contraste direccional). Las Figuras 11a- 11c ilustran diagramaticalmente tres distintas distribuciones de Gauss de la intensidad que rodea a un pico de intensidad. En la Figura 11a, un pico de intensidad marcadamente definido se situa en el centro del area, y la distribucion de intensidad disminuye uniformemente alejandose del pico central; por ejemplo, una disminucion de intensidad de pixel a pixel de aproximadamente 4 %. Esta distribucion de intensidad es muy tfpica de las imagenes de plaquetas y los candidatos plaquetarios que tienen esta distribucion se aceptan como imagenes de plaquetas. En la Figura 11b, la distribucion ilustra un pico de intensidad dentro del centro del area, rodeado de una region de casi la misma intensidad (por ejemplo, una variacion de menos del 3 % de intensidad entre los pfxeles centrales), region que a su vez esta rodeada por una region de una disminucion de intensidad relativamente grande en la direccion hacia fuera. Esta distribucion de intensidad (que aparece como que tiene un area del pico de intensidad grande) es menos tfpica de las imagenes de plaquetas y puede ser una funcion de la imagen que se esta sobreexponiendo. Dependiendo de las circunstancias de la imagen, los candidatos plaquetarios que tienen este tipo de distribucion de Gauss pueden aceptarse como una plaqueta; por ejemplo, aceptarse cuando son favorablemente comparables a valores de intensidad del plasma locales, etc. En la Figura 11c, la distribucion ilustra un pico de intensidad relativamente marcado dentro del centro del area, rodeado por una disminucion de intensidad marcada en la direccion hacia fuera. Esta distribucion de intensidad no es indicativa de una plaqueta, y estos candidatos plaquetarios no se aceptan como plaquetas 52. Sobre un candidato plaquetario pueden realizarse uno o ambos de los analisis de distribucion de Gauss y de contraste direccional.

Dentro de una muestra de sangre completa sustancialmente no diluida, las plaquetas 52 pueden sumarse en grupos que aparecen en la imagen como una masa que tiene multiples picos de intensidad. Si se considera que un grupo solamente es una unica plaqueta, el numero de plaquetas 52 identificadas sera inferior a las que realmente estan presentes en el grupo. Para evitar este tipo de error, el analizador 42 puede adaptarse algontmicamente para identificar grupos de plaquetas y distinguirlos de las plaquetas 52 unicas. Un metodo para identificar y distinguir los grupos conlleva el analisis de distribucion de Gauss anteriormente descrito. Esta tecnica utiliza la region del area externa definida como un candidato plaquetario dentro del analisis de distribucion de Gauss (por ejemplo, el area dentro de un radio de “x” pfxeles). Para identificar un grupo, la intensidad de la imagen de los pfxeles en el penmetro se compara con la intensidad del plasma local. Si un numero de los pfxeles del penmetro del candidato (por ejemplo, 50 %) tiene cada uno una intensidad de la imagen que es un porcentaje predeterminado mayor que la intensidad del plasma de la imagen local, entonces el candidato se considera un grupo. Este es un ejemplo de un metodo para identificar un grupo y la presente invencion no se limita a este ejemplo particular.

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Una vez identificado un grupo, puede determinarse el numero de plaquetas 52 dentro del grupo utilizando una variedad de tecnicas. Por ejemplo, el algoritmo puede adaptarse para determinar un valor de intensidad de la imagen umbral (Th) para cada pico en el grupo. El valor de intensidad de la imagen umbral (Th) se determina en base al valor de intensidad de la imagen de dicho pico particular, y a un valor de intensidad del plasma local. El valor umbral (Th) es inferior al respectivo valor de intensidad pico, pero es mayor que los valores de intensidad del fondo local. Para determinar el numero de plaquetas 52 dentro de un grupo determinado, el algoritmo aplica una tecnica de “aumento” al grupo identificado. Con la tecnica de aumento, las unidades de la imagen (por ejemplo, los pfxeles) que estan proximas a las unidades de intensidad de la imagen pico, y que tienen un valor de intensidad igual o mayor al valor de intensidad umbral (Th), se identifican como parte del grupo. El proceso aplica entonces la misma evaluacion umbral a los pfxeles proximos a los ultimos pfxeles identificados como parte del grupo. El proceso se repite hasta que no se encuentran mas pfxeles proximos a un nivel de intensidad mayor que el nivel umbral (Th).

Una vez “aumentado” el grupo, se determina el area asociada a cada plaqueta aumentada (es decir, cada cuerpo expandido por fuera desde un pico de intensidad de la imagen como se ha descrito anteriormente) dentro del grupo y se determina un valor del area medio (area aumentada media de PLQ) de dichas regiones expandidas. Despues, dicho valor de area medio (area aumentada media de PLQ) se compara con un area de plaquetas normal medio conocido (area normal media de PLQ). Si el area aumentada media (area aumentada media de PLQ) es mayor que un multiplicador por el area media de plaqueta humana (por ejemplo, a * area normal media de PLQ, en la que a puede equivaler a 1.x), entonces el numero de plaquetas 52 dentro del grupo se define mediante el area total del grupo (AgmPo) dividido entre el area media de plaqueta humana (por ejemplo, Agrupo / area normal media de PLQ). Si el area aumentada media (area aumentada media de PLQ) es inferior a dicho multiplicador por el area media de plaqueta humana, entonces el numero de plaquetas 52 dentro del grupo se define por el area total del grupo dividido entre el area de plaqueta aumentada media (por ejemplo, Agrupo/ area aumentada media de PLQ).

Para aquellos analisis plaquetarios que utilizan una camara de analisis 24 que tiene perlas 31 colocadas dentro de la camara 24 (por ejemplo, una camara tal como la desvelada en la Solicitud '114), las perlas 31 pueden aparecer en la imagen como con un anillo brillante alrededor de su penmetro; es decir, un anillo de alta intensidad dentro de la imagen. La imagen mostrada en la Figura 12 incluye una pluralidad de perlas 31, cada una con un anillo de alta intensidad de la imagen alrededor de su perla 31 perimetral.

Para evitar un posible error de identificacion de plaquetas asociado a las perlas 31 (por ejemplo, dentro del anillo brillante, o muy cerca del anillo, o en el interior del anillo), el analizador 42 puede adaptarse para evaluar los picos de intensidad asociados a una perla 31 utilizando un clasificador basado en reglas basado en una pluralidad de caractensticas. Sin embargo, la presente invencion no se limita a utilizar el clasificador solamente con el fin de analizar regiones proximas a la perla para las plaquetas 52.

Como etapa inicial, las perlas 31 se identifican dentro de la muestra de la imagen. Por ejemplo, pueden identificarse perlas 31 dentro de la imagen de la muestra creada para determinar el volumen de la muestra, pudiendo aparecer en la imagen como una mancha oscura; por ejemplo, en algunos casos las perlas identificadas pueden ocultarse para aparecer mas claramente como una mancha oscura para facilitar el analisis. Sin embargo, la invencion no se limita a esta tecnica para identificar perlas 31.

Una vez identificada una perla 31, se identifica cada pico de intensidad de la imagen dentro del area de la perla y se considera un candidato plaquetario. Para evaluar mas a fondo un candidato plaquetario, dicho candidato puede someterse entonces a una tecnica de “aumento” como se ha descrito anteriormente para determinar si el candidato es un candidato plaquetario o posiblemente un grupo plaquetario.

Por cada pico de intensidad (por ejemplo, situado proximo a una perla 31) que se identifica como un candidato plaquetario, dicho candidato puede evaluarse entonces mas a fondo utilizando el clasificador basado en reglas. Dentro de las medidas del clasificador basado en reglas, se analiza cada candidato plaquetario utilizando al menos parte de una pluralidad de caractensticas cuantitativas, incluidas: Area, Valor de Intensidad Pico Normalizado, Valor de Intensidad Media Normalizado, Intensidad del Plasma Estimada Normalizada, Redondez, Extension, Solidez, Excentricidad, Longitud del Eje Principal, y Longitud del Eje Menor. Estas caractensticas cuantitativas son ejemplos de caractensticas que pueden utilizarse dentro del clasificador basado en reglas, pero la presente invencion no se limita a estas caractensticas espedficas. Ademas, la presente invencion no se limita a utilizar ningun numero o combinacion particular de estas caractensticas; por ejemplo, en algunos casos el clasificador basado en reglas tan solo puede utilizar una caractenstica o hasta todas las caractensticas durante el proceso de clasificacion.

Por ejemplo, para evaluar un candidato plaquetario particular, el clasificador puede considerar primero el Area del candidato. Puede asignarse un valor cuantitativo para el Area del candidato en base al numero de pfxeles que ocupe el candidato plaquetario dentro de la imagen.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de un Valor de Intensidad Pico Normalizado del candidato plaquetario. Por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, a los valores de intensidad de la imagen se les puede asignar una escala arbitraria de, por ejemplo, 0 unidades a 4095 unidades (“UVI”). En esta caractenstica, el valor de intensidad pico de la imagen puede normalizarse dividiendo el

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valor determinado entre 4095. Como se ha indicado anteriormente, la escala de intensidad de 0-4095 es una escala arbitraria y la presente invencion no se limita a esta escala particular.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo del Valor de Intensidad Media Normalizado del candidato plaquetario. En esta caractenstica, los valores de intensidad de la imagen de los pfxeles dentro del candidato plaquetario se promedian y normalizan dividiendo el valor determinado entre 4095. Nuevamente, la escala de intensidad de 0-4095 es una escala arbitraria y la presente invencion no se limita a este caso particular.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Intensidad del Plasma Estimada Normalizada del plasma local para el candidato plaquetario. En esta caractenstica, de una forma igual o similar a la descrita anteriormente, se identifican las regiones de plasma local y se determina un valor representativo de la intensidad de la imagen de dichas regiones de plasma; por ejemplo, se determina un valor de intensidad medio para las regiones de plasma local. El valor representativo de la intensidad de la imagen para las regiones de plasma local se normaliza entonces de una forma tal como la descrita anteriormente; por ejemplo, el valor dividido entre 4095.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Redondez de un candidato plaquetario. Una tecnica para determinar la Redondez de un candidato plaquetario conlleva utilizar la siguiente ecuacion:

Perimetro2

Redondez=------------------------

4n • Area

en la que el termino Penmetro se define como la distancia alrededor del perimetro del candidato plaquetario, y el termino Area es el area del candidato plaquetario.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Extension de un candidato plaquetario. En esta caractenstica, se determina un valor cuantitativo representativo de la proporcion de los pfxeles en un cuadro delimitador 60 que tambien estan dentro de la “mascara segmentada” 62, valor que se denomina la Extension. La “mascara segmentada” 62 se refiere al area ocupada por el candidato plaquetario dentro del cuadro delimitador 60. Un ejemplo de un cuadro delimitador 60 es el cuadro mas pequeno en una cuadncula ortogonal 64 que encierra la mascara segmentada 62. La Figura 13 ilustra diagramaticalmente una mascara segmentada 62 de un candidato plaquetario de forma elfptica colocado dentro de una parte de un cuadro delimitador 60 de una cuadncula ortogonal 64.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Solidez de un candidato plaquetario. En esta caractenstica, se determina un valor cuantitativo representativo de la proporcion de pfxeles en la envolvente 66 convexa que tambien estan en la mascara segmentada 62, valor que se denomina la Solidez. Como se ha indicado anteriormente, la mascara segmentada 62 se refiere al area ocupada por el candidato plaquetario. La envolvente 66 convexa puede definirse, por ejemplo, como el cuadro mas pequeno en el que puede entrar la mascara segmentada 62, pudiendo no estar alineada ortogonalmente la envolvente 66. La Figura 14 ilustra diagramaticalmente la mascara segmentada 62 de forma elfptica mostrada en la Figura 13, colocada ahora dentro de una envolvente 66 convexa.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Excentricidad de un candidato plaquetario. En esta caractenstica, se determina un valor cuantitativo representativo de una relacion de una distancia entre los focos de la elipse y la longitud de su eje principal.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Longitud del Eje Principal de un candidato plaquetario. En esta caractenstica, se determina un valor cuantitativo representativo de la longitud (en pfxeles) del eje principal de la elipse que tiene los mismos segundos momentos centrales normalizados que la mascara segmentada.

El clasificador basado en reglas tambien se adapta para considerar un valor cuantitativo representativo de la Longitud del Eje Menor de un candidato plaquetario. En esta caractenstica, se determina un valor cuantitativo representativo de la longitud (en pfxeles) del eje menor de la elipse que tiene los mismos segundos momentos centrales normalizados que la mascara segmentada.

El valor cuantitativo de cada caractenstica puede variar, en cierto grado, dentro de una poblacion de muestra desde un sujeto particular, y tambien puede variar entre sujetos. La presente invencion aborda esta variabilidad utilizando tipicamente una pluralidad de caractensticas para evaluar a un candidato plaquetario. Utilizando mas de una caractenstica para evaluar e identificar a un candidato plaquetario, el presente metodo disminuye la posibilidad de que cualquier caractenstica particular tenga un efecto adverso en la exactitud de la evaluacion. La variabilidad

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tambien puede abordarse ajustando selectivamente la magnitud del valor (o los valores) de referencia cuantitativos asociados a cada caractenstica.

En algunas realizaciones, el clasificador basado en reglas es un clasificador basado en un modelo aprendido. Se utilizan imagenes de muestra de entrenamiento para entrenar al clasificador, y el clasificador entrenado crea a su vez el modelo aprendido. Una vez desarrollado el modelo aprendido, dicho modelo se utiliza despues para evaluar caractensticas (por ejemplo, tales como las descritas anteriormente) asociadas a la imagen de un candidato plaquetario desde una muestra, y para incluir o excluir al candidato plaquetario en base a dichas caractensticas.

Las imagenes de muestra de entrenamiento pueden ser imagenes de plaquetas obtenidas empmcamente; por ejemplo, imagenes de plaquetas obtenidas por un tecnico experto. En algunas realizaciones, las imagenes de muestra de entrenamiento pueden organizarse en conjuntos asociados a cada caractenstica. El numero de imagenes de plaqueta se selecciona para proporcionar datos suficientes para cada caractenstica con fines de entrenamiento; es decir, datos suficientes para permitir que el clasificador se entrene con un nivel de exactitud aceptable para el analisis de la caractenstica. El modelo aprendido utilizado en esta realizacion no se limita a ningun conjunto de entrenamiento de un tamano particular. A menudo, un conjunto de entrenamiento puede contener entre cientos y miles de cada tipo de plaqueta caractenstica para representar fielmente la variabilidad dentro de distintas personas, las distintas condiciones de captacion de imagenes, etc.

El clasificador puede entrenarse (y el modelo aprendido desarrollarse) evaluando cada imagen de plaqueta dentro de un conjunto de entrenamiento para proporcionar un valor (o valores) de referencia cuantitativos para cada caractenstica para cada plaqueta. Los valores de referencia colectivos (o las representaciones estadfsticas de los mismos) pueden utilizarse entonces para construir el modelo aprendido. Los modelos aprendidos permiten que la presente aplicacion se ajuste en base a datos de imagenes reales, y la interpretacion automatizada de dichos datos de imagenes, proporcionando asf un nivel de exactitud deseable. La presente invencion no se limita a ningun tipo de modelo aprendido particular. Ejemplos de tipos de modelos aprendidos aceptables incluyen un modelo de red neural tal como un Perceptron Multicapa, o un modelo estadfstico tal como un clasificador bayesiano, o un modelo lineal tal como una Maquina de Soporte Vectorial (SVM). Todos estos tipos de modelos aprendidos se conocen bien y la presente invencion no se limita a ninguna realizacion particular de los mismos. En algunas realizaciones, pueden utilizarse combinaciones de estos modelos (y/u otros).

Durante el funcionamiento de la invencion, una muestra no diluida de sangre completa se recoge en un cartucho desechable tal como el ilustrado en las Figuras 2-5. Reactivos, incluidos uno o varios colorantes (por ejemplo, NDA) y un anticoagulante (por ejemplo, EDTA), se anaden a la muestra para facilitar el analisis plaquetario. La muestra mezclada con los reactivos se deposita dentro de la parte de camara de analisis del cartucho, donde reside de forma quiescente durante el proceso de captacion de imagenes. El cartucho se introduce en (o se engrana de otro modo con) el dispositivo de analisis 22, donde es colocado adecuadamente por el posicionador 36 del cartucho relativo a la lente objetivo, el iluminador38 de la muestra, y el disector 40 de la imagen, y la imagen se capta posteriormente.

En la mayona de los casos, el dispositivo de analisis 22 se programa para captar la imagen de la totalidad de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara 24. Sin embargo, en algunas aplicaciones puede captarse la imagen de una parte de la muestra. El proceso de captacion de la imagen puede variar dependiendo de la aplicacion que nos ocupa. Para el analisis plaquetario descrito anteriormente, el proceso de captacion de imagenes conlleva someter la muestra a una fuente de luz de excitacion fluorescente; por ejemplo, luz a aproximadamente 470 nm desde la fuente de luz epifluorescente. La fuente de luz de excitacion provoca que el colorante combinado con elementos colocados dentro de la muestra emita luz fluorescente a dos longitudes de onda diferentes (por ejemplo, roja ~ 660 nm, y verde ~ 540 nm). El disector 40 de la imagen capta la luz fluoresciendo desde la muestra y proporciona senales representativas de la intensidad y el color (es decir, longitud de onda) de la luz capturada. Las senales se procesan de una forma que permite que el analizador 42 programable forme una imagen de la muestra basada en las senales, pudiendo analizarse la imagen cuantitativamente para realizar el analisis plaquetario.

El diagrama de flujo mostrado en la Figura 15 proporciona un ejemplo del proceso a traves del cual las plaquetas 52 en una muestra, con su imagen captada como se ha descrito anteriormente, pueden identificarse y enumerarse entonces de acuerdo con la presente invencion. La presente invencion no exige que se lleven a cabo todas las etapas identificadas en la Figura 15 en todas las realizaciones, ni tampoco se limita al orden de etapas particular mostrado en la Figura 15.

La primera etapa mostrada en la Figura 15 conlleva aplicar una mascara de volumen sangumeo a la imagen para determinar el area ocupada por la muestra dentro de la imagen, que puede utilizarse entonces para determinar el volumen de la muestra dentro de la camara de analisis 24. Tambien puede generarse una mascara de hematfes para su uso posterior en la distincion de plaquetas 52 en determinadas regiones.

La segunda etapa conlleva la supresion del fondo de la imagen de la muestra. Como se ha indicado anteriormente, las partes del fondo de las imagenes pueden identificarse mediante diversas tecnicas que incluyen la umbralizacion, y una vez identificadas pueden suprimirse mediante el filtrado, la segmentacion, etc.

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La tercera etapa conlleva identificar los picos de intensidad de la imagen identificando maximos de intensidad local en area de la imagen determinada.

La cuarta etapa conlleva identificar leucocitos 50 dentro de la imagen de la muestra, o partes de la imagen, y excluir dichas regiones como regiones de intensidad de la imagen que no son candidatos plaquetarios.

La quinta etapa conlleva identificar perlas 31 dentro de la imagen de la muestra y preparar una mascara que pueda aplicarse a las partes de la imagen que representan perlas 31.

La sexta etapa conlleva calcular la intensidad del plasma en regiones locales en las que es necesario identificar plaquetas 52; por ejemplo, pueden utilizarse valores de intensidad del plasma local para distinguir picos de intensidad local atribuibles a las plaquetas 52 a partir de picos de intensidad local atribuibles al plasma. Esta etapa puede realizarse de forma selectiva en regiones particulares dentro de la muestra; por ejemplo, regiones que contienen grandes numeros de hematies 54.

La septima etapa conlleva analizar candidatos plaquetarios particulares para determinar si el pico de intensidad de la imagen del candidato tiene un contraste direccional en una o varias direcciones extendiendose por fuera desde el pico.

La octava etapa conlleva analizar la distribucion de Gauss de la intensidad de la imagen de los candidatos plaquetarios particulares. La naturaleza de la distribucion, como se ha descrito anteriormente, proporciona informacion concerniente a la probabilidad de que un candidato particular sea una verdadera plaqueta.

La novena etapa conlleva la supresion de elementos dentro de la imagen de la muestra que son atribuibles a imperfecciones presentes en el sistema de captacion de imagenes; por ejemplo, aranazos en los paneles de la camara de analisis, restos en los paneles, etc.

La decima etapa conlleva identificar plaquetas 52 de candidatos utilizando una tecnica de aumento de la imagen. Esta tecnica puede aplicarse a una variedad de distintos tipos de candidatos plaquetarios. Por ejemplo, la tecnica de aumento puede aplicarse a un candidato plaquetario que se identifique como un posible grupo plaquetario. La tecnica de aumento, uno de cuyos ejemplos se ha descrito anteriormente, proporciona un medio para evaluar el area ocupada por el candidato (o grupo) plaquetario. El area proporciona informacion que puede utilizarse posteriormente para evaluar si el candidato es realmente una plaqueta. Si el candidato es un grupo, el area proporciona informacion que puede utilizarse para determinar el numero de plaquetas 52 que residen dentro del grupo.

La undecima etapa conlleva calcular el numero de plaquetas 52 dentro de aquellos candidatos determinados como grupos. Anteriormente se han descrito ejemplos de tecnicas matematicas que pueden utilizarse para calcular el numero de plaquetas 52 dentro de un grupo. La presente invencion no se limita a estos algoritmos particulares.

La duodecima etapa conlleva clasificar candidatos plaquetarios que estan situados muy cerca de las perlas 31 separadoras colocadas dentro de la camara 24. Como se ha indicado antes, en algunas realizaciones de la presente invencion el analizador42 programable se adapta con un algoritmo que incluye un clasificador basado en reglas que puede incluir un modelo aprendido. Los candidatos plaquetarios se evaluan utilizando el clasificador y las plaquetas 52 identificadas se enumeran.

Una vez identificadas las verdaderas plaquetas 52, las plaquetas 52 dentro del volumen de la muestra determinada pueden presentarse en un valor de numero de plaquetas por volumen, u otra forma util, como se indica en la decimotercera etapa.

Aunque esta invencion se ha mostrado y descrito con respecto a las realizaciones detalladas de la misma, los expertos en la materia entenderan que pueden realizarse diversos cambios en la forma y el detalle de la misma sin apartarse del alcance de la invencion segun se define en las reivindicaciones.

Aspectos y realizaciones de la invencion que se desvelan pero no se reivindican:

1. Un metodo para identificar plaquetas dentro de una muestra de sangre completa, que comprende las etapas de:

anadir al menos un colorante a la muestra de sangre completa, colorante que puede marcar plaquetas; colocar la muestra de sangre en una camara definida por al menos un panel transparente; captar la imagen de al menos una parte de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara para crear una o varias imagenes; e

identificar una o varias plaquetas dentro de la muestra utilizando un analizador adaptado para identificar las plaquetas en base a caractensticas determinables cuantitativamente dentro de la imagen utilizando un analizador, caractensticas determinables cuantitativamente que incluyen diferencias de intensidad.

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2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye determinar diferencias de intensidad en regiones locales dentro de la imagen.

3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la etapa de identificacion incluye aplicar un umbral global a las diferencias de intensidad dentro de la imagen.

4. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas identificar partes anomalas de la imagen y calcular el numero de plaquetas en las partes anomalas de la imagen.

5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye representar una intensidad del plasma en la imagen.

6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye evaluar candidatos plaquetarios utilizando un contraste direccional de una diferencia de intensidad.

7. El metodo de la reivindicacion 6, que comprende ademas determinar una diferencia de intensidad pico y determinar un valor de una disminucion de intensidad incremental dentro de la imagen en una direccion que se aleja del pico.

8. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas determinar una uniformidad circunferencial de la disminucion de intensidad incremental.

9. El metodo de la reivindicacion 7, que comprende ademas determinar una distribucion de Gauss de la disminucion de intensidad incremental.

10. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye evaluar la imagen para determinar una presencia de uno o varios grupos de plaquetas dentro de la muestra.

11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye identificar candidatos plaquetarios dentro de la imagen y analizar uno o varios de los candidatos plaquetarios utilizando un clasificador basado en reglas que utiliza una pluralidad de caractensticas cuantitativas.

12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las diferencias de intensidad son diferencias en la intensidad de la luz fluorescente emitida.

13. Un aparato para identificar plaquetas dentro de una muestra de sangre completa, que comprende:

un cartucho de analisis que tiene una camara de analisis con un par de miembros planares, al menos uno de los cuales es transparente, pudiendo dicho cartucho anadir al menos un colorante a la muestra de sangre completa, colorante que puede marcar plaquetas, y camara que puede sujetar la muestra de forma quiescente entre los miembros planares; y

un dispositivo de analisis que puede captar la imagen de al menos una parte de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara, dispositivo de analisis que se adapta para identificar las plaquetas en base a caractensticas determinables cuantitativamente dentro de la imagen, caractensticas determinables cuantitativamente que incluyen diferencias de intensidad.

14. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para determinar diferencias de intensidad en regiones locales dentro de la imagen.

15. El aparato de la reivindicacion 14, en el que el dispositivo de analisis se adapta para aplicar un umbral global a las diferencias de intensidad dentro de la imagen.

16. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para identificar partes anomalas de la imagen y calcular el numero de plaquetas en las partes anomalas de la imagen.

17. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para representar una intensidad de imagen del plasma.

18. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para evaluar candidatos plaquetarios utilizando un contraste direccional de una diferencia de intensidad.

19. El aparato de la reivindicacion 18, en el que el dispositivo de analisis se adapta para determinar una diferencia de intensidad pico y para determinar un valor de una disminucion de intensidad incremental dentro de la imagen en una direccion que se aleja del pico.

20. El aparato de la reivindicacion 19, en el que el dispositivo de analisis se adapta para determinar una uniformidad circunferencial de la disminucion de intensidad incremental.

21. El aparato de la reivindicacion 19, en el que el dispositivo de analisis se adapta para determinar una distribucion 5 de Gauss de la disminucion de intensidad incremental.

22. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para evaluar la imagen para determinar una presencia de uno o varios grupos de plaquetas en la muestra.

10 23. El aparato de la reivindicacion 13, en el que el dispositivo de analisis se adapta para identificar candidatos

plaquetarios dentro de la imagen y analizar uno o varios de los candidatos plaquetarios utilizando un clasificador basado en reglas que utiliza una pluralidad de caractensticas cuantitativas.

24. El aparato de la reivindicacion 13, en el que las diferencias de intensidad son diferencias en la intensidad de la 15 luz fluorescente emitida.

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para identificar plaquetas (52) dentro de una muestra de sangre completa, que comprende:

   anadir al menos un colorante a la muestra de sangre completa, colorante que puede marcar plaquetas (52); colocar la muestra de sangre en una camara (24) definida por al menos un panel transparente (26, 28); captar la imagen de al menos una parte de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara (24) para crear una o varias imagenes; e

   identificar una o varias plaquetas (52) dentro de la muestra utilizando un analizador adaptado para identificar las plaquetas (52) en base a caractensticas determinables cuantitativamente dentro de la imagen utilizando un analizador, caractensticas determinables cuantitativamente que incluyen diferencias de intensidad; en el que la etapa de identificacion incluye representar una intensidad del plasma en la imagen.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye determinar diferencias de intensidad en regiones locales dentro de la imagen.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la etapa de identificacion incluye aplicar un umbral global a las diferencias de intensidad dentro de la imagen.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas identificar partes anomalas de la imagen y calcular el numero de plaquetas en las partes anomalas de la imagen.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye evaluar la imagen para determinar una presencia de uno o varios grupos de plaquetas dentro de la muestra.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la etapa de identificacion incluye identificar candidatos plaquetarios dentro de la imagen y analizar uno o varios de los candidatos plaquetarios utilizando un clasificador basado en reglas que utiliza una pluralidad de caractensticas cuantitativas.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que las diferencias de intensidad son diferencias en la intensidad de la luz fluorescente emitida.
8. 8. Un aparato para identificar plaquetas (52) dentro de una muestra de sangre completa, que comprende:

   un cartucho de analisis (20) que tiene una camara de analisis (24) con un par de miembros planares (26, 28), al menos uno de los cuales es transparente, pudiendo dicho cartucho (20) anadir al menos un colorante a la muestra de sangre completa, colorante que puede marcar plaquetas (52), y camara (24) que puede sujetar la muestra de forma quiescente entre los miembros planares (26, 28); y

   un dispositivo de analisis (22) que puede captar la imagen de al menos una parte de la muestra que reside de forma quiescente dentro de la camara (24), dispositivo de analisis (22) que se adapta para identificar las plaquetas (52) en base a caractensticas determinables cuantitativamente dentro de la imagen, caractensticas determinables cuantitativamente que incluyen diferencias de intensidad;

   en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para representar una intensidad del plasma en la imagen.
9. 9. El aparato de la reivindicacion 8, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para determinar diferencias de intensidad en regiones locales dentro de la imagen.
10. 10. El aparato de la reivindicacion 9, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para aplicar un umbral global a las diferencias de intensidad dentro de la imagen.
11. 11. El aparato de la reivindicacion 8, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para identificar partes anomalas de la imagen y calcular el numero de plaquetas en las partes anomalas de la imagen.
12. 12. El aparato de la reivindicacion 8, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para representar una intensidad de imagen del plasma.
13. 13. El aparato de la reivindicacion 8, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para evaluar la imagen para determinar una presencia de uno o varios grupos de plaquetas dentro de la muestra.
14. 14. El aparato de la reivindicacion 8, en el que el dispositivo de analisis (22) se adapta para identificar candidatos plaquetarios dentro de la imagen y analizar uno o varios de los candidatos plaquetarios utilizando un clasificador basado en reglas que utiliza una pluralidad de caractensticas cuantitativas.
15. 15. El aparato de la reivindicacion 8, en el que las diferencias de intensidad son diferencias en la intensidad de la luz fluorescente emitida.