JP4615865B2 - 静止したバックグラウンド中の移動物質の特徴づけ - Google Patents

Description

本発明の分野
本発明は、特に有意の拍動を示さない血管においてさえ、移動赤血球の分離スペクトルをスペクトル的に分解することにより血管中の酸素飽和度の非侵襲的測定に、ならびに血流の経路の特徴づけに適用されるような、全体的なバックグラウンド・スペクトルから移動物体の既知の異なるスペクトルを分離することにより、一般的な静止スペクトル・バックグラウンド中の移動物体に付着された発色団を検出する分野に関する。

本発明の背景
移動系の特定の構成成分または詳細の定量的レベルを決定する必要がある、工業的、科学的および医学的な多数の用途が存在し、この場合、測定される構成成分または詳細は、測定される構成成分または詳細と区別することが視覚的に困難であり得るバックグラウンド環境中に位置する。このような場合、慣用的画像形成方法は常に適切であるというわけではない。

このような一例は、生体組織への血液供給における酸素レベルの、あるいは血液供給の任意のその他の認識可能な構成成分の決定の場合である。組織への血液による適切な酸素供給は、その正確な機能のための基本的必要前提条件である。しかしながら酸素供給はしばしば、いくつかの急性および／または慢性疾患、例えば機械的閉塞または炎症過程により引き起こされる血管の局所的変化を包含する疾患の結果として減損される。このような変化は、例えば全身レベルでの組織への損傷を引き起こし得るおよび／または特定器官、例えば心臓、脳、眼等における十分に限定された病態を引き起こし得る動脈硬化症または糖尿病の結果として生じ得る。特に網膜血管系による酸素供給低減を包含するかまたは起因する疾患は、世界的に失明の主因の1つである。これらの疾患の多くは、進行性で且つ治療可能である。したがって予防的処置につながり得るため、早期検出が非常に望ましい。

例えば眼においては、診断はしばしば網膜酸素供給に伴う問題の結果として、またはそれと一緒に網膜に起こる構造的変化に基づいてなされる。このような構造的変化としては、時としてそれらが検出されるために蛍光血管撮影の実行を必要とする虚血性事象の結果、血管新生（先在する血管からの酸素供給の低減を補償しようとしての新規の血管の成長）、綿花状白斑（神経線維軸索輸送ができない領域）が、ならびに網膜神経線維の変性も挙げられる。一旦観察されると、これらのおよびその他の現象を用いて、網膜血管性疾患を診断し、そしてさらなる変性を改善するための治療を開始し得る。

しかしこれらの構造的変化は、すでに起きてしまった有意の不可逆的損傷を示す。したがって構造損傷が起こる前に、早期に疾患を検出することが明らかに望ましい。多くの場合、損傷を受けている網膜の部分は酸素供給または代謝の減損を示し、したがって毛細血管の酸素飽和度の局所的異常による同定が可能である。同様に、それらの毛細血管の局所酸素飽和度特徴により、適正に機能しているかまたは特に活発な網膜領域が同定され得る。

損傷および無傷網膜領域についてのこのような情報は一緒になって、標的化網膜治療に起因する健常組織への損傷をできるだけ多く制限するための重要な目印を提供し得る。この情報は、2つの種類に分けられる：即ち血管中の血中酸素飽和度レベルに関するもの（これは血流の構成成分のスペクトル組成についての知識を要する）；ならびに血管形状それ自体の構造的変化に関するもの（例えば血管新生における新規血管の作成によるか、または底を通る流れの遮断のための血管の見掛けの消失による）である。これらの種類の各々が、ここで首尾よく取り扱われる。

血中酸素飽和度を測定するための方法は、迅速、定量的、客観的で、できるだけ非侵襲性であるべきである。従来技術において以下のような多数の方法が存在する：
血中ガス分析は、高精度で血中の酸素飽和度を測定する方法を提供する。しかしながらそれは問題の場所からの血液試料を必要とする溜め侵襲性であり、したがって多くの場合用いられ得ない。さらにまた測定は時間を要し、継続的に実施され得ない。さらに動脈または静脈酸素付加のみが一般に測定され、あるいは検査中に組織中小さな切り傷をつけることにより、小動脈、小静脈および毛細血管の混合物の酸素付加が測定され得る。

他方、パルスオキシメトリーは非侵襲性であり、連続測定を可能にする。パルスオキシメトリーは、心拍のために血液供給の拍動性を利用する。これは、還流組織中のヘモグロビンの濃度の心拍数相関変化を導入する。濃度におけるこれらの変化は次に、周囲組織のより一定のバックグラウンド吸収とは対照的に、組織の光吸収における心拍数相関変化を引き起こす。しかしながらパルスオキシメトリーは、血液の粘性特性および血管系の弾性特性のために、心拍信号が検出可能性閾値より低く減衰した血管または血管灌注領域に適用され得ない。これは毛細血管および後毛細血管で、そして概して網膜血管系の大部分で起こる。したがってパルスオキシメトリーは、それが動脈拍動に頼るため、動脈血の酸素付加に関する情報を提供するためにだけ用いられ、他の血管構成成分のためには、特に毛細血管、小静脈または小直径静脈のために用いられ得ない。

血液試料の酸素付加の評価のための多数の方法はスペクトル分析によっており、オキシ−ヘモグロビン（ＨｂＯ₂）およびデオキシ−ヘモグロビン（Ｈｂｒ）の異なる吸収スペクトルを利用する。各スペクトルは異なり、したがって理論では、2〜3の波長のみでのキュベット中の試料のスペクトル測定は、いくつかの仮定を前提として、各発色団の量についての情報を提供し得る。酸素飽和度は次に、オキシ−ヘモグロビン対デオキシ−ヘモグロビンの比に関連づけられる。酸素飽和度の値ＳＯ₂は、以下の方程式：
ＳＯ₂＝［ＨｂＯ₂］／｛［ＨｂＯ₂］＋［Ｈｂｒ］｝
から算定され得る。

他方、in vivo測定はより難しい。In vivo分光分析法に伴う主な難しさは、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン以外の色素の存在により持ちかけられる。当該スペクトル範囲では、それらの色素の吸収スペクトルは、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンのスペクトルに加えて、フラットから遠く離れ、そしてこのような色素のために全体的スペクトルの部分はin vivoでは容易に決定されない。さらに反射光によっているスペクトル測定では、光強度は発色団によるだけでなく、他の反射存在物によっても影響を及ぼされる。したがって絶対反射スペクトルのスペクトル分解は、特に例えば多数の色素が含まれる網膜のような場所において、しばしば非常に問題が多い。さらに網膜からの反射は多数の供給源から生じ得るし、したがって反射光のスペクトル含量は周囲組織全体にわたって発色団または色素による影響を受け、そして局所的だけでない。

in vivo酸素飽和度測定のための上記の技法の全てについての別の一般的欠点は、それらの本質的に低い空間分解能であり、一般に全身的血液酸素付加値の評価のみを可能にする。これらの技法で、異なる容器中の酸素飽和度のin vivo可視化を、特に毛細血管網のレベルで、ならびに異なる血管区画を通しての比較方法で、可能にするものはない。酸素付加は異なる毛細血管では、あるいは時間のまたは生理学的活性の操作の一関数として異なり得るため、重要な診断情報は、別個の点様測定よりむしろ画像特徴を有するデータ・セットの使用により得られる。

網膜疾患の本発明の実例では、網膜血液酸素付加を測定するより直接的方法の重要性は、R.A. Linsenmeier and L. Padmick-Silverによる表題”Metabolic dependence of photoreceptors on the choroids in the normal and detached retina” （Investigative Ophthalmology and Visual Science, Vol. 41(10), pp. 3117-3123 (September 2000)）による刊行物に記載された網膜剥離の場合における高酸素症の、そして、R.A. Linsenmeier et al.による”Retinal Hypoxia in long-term diabetic cats”という表題の刊行物（Investigative Ophthalmology and Visual Science, Vol. 39(9), pp. 1647-1657 (August 1998)）に記載されたような、そしてこのような技術を開発する場合に注ぎ込まれた尽力により例証されるような、臨床的に明らかな網膜症が出現する前の、糖尿病の初期段階の特徴を示す網膜低酸素症における治療効果といった分野における一般的関心から明らかである。網膜酸素濃度計を用いて実施された直接酸素張力測定を記載する方法が、Diabetes Technol. Ther. Vol. 2(1), pp. 111-3 (Spring 2000)に発表されている。しかしながらそれらの測定は、ブタ動物モデルにおける光ディスクは別にして、大血管に限定された。

したがって血中酸素飽和度を定量的に測定し得る、そして組織中のその他の吸収発色団または反射物体の存在を克服する新しい方法が必要とされる。単一点測定ではなく、しかし一点でというよりむしろ全画像化組織における酸素飽和度およびその他の関連パラメーターの値の高解像度画像を提供する方法も必要とされる。このような画像は好ましくは、全ての種類の血管、例えば毛細血管、小静脈および静脈から得られるべきである。

血管系を含むいくつかの型の慢性進行性疾患において、治療を開始するという決定は、疾患の進行における重大な点を指示すると思われる構造的変化の開始に直接基礎を置く。眼における血管新生は、眼性疾患状態の発症を示す構造的変化であり、これは患者の視力に恒久的且つ不可逆的損傷を引き起こす高い危険性を有する。多数の因子が、顕著には糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および網膜血管閉塞を含めた血管新生を蒙り易くする。これらの因子は、疾患のさらなる徴候に関して患者は厳密にモニタリングされるべきであるということを示すが、しかしそれらだけで、それら自体が個体の視力に関する重篤な結果を有し得る治療を開始するのに十分ではない。したがって血管新生の開始の高感度早期検出が、危険にさらされていることが既知である患者にとっては望ましい。

眼性血管新生性疾患は、組織の一領域への酸素運搬の不足に関連があり、そして一部はそれにより引き起こされると考えられる。血管新生についてのその他の提唱されたメカニズムは、酸素不足の段階を必ずしも通過しない。眼における新脈管形成因子（例えばある種の腫瘍）の濃度を増大する、あるいは血管抑制性因子（例えば硝子体切除術または水晶体切除術）の濃度を低減する原因も、血管新生性疾患の危険増大をもたらし得る。

一旦始まれば、血管新生は、いくつかのメカニズムのうちの１つまたは複数によりそれ自体がさらなる眼性変性の原因になるまで進行し得る。小柱網による流体流出を遮断することにより、血管新生は、血管新生緑内障に関連した眼内圧の組織損傷性上昇に直接関与し得る。新しい血管は正常血管より弱く、そして視力を遮断し、血液供給を低減し得る出血を起こし易い。出血は次に網膜剥離を促し、これが直接的に視力損失をもたらし得る。したがって新欠陥新生はM. Bruce Shields, M.D.による”Textbook of Glaucoma”（Lippincott Williams and Wilkins (Philadelphia), 1997出版）により詳細に記載されているように、網膜疾患の進行における重大な要点を占める。

全体的疾患過程の中心であるだけでなく、血管新生疾患は、上記のように、治療可能でもある。現在、眼の血管新生を発症した患者の場合における最も一般的介入は、汎網膜光凝固（ＰＲＰ）である。この技術は、通常は患者の長期視力を救済するが、しかし部分的には現存視力にとって有害であり、合併症の危険を伴う。したがって、さらなる疾患進行の危険が最高である患者においてのみ、この治療を適用することが有益である。

例えば非増殖型糖尿病網膜症（ＮＰＤＲ）を有する患者のＰＲＰ治療は、そのＮＰＤＲがさらに危険な増殖性糖尿病網膜症（ＰＤＲ）にすでに進行した患者を治療することと比較して、測定可能ではあるが、しかし中等度長期防御利益を提供する。同時に、早期ＰＲＰ治療は、実際にＰＤＲを発症していない場合でさえ、多数の患者を不都合および危険にさらす。したがって患者がＰＲＰにより治療されるべきか否かを決定する臨床医の能力にさらに磨きをかけることは、大きな実際的利益を有する。

自明のこととして、それは、ＮＰＤＰおよびＰＤＲ間の境界線を表す血管新生の開始である−これら2つの用語が含有する「増殖性」とは、眼における新規の血管の増殖を指す。したがって血管新生を検出し、測定するより良好な方法は、どの集団の患者が迅速に処置され、その糖尿病網膜症が安定であり、直接的介入を必要としないかを臨床医が決定するのを手助けするのに役立つ。同様の議論は、他の原因のための、そして眼に加えて他の器官における血管新生疾患の、例えば血管閉塞、ＡＭＤおよび腫瘍刺激性血管新生の治療に当てはまる。

眼における血管新生を診断するために、現在主に2つの技法、即ちフルオレセイン血管造影法およびスリットランプ検査が用いられている。眼の血管新生はしばしば先ず虹彩に認められるが、しかしそれは同時に網膜にも観察され得る。2つの検査技法のうち最も高感度のフルオレセイン血管造影法は、新規成長血管からの瞳孔周囲または網膜漏出を検出する；しかしながらそれは合併症の危険を有する侵襲性技法である。さらにそれは、危険に直面した多くの患者が頼っている初期診察医にはしばしば利用可能でない。血管新生が十分に進行した場合には、スリットランプ検査も異常新血管成長を直接的に可視化し得る。しかしながら可視化はフルオレセイン血管造影法と同じくらい高感度であるというわけではなく、さらにまたその知見を評価するよう訓練された医者を要する。

したがって血管新生は、眼性およびその他の疾患、例えば癌において、ならびにこのような疾患の治療についての決定を左右するのに重要な役割を占める。血管新生を評価するための現存の技法は、侵襲性という、または非感受性という欠点を持ち、そして特別に訓練された医学従事者および／または病院設備を要する。したがって非侵襲性で、高感度で、操作が簡単で、そして臨床医により容易に解釈され得る結果を生じる血管新生を検出する手段が必要である。

新規の血管の作成を検出することによる血管新生の検出のための任意の装置または方法は、上首尾の画像形成期間におけるこのような血管の見掛けの消失による現存血管の遮断の検出のためにも有用であるべきである。このような現象は眼内圧増大の副作用として、または鎌状赤血球貧血の結果として生じ得る。
本明細書中に既述された全刊行物の開示内容は、参照により本明細書中で援用される。

発明の概要
本発明は、複合静止環境内に位置し、静止環境のものとは区別され得る光スペクトルを有する移動物体を同定し、マッピングし、そして特徴づけするための装置および方法であって、静止環境が一般にスペクトル的に不変性でもある装置および方法を提供する。本発明の好ましい一実施形態によれば、測定されるオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンに加えて組織中の他の発色団の存在下でさえ、存在するオキシ−およびデオキシヘモグロビンの比を決定するスペクトル分析による、組織内の血液の血中酸素飽和度を決定するための装置が提供される。装置は、微小循環の外側の組織中のその他の発色団および／または反射存在物から、これら2つの血液関連発色団のスペクトルを分離し得る。装置に用いられる測定方法は、血液関連発色団が血管および全てのそれらの区画に沿って血流とともに移動し、したがって空間中のそれらの位置を変えるが、一方、微小循環の外側の発色団は静止している、という事実に基づいている。微小循環における任意の点で血液分析のために装置が用いられるよう、この動きは拍動とは無関係である。したがって血液関連移動発色団のスペクトルは、全体的スペクトルとは、特に静止発色団または反射存在物のスペクトルとは、一時的に異なる。静止物体のスペクトルからの移動物体のスペクトルの分離は、時間の一関数としてスペクトルを分析することにより実施される。

本発明の第二の好ましい態様は、個々の点測定よりむしろ、全領域におけるパラメーターの画像形成に関する。装置が単一赤血球またはその凝塊を分解し得る光学解像度を有する場合には、空間パターンの変化から、時間の異なる一瞬に撮られた組織の少なくとも2つの画像を直接比較することにより、時間依存性および時間非依存性情報が同定され、分離され得る。例えば2つの画像の簡単なサブトラクションにより、移動発色団のスペクトル情報が保持され、一方、静止発色団および静止反射存在物のスペクトルは排除される。

いくつかの波長での一連の時間の画像を取得することにより、そして上記のように静止スペクトルの関与を排除することにより、移動物体のスペクトルのみが得られる。これらのスペクトルは次に、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンの吸収スペクトルに分解され、したがって画像中の静止色素のための吸収とは関係なく、血液の酸素付加の評価を可能にする。

上記のように、略記された方法は好ましくは以下の2つの異なる段階を包含する：（１）血液関連発色団、主に微小血管系内で移動する赤血球中のオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンのスペクトルの、いくつかの静止色素の関与を包含する全体的スペクトルからの単離；ならびに（２）オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン吸収スペクトルへのスペクトル分解分析。

したがって、本発明の好ましい実施形態に従って、血管中の血中酸素飽和度を直接分析するための装置が提供される。好ましくは網膜血管中の血流は、一般に網膜からの反射により、網膜の作成された画像における赤血球パターンの空間的変化を検出することにより決定される。網膜血流は、好ましくは網膜中の個々の血管中の個々の赤血球またはその凝塊を追跡することにより測定される。このようにして、個々の赤血球（ＲＢＣ）またはその集合体は、血管に沿ってそれらの移動中に追跡される。

これを実行するためには、網膜中のＲＢＣの、またはそれらの集合体の動きの「動画」の構成を可能にするよう、好ましくは青色および／または緑色光のパルスが、好ましくは1秒未満、さらに好ましくは5〜200 msの範囲内の精確に既知の間隔で眼に立て続けにフラッシュを当てられる。時間の異なる一瞬の網膜中のＲＢＣ空間的分布の差のための網膜反射の差である「示差的画像」が次に好ましくは測定される。このような示差的画像は好ましくは、異なる時点で得られる2つの画像のピクセル×ピクセル・サブトラクションにより、情報の処理の最も簡単な方法で得られる。

一旦移動発色団、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンのスペクトル画像が他の発色団のスペクトル画像から単離されれば、次にヘモグロビン酸素飽和度の評価のために、好ましくはスペクトル分解が実施される。この全過程は、いくつかの波長でこのような示差的画像を取得して、示差的スペクトルを作成し、これを次に、好ましくはオキシ−ヘモグロビン、デオキシ−ヘモグロビンの吸収スペクトルおよび定数項を含む分光分析モデルの助けを借りてスペクトル分解される。記録波長は、好ましくは2つの特徴的オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン誘導体吸収ピーク（520〜590 nm）の範囲内であるが、しかしこれら2つの発色団に関する差スペクトルが存在するＵＶ／ＶＩＳ／ＩＲ範囲での任意のその他の波長であり得る。

網膜の例の場合、網膜の画像が撮られる波長範囲全体を通しての条件、特に水晶体の焦点距離、ならびに光学視野軸は変わらないままである、ということも重要である。これを保証するために、波長依存性画像が同時にまたは立て続けに取得される必要がある。迅速波長スイッチが、いくつかの方法で得られる。異なる波長は、好ましくはコンピューター駆動高速フィルターホイールまたは任意のその他の高速波長スイッチまたは分割装置を用いて標本抽出される。フィルターホイールは光路に導入され、光学フィルター間で迅速に切り替わる。

フィルターホイールは一般に、少なくとも4つの異なる波長のサンプリングを可能にする。より多くのフィルターホイールまたは他の波長スイッチ装置はタンデムで用いられ、したがってスペクトルを個々のオキシおよびデオキシヘモグロビン構成成分のスペクトルに分解する必要がある詳細なスペクトルを得ることが必要な場合、任意数の波長での測定を可能にする。波長のスイッチは、好ましくはフラッシュ光源および画像処理装置間の経路において照明光に関して、または好ましくは画像処理装置および検出器間の経路において網膜から反射される光に関して実施され得る。概して波長スイッチングまたはフィルタリング装置は有限透過域を有するが、異なる単一波長ラインを有さず、そして本開示全体を通して、そして特許請求されているように、波長という用語の使用は、いわゆる所望の画像形成波長に集中される波長のこのような有限透過域を含むと理解される。

波長を迅速に切り替える好ましい且つ二者択一的方法は、網膜画像をいくつかの画像に分割し、次に各画像の適正な波長を別個に選択した後の、多重波長での同一画像の同時検出による。画像の分割は、好ましくはプリズム、半銀塗り鏡、分割が造形性光ガイドまたは同様の構成成分を用いることにより成し遂げられ得る。波長の選択は、好ましくはカラーフィルター、干渉フィルターおよび／または二色性鏡を用いることにより成し遂げられる。

あるいはそして好ましくは、高速同調分光計を用いて、入射光の所望の波長を選択するかまたは網膜から反射される光の所望の波長構成成分をスペクトル選択し得る。
これらの短時間間隔中の網膜画像の小運動は、好ましくは異なる標識構造、特に血管それ自体に基づいた画像の再登録をオフラインすることにより、あるいは相関反射レベルを有する領域を整列することにより、または画像処理の当該技術分野で既知のその他の方法により矯正され得る。

本発明の大まかな目的は、その他の発色団または反射物体を含有する組織中の血中酸素飽和度レベルを直接的且つ非侵襲的に測定するための装置および方法を提供することである。これは、当該領域の画像の小区域として同定される個々の血管区画の反射率の変化を検出することにより達成される。

したがって本発明によれば、血管中の血中酸素飽和度を直接的に画像形成し、分析するための装置であって、総合すると血液酸素付加のレベルについての情報に翻訳され得る移動物体のみについてのスペクトル情報を含有する各波長に関する少なくとも１つの示差的画像を作成するための、所定時間間隔で取得するための画像形成手段を包含する装置が提供される。

本発明のさらに好ましい実施形態によれば、装置は血管中の酸素飽和度を直接的に画像形成し、分析して、それらの特定血液酸素付加レベルに関する異なる血管区画を解像する。さらに装置は、上記血管中の血液酸素付加レベルについての情報への移動物体についてのスペクトル情報の選択的翻訳を可能にする。

網膜中の酸素飽和度の決定は本発明の好ましい一実施形態を例証するために本明細書中で用いられてきたが、一方、例えば内視鏡または腹腔鏡または同様の手法中にそれらを適切に可視化することにより、他の身体器官中の酸素飽和度の、または任意のその他の気体の直接in vivo検出のためにも本発明が用いられ得る、ということは当業者には明らかである。このような器官としては、脳、肺、心臓、肝臓、腎臓および皮膚が挙げられるが、これらに限定されない。血液中の他の気体の飽和度は、それらの既知のスペクトルの適切な使用を要する。

血液関連スペクトル定量に関する上記の好ましい実施形態のほかに、本発明の装置および方法の別の好ましい適用は、いくつかの病理学的状況において生物医学的問題を提出する脳脊髄液（ＣＳＦ）の流動の決定の場合である。明確に定義されたスペクトル特徴を有するミクロスフェアでＣＳＦを標識することにより、本発明の装置および方法を、より好ましい実施形態に従って用いて、その直接環境のバックグラウンド色にもかかわらず、ＣＳＦ流動を精確に測定し得る。

本発明はin vivo測定に必ずしも限定されない。組織活力度の評価は、移殖のために調製され、そしてその安定性が評価されねばならない器官において、生体の外側でin vitroにも有益であり得る。このような状況では、本発明は、器官の人工還流が活性化されるとすぐに、有益に適用され得る。

本発明の装置および方法を用いてin vitroで解決され得るいくつかのその他の問題も存在する。例えば細菌または寄生生物はしばしばある種のスペクトル的に異なる特性を有し、そしてさらに外因性プローブにより、あるいは例えばＧＦＰまたは同様のプローブを用いた遺伝子操作ラベリングにより、特異的に標識されさえし得る。細菌は一般に動いているため、本発明の装置は、細菌の存在および量を決定するために、in vitro血液検査、in vitro尿検査および同様の生物医学的用途のために用いられ得る。

付加的な本発明のステップを組入れることにより、組織中の血管のスペクトル特徴づけを決定するための運動信号を用いた上記の装置および方法は、このような血管の経路特徴づけを決定するためにも用いられ得る。多重重ね合わせ発色団が組織の反射率に関与するのとまさに同様に、多重重ね合わせ構造が関与する。例えば網膜では、当該構造物である血管は、軸索の束ならびに多数の局所色素変動と交じり合わされて、小血管および毛細血管を解像し難くする。そのように、そのバックグラウンドから問題の発色団の反射率を抽出するいくつかの手段を見出すことは、スペクトル分析のために有用であるのとまさに同様に、そのバックグラウンドから問題の構造物のための反射率を単離することは、解剖学的分析のために有用である。

血管構造の場合、循環を通り抜ける赤血球の動きのための反射率信号は、このような単離を実施するための手段を提供する。赤血球の動きのために一連の画像全体のその反射率を変える領域は明らかに、画像化表面近くに機能している血管を含有する。画像を組合せることにより、血球クラスターが通過する全ての点が血管上に位置していると印を付けられるよう、画像化表面の表示が形成される。画像の数の増大に伴って、血管上に位置する点が一緒に連関して、血管のセグメントを、そして最終的に当該領域における血管パターンの完全マップを明示する。

これは、それ自体、血球がそれに沿って移動する経路が、日中に空から観察される高速道路の網目構造のように、単一画像中で常に明らかに可視的であった場合、わずかな用途を有するのみである。しかしながら毛細血管および小血管の場合、経路それ自体は、周囲構造のためにしばしば閉塞され、あるいはそれ自体の透明性のために非可視的でさえある。毛細血管は、夜間の明かりの点いていない田舎道のようであり、それらに沿って移動するヘッドライトの経路を追跡することにより可視的になるだけである。

血管新生中に形成される最も早い血管はそれら自体毛細血管であるか、または毛細血管と同様の構造物で、壁が薄く非可視的であるが、但し、それらを通過する血液による。したがってそれらは、移動信号分析による可視化によく適合される。したがって長時間にわたって画像化された血管パターン間の比較、あるいは血管新生組織に独特の血管特徴の同定さえもが、血管新生眼性疾患の診断改善のための手段を提供する。しかしながら、血管新生眼性疾患は、本発明のこの態様の適用の好ましい一実施形態であることを意味するに過ぎない、と当業者に理解されるべきであり、そして本発明は、例えば新規の血管構造の作成であれ、あるいは現存血管構造の消失の検出であれ（後者は毛細血管の遮断に関連した疾患の診断改善のために適用可能である）、組織中の毛細血管構造の変化を含めたその他の病理学的状態の検出に等しく適用可能であると理解される。

経路特徴づけのための装置および方法は、スペクトル特徴づけに関して上記の装置および方法とは多少異なる。血液関連発色団の単離（上記の装置のステップ（ｉ））は、血管新生測定に不可欠である。しかしながらスペクトル分解分析（上記の装置のステップ（ｉｉ））は、必須ステップでない。したがって拡張バージョンの計器を用いて、すでに記載されたように、しかし好ましくは一波長範囲に、優先的には高ヘモグロビン吸収と高全体的網膜反射を組合せる範囲に限定される画像を用いて、血流の測定がなされる。それにもかかわらず、異なる波長で撮られた一連の画像の組合せも考えられて、血管解剖学についての改良された情報の抽出のためのスペクトル画像データ・セットの完全再利用を可能にする。

したがって血管新生の検出は最初に、各画像シリーズ内のアラインメントを含めたスペクトル特徴づけ装置、示差的分析、そして次に分析に含まれる各シリーズから得られた示差的画像の相互アラインメントを用いて得られたものと類似のまたは同一の血液移動画像データ・セットから進行する。この時点後、2つの装置の操作は異なる。

移動経路マップを作製するために、コンピューター処理および制御装置（２２）は、画像化部分の領域が移動発色団を含有するか否かを先ず決定することができなければならない。この手段のいくつかの好ましい例示が可能である。2つの例示例（限定するよう意図されない）は、長時間にわたってある点で測定され、その後閾値化された反射率値の標準偏差の測定、ならびに長時間に亘るその点での平均値からの最大差の測定とその後の閾値化による。

あるいはそして好ましくは、移動が測定される点のすぐ近くで一緒に連関するための（二値化ディレーション）、および／または任意の流動経路に関連しない単離点を除去するための（例えば二値化エロージョン）画像処理関数も提供され得る。

経路上に含まれるかまたは含まれないよう印を付けられた点のその結果生じた組は次に、好ましくは空間的に順序づけられた配列またはマップ中に一緒に集合される。このマップは、表示のための画像として処理され、そして表示手段が好ましくは提供され、さらにオペレーターが対話式に見て、単一経路マップから推測され得る任意の知見に従って画像に注釈を加えることを可能にする条項も有する。

さらにコンピューター処理および制御装置は、好ましくは経路マップおよびその注釈をデジタルに保存するよう構成され、したがってそれは同一物体および領域から後に得られた経路マップとの比較のために呼び出し可能である。

同一物体および領域に関して1つより多い経路マップが存在する場合、コンピューター処理および制御装置は、好ましくは全ての対応するマップとの相互作用を一斉に可能にするよう、そして特に強い調子でそれらの間の差を表示するために構成され、したがってそれに沿って移動が先に検出された経路の消失ならびに新しい経路の出現をともにオペレーターは容易に識別し得る。

好ましくは装置は、メモリにそれらを保存し、そして必要な場合にそれらを呼び出す能力とともに、一連の経路マップに相互に注釈を付け得る。
好ましくは、その後の測定値との比較のためにそれらを特徴づけするために、そして普通の、または新しく形成された経路の特徴に合致する経路を直ちに同定する一手段としても、個々の経路に関する形態学的測定、例えば長さ、幅および湾曲のようなパラメーター（これらに限定されない）の測定を実施するための手段も提供されると有益である。

いくつかの工業的用途、例えばスペクトル的に異なるスペクトルを示す移動物体が静止環境に埋め込まれる製品または複合物体の検査のための機械ビジョンおよび人工知能アルゴリズムの分野においても、本発明の使用から利益を得る。別の例は、食品の品質管理の分野二置いてであり、この場合、品質は、変化し、それゆえ時間の一関数として移動する異なるスペクトルと相関する。

したがって本発明の好ましい一実施形態に従って、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンド中で移動する物質の分析方法であって、以下の：
（ｉ）バックグラウンド中の移動物質の第一波長での少なくとも2つの画像を所定時間間隔で作成し；
（ｉｉ）所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に第一波長で強度レベル変化を示す画像の領域を決定するために少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し；
（ｉｉｉ）少なくとも第二波長でステップ（ｉ）および（ｉｉ）を実施し；
（ｉｖ）第一および少なくとも第二波長で決定される強度レベル変化を示す画像の領域に関してスペクトル分析を実施し；そして
（ｖ）移動物質中の発色団の定量レベルをスペクトル分析から決定する、
ステップを包含する方法が提供される。

この方法の、そして本出願中に同様に記載された他の方法のステップ（ｉｉ）は、単一画像を単一画像と比較することにより実施されるか、または単一画像を複数の画像の平均と比較することにより実施されるかにかかわらず、そのバックグラウンド中の移動物質の画像を比較することについて本出願中に既述された好ましい全ての方法、あるいは本明細書中に記述されたその他の画像比較方法のいずれかを説明する、と理解される。さらに上記の方法において、本質的に静止し且つ不変のスペクトル・バックグラウンドは、わずかに異なる画像の後処理アラインメントにより得られるために必要であり得る。さらに物質は血液であり、そして本質的に静止した且つ不変のスペクトル・バックグラウンドは被験者の組織であり、その場合、発色団は血液の構成成分であり得る。

本発明のさらに別の好ましい実施形態に従って、被験者の組織内の血液の分析方法であって、以下の：
（ｉ）第一波長での被験者の前記組織の少なくとも2つの画像を所定時間間隔で作成し；
（ｉｉ）所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に第一波長で強度レベル変化を示す前記画像の領域を決定するために少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し；
（ｉｉｉ）少なくとも第二波長での被験者の組織の少なくとも2つの画像を第二所定時間間隔で作成するステップを実施し；
（ｉｖ）所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に第一波長で強度レベル変化を示す画像の領域を決定するために少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し；
（ｖ）第二所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に少なくとも第二波長で強度レベル変化を示す画像の領域を決定するために、少なくとも第二波長で作成される少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較するステップを実施し；そして
（ｖｉ）異なるスペクトル特徴を有する血液の構成成分の濃度を決定するために第一および少なくとも第二波長で決定される強度レベル変化を示す領域をスペクトル分析する、
ステップを包含する方法も提供される。

上記の方法において、血液の構成成分は好ましくは血液の酸素飽和度に関連し、そしてさらに好ましくはオキシ−ヘモグロビンおよびデオキシ−ヘモグロビンのうちの少なくとも1つを含む。さらにスペクトル分析するステップは、好ましくは統計的に最小二乗分析法であり得る信号増幅分析により実施され得る。

本発明のさらに好ましい実施形態に従って、組織は網膜組織であり（この場合、手法は非侵襲的である）、あるいは内臓の光学的に接近可能な組織、例えば食道、腸または脳組織であり得る（一般的に侵襲性または半侵襲性手法を要する）。

本発明のさらに別の好ましい実施態様に従って、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンド中の物質移動の特徴づけ方法であって、以下の：
（ｉ）所定波長でバックグラウンド中の物質の少なくとも2つの画像を所定時間間隔で作成し；
（ｉｉ）所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に強度レベル変化を示す画像の領域を決定するために少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し；
（ｉｉｉ）物質の少なくとも１つの経路マップを作成するために画像の領域を重ね合わせ；
（ｉｖ）バックグラウンド中に存在する経路中の変化を決定するために少なくとも１つの経路マップを予め得られた経路マップと比較する、
ステップを包含する方法が提供される。

この方法では、物質は血液であり、そして本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドは被験者の組織であり、そしてその場合、経路マップはその組織中に存在する血管経路のマップである。さらに変化は、新規血管経路の出現または前に存在した血管経路の消失のうちの少なくとも1つであり得る。

本発明のさらに好ましい実施形態に従って、組織は網膜であり（この場合、手法は非侵襲性である）、あるいは内臓の光学的に接近可能な組織、例えば食道、腸または脳組織、あるいは経路の内部表面であり得る（一般的に侵襲性または半侵襲性手法を要する）。さらに上記の方法において、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドはわずかに異なる画像の後処理アラインメントにより得られる必要があり得る。

本発明のさらに別の好ましい実施形態に従って、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンド中の物質移動の特徴づけ方法であって、以下の：
（ｉ）所定波長でバックグラウンド中の物質の少なくとも2つの画像を所定時間間隔で作成し；
（ｉｉ）所定時間間隔のうちの少なくとも１つの間に強度レベル変化を示す画像の領域を決定するために少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し；
（ｉｉｉ）物質の少なくとも１つの経路マップを作成するために画像の領域を重ね合わせ；
（ｉｖ）バックグラウンド中に存在する経路の特徴を決定するために少なくとも１つの経路マップを精査する、
ステップを包含する方法がさらに提供される。

上記の方法において、物質は血液であり、そして本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドは被験者の組織であり、そして経路はその場合、その組織中に存在する血管経路であり得る。さらに組織は網膜組織であり（この場合、手法は非侵襲性である）、あるいは内臓の光学的に接近可能な組織、例えば食道、腸または脳組織、あるいは経路の内部表面であり得る（一般的に侵襲性または半侵襲性手法を要する）。さらにまた上記の方法において、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドはわずかに異なる画像の後処理アラインメントにより得られる必要があり得る。

本発明のさらに好ましい実施形態に従って、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンド中の物質移動の分析装置であって、以下の：
バックグラウンド中の物質を照明するための光源；
少なくとも第一および第二波長を限定するための波長選択装置；
バックグラウンド中の物質の少なくとも第一および第二波長で少なくとも2つの画像を所定時間間隔で取得するためのイメージャ（ｉｍａｇｅｒ）；
波長のうちの少なくとも2つの各々で少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し、そして強度レベル変化を示す領域を決定する弁別器；
弁別器により決定される強度レベル変化を示す領域のスペクトルを決定するよう適合させたスペクトル分析器；および
移動物質中の発色団の定量的レベルを決定するためのスペクトル分析器の出力を利用する発色団レベル計算機、
を包含する装置も提供される。

上記の装置は、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドのわずかに整然と並んでいない領域から得られる画像を整列するよう適合させた後処理画像アライナー（ａｌｉｇｎｅｒ）も包含し得る。さらに物質は血液であり、そして本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンドは被験者の組織であり、そして発色団はその場合、血液の構成成分であり得る。さらに組織は網膜組織であり（この場合、手法は非侵襲性である）、あるいは内臓の光学的に接近可能な組織、例えば食道、腸または脳組織、あるいは経路の内部表面であり得る。さらに発色団は好ましくは酸素飽和度に関連する血液の構成成分であり、そして発色団レベル計算機は酸素血中レベル決定器である。

上記の装置のいずれかにおいて、波長選択装置は光源とバックグラウンド中の物質との間の照明経路中に、あるいはバックグラウンド中の物質とイメージャとの間の画像形成経路中に、あるいはイメージャそれ自体の中に位置し得る。波長選択装置は好ましくは、コンピューター制御フィルターホイールであり、そして光源は好ましくはコンピューター制御フラッシュランプである。

本発明のさらに別の好ましい実施形態に従って、被験者の組織の分析のための装置であって、以下の：
（ｉ）組織を照明するための光源；
（ｉｉ）組織の少なくとも2つの画像を所定時間間隔で取得するためのイメージャ；
（ｉｖ）少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し、そして強度レベル変化を有する領域を決定する弁別器；ならびに
（ｖ）強度レベル変化を有する領域から血管経路位置の少なくとも１つのマップを作成するためのスーパーポジショナー、
を包含する装置がさらに提供される。

装置は好ましくは、被験者の組織中に存在する血管経路における変化を決定するために血管経路位置の少なくとも１つのマップおよび予め得られた血管経路マップを用いる経路マップ比較測定器も包含し得る。あるいは且つ好ましくは、それは被験者の組織中に存在する血管経路の特徴を決定するために少なくとも１つの血管経路マップを示すための出力表示装置を包含し得る。光源は好ましくは、コンピューター制御フラッシュランプであり、そして装置は好ましくは、画像形成波長範囲を限定する波長選択装置も包含する。

本発明の好ましい実施形態に従って、本質的に静止したおよび不変のスペクトル・バックグラウンド中の物質移動を特徴づけするための装置であって、以下の：
（ｉ）物質およびそのバックグラウンドを照明するための光源；
（ｉｉ）物質およびそのバックグラウンドの少なくとも2つの画像を所定時間間隔で取得するためのイメージャ；
（ｉｖ）少なくとも2つの画像のうちの少なくとも2つの少なくとも1組から得られる画像を少なくとも相互間で比較し、そして強度レベル変化を有する領域を決定する弁別器；ならびに
（ｖ）強度レベル変化を有する領域から物質の少なくとも１つの経路マップを作成するためのスーパーポジショナー、
を包含する装置をさらに提供する。

上記の装置は好ましくは、存在する経路における変化を決定するために物質の少なくとも１つの経路マップおよび予め得られた経路マップを用いる経路マップ比較測定器も包含する。それは好ましくは、物質の経路の特徴を決定するために少なくとも１つの経路マップを示すための出力表示装置、ならびに画像形成波長範囲を限定する波長選択装置も包含する。

本発明は、図面と一緒に考えて、以下の詳細な説明からさらに十分に理解され、認識される。

好ましい実施形態の詳細な説明
さらに十分に理解され得るよう、以下の例示的図を参照しながらある種の好ましい実施形態に関連して本発明をここで説明する。

ここで図面を詳細に特定的に参照しながら、示された事項は本発明の好ましい実施形態の実例として、ならびに例示的考察の目的のためであるに過ぎず、本発明の原理、概念的態様および関連する詳細の最も有用な且つ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示される、ということを強調する。図面を用いてなされる説明は、本発明のいくつかの形態が実際に具現化され得る方法を当業者に明らかにするに違いない。

ここで図１Ａを参照するが、これは生体器官の血管中の酸素飽和度を決定するための、本発明の好ましい実施形態により構築され、操作する装置を説明する模式的ブロック図である。図１Ａでは、網膜中の血管に関して非侵襲的に測定を実施する装置が示されるが、装置は本明細書中に上記したように、例えば光学的に接近可能な内臓、例えば食道の表面組織または脳の表面組織を照明し、画像形成するための内視鏡または腹腔鏡検査用プローブを用いることにより、他の器官中の血管への適用のために等しく有用である、と理解されるべきである。

図１Ａの装置（１０）は、当該器官の表面層を画像形成するための画像形成光学系装置（１２）を包含する。網膜（１６）を画像形成するためには、画像形成光学系装置（１２）は、好ましくは眼底カメラまたは検眼鏡である。他の内臓を画像形成するためには、画像形成光学系装置は好ましくは、高品質対物レンズヘッドまたはマクロカメラレンズを含み、そして好ましくは一般的に身体の外側から非接近可能な器官を画像形成するための光学内視鏡または腹腔鏡プローブを含み得る。このような装置は、図１Ｂに模式的に示されているが、これは、一般的に非接近可能な内臓の検査の一例として、被験者の食道の表面を画像形成するために用いる場合の光ファイバープローブ（３０）を含めた好ましい画像形成光学系装置を示す。同様に装置（１０）は、とりわけ適切に適合させた画像形成光学系およびデータ処理モジュールを用いることにより、被験者の組織中の血管以外の経路中の流れの分析のために、本発明のさらに好ましい実施形態に従って用いられ得る。

画像形成光学系装置（１２）は好ましくは、任意のその他の適切な照明源も好ましくは用いられ得るが、しかしフラッシュランプ（１４）から来る、ここに記載された実施形態における入力照明が、当該照明組織（１６）からの反射または散乱により得られる画像情報と同一の光路に沿って、照明器官組織（１６）に向けられ得るよう、光線分割装置、中心透過開口を有する鏡またはその他の光学的装置を含有する。画像形成情報は好ましくは、高解像度画像形成装置、例えばＣＣＤカメラ（１８）により受信される。このカメラ（１８）からの出力画像データは好ましくは、好ましいフラッシュランプ（１４）のタイミングも制御するコンピューター処理および制御装置（２２）によりその出力データが処理されるデジタルフレームグラバーのような画像取得装置（２０）に入力される。

コンピューター処理および制御装置（２２）は好ましくは、多重イメージャーおよびプロセッサー（２２ａ）、スペクトル分析器のデータ出力を利用する、好ましくは酸素血中レベル決定因子を組入れるスペクトル分析器（２２ｃ）を包含する。出力データの作成後、それらは好ましくは表示モニター（２４）および／またはプリンター（２６）に向けられる。コンピューター処理および制御装置（２２）の構成成分モジュールの各々の操作は、図４Ａ、４Ｂおよび５のフロー図を参照しながら本明細書中で以下でさらに詳しく説明される。装置は好ましくは例えば国際公告WO 99/63882（A. Grinvald and D. Nelson, “Imaging and Analyzing Movement of Individual Erythrocytes in Blood Vessels”）（この記載内容は、参照により本明細書中で援用される）として公開されたＰＣＴ特許出願に記載されているように、空間的変動に関してならびに全体的強度変動に関して照明フラッシュを較正するための構成成分装置も含む。このような装置は、照明源の均一性が不十分である場合、または強度がフラッシュ毎に有意に変化する場合にのみ必要である。

波長選択装置（２８）、（２８ａ）は、狭い帯域の偶発的照明が異なる予め選定された波長で網膜中の血管を逐次的に画像形成するために用いられるよう、照明光路または画像化光路に付加される。あるいは且つ好ましくは、スペクトル選択は、画像形成形またはカメラそれ自体内で作動される設備、例えば多重検出器アレイ（２８ｂ）を用いて実施され、各アレイは特定の波長帯域を検出する。典型的に用いられる帯域幅は、2〜30 nmである。これらの波長選択素子は、上記の公告WO 99/63882に記載された装置に既述された帯域フィルター（この場合、フィルターは赤血球の画像のコントラストを改善する光の帯域幅を提供するために必要とされる）とは異なる。

赤血球はスペクトルの青色および緑色域で強く吸収するため、フィルターは、それに対してそれらが画像形成される、そして異なる色の多数の色素も含有する相対的に反射性の網膜とのそれらのコントラストを改善するためにその従来技術系で必要とされる。一方、本発明においては、波長選択装置は、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン間の差スペクトルのピークであるよう、そして2つの発色団の吸収がたまたま同一である等吸収波長（データを分析するのに用いられる使用分光分析モデルのための対照波長として用いられる）であるよう、予め選定された波長で血液のオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン構成成分の別個のスペクトル関与の抽出を実施するために必要である。

本質的に同一領域のスペクトル的解像画像は、事実上同時に、しかし異なる波長で取得されるべきである。これは好ましくは、波長選択装置（２８）、（２８ａ）のようなコンピューター駆動高速フィルターホイールの使用により成し遂げられる。しかしながら任意のその他の高速制御可能色切り替えまたは分割装置も、本明細書の上記で説明されているように、コンピューター処理および制御装置（２２）から来る波長選択を変更するための制御コマンドで、用いられ得る。

赤血球の空間パターンが血管を下降する赤血球の移動に調子を合わせて変化する方法、ならびに移動情報が静止情報から分離され得る方法の表示を示す一連の模式図である図２Ａ〜２Ｃをここで参照する。血流のために、黒色ドットとして図２Ａおよび２Ｂに示されているような赤血球のクラスターは、白色形跡として図２Ａおよび２Ｃに図示された血管セグメントを下降する。その結果、異なる空間的赤血球パターンが、異なる時点で同一血管セグメント中に観察される。

図２Ａは、ｔ_A時点での血管セグメント中の赤血球分布を模式的に示す。図２Ｂは、ｔ_B時点（観察される血管によって、典型的には2〜3ミリ秒から100ミリ秒の間隔だけｔ_Aより遅い時点である）での同一血管セグメント中の赤血球分布を示す。図２Ｂにおける空間的赤血球パターンは、図２Ａと比較して変化している。図２Ａおよび２Ｂにおける十字線は、血管上の同一空間位置を意味する。図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂの2つの画像が、一方が他方から差し引かれた場合に結果的に生じる画像を示す。このようにして得られた差画像は、赤血球の移動のための、反射における変化をはっきり見せる。黒色および白色円形パターンは、図２Ｂと比較した場合の図２Ａにおける赤血球の置換のために生じる。図２Ｃは、図２Ａおよび２Ｂにおける十字線の中心で観察された小矩形の拡大図である。血管それ自体（白色）およびバックグラウンド組織（灰色）の位置は2つの画像間で変更されないために、これらの構造物は差し引き時に帳消しにして、移動中の赤血球に関連した情報のみを残す。上記の手法は、上記のＰＣＴ国際公告WO 99/63882から既知である。この情報（移動赤血球の画像の形態で）は次に、以下で説明される段階における比較および処理のために、好ましくはコンピューター処理および制御装置（２２）のメモリモジュール中に保存される。

本発明の図１Ａの装置を用いて、この手法はここで好ましくは異なる波長で数回反復される。移動物体の実から得られる波長依存性情報は次に、好ましくはコンピューター処理および制御装置（２２）により処理されて、移動赤血球のスペクトルを赤血球中に含有される発色団（この場合はオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン）の吸収スペクトルに分解させる。

移動物体、この場合は赤血球だけについてスペクトル情報画得られる方法を説明する網膜血管系の画像を示す連続模式図である図３Ａ〜３Ｄをここで参照する。図３Ａおよび３Ｂにおいて、Ａ₁およびＢ₁と印を付けた上列の図は、画像中の静止情報が真に静止しているとみなされ得るのに十分迅速な連続で波長λ₁で得られる2つの画像である。例示目的のために2つの画像のみが図示されているが、しかし各波長で得られるデータの質を、それゆえ信頼性を増大するために、一連のいくつかの、典型的には6〜8またはそれ以上の数の画像が好ましくは各波長で取得される。次に同一手法がいくつかの波長（λ₁〜λ_n）で反復される。Ａ₁およびＢ₁の印を付けた画像対とＡ_nおよびＢ_nと印を付けたものとの間の差から観察されるように、異なる波長で得られる血管系のコントラストは異なる。

図３Ｃをここで参照するが、この場合、図３Ｃ₁は図２Ａ〜２Ｃに記載されたように画像Ａ₁およびＢ₁を差し引くことにより得られる示差的画像である。同様に、λ_n（この場合、Ｃ_nと印を付けた示差的画像が得られる）までの各波長に関して示差的画像が作成される。さらに好ましくは、画像Ａ₁およびＢ₁を分けることにより示差的画像が得られ、この手法は一様でない照明を矯正するよう操作する。さらに好ましくは、個々のフレームＡ₁の各々を、上記の6〜8個の厳密に時間調節された画像から得られる平均フレームＢ₁で割ることにより、示差的画像が得られる。照明の差が小さい場合、差引き手法および割り算手法は本質的に等価である。図３Ａおよび３Ｂに示された例では、各画像対間の差が画像それ自体に比して非常に小さいため、図３Ｃにおける示差的画像を定数（図の場合は1000）を掛けることにより結果は増強された。

代替的な好ましい実施形態に従って、好ましくはできるだけ同時的に、いくつかの波長λ₁〜λ_nで相対的に迅速な連続で得られる一連の画像として図３Ａ₁〜３Ａ_nを作成することにより、装置に関して測定が実施される。これは、図１Ａの装置に示されているように、高速切り替え可能フィルター（２８）または（２８ａ）により成し遂げられる。図３Ｂ₁〜３Ｂ_nは、高速切り替え可能フィルターの使用により迅速に連続して同一波長λ₁〜λ_nで得られる、本質的には同時に、しかし画像Ａ₁〜Ａ_nのシリーズが取得された間の時間より遅い時点で得られる、図Ａ₁〜Ａ_nにおけるのと同一網膜血管系の一連の画像である。しかしながら画像Ｂ₁〜Ｂ_nは、アラインメントが画像に関して実施された後、画像中の静止情報が真に静止しているとみなされ得るということの正当な根拠となるのに十分にＡ₁〜Ａ_nに近接して得られる。さらにまた、この代替的な好ましい実施形態に従って、例示的目的のために、2シリーズの画像（Ａ_iおよびＢ_i）のみが図示されているが、しかし一連の6〜8個の画像が好ましくは取得される。図３Ｃ₁〜３Ｃ_nは、画像Ａ_iおよびＢ_iを引き算するかまたは割り算することにより得られる一連の示差的画像である。

図３Ａ₁〜３Ａ_nおよび図３Ｂ₁〜３Ｂ_nの未加工画像から、そして選定された異なる波長で得られる図３Ｃ₁〜３Ｃ_nの示差的画像から得られる反射スペクトルの一連のグラフである図３Ｄをここで参照する。図３Ｄの実線曲線は、図３Ａ₁〜３Ａ_nの画像から得られるが、しかしそれは代わりに図３Ｂ₁〜３Ｂ_nから得られる可能性もあり、そして時間依存性および静止スペクトル情報をともに含有する画像シリーズから得られる典型的反射スペクトルを示す。これら2つの構成成分は、それぞれ血液の空間的特性およびバックグラウンド組織、例えば血管の壁、周囲組織、ヘモグロビン以外の色素等の空間的特性から生じる。このスペクトルが移動物体のみ、即ち赤血球中に含有されることが既知である発色団のスペクトルに分解されるものであり、そしてオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンがこのような方法で算定される場合、画像の静止素子の未知のスペクトル関与のために、結果はそれぞれの濃度に関して不正確な値を生じる。一方、図３Ｄの破線曲線は、時間依存性スペクトル情報のみを、即ち画像化血管内の赤血球におけるヘモグロビン酸素飽和度についての情報を含有する示差的画像の部分から得られる典型的反射スペクトルを示す。したがってこのスペクトルは、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンに精確に分解されて、それらのそれぞれの濃度の精確な値を生じる。

スペクトル分解は、好ましくはビーア−ランベルト（Beer-Lambert）型（経路長の波長依存性を含むよう修正されないかまたは修正される）の線状分光分析モデルおよび実験データ（自由パラメーターとしてのオキシ−およびデオキシ−ヘモグロビン濃度を、ならびに好ましくは光散乱寄与を符号化する項を含む）へのモデル方程式の最小二乗法適合度の使用により実施される。画像は、好ましくは少なくとも3つの波長で取得される。これらの波長は好ましくは特徴的ヘモグロビン吸収ピークの範囲内（520〜590 nm）であり、そして好ましくは、用いられた好ましい分光分析モデルから生じる方程式を解くための少なくとも3つの個々の方程式を提供するよう選択される。一般的場合には、特定の分光分析モデル中に出現する未知の濃度を有する発色団の数は、必要とされる個々の方程式の数に関する低い方の限度に設定し、したがって画像を取得するための最小数の波長を決定する。しかしながら付加的波長は、モデルの妥当性のための対照として、または相でない場合は理論的考察から推定されねばならないモデルパラメーターを同調するために、あるいはスペクトル分解アルゴリズム（好ましくは最小二乗法）のノイズに対する信号を増大するために、特定の分光分析と関係なく付加され得る。

図３Ｄに示された示差的スペクトルは、好ましくは画像の多数の亜領域に関して記録され、そして各々のピクセルに下げた場合でも、全画像化領域の酸素飽和度マップを生じる。この手法は、画像化領域の同定を、そしてその健常および病態領域間の識別を可能にする。

当該領域のスペクトル画像データを取得するための、本発明の図１Ａの装置の好ましい操作方法に従って実行されたステップを例示する図４Ａのフロー図をここで参照する。
ステップ４０． バックグラウンド画像撮影（照明なし）。
ステップ４２． 当該領域の画像を撮影するためにフラッシュ照明。
ステップ４４． 画像の保存。
ステップ４６． 15〜40ミリ秒の間隔でｋ回のステップ４４〜４６の高速反復。ｋは明白な移動信号を得るために必要なフラッシュの数であり、好ましくは約6〜8フラッシュである。
ステップ４８． 波長変化（例えばフィルターホイールが1段階進む）。
ステップ５０． 同一病巣で「波長ｎ個組」の画像を得るために、ステップ４０〜４６をｎ回（ｎ＝3）反復する。

あるいは且つ好ましくは、図４Ｂに例示したように、当該領域のスペクトル画像データを取得するために、修正連続ステップが用いられ得る。この修正連続ステップは、図３Ａ〜３Ｄとの関係で上記された好ましい代替的実施形態に対応するが、それらを以下に示す：
ステップ５２． バックグラウンド画像撮影（照明なし）。
ステップ５４． 当該領域の画像を撮影するためにフラッシュ照明。
ステップ５６． 波長変化（例えばフィルターホイールが1段階進む）。
ステップ５８． 画像の保存。
ステップ６０〜６１． 同一病巣で「波長ｎ個組」の画像を得るために、ステップ５４〜５８をｎ回（ｎは用いられた波長の数であり、この場合ｎ＝3）高速反復する。
ステップ６２〜６３． 波長ｎ個組みの「ｍ時点画像シリーズ」を得るためにステップ５２〜６０を、毎回異なる波長で、ｍ回（ｍ＝2）反復する。

上記のステップ５８の代わりに実施される当該領域のスペクトルデータを取得するための方法の別の代替的且つ好ましい実施態様は、好ましくは画像形成装置またはカメラそれ自体内で作動される設備、例えば多重検出器アレイを用いて、前に記載されたように、当該波長全てを通して各画像を同時に取得することである。

図４Ａまたは４Ｂのフロー図の方法により得られたデータを分析するための、ならびに画像化領域中の各当該領域に関する血中酸素飽和度レベルを決定するための、本発明の図１Ａの装置の好ましい操作方法に従って実行されるステップを例示する図５のフロー図をここで参照する。

ステップ７０． 図４Ａまたは４Ｂに示されたデータ取得工程の出力で得られた画像の波長ｎ個組のｍ時点シリーズに関して実施された検出器のパターンノイズ・アーティファクトの排除。
ステップ７２． 網膜に関する血管パターンによる全画像のアラインメント。
ステップ７４． 網膜血管系のものより有意に低い空間的頻度を有する情報を排除するための画像処理、好ましくは画像の高域フィルタリング。
ステップ７６． 画像処理による考え得る照明アーティファクトの排除。
ステップ７８〜７９． 示差的画像シリーズの作製；例えば各波長ｎ個組のピクセル×ピクセル方式を、ｍ時点画像シリーズのそのｓ番目の素子（1＝ｓ＝ｍ）で割って、その結果生じたｍシリーズのｓ番目の素子をその後排除することによる。

ステップ８０． 長時間にわたって（ｔ＝１・・・・ｍ-1）ステップ７８〜７９で得られた示差的波長（ｍ-1）シリーズを平均化して、各波長に関して1画像を作成することによる「主示差的画像ｎ個組」の作製。
ステップ８２． ステップ７６で得られた画像のうちの1つからの「当該領域」、即ち関連血管素子の手動選択、ならびに「主示差的画像ｎ個組」上での、画像×画像方式（「ＲＯＩ」）での画像の選定サブセットの数学的交差の作製。
ステップ８４． ステップ８２で選択されたＲＯＩのピクセル平均。ｎ−素子（各波長に関して1個）を有する「波長ベクトル」を生じる。

ステップ８６． 波長ベクトルの保存。
ステップ８８． 異なる血管素子を選択するためのステップ８２〜８６の反復。ユーザーが所望するだけ何回も波長ベクトルを別個に保存。
ステップ９０〜９１． ユーザーに選択された波長ベクトルの各々に関する最小平均二乗法による、オキシヘモグロビン、デオキシヘモグロビンおよび波長非依存性項の消光係数の線状組合せへの波長ベクトルの対数のスペクトル分解。このステップは、オキシ−およびデオキシ−ヘモグロビンの濃度に光路長を掛けて生じる。
ステップ９２． ステップ９１で得られたオキシ−およびデオキシヘモグロビンの濃度の各血管素子に関する血中酸素飽和度への変換。
ステップ９４． 結果の表示。

しかし、図４Ａ〜５における記載されたアルゴリズムは、関連データが処理され、抽出される一方法に過ぎず、そして当該領域における血流の血中酸素飽和度レベルを決定するために、それらが必要なデータ分析手法を提供する場合、当該技術分野で既知のその他の方法が等しく良好に利用され得る、と強調されるべきである。

血管新生または毛細血管遮断が起こると考えられる組織の一領域で作成された連続画像の模式図であり、画像は、一連の個々の画像において直接得られる粒子流情報からの存在する血管中の赤血球の完全移動マップを作成するために用いられる図６Ａ〜６Ｃをここで参照する。図６Ｄは、被験者の組織中の血管新生または毛細血管遮断の存在の決定に適した本発明のさらに好ましい実施形態により構築され、作動する画像形成装置の模式図である。図６Ｄの装置は、本明細書中で以下でさらに詳細に説明される。

ここで図６Ａは、図Ｄの装置により作成され得るような、当該領域内の粒子流の経路を拘束する血管の単一フレーム画像の模式図であり、血管中の吸収ヘモグロビンと網膜組織からの反射間に良好なコントラストを提供する波長で好ましくは固定される波長選択装置を伴う。（１０１）、（１０２）で示される2つの大型可視血管の両端は、図面の中央でより小さい、ほとんど眼に見えない血管により接合されているが、しかし粒子は大型血管間の経路中を流動する。このような単一フレーム画像から、2つの大型血管間の血管系についてはほとんど知られていない、ということが明らかである。しかしながら本発明の装置を用いて、本明細書中に上記されたのと同様に、当該領域の一連の時限画像が作成され、そしてさらなる処理のために、画像はコンピューターおよび制御装置のメモリに保存される。同一領域のこれらのデジタル画像は次に、一組の逐次示差的画像を作成するために互いから差し引かれ、あるいはさらに好ましくは各々の別個の時限画像が、連続フラッシュ照明により、数回、本明細書中に記載された好ましい実施形態では6〜8回、すばやく反復的に捕獲され、その結果生じた好ましくは6〜8個の一連の画像が平均されて、各々連続した別個の時限画像のための約数として用いられる。したがってこれら2つの方法による示差的画像の作成は、図３に関して本明細書中に上記されたものと同様である。

それぞれ暗色移動粒子のクラスターまたはそれらの非存在を表し、そして上記のような連続フレームの示差的分析により作成された黒および白スポットを含有する模式的示差的画像を示す図６Ｂ₁〜６Ｂ₄をここで参照する。一領域を通って流れる粒子列中の「ギャップ」の流れが、粒子のクラスターそれ自体とまさに同様に、経路情報の供給源である、ということは容易に明らかになるはずである。各々図６Ｂ₁〜６Ｂ₄で作成される4つの別個の示差的画像は、異なる毛細血管を下って移動する赤血球クラスターの異なる位置を無作為に示す。参照目的のために、毛細血管内の赤血球クラスターの相対位置が静止可視的血管と関連し得るよう、示差的画像を可視的血管（１０１）、（１０２）の図の上に重ねる。

図６Ｂ₁〜６Ｂ₄の示差的画像中で可視的なスポットを重ねた結果を示す図６Ｃをここで参照する。スポットは、血管それ自体は任意の単一フレーム中で非可視的であるが、しかしそれらの空間的位置はこの重ね合わせ手法により仮想位置として明らかにされ得るよう、移動粒子が通過する血管の経路を追跡する。図８の（１３０）に関して以下に記載されるような後処理ステップは、好ましくはこの重ね合わせを最終移動マップに変換するために付加され得る。

当該領域中の毛細血管の経路マップを限定する完全移動マップは次に、同一被験者における同一領域について以前に得られた同様のマップと比較され、そして装置のメモリ中にデジタルに保存される。血管新生の存在または機能中の血管の消失は、システムオペレーターにより、担当医師により、または既知の画像処理技術に基づいたアルゴリズム方法により、視覚的比較によって容易に決定され得る。

図６Ａ〜６Ｃに示された画像を得るために用いられ得るような装置（１００）の略図である図６Ｄをここで参照する。図６Ｄの装置は、図１Ａの場合と同様に、網膜領域（１６）を画像形成することが示されるが、しかし、適切な光学的装置の使用により、その中の血管構造を特徴づけするという目的のために、任意の光学的に接近可能な組織が検査され得る、と理解されるべきである。同様に、装置（１００）は、本発明のさらに好ましい実施形態に従って、被験者の組織中の血管以外の経路を特徴づけするためにも用いられ得る。

装置（１００）は、当該器官の表面層を画像形成するために、画像形成光学装置（１２）を含む。網膜（１６）を画像形成するために、画像形成光学装置（１２）は、好ましくは眼底カメラまたは検眼鏡である。他の内臓を画像形成するためには、画像形成光学系装置は好ましくは、高品質対物レンズヘッドまたはマクロカメラレンズを含み、あるいは好ましくは上記で図１Ｂに模式的に示されているように、一般的に身体の外側から非接近可能な器官を画像形成するための光学内視鏡または腹腔鏡プローブを含み得る。画像形成光学系装置（１２）は好ましくは、任意のその他の適切な照明源も好ましくは用いられ得るが、しかしこの好ましい実施態様ではフラッシュランプ（１４）から来るように示された入力照明が、当該照明組織（１６）からの反射または散乱により得られる画像情報と同一の光路に沿って、照明器官組織（１６）に向けられ得るよう、光線分割装置、中心透過開口を有する鏡またはその他の光学的装置を含有する。帯域フィルター（１０６）、（１０６ａ）は一般に、異なる色の多数の色素をも含有する相対的に反射性の網膜に対して赤血球の画像のコントラストを改善する光の帯域幅内で装置を操作させるために必要とされる。波長フィルタリング装置は、光路中の任意の適切な位置に挿入され得る。

画像形成情報は好ましくは、高解像度画像形成装置、例えばＣＣＤカメラ（１８）により受信される。このカメラ（１８）からの出力画像データは好ましくは、好ましいフラッシュランプ（１４）のタイミングも制御するコンピューター処理および制御装置（１０４）によりその出力データが処理されるデジタルフレームグラバーのような画像取得装置（２０）に入力される。コンピューター処理および制御装置（１０４）は好ましくは、多重イメージシリーズ取得器および移動弁別プロセッサー（１０４ａ）、経路マップを作成するための示差的画像スーパーポジショナー（１０４ｂ）、ならびにあらかじめ作成され、コンピューター処理および制御計（１０４）または他の場所のメモリに保存された経路マップを呼び出し得る、そして表示モニター（２４）および／またはプリンター（２６）への出力のためにデータを処理する経路マップ比較測定器（１０４ｃ）を包含する。あるいは且つ好ましくは、作成された単数または複数の経路マップは、経路マップ比較測定器（１０４ｃ）から表示装置（２４）に直接的に出力され、したがってオペレーターまたは担当医師は経路マップそれ自体を精査して、経路の形態における、あるいはそれらの存在下でのまたは存在の欠如における、任意の異常変化を確証し得る。コンピューター処理および制御計（１０４）の構成成分モジュールの各々の操作は、図７および８のフロー図を参照しながら、本明細書中で以下でさらに詳細に説明される。

被験者における当該領域内の赤血球クラスターの移動マップの決定のための画像データを取得するための、本発明の図６Ｄの装置の好ましい操作方法により実行されるステップを例示する図７のフロー図をここで参照する。ステップは図４Ａの実施形態で用いられたものと同様であるが、但し、図４Ａのステップ４８は、照明の波長の変化または検出機能性を含めて、最終ステップ４９の出力がｎ個の一連のｍ時点画像の作成のみであるよう、省略され得る。

図７のフロー図の方法により得られるデータを分析するための、そして画像化領域中の当該領域に関する完全経路マップを決定するための、そして個の経路マップを保存し、同一被験者に関して異なるタイミングに得られた他のものと比較するための、本発明の図６Ｄの装置の好ましい操作方法により実行されるステップを例示する図８のフロー図をここで、参照する。

ステップ１１０〜１２６は本質的には図５に示された実施形態のステップ７０〜８６と同様であるが、但し、測定は一般的に単一波長で実施される。ステップ１２８では、本明細書中に上記されたような、測定された反射率値の標準偏差の測定、その後の閾値化、あるいは長時間に及ぶ点での平均値からの最大差の測定とその後の閾値化といった当該技術分野で既知の方法の１つにより、ステップ１２６で蓄積された別個の示差的画像の全てが重ね合わされて、当該領域の単一画像を作成する。

ステップ１３０では、作成された経路マップを後処理して、よりむらのない結果的に生じるマップ（これはステップ１３２で最終的な形にされる）を作成するために、既知の画像処理技法が用いられる。ステップ１３４〜１４４では、作成された経路マップは、装置メモリに保存され、装置モニター（２４）上に表示され、そして同一被験者の当該同一領域についてなされた他のマップは、ステップ１３２で最終的な形にされたマップとの比較のために、あるいは前に得られたマップとの信号処理アルゴリズムによる比較のために、好ましくはメモリから呼び出され得る。これらのマップのいずれかのハードコピーも装置プリンター（２６）で任意にプリントアウトされ得る。

しかし図７および８における記載されたアルゴリズムは関連データが抽出され、処理される一方法を例示するに過ぎず、そして当該領域における血流の移動決定から経路位置を決定するために、それらが必要なデータ分析手法を提供する場合、当該技術分野で既知のその他の方法が等しく良好に利用され得る、と強調されるべきである。

本発明は本明細書中に特定的に示され、上記されたものに限定されない、と当業者に認識される。むしろ本発明の範囲は本明細書中に上気したような種々の特徴の組合せおよびサブセットを、ならびに上記の説明を読んだときに当業者に生じ得る、そして従来技術に存在しないそれに対する変更および修正を包含する。

本発明の好ましい実施形態による生体器官の血管中の酸素飽和度を決定するための装置を例示する模式図である。 被験者の一般的に非接近可能器官の表面を画像形成するために用いる場合の、光ファイバープローブを含めた、図１Ａの画像形成光学装置の好ましい実施形態を示す挿入図である。 赤血球の空間パターンが血管を下降する赤血球の移動に調子を合わせて変化する方法、ならびに移動情報が静止情報から分離され得る方法の表示を示す一連の模式図である。 移動物体、この場合は赤血球だけについてのスペクトル情報の好ましい抽出方法を説明するための、異なる波長に関する網膜血管系の画像を示す連続模式図である。 分析される当該領域のスペクトル画像データを取得するための、図１Ａの装置で実行されたステップを例示する模式的フロー図である。 分析される当該領域のスペクトル画像データを取得するための、図１Ａの装置で実行されたステップを例示する模式的フロー図である。 図４のフロー図のステップにより得られたデータを分析するための、ならびに画像化領域中の各当該領域に関する血中酸素飽和度レベルを決定するための、本発明の好ましい方法に従って実行されるステップを例示する模式的フロー図である。 血管新生または毛細血管遮断が起こると考えられる組織の一領域の連続画像、ならびに個々の画像から得られる示差的画像から作成される経路マップの模式図である。 図６Ａ〜６Ｃに示したもののような画像を作成するための、そしてそこから検査中の組織における血管新生または毛細血管遮断の存在または程度を決定するための、本発明の好ましい実施形態による装置を例示する模式図である。 被験者における当該領域内の赤血球クラスターの移動マップの決定のための画像データを取得するための、本発明の図６Ｄの装置の好ましい操作方法により実行されるステップを例示するフロー図である。 図７のフロー図の方法により得られるデータを分析するための、そして画像化領域中の当該領域に関する完全経路マップを決定するための、本発明の図６Ｄの装置の別の好ましい操作方法により実行されるステップを例示するフロー図である。

Claims (4)

1. 被験者の網膜の分析装置であって、以下の：
   （ｉ）上記網膜を照明するための光源；
   （ｉｉ）上記網膜の少なくとも第１および第２の画像を所定時間間隔で取得するためのイメージャ；
   （ｉｉｉ）第１画像と第２画像とを相互に比較することによって、第１画像と第２画像との間で強度レベル変化を示す領域を決定するための弁別器；
   （ｉｖ）別個の示差的画像の強度レベル変化を示す上記領域を互いに重ね合わせることによって、強度レベル変化を示す上記領域を用いて少なくとも１つの血管経路位置のマップを作成するためのスーパーポジショナー；ならびに
   （ｖ）上記被験者の前記網膜中に存在する血管経路における変化を測定するために、前記の少なくとも１つの血管経路位置マップおよび予め得られた血管経路マップを用いる経路マップ比較測定器、
   を含む前記装置。
2. 前記被験者の前記網膜中に存在する血管経路の特徴を決定するために、前記の少なくとも１つの血管経路マップを表示するための出力表示装置を同様に含む、請求項１に記載の装置。
3. 画像形成波長範囲を規定するための波長選択装置を同様に含む、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記光源がコンピューター制御フラッシュランプである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。

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