CN1292874A - 白细胞分类和网织红细胞计数的测定方法 - Google Patents

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Abstract

在因会聚相对的样品室壁而具有可变的通过面厚度的样品室(14)内对存在于静态抗凝全血样品中的靶带核细胞和含有剩余核糖体物质的靶细胞进行光学检测、计数和分析。至少一个会聚壁(8)是透明的以便可以观察到血样。该室的可变厚度在室中形成了第一个厚度较小的区(A),其中样品中各红细胞(32)和红细胞静态单层(31)在将样品导入并充满该室后停留在该区。存在于样品中的较大的成形组分诸如白细胞(34)和带核红细胞停留在该室中的厚度较大的区(B)内,而停留在这类厚度较大区中的不带核的红细胞团聚成红细胞钱串(33)。通过将荧光染料与血样混合,借助于一种扫描仪(54)可以计数并区分样品中的靶细胞,所述的扫描仪能够测定发源自样品中靶细胞的不同波长的颜色信号并根据所发射的颜色信号的特性彼此区分靶细胞。

Description

白细胞分类和网织红细胞计数的测定方法
本发明涉及一种用于分析抗凝全血的静态样品的装置和方法。更具体地说，本发明涉及一种用于分析静态血样以便提供白细胞分类计数、网织红细胞计数分析、带核红细胞计数和检测属于罕有事件的异常带核循环细胞(诸如癌细胞)的装置和方法。
背景领域
近来在血液分析学中的进展已经提高了从患者血样中获得的信息的质量和数量。结果是：对使用患者血样作为诊断工具感兴趣的医疗团体也得到了增加，对抗凝全血进行的最普遍进行检测试验是全血计数(或CBC)，这是一套试验，除对细胞成分和血小板进行计数外，它还可以包括红细胞度量、网织红细胞计数和属于存在于血样中的白细胞类型的分类的白细胞分类计数(LDC或“Diff”)。样品的一般物理特性即各种细胞或计数必须使用与整个样品相关的定量方法来分析。在常规的测量装置和方法中，要求精确的样品计量和稀释、其次是特定的测定装置。另外，该仪器必须测定各细胞的定量情况，通常包括给一种高度稀释的样品提供稀释的物质通过使用电学或光学方式测定该池的流动池的连续通道。再进一步说，将定性测定用于对由特异性亚群组成的总白细胞百分比进行分类。亚群的数量取决于所涉及仪器的精致程度，它可以是仅两个或7个以上的分类。
从历史的观点来看，使用从用于计数的那些方法分离出来的方法已经完成了CBC的分类方面。例如，通过将小量的未稀释的血液涂在栽玻片上、染色干燥固定的涂片并在显微镜下检验所述的涂片可以传统地进行CBC的LDC部分。从这类涂片中可以获得合理的结果，但是数据的精确性和可靠性主要取决于技师的经验和技术。这类涂片的一个难题在于必须将细胞杀死并将其固定，且这会使结果取决于活细胞的许多类型的超活体染色和分析变得不可能，诸如某些细胞化学分析。此外，血液涂片的应用是使得劳动密集且成本过高，且由此一般不利于商业化应用。
另一种进行LDC的方法使用电阻抗或光学流式细胞仪。流式细胞仪涉及使稀释的血样流过小导管，其中当它们连续流过导管时电阻抗或光学传感器可以评估组成的细胞。还可以将相同的装置用于同时统计并提供细胞计量数据。为了评估WBC’S，必须将血样稀释并必须将样品进行处理以便调节相对于WBC’S来说占优势的RBC’s的数量。尽管比上述涂抹法更为方便而稳定，但是流式细胞仪也具有几个缺陷。流式细胞仪的一个缺陷是对于控制稀释血样通过传感器的流速所必须的管道系统和流量控制。目前的流式细胞仪中的管道系统可以且经常发生渗漏，由此可潜在地危害仪器的精确度和安全性。这些分析还通常不能够提供任何类型的形态测量分析，这是因为没有得到各细胞的实际影象；仅可以分析来自任意得到细胞的总信号。许多目前的流式细胞仪的另一个缺陷与内部液体的流量控制和自动稀释装置的精确度相关。流式细胞仪的精确度取决于液体流量控制和样品稀释装置的精确度及其保持精确校准的能力。流量控制和稀释装置需要定期重新校准。对重新校准的需求说明了使用许多目前可得到的流式细胞仪存在的不精确结果和不理想的操作成本的潜在性。由John L．Haynes所著并公开在《细胞计量术增刊》(Cytometry Supplement)3：7-17(1988)的文章描述了流式细胞仪(电阻抗和光学)的原理和这类技术在所致力的各领域中的应用。无论在何种情况下，均将流式细胞仪中所检验的血样从10∶1稀释至50，000∶1。
另一种用于细胞分析的手段是如美国专利5，547，849；5，585，246及其它中所概括的容量毛细管扫描法，其中将相对未稀释的全血样品放入已知体积和厚度的毛细管中并在血液处于静态时检验它们。该项技术通过限定扫描波长到红细胞相对透明的波长而处理红细胞的存在，且它需要将样品处理成红细胞在测定过程中不聚集。因此，该项技术被限定到应用较长波长的荧光，且无法保障对网织红细胞或带核红细胞进行计数。另外，如同流式细胞仪一样，从扫描中无法得到形态信息。存在许多用于进行CBC或相关检测试验的可得到的商品仪器，而那些可提供几种以上CBC检测试验的仪器很快会变得复杂、昂贵的情况并易发生故障。此外，存在大量推荐用于特异性血液检测试验的方法，但它们无法提供在CBC中所预计的所有临床上有用的信息。
所有上述方法通常均被限定到单一的分析模式，其中组织化学染色和细胞形态学结合起来是不可能的。具有进行这两类检测试验的能力将扩展可以由所述方法识别的类别的数量。
理想的情况是存在一种用于检验抗凝全血的静态样品的方法和装置，该方法和装置能够提供精确的LDC、网织红细胞计数和带核红细胞与异常的循环带核细胞(诸如癌细胞)的检测的结果且不需样品液体在样品分析过程中流过取样室。
本发明的公开内容
本发明涉及一种用于检验并获得来自在室中所包含的静态的基本上未稀释的抗凝全血样品的信息的方法和装置。与本发明相关所用的术语“基本上未稀释的”指的是按不超过1∶1且优选更低比例稀释的血样。一般来说，在实施本发明方法中所用的仅有的试剂是染料、染色剂和抗凝剂且不将这些试剂(即使它们是液体)用来稀释样本。可以在具有固定深度的室内进行分析，条件是该深度可支持形成的红细胞聚集和胞隙(lacunae)，这种聚集和胞隙可在一种具有约7至约40微米厚度的层中形成，这取决于样品的血细胞比容。然而，具有固定的深度使得更难以分析具有广泛变化的白细胞计数的样品且对网织红细胞同时计数在这类室中是不可能的。优选的情况是使用具有如下所述的可变通过面厚度的室。在该室中的几个区会在该室的所有区中产生足够的毛细管力以便使血样扩散至整个室中，这最终在该室中产生静态血样。在分析时，血样中的唯一运动是血样的成形组分的布朗运动，这种运动并不使本发明变得无用。所述的装置包括具有相对的样品容纳壁(其中至少一个是透明的)的样品收集室，所述的壁优选在该室的至少一部分中会聚。在优选的实施方案中，所述室的通过面厚度由此在该室的不同区内变化。本公开内容中所用的术语“通过面(though plane)”指的是相当于所述室的任何区内的会聚壁之间最短距离的视线。正如下文所述，在所述室内的任意特定点处的两壁会聚程度即两壁之间的距离是已知的或者在将样品放入该室后可以测定它。
可以依一定尺寸来制造室中的最薄区以便当血样充满该室时存在于样品中的各个红细胞单层形成。所述室中该区的厚度应在约2至约7微米的范围，且优选约为5微米。由此在所述室的该区中可以得出红细胞的网织红细胞分类计数的测定值。
从该室的薄部分起增加室的厚度以便在用于区分和以区分方式对血样中的各种白细胞类和带核红细胞进行计数的该室中逐渐形成较厚的区。带核红细胞趋向于接近小淋巴细胞的大小，但是它们可以更大。在该区中室的厚度一般在约7至约40微米的范围。所述的室包含在可抽入血样的样品收集器内。
将所检测的样品与可以是例如一种或多种荧光染料的着色剂进行混合并使所得的混合物扩散在该室内以便形成因室中壁会聚而具有可变厚度的静态样品。可以在将样品加入到室中之前添加着色剂或在样品处于室的范围内的同时将着色剂添加到样品中，诸如通过将着色剂干燥涂布在室壁上。在室中有意义的区受到具有选择的一种或多种波长的光源选择性地照射，这导致样品中的着色剂发出荧光。在血样中包含有红细胞单层和白细胞和红细胞钱串的室中的区由此得到扫描(优选被一种光学仪器扫描)且可以将扫描的结果数字化并进行分析。正如由荧光所确定的，在所述室的该区中还可以得到具有由大小和RNA含量所分类的血小板的血小板分类计数，而在所述的室的该区中红细胞钱串物和胞隙形成。具有增加的RNA的血小板是较新鲜的血小板。
本发明提供了一种用于在抗凝全血样品中进行至少三部分白细胞分类计数的方法，该方法包括下列步骤：提供一种尺寸的取样室以便使在导入室的基本上未稀释的抗凝全血样品中的红细胞群聚集并使各个白细胞与红细胞分离开来。在取样室中形成发荧光的一种或多种着色剂与抗凝全血样品的混合物。所述的一种或多种着色剂可有效地以区分方式使全血中的至少三种不同的白细胞类型、且优选使五种不同的白细胞类型变得突出。使该混合物经所述的室分散以便在样品的光学工作视野中的血浆开放胞隙内形成一个或多个独立的白细胞的分离的静态群体。应理解当红细胞聚集时将所述的白细胞大规模从红细胞团中除去。然而，为了本发明的目的，白细胞可以位于红细胞聚集体的各红细胞上部而仍然会得到检测和估计，条件是白细胞对于扫描仪来说是可见的。通过在合适发光条件下的室中对分散的混合物进行逐个视野的X-Y-Z扫描来对视野进行光学扫描，所述的合适的发光条件会使得至少三种且优选五种或五种以上的不同白细胞类型由所述一种或多种着色剂以区分方式变得突出。对所述混合物中检测的全部差示突出的细胞进行计数且所计数的细胞由细胞类型来分类。因为在细胞中存在核物质，所以可以将相同的着色剂和光照条件用于在血样中完成网织红细胞或带核红细胞计数。就网织红细胞而言，细胞中的核物质构成细胞核的剩余部分诸如胞内RNA，且某些情况中是胞内DNA。存在于网织红细胞中的差示发出荧光的胞内物质可以称为“胞内带核物质剩余物”在所述室的最薄区内进行网织红细胞和不带核红细胞参数分析，其中，各个成熟红细胞和成熟红细胞单层以及网织红细胞可望根据其大小来检测。
因此本发明的一个目的是提供一种用于在静态抗凝全血样品中获得某些带核血细胞和血小板的血细胞分类计数的方法和装置。
本发明的另一个目的是提供一种具有所述特征的方法和装置，其能够对待检测的基本上未稀释的全血样品进行白细胞亚群分类计数、总白细胞亚群计数、网织红细胞计数、带核红细胞计数、血小板计数并检测异常带核循环细胞(诸如癌细胞)。
附图的简要说明
当结合附图考虑时，本发明的这些和其它目的和优点将从下列本发明的几个实施方案的具体描述中变得更为显而易见，其中：
附图1是包括样品接收室的血样分析装置的透视示意图，所述的室包括可变的通过面厚度区；
附图2是从室中最小通过面厚度区至室中任意其它通过面厚度区的室的厚度与距离之间关系图，实线是代表诸如附图1中所示线性室且虚线是代表非线性可变厚度室；
附图3是按照本发明制成的可变厚度室的一部分的平面示意图且图面意义说明了静态血样中各种大小的成形组分如何分离入室中的不同的厚度的区以便在室中的不同视野内是各自可见的；
附图4是表示可由样品扫描仪观测到的四个不同视野的室的一部分的平面示意图；
附图5是可用于鉴定、计数和分析室中放置的抗凝全血样品成形成分某种特征的扫描仪的示意图；
附图6是表示在一套特定分析条件下白细胞群群集情况的二维图；
附图7是表示在第二套分析条件下附图6的群体之一的亚群的二维图；且
附图8是表示在第三套分析条件下附图6群体之一的亚群的二维图。
本发明特定实施方案的具体描述
现在参照附图解释，附图1是通常由数字2指示的装置的图解说明，该装置2包括装样品的室14，该室具有可变的通过面厚度。所述的装置2包括下部承载壁4，对于解释的目的来说，它可以是例如一种显微镜栽玻片。该装置还可以包括直线围绕的垫片6和上部壁8，对于解释目的来说，所述的上部壁可以是例如一种显微镜栽玻片的盖玻片。壁4和8中至少一个是透明的以便可以通过透明壁4或8检验分布在两壁之间的样品。如果需要，那么壁4和8两者均可以是透明的。壁8具有依托于(或非常接近于)壁4的一边10且相对的边12置于垫片S的上表面。正如附图1中所观察到的，壁4和8之间的会聚关系的结果是形成具有可变通过面厚度的室14，所述的通过面厚度从壁8的边10增加到相对的边12。
附图2是表示室14的厚度如何可以在最薄边10至最厚边12之间改变的图解表示。实线PL表示由线性室构造导致的厚度-距离关系且虚线PNL表示由非线性室构造导致的厚度-距离关系。
附图3是包括室14的装置2的平面图以及存在于所检验血样中任何不同大小的成形组分在所述室14充满样品时以静止方式分布在室14中的方式的图解表示。数字10指示室14中厚度较小的区，而数字12指示室14中厚度较大的区。在附图3中所述装置2的表示中，所描绘的室14的部分中存在三个不同厚度的区A、B和C。A区是室14中厚度较小的区；B区是室14中中等厚度的区；而C区是室14中厚度最大的区。显然，仅将这种特定数量的不同厚度的区用来说明本发明优选的室14的主要特征、而不用来限定本发明，这是因为如上所述的室14可以包括实质上不定数量的不同厚度的区。还存在附图3中所示的三个不同视野1、3和5。将这些视野1、3和5描绘成圆圈形以便说明由一种光学仪器诸如显微镜所观察到的视野。在附图3中所描绘的说明中，血样已经充满室14且已经静止了至少几秒钟。在室14最薄的A区中发现了扁平的红细胞，其呈单独形式存在32或以单层形式31存在。在A区中还发现了几个血小板30。在室14的A区中可以进行网织红细胞和不带核红细胞计数，正如下文所述。
在B区中的下部中，有足够的空间供红细胞形成红细胞钱串物或其它聚集体33，它们由因形成红细胞钱串物而不含红细胞的血浆胞隙围绕。在视野3中有足够的室体积以便进行白细胞34以及带核红细胞的计数和分类。由此可以在该区中检测白细胞34的表面受体位点；可以对白细胞34进行分类；可以对白细胞34进行容量测定；可以对其进行形态研究；且有关白细胞34的另外的一些信息可以来源于B区上部中的血样。当室的厚度增加到C区中所示的厚度时，红细胞聚集体33形成汇合层，且尽管可以将该区用于极少的白细胞计数，但是探测白细胞的能力降低了。
附图4是室14的一段的平面图，其中数字12指示室14较厚的端且数字10指示室14较薄的端。具有在最薄部分10处约0微米至在最厚部分12处约200微米之间变化的可变厚度的室14允许每单位体积样品有100倍动态范围的血样颗粒状物计数。有4个附图4中所示的图解视野7’、7、9和11。在视野7、9和11的每一个中描绘了成形组分32，而在视野7’中没有显示出任何成形组分。在视野7’、7和9中还描绘了胞隙35，而在视野11中没有。
附图5是通常由数字54指示的自动比色显微仪器组件的图解描绘，且可以将它用于扫描装置2中所包含的血样并且它可以对来自血样中不同白细胞类型、网织红细胞和带核红细胞的颜色发射波长进行比色分析而没有明显的人为干扰，由此对这些细胞类型彼此进行鉴定和区分。将仪器组件54设计成可生成并储存或输送经扫描血样中的不同白细胞类型、网织红细胞和带核红细胞的影象。所述的仪器组件54包括包含可接合样品收集器2的夹子58并能够在扫描样品收集器2中的内含物时使样品收集器2沿X和Y方向横向运动的工作台56。
可以将可逆电动机59用于选择性地以相反方向旋转驱动螺杆60以便样品收集器2沿X和Y方向横向运动。在这种方式中，可以扫描样品收集器2中的全部内含物。所公开的自动实施方式的仪器组件54包括CCD照相机62、光束分离器64和可以沿Z方向选择性运动以便聚焦在样品收集器组件2中的含样品的部分上的透镜组66。CCD照相机62可通过安装在选择性旋转滤器轮74上的多个不同发射光波滤器68、70和72来查看并记录样品的影象。所述的仪器组件54还包括通过光束分离器64和聚焦透镜组66将激发光束射向样品收集器2的高强度激发光源75(诸如卤素光源)。可将一系列激发光波长滤器76、78和80安装在选择性旋转滤器轮82上。通过光束分离器64使激发光束发生折射到聚焦透镜66且该光束被透镜66聚焦在样品收集器2上。因此，两个滤器轮74和82使得可以控制并改变激发光源以及发射光源的波长。预编程的微处理机控制器84可有效地选择性控制样品收集器2的运动、滤器轮74和82的转动和CCD照相机62的操作。控制器84由此能够使仪器组件12全自动操作而无需明显的人为干扰。
如上所述，在进行包括在室14中得到白细胞、网织红细胞和带核红细胞的分类计数的样品检验过程中，当扫描仪对室14寻找室14中的有用区时，可以观察到附图4中所示的视野诸如7’、7、9和11。
当扫描仪已经观测到具有显著临床意义数量的有用细胞时，它会完成白细胞分类的示差分析以及网织红细胞和带核红细胞的分析。什么构成了统计学意义数量的计数组分的确定将取决于预定的临床上对计数程序误差接受的限度。可以理解这种数量将随所计数的是何种组分的不同而改变。
白细胞、带核红细胞和含有核物质的核糖体剩余物的网织红细胞可以通过由485nm范围内的光激发时细胞在530nm处、585nm处和660nm处的特征荧光并通过当560nm光激发时细胞在610nm处的荧光来鉴定，所述的细胞存在于样品中并是用着色剂诸如碱性橙21超活体染色。仪器54可以在所述室内将静态白细胞分离成由淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞组成的可区分的组。可以使用具有类似波长的其它染料诸如吖啶橙来进行类似的分析。
分类或区分不同血细胞的优选方法如下所述。用485nm的激发波长照射含有白细胞且还可以含有大的带核红细胞的多个视野并确定白细胞和任意带核的红细胞的位置。定位的算法依赖于这样一个事实，即白细胞和某些大的带核红细胞在发出荧光的任何视野中是唯一的大目标。确定所需数量白细胞的位置并记录5个发射值，其中L1、L2和L3是分别来自530nm、580nm和660nm处各细胞的总发射值，且其中通过加合来自细胞影象的象素强度来确定总发射值；AL1是在485nm处激发时各细胞在530nm处的平均象素强度；AL5是用560nm的光激发细胞时在610nm处测定的各细胞的平均象素强度；且A580是当在488nm处激发时由580nm处的发射值确定的细胞的面积。因此，用于区分细胞类型的数据包括光测数据(L1、L2、L3)以及形态测量数据(AL1、AL5、A580)。
附图6表示由仪器54成象的作为二维空间显示的细胞，其中Y轴是L1／L2之比且X轴是L2／L3之比。使用群分析法，将细胞分类成三种群体，其中群体40代表嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，群体41代表单核细胞和淋巴细胞且群体42代表嗜碱性粒细胞。这些是仅以光测数据为基础的细胞分离类型。为了得到更为确定的分离，附加形态测量数据将进一步细分所述群体以便进行更多细胞类型的鉴定。
附图7表示正在进行进一步二维群体分析的群体40，其中X轴是AL1／AL5之比且Y轴是L1／L3之比。目前这种群体分析将原始群体40分成两个代表嗜酸性粒细胞43和嗜中性粒细胞44的独立群体。
如果对群体41进行如附图8中所示的另外的群体分析，其中X轴是A580且Y轴是L1／L3之比，那么可以将群体41分离成其两个成分即单核细胞46和淋巴细胞45。因此，上述步骤能够将白细胞群体细分成至少5个亚群。通常将所鉴定并计数的不同类型的白细胞记录为该过程中扫描的白细胞总数的百分比。
通过测定在485nm处激发时来自各红细胞的585nm和660nm荧光的总强度来确定红细胞群体中网织红细胞的存在，且将具有的总荧光高于正常红细胞的那些细胞确定为网织红细胞。类似地，将在530nm处显示出强荧光的那些红细胞看作是带核红细胞。
上述实施例已经使用了表示细胞一般特性的超活体染色，但是也能够使用可以用荧光染料标记或用着色或荧光颗粒状物标记的特异性表位结合剂诸如抗体。它们可以用于基于表面抗原或其它结合基进一步分离带核细胞的亚群。这些实例是将CD4和CD8淋巴细胞与一般淋巴细胞群体区分开来的标记物。本发明的方法不会受到视野内所扫描血样中存在的红细胞的不利影响且由此不需显著的样品制备过程，诸如各种细胞类型的稀释或重量分离过程。形态测量信息诸如大小、粒度、带核物质的含量、表面受体等可以通过本发明的技术来检测。
由于可以对本发明所公开的实施方案进行许多修改和变化而不会脱离本发明的基本原则，因此除作为所附权利要求书的要求外，均不用来限定本发明。

Claims (25)

1．一种用于在取样室(14)中包含的抗凝全血样品中进行白细胞分类计数的方法，所述方法的特征在于：
a)在所述取样室中装入至少一种荧光着色剂和抗凝全血的混合物的步骤，所述的着色剂可有效地以区分方式使全血中的不同白细胞类型(34)变得突出；
b)使所述混合物充份分散至所述室中以便形成与样品光学工作视野内一个或多个单个的白细胞静态群相关的红细胞聚集体(33)的步骤；
c)在会产生由所述着色剂以区分方式突出的不同白细胞类型的合适光照条件下在所述室中对所分散的混合物进行多视野X-Y-Z光学扫描的步骤；
d)以光测和／或形态测量方式将不同白细胞亚群分离成不同群体(40、41、42、43、44、45、46)以便区分所述扫描步骤中检测的白细胞亚群的步骤；
e)在各亚群群体中对白细胞进行计数和分类的步骤；和
f)获得在由所述分离步骤中产生的各群体中的白细胞各不同亚群的分类计数的步骤。
2．权利要求1的方法，其中所述的室中配有可变通过面，或Z轴，厚度，该厚度可在进行所述扫描步骤的所述室的区域内从最小约为0至约10微米到最大约为20微米至约为50微米的范围变化。
3．权利要求1的方法，其中将所述的白细胞分离成不同的静态群体，该群体包括淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
4．一种用于在具有可变通过面厚度的取样室(14)中所包含的抗凝全血样品中进行带核血细胞分类计数的方法，所述的方法的特征在于：
a)在所述取样室中装入至少一种荧光着色剂和抗凝全血的混合物的步骤，所述的着色剂可有效地以区分方式使全血中的不同带核血细胞类型(34)变得突出；
b)在会产生由所述着色剂以区分方式突出不同带核细胞类型的合适光照条件下在所述室中对所分散的混合物进行多视野X-Y-Z光学扫描的步骤；
c)以光测和／或形态测量方式将至少一种带核血细胞亚群分离成不同群体(40、41、42、43、44、45、46)以便将带核血细胞亚群与在所述扫描步骤中检测的其它带核细胞区分开来的步骤；
d)对所述带核血细胞亚群群体中的带核血细胞进行计数和分类的步骤；和
e)在由所述分离步骤中产生的所述群体中产生带核血细胞各亚群的细胞计数的步骤。
5．一种用于在与一种或多种可有效地以区分方式使血样中网织红细胞内带核物质的剩余物变得突出的荧光着色剂混合的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中进行网织红细胞计数的方法，所述的血样和着色剂包含在具有可变厚度区的观测室(14)内，所述的方法的特征在于：
a)用具有视野的光学仪器(54)扫描血样的步骤；
b)在所述静态血样中确定视野(7’、7、9、11)位置的步骤，该视野含有单个红细胞或红细胞单层；
c)用所选择波长的光照射静态血样中的所述确定的视野以便以区分方式使所述确定的视野内红细胞中带核物质的任何剩余物变得突出的步骤；和
d)在所述视野中对任何以区分方式突出的红细胞进行计数的步骤。
6．一种用于在与一种或多种可有效地以区分方式使血样内白细胞(34)中带核物质变得突出的荧光着色剂混合的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中进行白细胞分类计数的方法，所述的血样和着色剂包含在具有可变厚度区的观测室(14)内，所述的方法的特征在于：
a)用具有视野(7’、7、9、11)的光学仪器(54)扫描血样的步骤；
b)在所述静态血样中确定并扫描视野的步骤，该视野中包含单个白细胞和红细胞聚集体(33)；
c)用所选择波长的光照射静态血样中的所述视野以便以区分方式使所述确定的视野内白细胞中任何带核物质变得突出的步骤；和
d)在所述确定并扫描的视野中对所有以区分方式突出的白细胞进行分类和计数以便获得白细胞分类计数的步骤，所述的分类步骤基于发源自所述以区分方式突出的白细胞的光发射差异。
7．权利要求6的方法，其中所述的着色剂可有效地根据发源自各种类型白细胞的不同信号特征来彼此区分白细胞类型，由此白细胞分类计数可以产生于所述的血样。
8．权利要求6的方法，其中所述的分类步骤包括使用获自所述光发射差异的光测和形态测量的细胞信息。
9．一种用于在与一种或多种可有效地以区分方式使血样内白细胞(34)中胞内染料结合的物质变得突出的荧光着色剂混合的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中进行白细胞分类计数的方法，所述的血样和着色剂包含在具有可变通过面厚度区的观测室(14)内，所述的方法的特征在于：
a)在所述静态血样中确定有用的视野(9)的步骤，其包含至少一种预定量的分离自红细胞聚集体(33)的单个白细胞；
b)用至少一种预定波长的光照射所述有用的视野的步骤，所述波长的光以区分方式使白细胞中所包含的胞内结合染料的物质变得突出并使所照射的白细胞发射光；
c)以两种或多种不同波长测定所述照射的白细胞的发射光的步骤；和
d)以一种区分白细胞彼此类型的方式分析所述不同波长的发射光的步骤。
11．权利要求10的方法，其中通过使用来源于所述发射光的光测信息和／或形态测量信息进行所述的区分步骤，且进一步包括对这类所区分的白细胞类型进行计数的步骤。
12．一种用于鉴定至少一种含有带核物质或含有带核物质胞内剩余物的靶细胞亚群的方法，所述的靶细胞包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含单个分离细胞的(A)区的观测室(14)内的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中，所述的区具有约0微米至约40微米范围的通过面厚度，所述的方法的特征在于：
a)在所述区内对所选择的视野(1、3)进行光学扫描的步骤，该视野包含有单个红细胞(32)和／或红细胞单层(31)和／或红细胞聚集体(33)；
b)用一种或多种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂产生多个已知波长的带核物质或剩余带核物质荧光发射，该发射是各细胞亚群的特征；和
c)在所述的多个已知波长处分析所述的发射以便鉴定视野中细胞亚群的步骤。
13．权利要求12的方法，其中所述的观测室包括附加的C区，该区具有大于约40微米的通过面厚度。
14．权利要求12的方法，其中所述的着色剂是超活体染色剂。
15．权利要求12的方法，其中所述的带核细胞亚群是白细胞(34)亚群。
16．权利要求12的方法，其中所述的带核细胞亚群是红细胞(32)亚群。
17．权利要求12的方法，其中所述的着色剂是针对带核细胞亚群上表位的结合颗粒的部分。
18．权利要求12的方法，其中所述的发射的特征在于可用于鉴定所研究的亚群的光测和／或形态测量特征。
19．一种用于鉴定至少一种包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含红细胞聚集体(33)和各自分离的带核细胞(34)的B区的观测室(14)内的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中的带核血细胞亚群的方法，所述的区具有不大于约50微米的通过面厚度，所述的方法的特征在于：
a)用一种光学扫描仪(54)在所述区内扫描所选择的视野的步骤；
b)用一种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂在多个已知波长处产生荧光发射，该发射是带核细胞亚群的特征；和
c)在所述的多个已知波长处分析所述的发射以便鉴定视野中任何带核细胞亚群的步骤。
20．一种鉴定包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含各自分离的带核细胞(34)的(B)区的观测室(14)内的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中的带核细胞亚群的方法，所述的区具有不大于约50微米的通过面厚度，所述的方法的特征在于：
a)用一种光学扫描仪(54)在所述区内扫描所选择的视野(3、5)的步骤；
b)用一种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂在多个已知波长处产生荧光发射，该发射是带核细胞亚群的特征；和
c)在所述的多个已知波长处分析所述的发射以便鉴定视野中带核细胞亚群的步骤。
21．一种鉴定包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含单个红细胞(32)和／或单层(31)红细胞和／或红细胞聚集体(33)的(A、B)区的观测室(14)内的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中的带核细胞(34)的靶亚群的方法，且所述的区具有不大于约50微米的通过面厚度，所述的方法包括：
a)用一种光学扫描仪(54)在所述区内扫描所选择的视野(1、3、5)的步骤；
b)用一种或多种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂在一个或多个已知波长处产生荧光发射，该发射是所述带核细胞的靶亚群的特征；和
c)在所述的已知波长处分析所述的发射以便鉴定并区分所述带核细胞的靶亚群的步骤。
22．权利要求21的方法，其中所述的观测室(14)基本上是楔形的且包括具有大于约40微米通过面厚度的附加(C)区。
23．一种鉴定包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含单个红细胞(32)和／或单层(31)红细胞的(A)区的观测室(14)内的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中的网织红细胞的方法，且所述的区具有不大于约20微米的通过面厚度，所述的方法的特征在于：
a)用一种光学扫描仪(54)在所述区内扫描所选择的视野(1、3)的步骤；
b)用一种或多种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂在一个或多个已知波长处产生荧光发射，该发射是包含在所述网织红细胞中带核物质的剩余物的特征；和
c)在所述的已知波长处分析所述的发射以便在样品中的所述所选择的视野内鉴定所述网织红细胞并将其与其它细胞区分开来的步骤。
24．一种用于在取样室(14)中包含的抗凝全血样品中进行带核血细胞分类计数的方法，所述方法的特征在于：
a)在所述取样室中装入至少一种荧光着色剂和抗凝全血的混合物的步骤，所述的着色剂可有效地以区分方式使全血中的不同带核血细胞类型(34)变得突出；
b)在会产生由所述着色剂以区分方式突出不同白细胞类型的合适光照条件下在所述室中对所分散的混合物进行多视野X-Y-Z光学扫描的步骤；
c)以光测和／或形态测量方式将至少一个带核血细胞亚群分离成不同群体(40、41、42、43、44、45、46)以便将该带核血细胞亚群与所说扫描步骤中检测的其它带核细胞区分开来的步骤；
d)在所述带核血细胞亚群群体中对带核血细胞进行计数和分类的步骤；和
e)在所述由所述分离步骤产生的所述群体中产生带核血细胞亚群的细胞计数的步骤。
25．一种用于在与一种或多种可有效地以区分方式使血样中网织红细胞内带核物质的剩余物变得突出的荧光着色剂混合的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中进行网织红细胞计数的方法，所述的血样和着色剂包含在观测室(14)内，所述的方法的特征在于：
a)用具有视野(7’、7、9、11)的光学仪器(54)扫描血样的步骤；
b)在所述静态血样中确定视野的步骤，该视野(1，3)包含单个红细胞(32)或单层(31)红细胞；
c)用所选择波长的光照射静态血样中的所述确定的视野以便以区分方式使所述确定的视野内红细胞中带核物质的任何剩余物变得突出的步骤；和
d)在所述视野中对任何以区分方式突出的红细胞进行计数的步骤。
26．一种鉴定包含在与荧光着色剂混合并分散在包括包含单个红细胞(32)和／或单层(31)红细胞和／或红细胞聚集体(33)的(A)区的观测室(14)中的基本上未稀释的静态抗凝全血样品中的细胞或其它成形体靶亚群的方法，所述的方法的特征在于：
a)用一种光学扫描仪(54)在所述区内扫描所选择的视野的步骤；
b)用一种或多种预选波长的光源照射所述所选择的视野的步骤，所述的预选波长的光源可有效地使所述荧光着色剂在一个或多个已知波长处产生荧光发射，这种发射可产生可有效地区分所述细胞和其它成形体的靶亚群的光测和形态测量信息；和
c)分析所述的发射以便以光测方式和形态测量方式鉴定并区分所述的细胞和成形体靶亚群的步骤。
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