CN101086473B - 试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定试样中的嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试剂，至少含通式(I)或(II)所示荧光色素的一种荧光色素。还涉及一种测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试剂盒及其方法。

Description

试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法

技术领域：

本发明涉及一种用于分析从生物体采集的试样中的血细胞的试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法。

背景技术：

在临床检查领域，试样中的血细胞成份分析对于诊断受检者循环器官等的各种疾病非常有用。根据疾病的不同，有时特定的血细胞数量会增加或减少、通常不存在的血细胞会出现在末梢血液中。

近年来，应用流式细胞技术的各种自动血细胞计数装置面市。人们用该装置在一般检查室进行血细胞的分类和计数。使用这些自动血细胞计数装置可以自动地对试样中的血细胞进行分类和计数。

要进行白细胞的分类和计数，首先要溶解血液试样中的红细胞。只要将所得试样导入检测器，检测出电阻信号即可将白细胞分成3类。或者可以用以下方法将白细胞分成淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞5类。首先溶解血样中的红细胞，用荧光色素对所得试样中的血细胞染色。然后向血细胞照射励起光，检测血细胞发出的荧光信号和散射光信号。分析这些信号即可将白细胞分成5类。

嗜碱性细胞通常比较少，因此也可以在一次测定中不将白细胞分为5类，而只测定嗜碱性细胞。根据嗜碱性细胞在酸性条件下比其他白细胞更难被破损的特性，可以对血样进行处理使其成为嗜碱性细胞测定专用，再对嗜碱性细胞进行测定(参照专利公开平成6—8817号公报)。将此结果与其他方法得到的白细胞分类结果组合起来，即能更正确地将白细胞分为5类。

在白细胞测定中常常成为问题的是有核红细胞的出现。由于存在有核红细胞，即使对红细胞进行溶解处理也会有核残留。残留的核在上述测定方法中会发出近似淋巴细胞的信号，从而使白细胞计数时产生加法误差。为排除此影响，比如可以进行有核红细胞测定专用处理，测定有核红细胞数(专利公开平成10—339729号公报)，再从用其他方法获得的白细胞数中减去有核红细胞数。用此方法可以得到正确的白细胞数。

但是，为了得到正确的白细胞分类而增加特定的血细胞专用处理，会很费事，装置也会复杂化或大型化。而且，多用特定的血细胞测定专用试剂，会增加血液检查成本。出于这种观点，最好尽可能减少特定的血细胞专用处理。

嗜碱性细胞和有核红细胞都可以通过在酸性条件下处理血样来测定，因此，如果在酸性条件下处理血样，则有可能嗜碱性细胞和有核红细胞二者一次即能测定。比如，专利2002-148261号公报上记载有嗜碱性细胞和红芽球(有核红细胞)测定方法，即将含有能使白细胞和异常细胞易于染色的红细胞溶解剂和表面活性剂的水溶液与试样混合，加入含荧光色素的染色剂进行染色，用流式细胞仪测定荧光强度和散射光强度等。

然而，用上述这种老方法在白细胞数量多的标本中，有时会出现嗜碱性细胞和嗜碱性细胞以外的白细胞不易分离的问题。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明的第一部分为测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂，该试剂的pH值为2.0～4.5，含阳离子型表面活性剂以及选自以下通式所示荧光色素的至少一种荧光色素，

通式(I)的荧光色素：

【化1】

(式中，R¹和R²为相同或不同的烷基；

【化2】

但是当

【化3】

为

时

则【化4】

为

当【化5】

为

时

则【化6】

为或

R³、R⁴、R⁵和R⁶相同或不同，为氢原子或烷基；

X^-为阴离子)

通式(II)的荧光色素：

【化7】

(式中，R⁷和R⁸为相同或不同、也可含酸基的烷基；

【化8】

为

【化9】

为

R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²为相同或不同的氢原子或酸性基，但是R⁷～R¹²中的某一个含酸性基；

可能存在于R⁷～R¹²的酸性基也可形成盐，但是R⁷～R¹²可能存在的酸性基中总有一个是放出了质子的游离基。)

本发明第二部分涉及测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试剂盒，它包含：含有溶解红细胞并给白细胞细胞膜以荧光色素能透射的破损的阳离子型表面活性剂、且pH值为2.0～4.5的溶液和含有选自上述通式(I)和通式(II)荧光色素中至少一种荧光色素的溶液。

本发明第三部分涉及一种试样分析方法，其包括，用上述试剂和试样分析用试剂盒对试样中的血细胞染色的步骤；激光照射上述经染色的血细胞、获取散射光信息和荧光信息的步骤；以及根据上述散射光信息和荧光信息区分和/或计数上述试样中嗜碱性细胞和/或有核红细胞的步骤。

附图说明：

图1为用本发明试样分析用试剂分析试样时使用的散点图的模式图。

图2为用本发明试样分析用试剂分析试样时使用的散点图(实施例1)。

图3为用本发明试样分析用试剂分析试样时使用的散点图(实施例1)。

图4为用本发明试样分析用试剂分析试样时使用的散点图(实施例2)。

具体实施方式：

下面参照附图，详细说明本发明的优选实施例：

本发明可以测定的嗜碱性细胞是被碱性色素染色的含大型酸性颗粒的白细胞的一种。有核红细胞也俗称为红芽球，含前红芽球、嗜碱性红芽球、多染性红芽球和正染性红芽球。

在本说明书中，所谓“试样”指，采自哺乳动物优选人的血液、骨髓液、尿液和用单采血液成份技术采集的试样等体液试样。

本发明试剂所含荧光色素为上述通式(I)和/或(II)所示物质。

本说明书中，通式(I)和(II)中的“烷基”可以是直链或分链。烷基的碳原子数一般为1～20，最好为1～10，但从荧光色素的水溶性考虑，碳原子数1～6更好。作为理想的该烷基可以举例如：甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和已基等。

作为通式(I)中的阴离子X^-，有诸如F^-、Cl^-、Br^-及I^-等卤负离子、CF₃SO₃ ^-、BF₄ ^-、ClO₄ ^-等。

在本说明书中，通式(II)可能存在的“酸性基”包括能释放质子的基和能释放质子的基释放了质子的游离酸基两种基。能释放质子的基有羧基、磺酸基和磷酸基，其中以羧基或磺酸基为佳。

上述酸性基也可形成盐。这种盐包括：钠盐、钾盐等碱性金属盐和铵盐、三乙铵盐等烷基铵盐等。其中比较理想的盐是碱性金属盐或烷基铵盐，更好的是钠盐或三乙铵盐。

上述通式(I)、(II)的荧光色素可以使用一种或二种以上。

上述荧光色素比如可以购买株式会社林原生物化学研究所的产品。

本发明的试剂中的色素浓度可以根据色素种类适当选择，一般为0.01～100mg/L、比较适宜的为0.1～10mg/L、更理想的是0.3～6.0mg/L。

本发明的试样分析用试剂所含上述通式(I)和通式(II)的荧光色素对嗜酸性细胞和中性细胞的亲和性比对嗜碱性细胞的亲和性更强，因此，对嗜酸性细胞和中性细胞的染色比嗜碱性细胞强。根据经这些荧光色素染色的细胞发出的荧光差异，可以明确区分粒细胞中的嗜碱性细胞。嗜碱性细胞也可根据细胞的大小和细胞内小器官的构造等不同明确与淋巴细胞和单核细胞区分开。

用本发明的试样分析用试剂对血细胞染色时，最好使妨碍有核红细胞和白细胞(淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞)测定的红细胞溶血，破损有核红细胞和白细胞的细胞膜。通过这种破损处理，荧光色素对有核红细胞和白细胞的透射性更高，可以更有效地对血细胞染色。

一般来说，以大约150mOsm/kg以下的渗透压即可使红细胞的细胞膜产生微孔。红细胞内部的血红蛋白通过该微孔溶出，则红细胞在光学上变为透明(溶血)。在光学上透明的红细胞实际上不会成为使用流式细胞技术进行测定的障碍。红细胞的溶血比较适用低渗透压条件和低pH条件。这两个条件都满足的渗透压是20mOsm/kg～150mOsm/kg。

本发明的试剂的pH值以2.0～4.5为宜，2.0～3.5更好。pH值只要在此范围内，嗜碱性细胞的颗粒就会稳定，而且，能够在不对白细胞和有核红细胞等产生过度影响的情况下，高效地使红细胞溶血。以此pH值处理试样，无核的红细胞的散射光和荧光极其微弱，实际上不会给有核红细胞和白细胞的测定造成负面影响。

上述试剂的pH值也可用缓冲剂调整。比较适宜的缓冲剂为在所期望的pH值±2.0附近有pKa的缓冲剂。比如可以使用柠檬酸、苹果酸、二甘醇酸、丙二酸和马来酸等作为缓冲剂。

本发明的试剂中的上述缓冲剂浓度只要能保持pH值在上述范围内即可，无特别限定。

为了使本发明的试剂渗透压在适于红细胞溶血的范围内，可以使用NaCl、KCl等电解质和糖类等。也可根据上述缓冲剂浓度调整渗透压。

本发明的试剂应含有使红细胞溶血并给白细胞细胞膜以荧光色素能透射的破损的表面活性剂。该表面活性剂最好使用阳离子型表面活性剂。其中以第四级铵盐或吡啶鎓盐为宜。上述第四级铵盐比如最好使用下式表示的第四级铵盐：

【化10】

(式中，R⁷、R⁸和R⁹相同或不同，为氢原子、C_1-8烷基或C_6-8芳烷基；R¹⁰为C_8-18烷基、C_8-18链烯基或C_6-18芳烷基；X^-为阴离子。)

作为上述吡啶鎓盐，比如可以使用以下式子表示的吡啶鎓盐：

【化11】

(式中，R¹¹为C_8-18烷基；X^-为阴离子)

这种表面活性剂已经公开，比如可以使用专利公告2002—148261号上公开的东西。

作为上述表面活性剂可以举出以下具体例子：十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、辛基三甲基氯化铵、月桂三甲基溴化铵、月桂三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵或氯化月桂吡啶鎓等。

本发明的试剂中的上述表面活性剂浓度以10～10000mg/l为宜，100～5000mg/l更好，浓度只要在此范围内，即可在不过度影响白细胞和有核红细胞的情况下高效地使红细胞溶血。

本发明的试剂最好分子内至少含有一个至少有一个芳香环的有机酸(以下称“芳香有机酸”)或其盐。使用芳香有机酸可以更有效地在短时间内使红细胞溶血。比较理想的芳香有机酸是水杨酸或酞酸。

至于本发明的试样分析用试剂中的上述芳香有机酸或其盐的浓度，没有特别限定，只要本发明的试剂达到上述范围的浓度即可，但以0.1～100mM，1～50mM更好。

将上述荧光色素加入适当的溶媒中，并根据希望在该溶媒中加入上述表面活性剂和芳香有机酸或其盐，加到上述浓度，再根据需要用NaOH和HCl等调整pH值即可得到本发明的试剂。另外，将分别溶解于适当溶媒的荧光色素溶液、根据希望添加的表面活性剂溶液和芳香有机酸或其盐的溶液混合，使上述各成份最终浓度达到上述范围，再根据需要用NaOH、HCl等调整pH值也可得到本发明的试剂。上述适当溶媒无特别限定，只要能溶解上述成份即可，例如有水、酒精、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)以及这些混合液等。

本发明的试剂最好以试剂：试样的容量比为5～1000：1、最好10～500：1与试样混合。以这种比例混合试剂和试样可以加快红细胞的溶解，更好地对血细胞成份染色。试样的量只要有数μ1～100μl即能较好地进行测定。

含有含上述表面活性剂的第一试剂和含荧光色素的第二试剂的试剂盒也是本发明之一。第一试剂和第二试剂是分别含有表面活性剂的溶液和含荧光色素的溶液。用于这些溶液的溶媒无特别限定，只要能够溶解表面活性剂或荧光色素即可。比如可以用水、酒精、有机溶媒(乙二醇、二甲基亚砜(DMSO))及其混合液等。当使用在水溶液中长期保存稳定性低的荧光色素时，最好将其溶解在上述有机溶媒中。

第一试剂也可以包含上述芳香族有机酸或其盐。

或者本发明的试剂盒还可以包含不同于第一试剂和第二试剂另含芳香族有机酸或其盐的第三试剂。

本发明的试样分析方法包括以下步骤：用上述荧光色素对试样中的血细胞染色；用光束照射经染色的血细胞，获取散射光信息和荧光信息；根据获取的散射光信息和荧光信息将试样中的嗜碱性细胞与其他白细胞成份区分并计数。在该染色步骤中，最好先使红细胞溶血，破损被溶血的红细胞以外的其他细胞的细胞膜，使荧光色素能透射，再对受损的血细胞进行染色。

在该染色步骤中，将荧光色素与试样混合。最好在此步骤将荧光色素和上述表面活性剂和试样混合。此表面活性剂会破损血细胞细胞膜使荧光色素能透射，因此，通过混合表面活性剂和试样可以有效地用荧光色素对待测血细胞染色。

在该染色步骤中，如果使用表面活性剂，对表面活性剂、荧光色素和试样的混合顺序无特别限定。可以先混合表面活性剂和荧光色素，再将其混合液与试样混合，也可以先混合表面活性剂和试样，再将其混合液与荧光色素混合。无论用哪个顺序混合都能得到同样的测定结果。

在上述染色步骤中，也可以将本发明的试剂与试样混合，也可以将本发明的试剂盒的各组成部分与试样混合。

在上述染色步骤中，混合荧光色素和试样后，应使其在15～50℃、最好20～40℃的温度中反应5～120秒、最好5～30秒。

在上述染色步骤中染色的血细胞可以用流式细胞仪进行分析。下面就用流式细胞仪分析血细胞的过程作一说明。当染色的血细胞通过流式细胞仪的流动池时，通过用光束照射血细胞，即可得到散射光信息和荧光信息。作为散射光信息，是市面上出售的流式细胞仪能够测定的散射光即可，无特别限定。比如前向散射光(如受光角度0～20度附近)、侧向散射光(受光角度90度附近)等的散射光光幅、强度等都可作为散射光信息使用。众所周知，侧向散射光反映细胞核和颗粒等内部信息，前向散射光反映细胞大小等信息。在本发明的方法中，最好使用前向散射光强度作为散射光信息。

所谓荧光信息，指以适当波长的光照射待测试样，测定励起的荧光所得到的信息。根据所用荧光色素不同，可以选择适当的受光波长。荧光从被上述荧光色素染色的细胞内的核和颗粒产生。

所用流式细胞仪的光源无特别限定，可以选择适于荧光色素励起的波长的光源。比如可使用红色半导体激光器、兰色半导体激光器、氩激光器、He-Ne激光器等。特别是半导体激光器比气体激光器便宜很多，比较合适。

根据上述测定的散射光和荧光，可以从其他成份中区分有核红细胞和嗜碱性细胞并计数。此步骤最好包括(1)比如以荧光信息和前向散射光信息为二轴绘制散点图；(2)用适当分析软件分析所得散点图。当以荧光强度为X轴、以前向散射光强度为Y轴绘制散点图时，如图1所示，各细胞成群(聚类)分布。有核红细胞比粒细胞(中性细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞)个头小。因此，在这种散点图中，有核红细胞出现在比粒细胞前向散射光强度小、比白细胞荧光强度小的区域，因此而能明确区分白细胞和有核红细胞。嗜碱性细胞出现在荧光强度比嗜酸性细胞和中性细胞小的区域，因此能够明确将嗜碱性细胞与其他粒细胞明确区分开。至于散点图上的各群对应于哪个血细胞，要待用本发明处理了只含各血细胞的试样后，通过测定、确认出现位置才能确定。

通过用适当分析软件分析散点图上的细胞群，能够计算出有核红细胞和嗜碱性细胞的数量和比例。具体而言，在散点图中，当确认细胞群出现在被认为某一特定细胞出现的位置上时，首先划定此细胞群的中心。可以将从此中心到其他细胞群出现区域之间直至特定细胞群的细胞出现的部分止设为此细胞群的界限。出现在所设区域内的细胞即可作为特定细胞计数。通过对嗜碱性细胞以外的白细胞计数，可以算出嗜碱性细胞对全白细胞的比率(嗜碱性细胞/全白细胞：以下称“嗜碱性细胞比率”)和有核红细胞对全白细胞的比率(有核红细胞/全白细胞：以下称“有核红细胞比率”)。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率表示，单位记为“个/100WBC”。

使用本发明的试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及其试样分析方法，可以明确将有核红细胞形成的细胞群、嗜碱性细胞形成的细胞群分别从其他血细胞形成的细胞群区分开。因此可以更正确地对白细胞进行分类和/或计数。

下面用实施例更详细地说明本发明。对于本发明可以进行各种变更和修饰，本发明的范围不受以下实施例所限。

[实施例]

以下实施例中使用的荧光色素如下：

NK—1840

[化12]

NK—2929

[化13]

NK-3375

[化14]

NK-3662

[化15]

NK-5056

[化16]

NK-9001

[化17]

NK-9002

[化18]

NK-9003

[化19]

NK-4249

[化20]

NK-3606

[化21]

NK-3620

[化22]

比较例1

试样使用的是分别从2名受检者采集的血液。用XE—2100自动血细胞计数仪(希森美康公司制：配备红色半导体激光器(633nm))测定血样2标本中所含嗜碱性细胞，算出嗜碱性细胞比率。试剂使用的是STROMATOLYSER-FBII(希森美康公司制)。

测定结果，确认这些试样嗜碱性细胞的含量很高(以下将此试样称为Baso试样1和Baso试样2)。Baso试样1的嗜碱性细胞比率为2.3％，Baso试样2的嗜碱性细胞比率为1.7％，将这些结果与实施例1作比较。

接下来，以从不同于上述受检者的其他2名受检者采集的血液作为试样使用。用XE-2100自动血细胞计数仪测定血样2标本中所含有核红细胞，计算出有核红细胞比率。试剂使用的是STROMATOLYSER-NR(希森美康公司制)。

测定结果，确认这些试样有有核红细胞出现(以下将此试样称为NRBC试样1和NRBC试样2)。NRBC试样1的有核红细胞比率为3.0个/100WBC，NRBC试样2的有核红细胞比率为5.9个/100WBC。将此结果与实施例1比较。

实施例1

将含有水杨酸10mM(pH：3.0)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)3000ppm的水溶液1mL放入35℃恒温槽。在此，将图2和图3显示的各种色素(NK—1840 2ppm、NK—2929 6ppm、NK—3375 6ppm、NK—3662 6ppm、NK—5056 6ppm、NK—3620 6ppm、NK—9001 2ppm、NK—9002 2ppm、NK—9003 2ppm、NK—4249 2ppm及NK—3606 2ppm)分别加到上述浓度溶解，得到试样分析用试剂。

所得试剂1mL与血样(Baso试样1或2或者NRBC试样1或2)20μl充分混合，在35℃反应20秒后，试样从恒温槽取出，送至有633nm励起光源的流式细胞仪检测部分。试样中的细胞受励起光照射发出散射光和荧光，检测细胞发出的散射光信号和荧光信号。分析所得信号，测定试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和全白细胞。此测定使用XE-2100自动血细胞计数仪进行。

另外，在Baso试样1中分别添加含NK1840的试剂、含NK2929的试剂、含NK3375的试剂、含NK3662的试剂、含NK5056的试剂和含NK3620的试剂进行测定。

在Baso试样2中分别添加含NK9001的试剂、含NK9002的试剂、含NK9003的试剂、含NK4249的试剂及含NK3606的试剂进行测定。

在NRBC试样1中分别添加含NK1840的试剂、含NK2929的试剂、含NK3375的试剂、含NK3662的试剂、含NK5056的试剂和含NK3620的试剂进行测定。

在NRBC试样2中分别添加含NK9001的试剂、含NK9002的试剂、含NK9003的试剂、含NK4249的试剂及含NK3606的试剂进行测定。

再就各个试样绘制以荧光强度和前向散射光强度为二轴的散点图。此散点图如图2和图3所示。根据这些散点图，对全白细胞、嗜碱性细胞和有核红细胞进行计数，算出嗜碱性细胞比率和有核红细胞比率。将根据比较例1和本实施例算出的Baso试样中的嗜碱性细胞比率显示为表1，将NRBC试样中的有核红细胞比率显示为表2。

【表1】

【表2】

从图2和3可以看出，使用本发明的试样分析用试剂，嗜碱性细胞被从嗜碱性细胞以外的白细胞成份明确区分开，有核红细胞也被明确区分开。如此，如图2和3所示，在散点图上出现在一定区域内的细胞作为嗜碱性细胞和有核红细胞划定出来，并求出这些细胞的个数和对全白细胞的比率。

从表1和2可以看出，实施例1算出的比率和比较例1算出的比率值很近似，因此可以确认，使用本发明的试样分析用试剂能够以与分别使用不同试剂测定有核红细胞和嗜碱性细胞时同样的精度测定有核红细胞和嗜碱性细胞。

比较例2

除使用嗜碱性细胞含量高且有有核红细胞出现的试样(以下称BN试样)取代在比较例1中使用的试样外，其他同比较例1，测定试样中的嗜碱性细胞，算出嗜碱性细胞比率。嗜碱性细胞比率为2.1％。与嗜碱性细胞测定分开，使用BN试样测定有核红细胞，算出有核红细胞比率。有核红细胞比率为3.6个/100WBC。将这些结果与实施例2比较。测定嗜碱性细胞使用的试剂是STROMATOLYSER-FBII(希森美康公司制)，使用的仪器是XE-2100自动血细胞计数仪(希森美康公司制)。测定有核红细胞使用的试剂是STROMATOLYSER-NR(希森美康公司制)，使用的仪器是XE-2100自动血细胞计数仪(希森美康公司制)。

实施例2

除使用BN试样取代实施例1使用的试样、作为色素使用含有NK-2929、NK-3375、NK-3662和NK-5056的试剂外，其他同实施例1，对嗜碱性细胞和有核红细胞进行测定，算出嗜碱性细胞比率和有核红细胞比率。试样分析用试剂中的色素浓度调整到6ppm。这些比率如表3所示。在本实施例中绘制的以前向散射光强度和荧光强度为二轴的散点图如图4所示。

[表3]

从图4的结果可以确认，使用本发明的试样分析用试剂一次测定即可明确将试样中的嗜碱性细胞与其他成份区分开，将有核红细胞与其他成份明确分开。从表3可以看出，实施例2算出的比率与比较例2算出的比率值很近似。因此，使用本发明的试剂能够以与分别用不同试剂测定嗜碱性细胞和有核红细胞时同样的精度测定嗜碱性细胞和有核红细胞。

Claims (8)

1.一种测定试样中的嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试剂，该试剂的pH值为2.0～4.5，含有阳离子型表面活性剂以及选自以下通式所示荧光色素的至少一种荧光色素：

通式(I)：

式中，R¹和R²为相同或不同的烷基；

但是当

则

当

则

R³、R⁴、R⁵和R⁶为相同或不同的氢原子或烷基；

X^-为阴离子；

和通式(II)：

式中，R⁷和R⁸为相同或不同、也可含酸基的烷基；

R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²为相同或不同的氢原子或酸性基，但是R⁷～R¹²中的某一个含酸性基；

可能存在于R⁷～R¹²的酸性基也可形成盐，但是R⁷～R¹²可能存在的酸性基中总有一个是放出了质子的游离基。

2.权利要求1所述试剂，其特征在于：通式(II)R⁷～R¹²可能存在的酸性基至少是由羧基和磺酸基构成的群体中的1种酸性基。

3.权利要求1所述试剂，其特征在于：上述通式(II)R⁷～R¹²可能存在的酸性基至少是由碱性金属盐的基和烷基铵盐的基组成的群体中的1种酸性基。

4.权利要求1所述试剂，其特征在于：所述阳离子型表面活性剂为选自第四级铵盐和吡啶鎓盐型构成的群体中的至少一种表面活性剂。

5.权利要求1所述试剂，还含有芳香族有机酸。

6.权利要求5所述试剂，其特征在于：所述芳香族有机酸是选自水杨酸、酞酸及其盐构成的群体中至少一种芳香族有机酸。

7.一种试样分析用试剂盒，用于测定选自由嗜碱性细胞和有核红细胞构成的细胞群的细胞，其包含：含有溶解红细胞并给白细胞细胞膜以荧光色素能透射的破损的阳离子型表面活性剂、且pH值为2.0～4.5的溶液和含有选自下述通式(I)和通式(II)荧光色素中至少一种荧光色素的溶液，

通式(I)：

式中，R¹和R²为相同或不同的烷基；

但是当

则

当

则

R³、R⁴、R⁵和R⁶为相同或不同的氢原子或烷基；

X^-为阴离子；

和通式(II)：

式中，R⁷和R⁸为相同或不同、也可含酸基的烷基；

R⁹、R¹⁰、R¹¹及R¹²为相同或不同的氢原子或酸性基，

但是R⁷～R¹²中的某一个含酸性基；

可能存在于R⁷～R¹²的酸性基也可形成盐，但是R⁷～R¹²可能存在的酸性基中总有一个是放出了质子的游离基。

8.一种对可能含有选自嗜碱性细胞和有核红细胞组成的细胞群的血细胞的试样进行分析的方法，该试样分析方法包括以下步骤：

用权利要求1的试剂和权利要求7的试样分析用试剂盒对试样中的血细胞染色的步骤；

激光照射上述经染色的血细胞的步骤；

检测各个血细胞发出的散射光和荧光的步骤；以及

根据上述散射光和荧光的强度，对上述试样中选自由嗜碱性细胞和有核红细胞构成的细胞群的血细胞进行计数的步骤。

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