JP6738652B2 - 試料分析方法、試料分析装置および試薬 - Google Patents

試料分析方法、試料分析装置および試薬 Download PDF

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Description

本発明は、試料分析方法、試料分析装置および試薬に関する。
好中球細胞外トラップは、血液または組織中の病原体の排除のために、好中球から放出される網状の構造体である。好中球細胞外トラップは、顆粒タンパク質およびクロマチン繊維を含む。好中球細胞外トラップを検出する方法として、非特許文献１には、フローサイトメトリーを用いる方法が記載されている。
ワリード（Ｗａｌｉｄ Ｍ．Ａｌ−Ｇｈｏｕｌ）ら、「ネトーシス（ＮＥＴｏｓｉｓ）および他の炎症／酸化マーカーの定量解析に基づくシンバスタチンの抗炎症作用のエビデンス（Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ＮＥＴｏｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ／ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒｓ）」、リザルツ・イン・イムノロジー（Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４巻、２０１４年、ｐｐ．１４−２２
しかし、本発明者らは、非特許文献１に記載の技術は、好中球細胞外トラップを放出していない好中球と好中球細胞外トラップとの分離感度が低く、スキャッタグラム上において通常の好中球および好中球細胞外トラップがそれぞれ独立したクラスターを形成し難いことを見出した。
本発明は、高精度に好中球細胞外トラップを検出できる新たな手段を提供する。
本発明の第１の態様における試料分析方法は、（Ａ）血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する工程、
（Ｂ）測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
（Ｃ）蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップとして検出する工程、
を含む。
本発明の第２の態様における試料分析装置は、血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製するための試料調製部と、測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得するための検出部と、検出部によって取得された蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップとして検出するための情報処理部とを備える。
本発明の第３の態様における試薬は、浸透圧調整剤と、核酸染色性蛍光色素とを含有し、前述の試料分析方法に用いるための試薬である。
本発明によれば、高精度に好中球細胞外トラップを検出できる新たな手段を提供できる。
試料分析方法によって好中球細胞外トラップを含む生体試料をスキャッタグラムの模式図である。 試料分析装置の全体構成を示すブロック図である。 試料分析装置の検出部の構成を示す模式図である 試料分析装置による好中球細胞外トラップの検出の処理手順のフローチャートである。 試料分析装置の処理手順のフローチャートである。 試料分析装置による測定用試料調製の処理手順のフローチャートである。 試料分析装置による蛍光および散乱光の測定の処理手順のフローチャートである。 試料分析装置による好中球細胞外トラップの検出の処理手順のフローチャートである。 試薬キットの構成を説明する図である。 実施例１の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムである。 比較例１の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムである。 実施例１の測定用試料、実施例１の測定用対照試料、比較例１の測定用試料および比較例１の測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合を示すグラフである。 実施例１０の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムである。
１．用語の説明
本明細書において、「Ｘ〜Ｙ」のように、端点による数値範囲の記載は、各範囲内に含まれるすべての数および有理数ならびに記載されている端点を含む。
本明細書において、「好中球細胞外トラップ放出後の粒子」は、好中球が好中球細胞外トラップを放出した後の残渣の粒子を意味する。
２．試料分析方法
本実施形態に係る試料分析方法は、（Ａ）血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する工程、
（Ｂ）測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
（Ｃ）蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップとして検出する工程、
を含む。本実施形態に係る試料分析方法は、例えば、後述の試料分析装置、後述の試薬などを用いることによって行なうことができる。
好中球細胞外トラップは、細菌などからの感染防御や血栓、癌転移、自己免疫疾患等に重要な働きをしていることが知られてきている。このため、検体中における好中球細胞外トラップの有無を検出することは、臨床的に有意義である。例えば、臓器や骨髄等の細胞を移植後に免疫抑制を行う際に、患者の血液中に好中球細胞外トラップが生じていることを察知することにより、ステロイドの投与など、過度な炎症を抑制するための治療をタイミングよく実行することが可能となる。本実施形態に係る試料分析方法では、工程（Ａ）において、以下の操作を行なうことにより、好中球細胞外トラップ放出後の粒子のクラスターを良好に形成できる。したがって、検体中の好中球細胞外トラップの存在を高精度に検出できる。また、検体中の好中球細胞外トラップの数を高精度に計数することも可能となる。具体的には、工程（Ａ）では、血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色する。工程（Ａ）により、測定用試料が得られる。好中球細胞外トラップ放出後の粒子は、好中球細胞外トラップの放出により、クロマチンを実質的に含まない。そのため、好中球細胞外トラップ放出後の粒子は、核酸染色性蛍光色素によりほとんど染色されない。したがって、測定用試料においては、好中球細胞外トラップ放出後の粒子における蛍光強度と、好中球細胞外トラップを放出していない好中球における蛍光強度との差が、好中球外トラップを放出していない好中球を染色ない場合と比較して大きくなり、より明確に区別化できる。
生体試料は、血液細胞を含む試料である。生体試料としては、例えば、血液、骨髄液、肺洗浄液などが挙げられるが、特に限定されない。これらの生体試料のなかでは、血液、骨髄液および肺洗浄液が好ましい。血液細胞としては、白血球、赤血球および血小板が挙げられる。また、白血球としては、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球が挙げられる。
工程（Ａ）では、好中球の細胞膜に損傷を与え、核酸染色性蛍光色素を導入して測定用試料を調製することができる。工程（Ａ）において、好中球の細胞膜に損傷を与え、核酸染色性蛍光色素を導入した場合、核酸染色性蛍光色素により、好中球に含まれる核酸がより確実に染色される。
工程（Ａ）において、好中球の細胞膜に損傷を与え、核酸染色性蛍光色素を導入することにより、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度を好中球細胞外トラップから得られる蛍光強度より大きくすることができる。これにより、好中球細胞外トラップ放出後の粒子と、好中球細胞外トラップを放出していない好中球とを、より明確に区別化できる。
工程（Ａ）において、好中球の細胞膜への損傷の付与および核酸染色性蛍光色素の導入は、同時に行なってもよく、好中球の細胞膜への損傷の付与後に核酸染色性蛍光色素の導入を行なう順序で行なってもよい。
好中球の細胞膜における損傷部分の大きさは、核酸染色性蛍光色素が導入可能な大きさであればよい。好中球の細胞膜への損傷の付与は、例えば、（Ａ−１）〜（Ａ−３）などの手法によって行なうことができる。
（Ａ−１）少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤とを、浸透圧が２４５ｈＰａ以上１６８０ｈＰａ以下になるように混合することを含む手法
（Ａ−２）少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と界面活性剤と浸透圧調整剤とを、浸透圧が２６３５ｈＰａ以下になるように混合することを含む手法
（Ａ−３）電気穿孔、レーザ穿孔などの物理的手法
手法（Ａ−１）では、測定用試料の浸透圧が２４５ｈＰａ以上１６８０ｈＰａ以下になるように少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤とを混合する。これにより、生体試料に含まれる好中球の細胞膜に損傷が与えられ、細胞膜における損傷部分から核酸染色性蛍光色素が好中球内に導入される。
核酸染色性蛍光色素としては、例えば、プロピジウムアイオダイド、エチジウムブロマイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、トリメチレンビス［［３−［［４−［［（３−メチルベンゾチアゾール−３−イウム）−２−イル］メチレン］−１，４−ジヒドロキノリン］−１−イル］プロピル］ジメチルアミニウム］・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−１）、４−［（３−メチルベンゾチアゾール−２（３Ｈ）−イリデン）メチル］−１−［３−（トリメチルアミニオ）プロピル］キノリニウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス［３−［４−［３−［（３−メチルベンゾチアゾール−３−イウム）−２−イル］−２−プロペニリデン］−１，４−ジヒドロキノリン−１−イル］プロピル］−１，３−プロパンジアミニウム・テトラヨージド（ＴＯＴＯ−３）、２−［３−［［１−［３−（トリメチルアミニオ）プロピル］−１，４−ジヒドロキノリン］−４−イリデン］−１−プロペニル］−３−メチルベンゾチアゾール−３−イウム・ジヨージド（ＴＯ−ＰＲＯ−３）、式（Ｉ）〜（ＸＩ）で表わされる蛍光色素などが挙げられるが、特に限定されない。
〔式（Ｉ）で表わされる蛍光色素〕
〔式中、Ｒ１およびＲ４はそれぞれ独立して水素原子、置換基を有していてもよいアルキル基または置換基を有していてもよいベンジル基、Ｒ２およびＲ３はそれぞれ独立して水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基、アルキルスルホニル基またはフェニル基、Ｚは硫黄原子、酸素原子、置換基を有していてもよいアルキレン基、ｍは０〜３の自然数、Ｘ−はアニオンを示す〕。
なお、式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ４のいずれか一方が炭素数６〜１８のアルキル基の場合、他方は、水素原子または炭素数６未満のアルキル基であることが好ましい。炭素数が６〜１８のアルキル基のなかでは、炭素数６、８または１０のアルキル基が好ましい。アルキル基の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、エーテル基、エステル基などが挙げられるが、特に限定されない。Ｒ１およびＲ４において、ベンジル基の置換基としては、炭素数１〜２０のアルキル基、炭素数２〜２０のアルケニル基、炭素数２〜２０のアルキニル基などが挙げられるが、特に限定されない。ベンジル基の置換基のなかでは、メチル基およびエチル基が好ましい。Ｒ２およびＲ３において、アルケニル基としては、炭素数２〜２０のアルケニル基が挙げられる。Ｒ２およびＲ３において、アルコキシ基としては、炭素数１〜２０のアルコキシ基が挙げられる。これらのアルコキシ基のなかでは、メトキシ基およびエトキシ基が好ましい。Ｒ２およびＲ３において、アルキレン基の炭素数は１または２である。アルキレン基の置換基としては、メチレン基およびエチレン基が挙げられる。Ｘ−において、アニオンとしては、例えば、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオンなどのハロゲン化物イオン；トリフルオロメタンスルホナートイオン（ＣＦ３ＳＯ３ −）、ホウフッ化物イオン（ＢＦ４ −）などが挙げられるが、特に限定されない。
〔式（ＩＩ）で表わされる蛍光色素〕
〔式中、Ｒ５およびＲ６は低級アルキル基、Ｘ−はアニオン、Ｚは硫黄原子、酸素原子、または置換基を有していてもよいアルキレン基、ｎは１または２を示す）。式（ＩＩ）において、Ｒ５およびＲ６は、互いに同一であってもよく。異なっていてもよい。式（ＩＩ）の「低級アルキル基」は、炭素数１〜６のアルキル基である。炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられるが、特に限定されない。これらのアルキル基のなかでは、メチル基およびエチル基が好ましい。式（ＩＩ）における置換基を有していてもよいアルキレン基は、式（Ｉ）における置換基を有していてもよいアルキレン基と同様である。また、Ｚのなかでは、硫黄原子が好ましい。Ｘ−のアニオンは、ハロゲン化物イオン；ホウフッ化物イオン（ＢＦ４ −）、ホウ塩化物イオン（ＢＣｌ４ −）、ホウ臭化物イオン（ＢＢｒ４ −）などのハロゲン化ホウ素イオン；リン化合物イオン；ハロゲン酸素酸イオン；フルオロ硫酸イオン；メチル硫酸イオン；芳香環ハロゲンまたはハロゲノアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオンなどが挙げられるが、特に限定されない。これらのアニオンのなかでは、ヨウ素イオンが好ましい。式（ＩＩ）で表わされる蛍光色素のなかでは、式（ＩＩａ）：
で表わされる蛍光色素ＮＫ−３２１が好ましい。
〔式（ＩＩＩ）で表わされる蛍光色素〕
〔式中、Ｒ７およびＲ８は低級アルキル基、Ｘ−はアニオン、ｎは１または２を示す〕。式（ＩＩＩ）における低級アルキル基およびアニオンは、式（ＩＩ）における低級アルキル基およびアニオンと同様である。
式（ＩＩＩ）で表わされる蛍光色素のなかでは、式（ＩＩＩａ）：
で表わされる蛍光色素が好ましい。
〔式（ＩＶ）で表わされる蛍光色素〕
〔式中、Ｒ９は水素原子または低級アルキル基、Ｒ１０およびＲ１１はそれぞれ独立して水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基、Ｒ１２は水素原子、アシル基または低級アルキル基、Ｒ１３は水素原子または置換基を有していてもよい低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子、置換基を有していてもよいアルキレン基、Ｘ−はアニオン、ｎは１または２を示す〕。
式（ＩＶ）における低級アルキル基、アニオンおよび置換基を有していてもよいアルキレン基は、式（Ｉ）における低級アルキル基、アニオンおよび置換基を有していてもよいアルキレン基と同様である。低級アルコキシ基は、炭素数１〜６のアルコキシ基である。炭素数１〜６のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基などが挙げられるが、特に限定されない。これらの炭素数１〜６のアルコキシ基のなかでは、メトキシ基およびエトキシ基が好ましい。アシル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基であることが好ましい。アシル基としては、例えば、アセチル基、プロピオニル基などが挙げられるが、特に限定されない。これらのアシル基のなかでは、アセチル基が好ましい。置換基を有していてもよい低級アルキル基において、低級アルキル基の置換基としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子；水酸基などが挙げられるが、特に限定されない。置換基を有していてもよい低級アルキル基は、１〜３個の置換基を有することができる。置換基を有していてもよい低級アルキル基のなかでは、１個の水酸基を有する低級アルキル基が好ましい。なお、Ｚは、硫黄原子であることが好ましい。Ｘ−は、臭素イオンまたはホウフッ化物イオン（ＢＦ４ −）が好ましい。
式（ＩＶ）で表わされる蛍光色素のなかでは、式（ＩＶａ）〜（ＩＶｃ）で表わされる蛍光色素が好ましい。
〔式（Ｖ）で表わされる蛍光色素〕
〔式中、Ａ−およびＱ−はそれぞれ独立して塩化物イオン（Ｃｌ−）またはヨウ化物イオン（Ｉ−）を示す〕。
〔式（ＶＩ）で表わされる蛍光色素〕
〔式（ＶＩＩ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−１５７０〕
〔式（ＶＩＩＩ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−１０４９〕
〔式（ＩＸ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−９８〕
〔式（Ｘ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−１４１〕
〔式（ＸＩ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−３２１〕
これらの核酸染色性蛍光色素のなかでは、式（ＸＩ）で表わされる蛍光色素ＮＫ−３２１が好ましい。
核酸染色性蛍光色素は、適切な溶媒に溶解させて用いることができる。溶媒としては、水、有機溶媒、これらの混合物などが挙げられるが、特に限定されない。有機溶媒としては、例えば、アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドなどが挙げられるが、特に限定されない。
生体試料と混合される核酸染色性蛍光色素の量は、血液細胞に含まれる核酸を染色するのに十分な量であればよい。生体試料と混合される核酸染色性蛍光色素の量は、血液細胞に含まれる核酸に対して過剰量であってもよい。通常、等張溶液１ｍＬに懸濁した血液細胞である白血球１０４個または赤血球１０５個あたりの核酸染色性蛍光色素の量は、血液細胞に含まれる核酸を十分に染色する観点から、好ましくは０．５μＭ以上、より好ましくは１μＭ以上である。
浸透圧調整剤としては、測定用試料の浸透圧を調整するための試薬、例えば、糖、アミノ酸、塩化ナトリウムなどが溶媒に溶解した溶液；有機溶媒などが挙げられるが、特に限定されない。糖としては、例えば、グルコース、フルクトースなどの単糖；アラビノースなどの多糖；キシリトール、ソルビトール、マンニトール、リビトールなど糖アルコールなどが挙げられるが、特に限定されない。アミノ酸としては、例えば、アラニン、プロリン、グリシン、バリンなどが挙げられるが、特に限定されない。溶媒としては、水；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液などの緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。有機溶媒としては、例えば、エチレングリコール、グリセリンなどが挙げられるが、特に限定されない。浸透圧調整剤の具体例としては、リン酸緩衝生理食塩水などが挙げられるが、特に限定されない。
生体試料と混合される浸透圧調整剤の量は、測定用試料の浸透圧が２４９ｈＰａ以上１６８０ｈＰａ以下の範囲となる量である。測定用試料の浸透圧は、好中球細胞外トラップの検出感度を向上させる観点から、２４９ｈＰａ以上、好ましくは２７２ｈＰａ以上であり、同様の観点から、１６８０ｈＰａ以下、好ましくは５６８ｈＰａ以下である。このような浸透圧の影響により、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子から好中球細胞外トラップは分離されると考えられる。
手法（Ａ−１）において、測定用試料には、芳香族有機酸をさらに配合してもよい。芳香族有機酸としては、例えば、フタル酸、安息香酸、サリチル酸、馬尿酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、それらの塩などが挙げられるが、特に限定されない。芳香族有機酸は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
手法（Ａ−１）において、測定用試料のｐＨは、好中球の細胞膜に効率よく損傷を与える観点から、好ましくは５．０〜９．０である。測定用試料のｐＨは、例えば、水酸化ナトリウム、塩酸などのｐＨ調節剤によって調整できる。なお、浸透圧調整剤の溶媒として緩衝液が用いられている場合、浸透圧調整剤によって測定用試料のｐＨを調整できる。また、手法（Ａ−１）において、芳香族有機酸が用いられている場合、芳香族有機酸によって測定用試料のｐＨを調整できる。
手法（Ａ−１）では、好中球の細胞膜への損傷の付与および核酸染色性蛍光色素の導入をより確実に行なう観点から、生体試料と核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と、任意に芳香族有機酸との混合後、測定用試料を２５〜４１℃で０．２５〜３分間インキュベーションしてもよい。
手法（Ａ−１）では、必要に応じ、核酸染色性蛍光色素および浸透圧調整剤以外の助剤を用いてもよい。助剤としては、例えば、ｐＨ調整剤などが挙げられるが、特に限定されない。
手法（Ａ−２）では、測定用試料の浸透圧が２６３５ｈＰａ以下になるように少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と界面活性剤と浸透圧調整剤とを混合する。これにより、生体試料に含まれる好中球などの血液細胞の細胞膜に損傷が与えられ、損傷部位から核酸染色性蛍光色素が好中球などの血液細胞内に導入される。
手法（Ａ−２）に用いられる核酸染色性蛍光色素および浸透圧調整剤は、手法（Ａ−１）に用いられる核酸染色性蛍光色素および浸透圧調整剤と同様である。手法（Ａ−２）における生体試料と混合される核酸染色性蛍光色素の量は、手法（Ａ−１）における生体試料と混合される核酸染色性蛍光色素の量と同様である。
生体試料と混合される浸透圧調整剤の量は、測定用試料の浸透圧が２６３５ｈＰａ以下の範囲となる量である。
界面活性剤としては、カチオン界面活性剤、ノニオン界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
カチオン性界面活性剤としては、例えば、第４級アンモニウム塩型界面活性剤、ピリジニウム塩型界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。第４級アンモニウム塩型界面活性剤としては、例えば、式（ＸＩＩ）：
（式中、Ｒ１４は炭素数６〜１８のアルキル基または炭素数６〜１８のアルケニル基、Ｒ１５およびＲ１６はそれぞれ独立して炭素数１〜４のアルキル基または炭素数１〜４のアルケニル基、Ｒ１７は炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルケニル基またはベンジル基、Ｘ−はハロゲン原子を示し、炭素数の合計が９〜３０である）
で表わされる界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
式（ＸＩＩ）において、Ｒ１４のなかでは、炭素数が６、８、１０、１２または１４のアルキル基および炭素数が６、８、１０、１２または１４のアルケニル基が好ましく、炭素数が６、８、１０、１２もしくは１４の直鎖アルキル基がより好ましい。Ｒ１４の具体例としては、オクチル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられるが、特に限定されない。Ｒ１５およびＲ１６のなかでは、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。Ｒ１７のなかでは、メチル基、エチル基およびプロピル基が好ましい。
ピリジニウム塩型界面活性剤としては、例えば、式（ＸＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１８は炭素数６〜１８のアルキル基または炭素数６〜１８のアルケニル基、Ｘ−はハロゲノイオンを示す）
で表わされる界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
式（ＸＩＩＩ）において、Ｒ１８のなかでは、炭素数が６、８、１０、１２または１４のアルキル基および炭素数が６、８、１０、１２または１４のアルケニル基が好ましく、炭素数が６、８、１０、１２もしくは１４の直鎖アルキル基がより好ましい。Ｒ１８の具体例としては、オクチル基、デシル基、ドデシル基などが挙げられるが、特に限定されない。
ノニオン性界面活性剤としては、例えば、式（ＸＩＶ）：
（式中、Ｒ１９は炭素数８〜２５のアルキル基、炭素数８〜２５のアルケニル基または炭素数８〜２５のアルキニル基、Ｒ２０は酸素原子、エステル結合またはオキシフェニレン基、ｏは１０〜５０の整数を示す）
で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
ノニオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルなどが挙げられるが、特に限定されない。
これらの界面活性剤は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。２種類以上の界面活性剤を混合して用いる場合、界面活性剤の組み合せとしては、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤との組み合わせ、カチオン性界面活性剤同士の組み合わせおよびアニオン性界面活性剤同士の組み合せのいずれであってもよい。
界面活性剤は、溶液の形態であってもよい。界面活性剤を溶解するための溶媒としては、例えば、水、有機溶媒、水と有機溶媒との混合物などが挙げられるが、特に限定されない。有機溶媒としては、例えば、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドなどが挙げられるが、特に限定されない。
生体試料と混合される界面活性剤の量は、測定用試料における界面活性剤の量が所定量となる量であればよい。界面活性剤がカチオン性界面活性剤である場合、測定用試料における界面活性剤の量は、通常、好ましくは１０〜１００００ｐｐｍ、より好ましくは１００〜１０００ｐｐｍである。界面活性剤がノニオン性界面活性剤である場合、測定用試料における界面活性剤の量は、通常、好ましくは１０〜１０００００ｐｐｍ、より好ましくは１００〜１００００ｐｐｍ、さらに好ましくは１０００〜５０００ｐｐｍである。
手法（Ａ−２）において、測定用試料には、芳香族有機酸をさらに配合してもよい。芳香族有機酸としては、例えば、フタル酸、安息香酸、サリチル酸、馬尿酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、それらの塩などが挙げられるが、特に限定されない。芳香族有機酸は、単独で用いてもよく、２種類以上を混合して用いてもよい。
手法（Ａ−２）において、測定用試料のｐＨは、好中球の細胞膜に効率よく損傷を与える観点から、好ましくは５．０〜９．０である。測定用試料のｐＨは、例えば、水酸化ナトリウム、塩酸などのｐＨ調節剤によって調整できる。なお、浸透圧調整剤の溶媒として緩衝液が用いられている場合、浸透圧調整剤によって測定用試料のｐＨを調整できる。また、手法（Ａ−２）において、芳香族有機酸が用いられている場合、芳香族有機酸によって測定用試料のｐＨを調整できる。
手法（Ａ−２）では、好中球の細胞膜への損傷の付与および核酸染色性蛍光色素の導入をより確実に行なう観点から、生体試料と核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と、任意に芳香族有機酸との混合後、測定用試料を２５〜４１℃で０．２５〜３分間インキュベーションしてもよい。
手法（Ａ−２）では必要に応じ、核酸染色性蛍光色素、界面活性剤および浸透圧調整剤以外の助剤を用いてもよい。助剤は、手法（Ａ−１）に用いられる助剤と同様である。
つぎに、工程（Ｂ）において、測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する。工程（Ｂ）は、例えば、フローサイトメータを用いて行なうことができる。
測定用試料に照射される光は、用いられた核酸染色性蛍光色素の種類に応じて適宜選択できる。
蛍光情報は、核酸染色性蛍光色素によって染色された核酸から得られる情報である。蛍光情報としては、例えば、蛍光強度などが挙げられるが、特に限定されない。蛍光強度は、核酸染色性蛍光色素によって染色された核酸の量が多いほど大きい。蛍光強度の差は、白血球の分類、好中球細胞外トラップの発生の有無などに用いることができる。
工程（Ｂ）においては、測定用試料に光を照射して得られる散乱光情報をさらに取得することができる。散乱光情報としては、前方散乱光情報および側方散乱光情報が挙げられる。散乱光は、光の進行方向に血球のような粒子が障害物として存在する場合、粒子により光がその進行方向を変えることによって生じる。散乱光を検出することによって、粒子の大きさおよび材質に関する情報を得ることができる。前方散乱光からは、血液細胞などの粒子の大きさに関する情報を得ることができる。また、側方散乱光からは、粒子内部の情報を得ることができる。細胞へのレーザ光照射によって生じる側方散乱光の強度は、細胞内部の複雑さ、例えば、核の形状、核の大きさ、密度、顆粒の量などを反映する。したがって、これらの散乱光の強度は、白血球の分類などに利用できる。散乱光情報は、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子をより確実に分類する観点から、側方散乱光情報であることが好ましい。
その後、工程（Ｃ）において、蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップとして検出する。具体的には、例えば、好中球細胞外トラップを放出していない好中球のクラスターにおける蛍光強度の平均値よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子として検出できる。また、好中球細胞外トラップを放出していない好中球のクラスターにおける蛍光強度の最頻値よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子として検出できる。
工程（Ｂ）において、散乱光情報をさらに取得した場合、工程（Ｃ）において、蛍光情報および散乱光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを検出することができる。この場合、工程（Ｃ）においては、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球から得られる散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子として検出できる。具体的には、例えば、好中球細胞外トラップを放出していない好中球のクラスターにおける蛍光強度の平均値よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球のクラスターにおける散乱光強度の平均値よりも大きい散乱光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子として検出できる。また、好中球細胞外トラップを放出していない好中球のクラスターにおける蛍光強度の最頻値よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球のクラスターにおける散乱光強度の最頻値よりも大きい散乱光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子として検出できる。
フローサイトメトリーによるスキャッタグラムを用いる場合、スキャッタグラム上には、図１に示されるように、検出領域Ａ１、検出領域Ａ２および検出領域Ａ３が現れる。検出領域Ａ１は、好中球細胞外トラップを放出した後の粒子のクラスターが現れる領域である。検出領域Ａ２は、好中球細胞外トラップを放出していない好中球のクラスターが現れる領域である。検出領域Ａ３は、リンパ球のクラスターが現れる領域である。検出領域Ａ１は、検出領域Ａ２の蛍光強度よりも小さい蛍光強度を示す。また、検出領域Ａ１は、検出領域Ａ３の散乱光強度よりも大きい散乱光強度を示す。検出領域Ａ１に粒子が検出された場合、好中球により、好中球細胞外トラップが放出されていると判定できる。なお、好中球細胞外トラップ自体は、測定用試料の液体成分中に溶けるか、好中球と比較して非常に小さなデブリ成分としてスキャッタグラム上に現れると考えられる。
［試料分析装置の全体構成］
前述した試料分析方法に用いられる試料分析装置（以下、単に「分析装置」ともいう）の一例を、添付の図面に基づき説明する。図２に示されるように、分析装置１０は、測定ユニット２０と、情報処理ユニット３０とを含む。測定ユニット２０と情報処理ユニット３０とは、通信可能に接続されている。
［測定ユニットの構成］
図２に示されるように、測定ユニット２０は、試料調製部１００と、検出部２００と、試薬収容部３００と、生体試料が収容された生体試料収容部４００と、制御部５００とを含む。
試料調製部１００は、試薬収容部３００の第１容器３０１および第２容器３０２のそれぞれから試薬を取得する。また、試料調製部１００は、生体試料収容部４００から生体試料を取得する。さらに、試料調製部１００は、取得された試薬と生体試料とを混合する。これにより、試料調製部１００は、血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する。試料調製部１００は、チャンバー９０と、生体試料搬送部１１１、第１試薬搬送部１１２と、第２試薬搬送部１１３と、測定用試料搬送部１３１とを含む。生体試料搬送部１１１、第１試薬搬送部１１２、第２試薬搬送部１１３および測定用試料搬送部１３１は、それぞれ、コンプレッサに接続されている。
チャンバー９０は、生体試料搬送部１１１を介して生体試料収容部４００と接続されている。生体試料搬送部１１１は、生体試料を流すためのチューブである。生体試料搬送部１１１は、コンプレッサが発生する圧力により、生体試料収容部４００から定量の生体試料を取得する。生体試料搬送部１１１は、取得された定量の生体試料を、コンプレッサが発生する圧力によってチャンバー９０内に吐出する。
チャンバー９０は、第１試薬搬送部１１２を介して試薬収容部３００の第１容器３０１と接続されている。第１試薬搬送部１１２は、第１試薬を流すためのチューブである。第１試薬搬送部１１２は、コンプレッサにより発生される圧力により、試薬収容部３００の第１容器３０１から定量の第１試薬を取得する。第１試薬搬送部１１２は、取得された定量の第１試薬を、コンプレッサにより発生される圧力によってチャンバー９０内に吐出する。
チャンバー９０は、第２試薬搬送部１１３を介して試薬収容部３００の第２容器３０２と接続されている。第２試薬搬送部１１３は、第２試薬を流すためのチューブである。第２試薬搬送部１１３は、コンプレッサにより発生される圧力により、試薬収容部３００の第２容器３０２から定量の第２試薬を取得する。また、第２試薬搬送部１１３は、取得された定量の第２試薬を、コンプレッサにより発生される圧力によってチャンバー９０内に吐出する。
チャンバー９０は、測定用試料搬送部１３１を介して検出部２００と接続されている。測定用試料搬送部１３１は、チャンバー９０内で調製された測定用試料を検出部２００へ搬送するためのチューブである。
検出部２００は、光照射部２０１と、受光部２０２と、シースフロー部２０３とを含む。受光部２０２は、受光した光の量に応じた電気信号を情報処理ユニット３０の算出部３１に出力する。図３において、検出部２００は、シースフロー部２０３のフローセル２３１に測定用試料とシース液とを送り込む。これにより、検出部２００は、フローセル２３１中に液流を発生させる。また、検出部２００は、フローセル２３１内を通過する液流に含まれる血液細胞などの粒子にレーザ光を照射する。さらに、検出部２００は、レーザ光が照射された粒子から得られる光を測定する。
光照射部２０１は、光源２１１から照射されたレーザ光と、コリメータレンズ２１２と、コンデンサレンズ２１３と、ビームストッパ２１４とを有している。光照射部２０１は、光源２１１から照射されたレーザ光を、コリメータレンズ２１２とコンデンサレンズ２１３とを介してフローセル２３１に照射する。光源２１１は、用いられる核酸染色性蛍光色素の種類および用いられるレーザ光の種類に応じて適宜選択できる。レーザ光としては、例えば、赤色半導体レーザ光、青色半導体レーザ光などの半導体レーザ光；アルゴンレーザ光などの気体レーザ光などが挙げられるが、特に限定されない。
受光部２０２は、前方散乱光受光部２０２ａと、側方散乱光受光部２０２ｂと、蛍光受光部２０２ｃとを有している。なお、受光部２０２は、前方散乱光受光部２０２ａおよび側方散乱光受光部２０２ｂを有さず、蛍光受光部２０２ｃを有していてもよい。
前方散乱光受光部２０２ａは、前方集光レンズ２２１と、ピンホール２２２と、フォトダイオード２２３とを有している。前方散乱光受光部２０２ａは、前方への散乱光を前方集光レンズ２２１によって集光する。また、前方散乱光受光部２０２ａは、ピンホール２２２を通った光をフォトダイオード２２３で受光する。
一方、側方散乱光受光部２０２ｂは、側方集光レンズ２２４と、ダイクロイックミラー２２５と、フォトダイオード２２６とを有している。側方散乱光受光部２０２ｂは、側方への散乱光を側方集光レンズ２２４にて集光する。また、側方散乱光受光部２０２ｂは、側方への散乱光の一部をダイクロイックミラー２２５で反射させる。さらに、側方散乱光受光部２０２ｂは、ダイクロイックミラー２２５で反射させた光をフォトダイオード２２６で受光する。
蛍光受光部２０２ｃは、分光フィルタ２２７と、アバランシェフォトダイオード２２８とを有している。蛍光受光部２０２ｃは、ダイクロイックミラー２２５を透過した光を分光フィルタ２２７に通す。また、蛍光受光部２０２ｃは、分光フィルタ２２７を透過した光をアバランシェフォトダイオード２２８で受光する。
シースフロー部２０３は、フローセル２３１を有している、シースフロー部２０３は、フローセル２３１内において、測定用試料がシース液に包まれた状態で流れるように構成されている。
図２に戻り、試薬収容部３００は、第１容器３０１と、第２容器３０２とを含む。第１容器３０１は、核酸染色性蛍光色素を含む第１試薬を収容する。また、第２容器３０２は、浸透圧調整剤と界面活性剤とを含む第２試薬を収容する。第１容器３０１および第２容器３０２のそれぞれには、各容器に収容された試薬の種類を識別するための識別子が設けられている。識別子としては、例えば、バーコードなどが挙げられるが、特に限定されない。
生体試料収容部４００は、複数の生体試料容器４０１を備えている。複数の生体試料容器４０１のそれぞれには、互いに異なる種類の生体試料が収容されている。また、生体試料収容部４００は、所望の生体試料を収容した生体試料容器４０１を試料吸引位置へ搬送する。複数の生体試料容器４０１それぞれには、各容器に収容された生体試料の種類を識別するための識別子が設けられている。識別子としては、例えば、バーコードなどが挙げられるが、特に限定されない。
制御部５００は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）５０１と、記憶部５０２とを含む。制御部５００は、コンピュータによって構成されている。
記憶部５０２は、コンピュータプログラム、試薬収容部３００に収容された試薬を識別するための試薬識別情報、測定用試料の調製方法に関する試料調製情報、および生体試料収容部４００に収容された生体試料を識別するための試料識別情報を記憶している。コンピュータプログラムとしては、例えば、測定用試料の調製のためのコンピュータプログラム、測定用試料に関する蛍光情報および散乱光情報の取得のためのコンピュータプログラムなどが挙げられるが、特に限定されない。試薬識別情報としては、例えば、試薬の種類と試薬が収容された容器の位置と識別子との関連付けの情報などが挙げられるが、特に限定されない。また、試料識別情報としては、例えば、生体試料の種類と生体試料が収容された生体試料容器の位置と識別子との関連付けの情報などが挙げられるが、特に限定されない。
ＣＰＵ５０１は、記憶部５０２に記憶された試薬識別情報および試料調製情報を用い、測定用試料の調製のためのコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ５０１は、測定ユニット２０の試料調製部１００に測定用試料の調製を行なわせる。
［情報処理ユニットの構成］
情報処理ユニット３０は、図２に示されるように、算出部３１と、表示部３２と、入力部３３とを含む。情報処理ユニット３０は、検出部２００によって取得された蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップとして検出する。本実施形態において、情報処理ユニット３０は、コンピュータシステムによって構成されている。算出部３１は、ＣＰＵ６０１と、記憶部６０２とを含む。ＣＰＵ６０１は、記憶部６０２に記憶されたコンピュータプログラムを実行する。表示部３２としては、例えば、スクリーンディスプレイなどが挙げられるが、特に限定されない。表示部３２は、例えば、好中球細胞外トラップの有無などの情報などを表示する。入力部３３としては、例えば、キーボード、マウスなどが挙げられるが、特に限定されない。
記憶部６０２は、ＣＰＵ６０１に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラムなどのコンピュータプログラムおよびコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。アプリケーションプログラムとしては、例えば、好中球細胞外トラップの検出のためのコンピュータプログラムなどが挙げられるが、特に限定されない。ＣＰＵ６０１は、記憶部６０２に記憶された好中球細胞外トラップの検出のためのコンピュータプログラムを実行する。これにより、ＣＰＵ６０１は、分析装置１０に、好中球細胞外トラップの検出を行なわせることができる。
核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と界面活性剤とは、同時に生体試料と混合してもよい。したがって、第１容器３０１および第２容器３０２の代わりに、共通の１つの容器に核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と界面活性剤とが収容されていてもよい。この場合、第１試薬搬送部１１２および第２試薬搬送部１１３の代わりに、１つの試薬搬送部が用いられる。
［試料分析装置の処理手順］
つぎに、図４に基づき、分析装置１０の処理手順の概要を説明する。以下の処理手順においては、測定ユニット２０の制御部５００は、記憶部５０２から取得した試薬識別情報および試料調製情報を用い、記憶部５０２に記憶された測定用試料の調製のためのコンピュータプログラムを実行する。また、制御部５００は、記憶部５０２に記憶された測定用試料に関する蛍光情報および散乱光情報の取得のためのコンピュータプログラムを実行する。情報処理ユニット３０の算出部３１は、取得された光学的情報を用い、記憶部６０２に記憶された好中球細胞外トラップの検出のためのコンピュータプログラムを実行する。
まず、ステップＳ１において、測定ユニット２０の制御部５００は、試料調製部１００に測定用試料の調製を実行させる。ステップＳ１の測定用試料の調製は、後述する図５および図６に示される処理手順にしたがって実行される。
その後、ステップＳ２において、制御部５００は、検出部２００に、測定用試料から得られる蛍光および散乱光の測定を実行させる。ステップＳ２の蛍光および散乱光の測定は、図７に示される処理手順に従って実行される。
その後、ステップＳ３において、情報処理ユニット３０の算出部３１は、好中球細胞外トラップの検出のためのコンピュータプログラムを実行することにより、好中球細胞外トラップの検出を行なう。
［測定用試料調製工程の処理手順］
つぎに、図５および図６に基づき、分析装置１０による測定用試料調製工程の処理手順の概要を説明する。測定用試料調製工程は、前述の試料分析方法の工程（Ａ）に対応する。
まず、図５に示されるように、ステップＳ１０１において、制御部５００は、生体試料収容部４００に、試料吸引位置への所望の生体試料容器４０１の搬送を実行させる。このとき、制御部５００は、記憶部５０２に記憶された試料識別情報に基づき、生体試料収容部４００に、所望の生体試料が収容された生体試料容器４０１を選択させる。そして、制御部５００は、生体試料収容部４００に、選択された生体試料容器４０１を試料吸引位置に位置するように搬送させる。
つぎに、ステップＳ１０２において、制御部５００は、試料調製部１００に、生体試料容器４０１中の生体試料の定量吸引を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、生体試料搬送部１１１を介して生体試料容器４０１から定量の生体試料を吸引させる。
つぎに、ステップＳ１０３において、制御部５００は、試料調製部１００に、チャンバー９０への生体試料の吐出を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、吸引された定量の生体試料を、生体試料搬送部１１１を介してチャンバー９０に吐出させる。
つぎに、図６に示されるように、ステップＳ１０４において、制御部５００は、試料調製部１００に、第１容器３０１中の第１試薬の定量吸引を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、第１試薬搬送部１１２を介して第１容器３０１から定量の第１試薬を吸引させる。つぎに、ステップＳ１０５において、制御部５００は、試料調製部１００に、チャンバー９０への第１試薬の吐出を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、吸引された定量の第１試薬を、第１試薬搬送部１１２を介してチャンバー９０に吐出させる。
また、ステップＳ１０６において、制御部５００は、試料調製部１００に、第２容器３０２中の第２試薬の定量吸引を実行させる。つぎに、ステップＳ１０７において、制御部５００は、試料調製部１００に、チャンバー９０への第２試薬の吐出を実行させる。ステップＳ１０６およびステップＳ１０７は、第２試薬搬送部１１３を介して第２試薬の吸引および吐出の一連の処理を行なうことを除き、図６のステップＳ１０４およびステップＳ１０５と同様である。本実施形態においては、ステップＳ１０６およびステップＳ１０７は、図６のステップＳ１０４およびステップＳ１０５と並行して実行される。
つぎに、ステップＳ１０８において、制御部５００は、試料調製部１００に、チャンバー９０内の生体試料、第１試薬および第２試薬の撹拌および混合を実行させる。これにより、血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸が核酸染色性蛍光色素により染色され、測定用試料が得られる。
その後、図４のステップＳ２における測定工程に処理が進行する。
［測定工程の処理手順］
つぎに、図７に基づき、分析装置１０による蛍光および散乱光の測定工程の処理手順の概要を説明する。測定工程は、前述の試料分析方法の工程（Ｂ）に対応する。
ステップＳ２０１において、制御部５００は、試料調製部１００に、検出部２００のフローセル２３１への測定用試料の導入を実行させる。具体的には、制御部５００は、試料調製部１００に、測定用試料搬送部１３１を介してチャンバー９０内の測定用試料を検出部２００のフローセル２３１へ搬送させる。つぎに、ステップＳ２０２において、制御部５００は、検出部２００に、測定用試料への光照射を実行させる。具体的には、制御部５００は、検出部２００の光照射部２０１に、フローセル２３１内を流れる測定用試料に対し、光を照射する。また、ステップＳ２０３において、制御部５００は、検出部２００に、測定用試料から得られる蛍光および散乱光の測定を実行させる。具体的には、制御部５００は、検出部２００の受光部２０２に受光された蛍光および散乱光それぞれの強度に応じた電気信号として光学的情報を情報処理ユニット３０の算出部３１に出力させる。
その後、図４のステップＳ３における検出工程に処理が進行する。
［検出工程の処理手順］
つぎに、図８に基づき、分析装置１０による好中球細胞外トラップの検出工程の処理手順の概要を説明する。検出工程は、前述の試料分析方法の工程（Ｃ）に対応する。
ステップＳ３０１において、情報処理ユニット３０は、測定ユニット２０から光学的情報を受信する。つぎに、ステップＳ３０２において、ＣＰＵ６０１は、受信された光学的情報を用い、粒子の分類を実行する。具体的には、ＣＰＵ６０１は、受信された光学的情報を用い、蛍光強度および散乱光強度のスキャッタグラム上への粒子のプロットを実行する。蛍光強度および散乱光強度を用いることにより、図１のスキャッタグラムに示されるように、粒子は、主に、検出領域Ａ１に現れる粒子群、検出領域Ａ２に現れる粒子群および検出領域Ａ３に現れる粒子群に分類される。つぎに、図８のステップＳ３０３において、ＣＰＵ６０１は、好中球細胞外トラップの有無の判定を実行する。具体的には、ＣＰＵ６０１は、検出領域Ａ１に現れる粒子を抽出する。ＣＰＵ６０１は、図１のスキャッタグラムの検出領域Ａ１において、粒子が抽出された場合、好中球により、好中球細胞外トラップが放出されていると判定する。その際、ＣＰＵ６０１は検出領域Ａ１に現れる粒子の数が所定値以上であるか否かに基づいて好中球細胞外トラップが放出されているか否かを判定してもよい。この所定値は、ノイズなどを考慮して好中球細胞外トラップが出現していないと判断できる値である。その後、ＣＰＵ６０１は、検出結果を表示部３２などに出力する。
［処理手順の変形例］
生体試料への第１試薬および第２試薬の添加は、第１試薬の添加および第２試薬の添加の順で行なわれてもよい。具体的には、ステップＳ１０４およびステップＳ１０５の一連のステップの後、ステップＳ１０６およびステップＳ１０７の一連のステップを実行してもよい。生体試料への第１試薬および第２試薬の添加は、第２試薬の添加および第１試薬の添加の順で行なわれてもよい。具体的には、ステップＳ１０６およびステップＳ１０７の一連のステップの後、ステップＳ１０４およびステップＳ１０５の一連のステップを実行してもよい。第１試薬および第２試薬の代わりに、核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と界面活性剤とを含む試薬を用いてもよい。
受光部２０２が前方散乱光受光部２０２ａおよび側方散乱光受光部２０２ｂを有さず、蛍光受光部２０２ｃを有する場合、ＣＰＵ６０１は、受信された蛍光強度を用い、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップとして検出する。
４．試薬
本実施形態に係る試薬は、前述の試料分析方法に用いるための試薬である。本実施形態に係る試薬は、浸透圧調整剤と、核酸染色性蛍光色素とを含有する。
本実施形態に係る試薬に用いられる浸透圧調整剤および核酸染色性蛍光色素は、前述の試料分析方法に用いられる浸透圧調整剤および核酸染色性蛍光色素と同様である。浸透圧調整剤および核酸染色性蛍光色素は、別々の試薬に含まれていてもよく、１つの試薬に含まれていてもよい。
本実施形態に係る試薬は、界面活性剤をさらに含有していてもよい。本実施形態に係る試薬界面活性剤は、前述の試料分析方法に用いられる界面活性剤と同様である。本実施形態に係る試薬が界面活性剤を含有している場合、界面活性剤、浸透圧調整剤および核酸染色性蛍光色素は、それぞれ別々の試薬に含まれていてもよく、１つの試薬に含まれていてもよい。また、本実施形態に係る試薬が浸透圧調整剤を含む試薬と核酸染色性蛍光色素を含む試薬とから構成されている場合、界面活性剤は、浸透圧調整剤を含む試薬および核酸染色性蛍光色素を含む試薬のいずれか一方に含まれていてもよく、両方に含まれていてもよい。
本実施形態に係る試薬は、芳香族有機酸、他の溶媒、助剤などをさらに含有していてもよい。本実施形態に係る試薬に用いられる芳香族有機酸は、前述の試料分析方法に用いられる芳香族有機酸と同様である。溶媒としては、水；緩衝液；有機溶媒、これらの少なくとも２種の混合物などが挙げられるが、特に限定されない。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などが挙げられるが、特に限定されない。有機溶媒としては、例えば、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシドなどが挙げられるが、特に限定されない。助剤としては、例えば、キレート剤、防腐剤などが挙げられるが、特に限定されない。
本実施形態に係る試薬は、浸透圧調整剤、核酸染色性蛍光色素および界面活性剤それぞれを試薬の形態に応じて適切な溶媒に配合することによって製造できる。
本実施形態に係る試薬は、容器に封入された試薬キットとして提供できる。本実施形態に係る試薬キットの一例を図９に示す。図９に示される試薬キット８００は、第１試薬８０１が入った容器８０２と、第２試薬８０３が入った容器８０４と、添付文書８０５と、箱８０６とを含む。第１試薬８０１は、核酸染色性蛍光色素を含む。また、第２試薬８０３は、浸透圧調整剤と界面活性剤とを含む。添付文書８０５は、試薬キット８００を用いて好中球細胞外トラップの検出を行なう操作手順などの記載を含む。箱８０６は、第１試薬８０１が入った容器８０２と、第２試薬８０３が入った容器８０４と、添付文書８０５とを収容する。なお、図９に示される試薬キットは、第１試薬８０１および第２試薬８０３それぞれが異なる容器に封入されたキットであるが、第１試薬８０１および第２試薬８０３の混合物が１つの容器に封入されていてもよい。
略語の説明
ＰＭＡ：ホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタート
ＮＥＴｓ：好中球細胞外トラップ
（実施例１および比較例１）
健常者末梢血１０００μＬに、ＰＭＡを終濃度が１６２ｎＭになるように混合した。得られた混合物を室温（２５℃）で３時間静置することにより、ＮＥＴｓを引き起こした。得られた混合物１７μＬと、細胞膜を透過しない核酸染色性蛍光色素〔サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製、商品名：Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ ｓｔａｉｎ〕１μＬと、リン酸緩衝生理食塩水〔組成：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および１５０ｍＭ塩化ナトリウム〕とを、浸透圧が３１７．８ｈＰａになるように混合した。これにより、末梢血に含まれる好中球などの血液細胞の細胞膜に損傷を与え、損傷部位から核酸染色性蛍光色素を好中球などの血液細胞内に導入した。得られた試料を実施例１の測定用試料とした。また、ＰＭＡを用いる代わりに精製水を用いたことを除き、実施例１の測定用試料の調製と同様の操作を行ない、実施例１の測定用対照試料を得た。
健常者末梢血１０００μＬに、ＰＭＡを終濃度が１６２ｎＭになるように混合した。得られた混合物を室温（２５℃）で３時間静置した。得られた混合物１７μＬと、核酸染色性蛍光色素１μＬと、リン酸緩衝生理食塩水とを、浸透圧が６６７３．８ｈＰａとなるように混合し、比較例１の測定用試料を得た。また、ＰＭＡを用いる代わりに精製水を用いたことを除き、比較例１の測定用試料の調製と同様の操作を行ない、比較例１の測定用対照試料を得た。なお、比較例１では、リン酸緩衝生理食塩水が用いられているため、比較例１の測定用試料および測定用対照試料に含まれる好中球の細胞膜には、損傷が与えられていない。
フローサイトメータを用いて測定用試料および測定用対照試料それぞれに含まれる核酸からの蛍光および散乱光を測定し、スキャッタグラムを得た。
実施例１の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムを図１０に示す。また、比較例１の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムを図１１に示す。図中、（Ａ）は測定用対照試料の蛍光強度と側方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｂ）は測定用試料の蛍光強度と側方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｃ）は測定用対照試料の蛍光強度と前方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｄ）は測定用試料の蛍光強度と前方散乱光強度との関係を調べた結果を示す。
図１０に示された結果から、実施例１の測定用試料のスキャッタグラムの右下の部分にクラスターが見られるのに対し、実施例１の測定用対照試料のスキャッタグラムではクラスターが見られないことがわかった。実施例１の測定用試料では、ＮＥＴｓが引き起こされている。したがって、図１０において、実施例１の測定用試料のスキャッタグラムの右下の部分のクラスターＡは、ＮＥＴｓを放出した後の粒子のクラスターであることが示唆された。通常、健常者の末梢血の白血球の大部分は、リンパ球および好中球である。リンパ球は、側方散乱光強度が好中球よりも低いことが知られている。図１０において、実施例１の測定用試料のスキャッタグラムの左上の部分のクラスターＢは、小さい側方散乱光強度を有する粒子がまとまった集団であるため、リンパ球のクラスターであることが示唆された。また、実施例１の測定用試料のスキャッタグラムの右上の部分のクラスターＣは、大きい側方散乱光強度を有するまとまった集団であるため、ＮＥＴｓを放出していない好中球のクラスターであることが示唆された。これらの結果から、ＮＥＴｓを放出していない好中球の蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球の散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子のクラスターは、ＮＥＴｓを放出した後の粒子のクラスターであることがわかった。
一方、図１１に示された結果から、比較例１の測定用試料のスキャッタグラムと測定用対照試料のスキャッタグラムとの間には、ほぼ差がないことがわかった。したがって、比較例１の測定用試料および測定用対照試料では、好中球などの血液細胞に損傷が与えられておらず、核酸染色性蛍光色素を好中球などの血液細胞に導入されていないことが示唆された。
図１０および図１１それぞれのスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合を式（ＸＶ）：
〔目的位置に出現する粒子の割合〕
＝〔［目的位置に出現する粒子の数］÷［スキャッタグラム中の全粒子の数］〕
（ＸＶ）
にしたがって求めた。なお、目的位置として、ＮＥＴｓを放出していない好中球の蛍光強度よりも小さい蛍光強度を示し、かつリンパ球の散乱光強度よりも大きい散乱光強度を示す位置を用いた。
実施例１の測定用試料、実施例１の測定用対照試料、比較例１の測定用試料および比較例１の測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合を調べた結果を図１２に示す。図中、レーン１は実施例１の測定用試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合、レーン２は実施例１の測定用対照試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合、レーン３は比較例１の測定用試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合、レーン４は比較例１の測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の割合を示す。
図１２に示された結果から、好中球の細胞膜に損傷を与えて核酸染色性蛍光色素を導入した実施例１では、比較例１と比べ、目的位置に出現する粒子の割合が高いことがわかった。したがって、これらの結果から、好中球の細胞膜に損傷を与えて核酸染色性蛍光色素を導入することにより、高精度にＮＥＴｓを検出できることが示唆された。
（実施例２〜９および比較例２〜５）
健常者末梢血およびＰＭＡを含む混合物１７μＬと、核酸染色性蛍光色素〔サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製、商品名：Ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ ｓｔａｉｎ〕と、リン酸緩衝生理食塩水とを、浸透圧が２４９．７（実施例２）、２７２．４（実施例３）、３１７．８（実施例４）、３８５．９（実施例５）、５６７．５（実施例６）、８８５．３（実施例７）、１２０３．１（実施例８）、１６７９．８（実施例９）、１９７４．９（比較例２）、２８６０．２（比較例３）、３４７３．１（比較例４）または６６７３．８（比較例５）となるように混合したことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、実施例２〜９および比較例２〜５の測定用試料を得た。また、ＰＭＡを用いる代わりに精製水を用いたことを除き、実施例２〜９および比較例２〜５の測定用試料の調製と同様の操作を行ない、実施例２〜９および比較例２〜５の測定用対照試料を得た。
フローサイトメータを用いて測定用試料および測定用対照試料それぞれに含まれる核酸からの蛍光および散乱光を測定し、スキャッタグラムを得た。ＮＥＴｓの検出感度を式（ＸＶＩ）：
〔ＮＥＴｓの検出感度〕
＝〔［目的位置に出現する粒子の数Ａ］÷［目的位置に出現する粒子の数Ｂ］〕
（ＸＶＩ）
（式中、［目的位置に出現する粒子の数Ａ］は測定用試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の数、［目的位置に出現する粒子の数Ｂ］は測定用対照試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の数を示す。）
にしたがって求めた。目的位置に出現する粒子の数Ａおよび目的位置に出現する粒子の数Ｂは、式（ＸＶ）にしたがって求めた。
実施例２〜９および比較例２〜５それぞれの測定用試料および測定用対照試料を用い、浸透圧と、ＮＥＴｓの検出感度との関係を調べた結果を表１に示す。
表１に示された結果から、測定用試料の浸透圧が２４５〜１６８０ｈＰａである場合、感度が１．８を超えていることがわかった。これらの結果から、測定用試料の浸透圧が２４５〜１６８０ｈＰａである場合、高精度にＮＥＴｓを検出できることが示唆された。
（実施例１０）
第１試薬として染色剤〔シスメックス（株）製の商品名：ストマトライザー４ＤＳ〕を用いた。また、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドと、ポリオキシエチレン（３０）セチルエーテルと、フタル酸水素カリウムと、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩とを表２に示される組成となるように精製水に添加して混合物を得た。水酸化ナトリウムを用い、得られた混合物のｐＨをｐＨ６．０になるように調整して第２試薬を得た。末梢血２０μＬと第１試薬２０μＬと第２試薬１０００μＬとを混合した。得られた混合物を４０℃で２０秒間インキュベーションして測定用試料（浸透圧：２６３３．２ｈＰａ）を得た。
フローサイトメータを用いて測定用試料および測定用対照試料それぞれに含まれる核酸からの蛍光および散乱光を測定し、スキャッタグラムを得た。
実施例１０の測定用試料および測定用対照試料それぞれのスキャッタグラムを図１３に示す。図中、（Ａ）は測定用対照試料の蛍光強度と側方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｂ）は測定用試料の蛍光強度と側方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｃ）は測定用対照試料の蛍光強度と前方散乱光強度との関係を調べた結果、（Ｄ）は測定用試料の蛍光強度と前方散乱光強度との関係を調べた結果を示す。
図１３に示された結果から、ＮＥＴｓを放出した後の粒子のクラスターと、他のクラスターとを明確に判別できることがわかった。したがって、生体試料と核酸染色性蛍光色素と界面活性剤とを、浸透圧が２６３３．２ｈＰａ以下となるように混合することにより、ＮＥＴｓをより高精度に検出できることがわかった。
１０ 分析装置
２０ 測定ユニット
３０ 情報処理ユニット
３１ 算出部
３２ 表示部
３３ 入力部
９０ チャンバー
１００ 試料調製部
１１１ 生体試料搬送部
１１２ 第１試薬搬送部
１１３ 第２試薬搬送部
１３１ 測定用試料搬送部
２００ 検出部
２０１ 光照射部
２０２ 受光部
２０２ａ 前方散乱光受光部
２０２ｂ 側方散乱光受光部
２０２ｃ 蛍光受光部
２０３ シースフロー部
２１１ 光源
２１２ コリメータレンズ
２１３ コンデンサレンズ
２１４ ビームストッパ
２２１ 前方集光レンズ
２２２ ピンホール
２２３ フォトダイオード
２２４ 側方集光レンズ
２２５ ダイクロイックミラー
２２６ フォトダイオード
２２７ 分光フィルタ
２２８ アバランシェフォトダイオード
２３１ フローセル
３００ 試薬収容部
３０１ 第１容器
３０２ 第２容器
４００ 生体試料収容部
４０１ 生体試料容器
５００ 制御部
５０１ ＣＰＵ
５０２ 記憶部
６０１ ＣＰＵ
６０２ 記憶部
８００ 試薬キット
８０１ 第１試薬
８０２ 容器
８０３ 第２試薬
８０４ 容器
８０５ 添付文書
８０６ 箱

Claims (16)

  1. （Ａ）血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する工程、
    （Ｂ）前記測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
    （Ｃ）前記蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する工程、
    を含み、
    工程（Ａ）において、前記好中球の細胞膜に損傷を与え、前記核酸染色性蛍光色素を導入して測定用試料を調製する試料分析方法。
  2. 工程（Ａ）において、前記好中球の細胞膜に損傷を与え、前記核酸染色性蛍光色素を導入することにより、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度を好中球細胞外トラップ放出後の粒子から得られる蛍光強度より大きくする請求項１に記載の試料分析方法。
  3. 工程（Ｂ）において、前記測定用試料に光を照射して得られる散乱光情報をさらに取得する請求項１または２に記載の試料分析方法。
  4. 前記散乱光情報が、側方散乱光情報である請求項３に記載の試料分析方法。
  5. 工程（Ｃ）において、リンパ球から得られる散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子を、前記好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する請求項３または４に記載の試料分析方法。
  6. 前記工程（Ｂ）において、フローサイトメータによって前記蛍光情報を取得する請求項１〜５のいずれか１項に記載の試料分析方法。
  7. 前記工程（Ａ）において、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素とを、浸透圧が２４５ｈＰａ以上１６８０ｈＰａ以下になるように混合し、前記測定用試料を調製する請求項１〜６のいずれか１項に記載の試料分析方法。
  8. 前記工程（Ａ）において、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素と界面活性剤とを、浸透圧が２６３５ｈＰａ以下になるように混合し、前記測定用試料を調製する請求項１〜６のいずれか１項に記載の試料分析方法。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の方法に用いられる試料分析装置であって、
    血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製するための試料調製部と、
    前記測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得するための検出部と、
    前記検出部によって取得された蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出するための情報処理部と、
    を備える試料分析装置。
  10. 前記検出部は、前記測定用試料に光を照射して得られる散乱光情報をさらに取得する請求項９に記載の試料分析装置。
  11. 前記散乱光情報が、側方散乱光情報である請求項１０に記載の試料分析装置。
  12. 前記情報処理部は、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球から得られる散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子を前記好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する請求項１０または１１に記載の試料分析装置。
  13. 前記試料調製部は、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素とを、浸透圧が２４５〜１６８０ｈＰａになるように混合し、前記測定試料を調製する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の試料分析装置。
  14. 前記試料調製部は、前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素と界面活性剤とを、浸透圧が２６３５ｈＰａ以下となるように混合し、前記測定試料を調製する請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の試料分析装置。
  15. 前記核酸染色性蛍光色素を含有し、請求項１〜８のいずれか１項に記載の試料分析方法に用いるための試薬。
  16. 界面活性剤をさらに含有する請求項１５に記載の試薬。
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