JP6738652B2 - 試料分析方法、試料分析装置および試薬 - Google Patents
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Description
(B)測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
(C)蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップとして検出する工程、
を含む。
本明細書において、「X〜Y」のように、端点による数値範囲の記載は、各範囲内に含まれるすべての数および有理数ならびに記載されている端点を含む。
本実施形態に係る試料分析方法は、(A)血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する工程、
(B)測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
(C)蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップとして検出する工程、
を含む。本実施形態に係る試料分析方法は、例えば、後述の試料分析装置、後述の試薬などを用いることによって行なうことができる。
(A−1)少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤とを、浸透圧が245hPa以上1680hPa以下になるように混合することを含む手法
(A−2)少なくとも生体試料と核酸染色性蛍光色素と界面活性剤と浸透圧調整剤とを、浸透圧が2635hPa以下になるように混合することを含む手法
(A−3)電気穿孔、レーザ穿孔などの物理的手法
で表わされる界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
で表わされる界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
で表わされるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤などが挙げられるが、特に限定されない。
前述した試料分析方法に用いられる試料分析装置(以下、単に「分析装置」ともいう)の一例を、添付の図面に基づき説明する。図2に示されるように、分析装置10は、測定ユニット20と、情報処理ユニット30とを含む。測定ユニット20と情報処理ユニット30とは、通信可能に接続されている。
図2に示されるように、測定ユニット20は、試料調製部100と、検出部200と、試薬収容部300と、生体試料が収容された生体試料収容部400と、制御部500とを含む。
情報処理ユニット30は、図2に示されるように、算出部31と、表示部32と、入力部33とを含む。情報処理ユニット30は、検出部200によって取得された蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップとして検出する。本実施形態において、情報処理ユニット30は、コンピュータシステムによって構成されている。算出部31は、CPU601と、記憶部602とを含む。CPU601は、記憶部602に記憶されたコンピュータプログラムを実行する。表示部32としては、例えば、スクリーンディスプレイなどが挙げられるが、特に限定されない。表示部32は、例えば、好中球細胞外トラップの有無などの情報などを表示する。入力部33としては、例えば、キーボード、マウスなどが挙げられるが、特に限定されない。
つぎに、図4に基づき、分析装置10の処理手順の概要を説明する。以下の処理手順においては、測定ユニット20の制御部500は、記憶部502から取得した試薬識別情報および試料調製情報を用い、記憶部502に記憶された測定用試料の調製のためのコンピュータプログラムを実行する。また、制御部500は、記憶部502に記憶された測定用試料に関する蛍光情報および散乱光情報の取得のためのコンピュータプログラムを実行する。情報処理ユニット30の算出部31は、取得された光学的情報を用い、記憶部602に記憶された好中球細胞外トラップの検出のためのコンピュータプログラムを実行する。
つぎに、図5および図6に基づき、分析装置10による測定用試料調製工程の処理手順の概要を説明する。測定用試料調製工程は、前述の試料分析方法の工程(A)に対応する。
つぎに、図7に基づき、分析装置10による蛍光および散乱光の測定工程の処理手順の概要を説明する。測定工程は、前述の試料分析方法の工程(B)に対応する。
つぎに、図8に基づき、分析装置10による好中球細胞外トラップの検出工程の処理手順の概要を説明する。検出工程は、前述の試料分析方法の工程(C)に対応する。
生体試料への第1試薬および第2試薬の添加は、第1試薬の添加および第2試薬の添加の順で行なわれてもよい。具体的には、ステップS104およびステップS105の一連のステップの後、ステップS106およびステップS107の一連のステップを実行してもよい。生体試料への第1試薬および第2試薬の添加は、第2試薬の添加および第1試薬の添加の順で行なわれてもよい。具体的には、ステップS106およびステップS107の一連のステップの後、ステップS104およびステップS105の一連のステップを実行してもよい。第1試薬および第2試薬の代わりに、核酸染色性蛍光色素と浸透圧調整剤と界面活性剤とを含む試薬を用いてもよい。
本実施形態に係る試薬は、前述の試料分析方法に用いるための試薬である。本実施形態に係る試薬は、浸透圧調整剤と、核酸染色性蛍光色素とを含有する。
PMA:ホルボール−12−ミリスタート−13−アセタート
NETs:好中球細胞外トラップ
健常者末梢血1000μLに、PMAを終濃度が162nMになるように混合した。得られた混合物を室温(25℃)で3時間静置することにより、NETsを引き起こした。得られた混合物17μLと、細胞膜を透過しない核酸染色性蛍光色素〔サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製、商品名:Sytox green stain〕1μLと、リン酸緩衝生理食塩水〔組成:10mMリン酸緩衝液(pH7.4)および150mM塩化ナトリウム〕とを、浸透圧が317.8hPaになるように混合した。これにより、末梢血に含まれる好中球などの血液細胞の細胞膜に損傷を与え、損傷部位から核酸染色性蛍光色素を好中球などの血液細胞内に導入した。得られた試料を実施例1の測定用試料とした。また、PMAを用いる代わりに精製水を用いたことを除き、実施例1の測定用試料の調製と同様の操作を行ない、実施例1の測定用対照試料を得た。
〔目的位置に出現する粒子の割合〕
=〔[目的位置に出現する粒子の数]÷[スキャッタグラム中の全粒子の数]〕
(XV)
にしたがって求めた。なお、目的位置として、NETsを放出していない好中球の蛍光強度よりも小さい蛍光強度を示し、かつリンパ球の散乱光強度よりも大きい散乱光強度を示す位置を用いた。
健常者末梢血およびPMAを含む混合物17μLと、核酸染色性蛍光色素〔サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)製、商品名:Sytox green stain〕と、リン酸緩衝生理食塩水とを、浸透圧が249.7(実施例2)、272.4(実施例3)、317.8(実施例4)、385.9(実施例5)、567.5(実施例6)、885.3(実施例7)、1203.1(実施例8)、1679.8(実施例9)、1974.9(比較例2)、2860.2(比較例3)、3473.1(比較例4)または6673.8(比較例5)となるように混合したことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、実施例2〜9および比較例2〜5の測定用試料を得た。また、PMAを用いる代わりに精製水を用いたことを除き、実施例2〜9および比較例2〜5の測定用試料の調製と同様の操作を行ない、実施例2〜9および比較例2〜5の測定用対照試料を得た。
〔NETsの検出感度〕
=〔[目的位置に出現する粒子の数A]÷[目的位置に出現する粒子の数B]〕
(XVI)
(式中、[目的位置に出現する粒子の数A]は測定用試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の数、[目的位置に出現する粒子の数B]は測定用対照試料のスキャッタグラムにおける目的位置に出現する粒子の数を示す。)
にしたがって求めた。目的位置に出現する粒子の数Aおよび目的位置に出現する粒子の数Bは、式(XV)にしたがって求めた。
第1試薬として染色剤〔シスメックス(株)製の商品名:ストマトライザー4DS〕を用いた。また、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドと、ポリオキシエチレン(30)セチルエーテルと、フタル酸水素カリウムと、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩とを表2に示される組成となるように精製水に添加して混合物を得た。水酸化ナトリウムを用い、得られた混合物のpHをpH6.0になるように調整して第2試薬を得た。末梢血20μLと第1試薬20μLと第2試薬1000μLとを混合した。得られた混合物を40℃で20秒間インキュベーションして測定用試料(浸透圧:2633.2hPa)を得た。
20 測定ユニット
30 情報処理ユニット
31 算出部
32 表示部
33 入力部
90 チャンバー
100 試料調製部
111 生体試料搬送部
112 第1試薬搬送部
113 第2試薬搬送部
131 測定用試料搬送部
200 検出部
201 光照射部
202 受光部
202a 前方散乱光受光部
202b 側方散乱光受光部
202c 蛍光受光部
203 シースフロー部
211 光源
212 コリメータレンズ
213 コンデンサレンズ
214 ビームストッパ
221 前方集光レンズ
222 ピンホール
223 フォトダイオード
224 側方集光レンズ
225 ダイクロイックミラー
226 フォトダイオード
227 分光フィルタ
228 アバランシェフォトダイオード
231 フローセル
300 試薬収容部
301 第1容器
302 第2容器
400 生体試料収容部
401 生体試料容器
500 制御部
501 CPU
502 記憶部
601 CPU
602 記憶部
800 試薬キット
801 第1試薬
802 容器
803 第2試薬
804 容器
805 添付文書
806 箱
Claims (16)
- (A)血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製する工程、
(B)前記測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得する工程、および
(C)前記蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する工程、
を含み、
工程(A)において、前記好中球の細胞膜に損傷を与え、前記核酸染色性蛍光色素を導入して測定用試料を調製する試料分析方法。 - 工程(A)において、前記好中球の細胞膜に損傷を与え、前記核酸染色性蛍光色素を導入することにより、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度を好中球細胞外トラップ放出後の粒子から得られる蛍光強度より大きくする請求項1に記載の試料分析方法。
- 工程(B)において、前記測定用試料に光を照射して得られる散乱光情報をさらに取得する請求項1または2に記載の試料分析方法。
- 前記散乱光情報が、側方散乱光情報である請求項3に記載の試料分析方法。
- 工程(C)において、リンパ球から得られる散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子を、前記好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する請求項3または4に記載の試料分析方法。
- 前記工程(B)において、フローサイトメータによって前記蛍光情報を取得する請求項1〜5のいずれか1項に記載の試料分析方法。
- 前記工程(A)において、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素とを、浸透圧が245hPa以上1680hPa以下になるように混合し、前記測定用試料を調製する請求項1〜6のいずれか1項に記載の試料分析方法。
- 前記工程(A)において、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素と界面活性剤とを、浸透圧が2635hPa以下になるように混合し、前記測定用試料を調製する請求項1〜6のいずれか1項に記載の試料分析方法。
- 請求項1〜8のいずれかに記載の方法に用いられる試料分析装置であって、
血液細胞を含む生体試料中の好中球細胞外トラップを放出していない好中球中に含まれる核酸を核酸染色性蛍光色素により染色して測定用試料を調製するための試料調製部と、
前記測定用試料に光を照射して得られる蛍光情報を取得するための検出部と、
前記検出部によって取得された蛍光情報に基づいて、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有する粒子を、好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出するための情報処理部と、
を備える試料分析装置。 - 前記検出部は、前記測定用試料に光を照射して得られる散乱光情報をさらに取得する請求項9に記載の試料分析装置。
- 前記散乱光情報が、側方散乱光情報である請求項10に記載の試料分析装置。
- 前記情報処理部は、好中球細胞外トラップを放出していない好中球から得られる蛍光強度よりも小さい蛍光強度を有し、かつリンパ球から得られる散乱光強度よりも大きい散乱光強度を有する粒子を前記好中球細胞外トラップ放出後の粒子として検出する請求項10または11に記載の試料分析装置。
- 前記試料調製部は、少なくとも前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素とを、浸透圧が245〜1680hPaになるように混合し、前記測定試料を調製する請求項10〜12のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 前記試料調製部は、前記生体試料と前記核酸染色性蛍光色素と界面活性剤とを、浸透圧が2635hPa以下となるように混合し、前記測定試料を調製する請求項10〜12のいずれか1項に記載の試料分析装置。
- 前記核酸染色性蛍光色素を含有し、請求項1〜8のいずれか1項に記載の試料分析方法に用いるための試薬。
- 界面活性剤をさらに含有する請求項15に記載の試薬。
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