CN107436296A - 试样分析方法、试样分析装置及试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种试样分析方法，能够高精度地检测出中性粒细胞胞外陷阱，其包括以下步骤：通过核酸染色性荧光色素对含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸进行染色，制备测定用试样；获取用光照射测定用试样所得到的荧光信息；根据荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱；本发明还提供一种与所述方法相对应的试样分析装置，以及一种含有渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素的、用于所述试样分析方法的试剂。

Description

试样分析方法、试样分析装置及试剂
技术领域
本发明涉及一种试样分析方法、试样分析装置及试剂。
背景技术
中性粒细胞胞外陷阱是为除掉血液或组织中的病原体而从中性粒细胞释放出的网状的结构体。中性粒细胞胞外陷阱包含颗粒蛋白和染色质纤维。关于检测中性粒细胞胞外陷阱的方法，瓦利德（Walid M.Al-Ghoul）等人合著的《基于NETosis和其他炎症/氧化标记物定量分析的辛伐他汀抗炎作用的证据》(Evidence for simvastatin anti-inflammatory actions based on quantitative analyses of NETosis and otherinflammation/oxidation markers)、 《Results in Immunology 》杂志中记述了一种使用流式细胞技术的方法。
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，本申请发明人发现，瓦利德（Walid M.Al-Ghoul）等人合著的《基于NETosis和其他炎症/氧化标记物定量分析的辛伐他汀抗炎作用的证据》(Evidence for simvastatinanti-inflammatory actions based on quantitative analyses of NETosis and otherinflammation/oxidation markers)、 《Results in Immunology》中记述的技术之下，未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞和中性粒细胞胞外陷阱的分离灵敏度低，在散点图中，常规的中性粒细胞和中性粒细胞胞外陷阱很难分别形成独立的聚簇。
本发明提供一种能够高精度检测中性粒细胞胞外陷阱的新方式。
解决技术问题的手段
本发明第一技术方案涉及的试样分析方法包括以下步骤：（A）通过核酸染色性荧光色素对含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸进行染色，制备测定用试样；（B）获取用光照射测定用试样所得到的荧光信息；（C）根据荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。
本发明第二技术方案涉及的试样分析装置含有：试样制备部件，通过核酸染色性荧光色素染色含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸，制备测定用试样；检测部件，获取用光照射测定用试样所得到的荧光信息；信息处理部件，根据检测部件所获取的荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中得到的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。
本发明第三技术方案涉及的试剂含有渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素，是一种用于上述试样分析方法的试剂。
发明效果
本发明能够提供一种能高精度检测出中性粒细胞胞外陷阱的新方式。
附图说明
图1为通过试样分析方法得到的含中性粒细胞胞外陷阱的生物试样的散点图的示意图；
图2为试样分析装置的整体结构框图；
图3为试样分析装置的检测部件的结构示意图；
图4为试样分析装置检测中性粒细胞胞外陷阱的处理步骤流程图；
图5为试样分析装置处理步骤的流程图；
图6为试样分析装置制备测定用试样的处理步骤流程图；
图7为试样分析装置测定荧光和散射光的处理步骤流程图；
图8为试样分析装置检测中性粒细胞胞外陷阱的处理步骤流程图；
图9为试剂盒的结构说明图；
图10为实施例1的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图；
图11为比较例1的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图；
图12为实施例1的测定用试样、实施例1的测定用对照试样、比较例1的测定用试样和比较例1的测定用对照试样各自的散点图中的目标位置所出现的的粒子的比例示图；
图13为实施例10的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图。
具体实施方式
1.用语说明
在本说明书中，如“X~Y”这一类的用端点表示的数值范围包含各范围内所含的所有数值和有理数以及所列出的端点。
在本说明书中，“中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子”指中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱后的残渣粒子。
2.试样分析方法
本实施方式涉及的试样分析方法包括以下步骤：（A）通过核酸染色性荧光色素染色含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸，制备测定用试样；（B）获取用光照射测定用试样所得到的荧光信息；（C）根据荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。比如，通过后述试样分析装置和后述试剂等就能实施本实施方式涉及的试样分析方法。
已知中性粒细胞胞外陷阱对防止细菌等的感染有重要作用，对血栓、癌转移和自身免疫疾病等也有重要作用。因此，检测出样本中有无中性粒细胞胞外陷阱具有其临床意义。比如，在移植脏器、骨髓等细胞后进行免疫抑制时，如果发现患者血液中产生中性粒细胞胞外陷阱的话，就能在恰当时机使用类固醇等，进行治疗以防止过度的炎症。本实施方式涉及的试样分析方法在步骤（A）中能够通过以下操作很好地形成中性粒细胞胞外陷阱释放后粒子的聚簇。因此能够高精度地检测出样本中中性粒细胞胞外陷阱的存在。还能高精度地计数样本中中性粒细胞胞外陷阱的数目。具体而言，在步骤（A），通过核酸染色性荧光色素对含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸进行染色。通过步骤（A）获得测定用试样。中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子由于中性粒细胞胞外陷阱的释放而实质上不含染色质。因此，中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子几乎不会被核酸染色性荧光色素染色。因此，在测定用试样中，中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子的荧光强度和未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中的荧光强度的差与不染色未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞时相比有所增大，更易于明确区分。
生物试样是含有血液细胞的试样。生物试样例如有血液、骨髓液、肺清洗液等，对其不作特别限定。在这些生物试样中，以血液、骨髓液、肺清洗液为宜。血液细胞如有白细胞、红细胞和血小板。白细胞如有中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞。
步骤（A）能够破坏中性粒细胞的细胞膜并导入核酸染色性荧光色素，制备测定用试样。在步骤（A），破坏中性粒细胞的细胞膜并导入核酸染色性荧光色素的话，通过核酸染色性荧光色素就能使中性粒细胞中所含有的核酸更加切实地被染色。
在步骤（A），破坏中性粒细胞的细胞膜并导入核酸染色性荧光色素，这样就能使从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度大于从中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子获得的荧光强度。以此就能更加明确地区分中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子和未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞。
在步骤（A），破坏中性粒细胞细胞膜的作业和导入核酸染色性荧光色素的作业既可以同时进行，也可以按照顺序先破坏中性粒细胞细胞膜之后再导入核酸染色性荧光色素。
中性粒细胞的细胞膜被破坏部分的大小只要能导入核酸染色性荧光色素即可。破坏中性粒细胞细胞膜的作业例如可以通过（A-1）~（A-3）等方法来进行。（A-1）的方法包括：至少混合生物试样和核酸染色性荧光色素及渗透压调整剂并使渗透压在245hPa以上1680hPa以下；（A-2）的方法包括：至少混合生物试样、核酸染色性荧光色素、表面活性剂和渗透压调整剂并使渗透压在2635hPa以下；（A-3）电穿孔、激光穿孔等物理方法。
在方法（A-1）中，至少混合生物试样和核酸染色性荧光色素及渗透压调整剂并使测定用试样的渗透压在245hPa以上1680hPa以下。以此破坏生物试样中所含中性粒细胞的细胞膜，从细胞膜的被破坏部分将核酸染色性荧光色素导入中性粒细胞内。
核酸染色性荧光色素例如有：碘化丙啶、溴化乙锭、乙锭－吖啶异质二聚体、乙锭二叠氮化物、乙锭同型二聚体－１、乙锭同型二聚体－２、乙锭单叠氮化物、三亚甲基双［［３‐［［４‐［［（３‐甲基苯并噻唑‐３‐鎓）‐２‐基］亚甲基］‐１，４‐二氢喹啉］‐１‐基］丙基］二甲基铵］・四碘化物（ＴＯＴＯ-１）、４‐［（３‐甲基苯并噻唑‐２（３Ｈ）‐亚基）甲基］‐１‐［３‐（三甲基氨基）丙基］喹啉鎓・二碘化物（ＴＯ-ＰＲＯ-１）、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'‐四甲基‐Ｎ，Ｎ'‐双［３‐［４‐［３‐［（３‐甲基苯并噻唑‐３‐鎓）‐２‐基］‐２‐亚丙烯基］‐１，４‐二氢喹啉‐１‐基］丙基］‐１，３‐丙烷二铵・四碘化物（ＴＯＴＯ-３）、２‐［３‐［［１‐［３‐（三甲基氨基）丙基］‐１，４‐二氢喹啉］‐４‐亚基］‐１‐丙烯基］‐３‐甲基苯并噻唑‐3‐鎓・二碘化物（ＴＯ-ＰＲＯ-３）、式（I）~（XI）所示荧光色素等，对其不作特别限定。
（式（I）所示的荧光色素）
【化1】
（式中，R1及R4分别独立地表示氢原子、可以有取代基的烷基或可以有取代基的苄基，R2及R3分别独立地表示氢原子、羟基、卤原子、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基磺酰基或苯基，Z表示硫原子、氧原子、可以有取代基的亚烷基，m为0~3的自然数，X-为阴离子。）
另外，在式（I）中，当R1和R4其中之一为碳原子数6~18的烷基时，另一者宜为氢原子或碳原子数不足6的烷基。碳原子数6~18的烷基中以碳原子数为6、8或10的烷基为宜。烷基的取代基例如有羟基、醚基、酯基等，对其不作特别限定。在R1及R4中，苄基的取代基如有碳原子数1~20的烷基、碳原子数2~20的烯基、碳原子数2~20的炔基等，对其不作特别限定。苄基的取代基中以甲基和乙基为宜。关于R2及R3，烯基如有碳原子数2~20的烯基。关于R2及R3，烷氧基如有碳原子数1~20的烷氧基。在这些烷氧基中，以甲氧基和乙氧基为宜。在R2及R3中，亚烷基的碳原子数是1或2。亚烷基的取代基如有亚甲基和亚乙基。在X-中，阴离子例如有氟离子、氯离子、溴离子、碘离子等的卤素离子；三氟甲磺酸根离子（CF3SO3 -）、氟硼酸根离子（BF4 -）等，对其不作特别限定。
（式（II）所示的荧光色素）
【化２】
（式中，R5和R6表示低级烷基，X-表示阴离子，Z表示硫原子、氧原子或可以有取代基的亚烷基，n表示1或2）。式（II）中，R5和R6可以彼此相同，也可以不同。式（II）的“低级烷基”是碳原子数1~6的烷基。碳原子数1~6的烷基例如有甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，对其不作特别限定。在这些烷基中，以甲基和乙基为宜。式（II）中的可以有取代基的亚烷基与式（I）中可以有取代基的亚烷基相同。此外，在Z中以硫原子为宜。X-的阴离子如有：卤素离子；氟硼酸根离子(BF4 -)、氯硼酸根离子（BCl4 -)、溴硼酸根离子(BBr4 - )等卤硼酸根离子；磷化合物离子；卤素含氧酸离子；氟代硫酸离子；甲基硫酸离子；有卤代芳香环或卤代烷基作为取代基的是苯基硼酸根离子等，对其不作特别限定。在这些阴离子中，以碘离子为宜。在式（II）所示荧光色素中，以式（IIa）所示荧光色素NK-321为宜。
【化3】
（式（III）所示荧光色素）
【化4】
（式中，R7和R8表示低级烷基，X-表示阴离子， n表示1或2）。式（III）中的低级烷基和阴离子与式（II）中的低级烷基和阴离子相同。
在式（III）所示荧光色素中，以式（IIIa）所示荧光色素为宜：
【化5】
（式（IV）所示的荧光色素）
【化6】
（式中，R9表示氢原子或低级烷基，R10和R11分别独立表示氢原子、低级烷基或低级烷氧基，R12表示氢原子、酰基或低级烷基，R13表示氢原子或可以有取代基的低级烷基，Z表示硫原子、氧原子、可以有取代基的亚烷基，X-表示阴离子，n表示1或2）。
式（IV）中的低级烷基、阴离子和可以有取代基的亚烷基与式（I）中的低级烷）基、阴离子和可以有取代基的亚烷基相同。低级烷氧基为碳原子数1~6的烷氧基。碳原子数1~6的烷氧基如有甲氧基、乙氧基、丙氧基等，对其不作特别限定。这些碳原子数1~6的烷氧基中以甲氧基和乙氧基为宜。酰基宜为从脂肪族羧酸衍生的酰基。酰基例如有乙酰基、丙酰基等，对其不作特别限定。在这些酰基中以乙酰基为宜。关于可以有取代基的低级烷基，低级烷基的取代基如有氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等卤原子；羟基等，对其不作特别限定。可以有取代基的低级烷基可以有1~3个取代基。可以有取代基的低级烷基中以有1个羟基的低级烷基为宜。另外，Z宜为硫原子。X-宜为溴离子或氟硼酸根离子（BF4 -)。
式（IV）所示荧光色素中以式（IVa）~(IVc)所示荧光色素为宜。
【化7】
【化8】
【化9】
（式（V）所示的荧光色素）
【化10】
（式中，A-和Q-分别独立表示氯离子(Cl-)或碘离子（Ｉ-））。
（式（VI）所示的荧光色素）
【化11】
（式（VII）所示的荧光色素NK-1570）
【化12】
（式（VIII）所示的荧光色素NK-1049）
【化13】
（式（IX）所示的荧光色素NK-98）
【化14】
（式（X）所示的荧光色素NK-141）
【化15】
（式（XI)所示的荧光色素NK-321）
【化16】
在这些核酸染色性荧光色素中，以式（XI）所示荧光色素NK-321为宜。
核酸染色性荧光色素可以溶解于适当的溶剂中使用。溶剂如有水、有机溶剂、上述物质的混合物等，对其不作特别限定。有机溶剂如有乙醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、二甲基亚砜等，对其不作特别限定。
与生物试样混合的核酸染色性荧光色素的量足够染色血液细胞中所含有的核酸即可。也可以使与生物试样混合的核酸染色性荧光色素的量相对于血液细胞所含有的核酸来说过剩。通常，要充分染色血液细胞中所含有的核酸的话，相对于悬浊于1mL等渗溶液的血液细胞——即104个白细胞或105个红细胞来说，核酸染色性荧光色素的量以0.5μＭ以上为宜，1μＭ以上更佳。
渗透压调整剂如有调整测定用试样的渗透压的试剂，例如糖、氨基酸、氯化钠等溶解于溶剂所得到的溶液；以及有机溶剂等，对其不作特别限定。糖例如有葡萄糖、果糖等单糖；树胶醛醣等多糖；木糖醇、山梨醇、甘露醇和核糖醇等糖醇等，对其不作特别限定。氨基酸例如有丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、缬氨酸等，对其不作特别限定。溶剂如有：水；磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液等缓冲液等，对其不作特别限定。有机溶剂例如有乙二醇、丙三醇等，对其不作特别限定。渗透压调整剂的具体例子如有磷酸缓冲生理盐水等，对其不作特别限定。
与生物试样混合的渗透压调整剂的量要使得测定用试样的渗透压在249hPa以上1680hPa以下的范围内。从提高中性粒细胞胞外陷阱的检测灵敏度的角度来说，测定用试样的渗透压要在249hPa以上，272hPa以上更佳，出于同样的考虑，其值应在1680hPa以下，568hPa以下更佳。在这种渗透压的影响下，中性粒细胞胞外陷阱会从中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子分离出来。
在方法（A-1）中，还可以在测定用试样中进一步添加芳香族有机酸。芳香族有机酸例如有邻苯二甲酸、苯甲酸、水杨酸、马尿酸、对氨基苯磺酸、苯磺酸、上述物质的盐等，对其不作特别限定。芳香族有机酸可以单独使用，也可以将二种以上混合使用。
在方法（A-1）中，从有效破坏中性粒细胞的细胞膜的角度来说，测定用试样的pH宜为5.0~9.0。测定用试样的pH例如可以通过氢氧化钠、盐酸等pH调节剂来进行调整。用缓冲液作为渗透压调整剂的溶剂时，可以通过渗透压调整剂调整测定用试样的pH。此外，在方法（A-1）中，使用芳香族有机酸时，可以通过芳香族有机酸调整测定用试样的pH。
在方法（A-1）中，为更有效地破坏中性粒细胞的细胞膜并导入核酸染色性荧光色素，也可以将生物试样、核酸染色性荧光色素、渗透压调整剂与任意的芳香族有机酸混合后，将测定用试样在２５～４１℃下培养0.25~3分钟。
在方法（A-1）中，也可以根据需要使用核酸染色性荧光色素和渗透压调整剂以外的助剂。助剂例如有pH调整剂等，对其不作特别限定。
在方法（A-2），至少混合生物试样、核酸染色性荧光色素、表面活性剂和渗透压调整剂并使得测定用试样的渗透压在2635hPa以下。以此，破坏生物试样中所含中性粒细胞等血液细胞的细胞膜，将核酸染色性荧光色素从被破坏部位导入中性粒细胞等血液细胞内。
方法（A-2）使用的核酸染色性荧光色素和渗透压调整剂与方法（A-1）使用的核酸染色性荧光色素和渗透压调整剂相同。方法（A-2）中与生物试样混合的核酸染色性荧光色素的量也与方法（A-1）中与生物试样混合的核酸染色性荧光色素的量相同。
与生物试样混合的渗透压调整剂的量要使测定用试样的渗透压在2635hPa以下的范围内。
表面活性剂有阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂等，对其不作特别限定。
阳离子表面活性剂例如有季铵盐型表面活性剂、吡啶盐型表面活性剂等，对其不作特别限定。季铵盐盐型表面活性剂例如有以下式（XII）所表示的表面活性剂等，对其不作特别限定：
【化17】
（式中，R14是碳原子数为6~18的烷基或碳原子数为6~18的烯基，R15及R16分别独立表示碳原子数为1~4的烷基或碳原子数为1~4的烯基，R17是碳原子数为1~4的烷基、碳原子数为1~4的烯基或者苄基，X-是卤原子，碳原子数合计为9~30）。
式（XII）中，R14中以碳原子数为6、8、10、12或14的烷基及碳原子数为6、8、10、12或14的烯基为宜，碳原子数为6、8、10、12或14的直链烷基更佳。R１4 的具体例子如有辛基、癸基、十二烷基等，对其不作特别限定。R15和R16 中以甲基、乙基和丙基为宜。R17中以甲基、乙基和丙基为宜。
吡啶盐型表面活性剂例如有以下式（XIII）中表示的表面活性剂等，对其不作特别限定：
【化18】
（式中，R18是碳原子数为6~18的烷基或碳原子数为6~18的烯基，X-是卤素离子）。
式（XIII）中，R18中以碳原子数为6、8、10、12或14的烷基和碳原子数为6、8、10、12或14的烯基为宜，碳原子数为6、8、10、12或14的直链烷基更佳。R18的具体例子如有辛基、癸基、十二烷基等，对其不作特别限定。
非离子表面活性剂例如有以下式（XIV）所示聚氧乙烯类非离子表面活性剂等，对其不作特别限定。
【化19】
（式中，R19为碳原子数8~25的烷基、碳原子数8~25的烯基或碳原子数8~25的炔基，R20为氧原子、酯键或苯醚基，o表示10~50的整数）。
非离子表面活性剂的具体例子有聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾醇、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚丙乙烯烷基醚等，对其不作特别限定。
这些表面活性剂可单独使用，也可以将二种以上混合使用。将二种以上表面活性剂混合使用时，表面活性剂的组合可以是以下任意组合：阳离子表面活性剂与非离子表面活性剂的组合、阳离子表面活性剂之间的相互组合、以及非离子表面活性剂之间的相互组合。
表面活性剂也可以是溶液形态。用于溶解表面活性剂的溶剂例如有水、有机溶剂、水与有机溶剂的混合物等，对其不作特别限定。有机溶剂例如有乙醇、乙二醇、二甲亚砜等，对其不作特别限定。
与生物试样混合的表面活性剂的量只要使测定用试样中表面活性剂的量达到一定量即可。当表面活性剂为阳离子表面活性剂时，测定用试样中表面活性剂的量通常宜为10~10000ppm，100~1000ppm更佳。当表面活性剂为非离子表面活性剂时，测定用试样中表面活性剂的量通常宜为10~100000ppm，为100~10000ppm更佳，1000~5000ppm更好。
在方法（A-2）中，测定用试样中还可以进一步添加芳香族有机酸。芳香族有机酸例如有邻苯二甲酸、苯甲酸、水杨酸、马尿酸、对氨基苯磺酸、苯磺酸、以及上述物质的盐等，对其不作特别限定。芳香族有机酸既可以单独使用，也可以将二种以上混合使用。
在方法（A-2）中，从有效破坏中性粒细胞的细胞膜的角度考虑，测定用试样的pH宜为5.0~9.0。测定用试样的pH例如可以通过氢氧化钠、盐酸等pH调节剂来进行调整。用缓冲液作为渗透压调整剂的溶剂时，可以通过渗透压调整剂调整测定用试样的pH。此外，在方法（A-2）中，使用芳香族有机酸时，可以通过芳香族有机酸调整测定用试样的pH。
在方法（A-2）中，为了更切实地破坏中性粒细胞的细胞膜并导入核酸染色性荧光色素，也可以生物试样、核酸染色性荧光色素、渗透压调整剂与任意的芳香族有机酸混合后，将测定用试样在25~41℃培养0.25~3分钟。
在方法（A-2）中，也可以根据需要使用核酸染色性荧光色素、表面活性剂和渗透压调整剂以外的助剂。助剂与方法（A-1）所用的助剂相同。
接着，在步骤（B）获取用光照射测定用试样所得到的荧光信息。例如可以用流式细胞仪来进行步骤（B）。
照射测定用试样的光可以根据所使用的核酸染色性荧光色素的种类来适当选择。
荧光信息是从被核酸染色性荧光色素染色的核酸获得的信息。荧光信息例如有荧光强度等，对其不作特别限定。荧光强度会随着被核酸染色性荧光色素染色的核酸量的增加而变大。荧光强度的差可以用于分类白细胞、判断是否出现中性粒细胞胞外陷阱等。
在步骤（B）还能够获取光照测定用试样所得到的散射光信息。散射光信息有前向散射光信息和侧向散射光信息。散射光是在诸如血细胞等的粒子作为障碍物存在于光的行进方向的情况下光因粒子而改变其行进方向而产生的。检测出散射光就能获得粒子大小和材质的相关信息。从前向散射光中能够获得血液细胞等粒子的大小的相关信息。此外，从侧向散射光中能够获得粒子内部的信息。通过激光照射细胞所产生的侧向散射光的强度反映细胞内部的复杂程度，如细胞核的形状、细胞核的大小、密度、颗粒量等。因此，上述散射光的强度能够用于分类白细胞等。从更切实分类中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子的角度考虑，散射光信息宜为侧向散射光信息。
然后，在步骤（C），根据荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。具体而言，例如能够实现的是：检测出荧光强度小于未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞的聚簇中荧光强度平均值的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子。此外，还能实现的是：检测出荧光强度小于未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞的聚簇中的荧光强度的众数的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子。
在步骤（B）中进一步获取了散射光信息的情况下，在步骤（C）中能够根据荧光信息和散射光信息检测出中性粒细胞胞外陷阱。此时，在步骤（C）能够实现的是：检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度，且散射光强度大于从淋巴细胞获得的散射光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子。具体而言，例如，能够实现的是：检测出荧光强度小于未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞的聚簇的荧光强度平均值，且散射光强度大于淋巴细胞的聚簇的散射光强度平均值的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子。此外还能够实现的是：检测出荧光强度小于未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞的聚簇的荧光强度的众数，且散射光强度大于淋巴细胞的聚簇的散射光强度众数的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子。
当使用通过流式细胞术得到的散点图时，散点图上如图1所示出现检测区域A1、检测区域A2和检测区域A3。检测区域A1是中性粒细胞胞外陷阱释放后的粒子的聚簇出现的区域。检测区域A2是未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞的聚簇出现的区域。检测区域A3是淋巴细胞的聚簇出现的区域。检测区域A1显示小于检测区域A2的荧光强度的荧光强度。此外，检测区域A1显示大于检测区域A3的散射光强度的散射光强度。在检测区域A1检测出粒子时，能够判断为通过中性粒细胞释放出了中性粒细胞胞外陷阱。另外，可以理解，中性粒细胞胞外陷阱本身也会溶于测定用试样的液体成分中或作为远小于中性粒细胞的碎片成分出现在散点图上。
（试样分析装置的整体结构）
下面根据附图说明上述试样分析方法所使用的试样分析装置（下文有时会简称为“分析装置”）的一例。如图2所示，分析装置10包括测定单元20、信息处理单元30。测定单元20与信息处理单元30进行了可通信连接。
（测定单元的结构）
如图2所示，测定单元20包括试样制备部件100、检测部件200、试剂收放部件300、收放有生物试样的生物试样收放部件400和控制部件500。
试样制备部件100分别从试剂收放部件300的第一容器301和第二容器302获取试剂。试样制备部件100还会从生物试样收放部件400获取生物试样。此外，试样制备部件100混合获取的试剂和生物试样。以此，试样制备部件100通过核酸染色性荧光色素染色含血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞所含有的核酸，制备测定用试样。试样制备部件100包括室90、生物试样运送部件111、第一试剂运送部件112、第二试剂运送部件113和测定用试样运送部件131。生物试样运送部件111、第一试剂运送部件112、第二试剂运送部件113和测定用试样运送部件131分别连接着压缩机。
室90通过生物试样运送部件111与生物试样收放部件400连接。生物试样运送部件111是供生物试样流动的管。生物试样运送部件111通过压缩机产生的压力从生物试样收放部件400获取定量的生物试样。生物试样运送部件111通过压缩机产生的压力将所获取的定量的生物试样排出到室90内。
室90通过第一试剂运送部件112与试剂收放部件300的第一容器301连接。第一试剂运送部件112是供第一试剂流动的管。第一试剂运送部件112通过压缩机所产生的压力从试剂收放部件300的第一容器301获取定量的第一试剂。第一试剂运送部件112通过压缩机所产生的压力将所获取的定量的第一试剂排出到室90内。
室90通过第二试剂运送部件113与试剂收放部件300的第二容器302连接。第二试剂运送部件113是供第二试剂流动的管。第二试剂运送部件113通过压缩机所产生的压力从试剂收放部件300的第二容器302获取定量的第二试剂。第二试剂运送部件113通过压缩机所产生的压力将获取的定量的第二试剂排出到室90内。
室90通过测定用试样运送部件131与检测部件200连接。测定用试样运送部件131是用于将在室90内制备的测定用试样运送至检测部件200的管。
检测部件200包括光照部件201、受光部件202和鞘流部件203。受光部件202向信息处理单元30的计算部件31输出与所接收光量相应的电信号。在图3中，检测部件200将测定用试样和鞘液送入鞘流部件203的流动池231。以此，检测部件200在流动池231中产生液流。此外，检测部件200用激光照射通过流动池231的液流中所含有的血液细胞等粒子。此外，检测部件200测定从激光照射下的粒子获得的光。
光照部件201有从光源211照射出的激光、准直镜212、聚光镜213和光束阻挡器214。光照部件201将由光源211照射的激光通过准直镜212和聚光镜213照射到流动池231。光源211可以根据所使用的核酸染色性荧光色素的种类和所使用的激光的种类适当选择。激光例如有红色半导体激光、蓝色半导体激光等半导体激光；氩激光等气体激光等，对其不作特别限定。
受光部件202有前向散射光受光部件202a、侧向散射光受光部件202b、荧光受光部件202c。也可以使受光部件202没有前向散射光受光部件202a和侧向散射光受光部件202b而有荧光受光部件202c。
前向散射光受光部件202a有前向光聚集镜221、针孔222和光电二极管223。前向散射光受光部件202a通过前向光聚集镜221使向前的散射光聚集。此外，前向散射光受光部件202a用光电二极管223接收通过针孔222的光。
另一方面，侧向散射光受光部件202b有侧向光聚集镜224、分色镜225和光电二极管226。侧向散射光受光部件202b通过侧向光聚集镜224使向着侧向的散射光聚集。此外，侧向散射光受光部件202b通过分色镜225反射朝向侧向前进的散射光的一部分。此外，侧向散射光受光部件202b通过光电二极管226接收分色镜225反射的光。
荧光受光部件202c有分光过滤器227、雪崩光电二极管228。荧光受光部件202c让透过分色镜225的光通过分光过滤器227。此外，荧光受光部件202c通过雪崩光电二极管228接收透过分光过滤器227的光。
鞘流部件203有流动池231。鞘流部件203使测定用试样在被鞘液包裹的状态下在流动池231内流动。
返回图2，试剂收放部件300包括第一容器301、第二容器302。第一容器301收放含有核酸染色性荧光色素的第一试剂。第二容器302收放含有渗透压调整剂和表面活性剂的第二试剂。第一容器301和第二容器302中分别设有用于识别各容器所收放的试剂的种类的识别元件。识别元件如有条形码等，对其不作特别限定。
生物试样收放部件400含有复数个生物试样容器401。复数个生物试样容器401分别收放有不同种类的生物试样。生物试样收放部件400将收放有所需要的生物试样的生物试样容器401运送至试样吸移位置。复数个生物试样容器401中分别设有用于识别各容器所收放的生物试样的种类的识别元件。识别元件例如有条形码等，对其不作特别限定。
控制部件500包括CPU（Central Processing Unit，中央处理单元）501和存储部件502。控制部件500由计算机构成。
存储部件502存储着计算机程序、用于识别试剂收放部件300所收放的试剂的试剂识别信息、关于测定用试样制备方法的试样制备信息、以及用于识别生物试样收放部件400所收放的生物试样的试样识别信息。计算机程序例如有用于制备测定用试样的计算机程序、用于获取关于测定用试样的荧光信息和散射光信息的计算机程序等，不作特别限定。试剂识别信息例如有将试剂种类与收放试剂的容器的位置和识别元件联系起来的信息等，对其不作特别限定。此外，试样识别信息例如有将生物试样种类、收放生物试样的生物试样容器的位置和识别元件联系起来的信息等，对其不作特别限定。
CPU501用存储在存储部件502中的试剂识别信息和试样制备信息来运行测定用试样的制备用计算机程序。以此CPU501让测定单元20的试样制备部件100制备测定用试样。
（信息处理单元的结构）
如图2所示，信息处理单元30包括计算部件31、显示部件32和输入部件33。信息处理单元30根据检测部件200所获取的荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。在本实施方式中，信息处理单元30由计算机系统构成。计算部件31包括CPU601和存储部件602。CPU601执行存储在存储部件602的计算机程序。显示部件32例如有显示器等，对其不作特别限定。显示部件32例如显示有无中性粒细胞胞外陷阱等的信息。输入部件33例如有键盘、鼠标等，对其不作特别限定。
存储部件602中安装有供CPU601执行的操作系统、应用程序等计算机程序、以及用于执行计算机程序的数据。应用程序例如有检测中性粒细胞胞外陷阱的计算机程序等，对其不作特别限定。CPU601执行存储部件602所存储的用于检测中性粒细胞胞外陷阱的计算机程序。以此，CPU601就能让分析装置10检测中性粒细胞胞外陷阱。
核酸染色性荧光色素、渗透压调整剂和表面活性剂也可以同时与生物试样混合。因此，也可以在一个通用的容器中收放核酸染色性荧光色素、渗透压调整剂和表面活性剂，由此取代第一容器301和第二容器302。此时会用一个试剂运送部件取代第一试剂运送部件112和第二试剂运送部件113。
（试样分析装置的处理步骤）
下面根据图4说明分析装置10的处理步骤的概要。在以下处理步骤中，测定单元20的控制部件500使用从存储部件502获取的试剂识别信息和试样制备信息并执行存储部件502所存储的测定用试样的制备用计算机程序。此外，控制部件500执行存储部件502所存储的测定用试样的相关荧光信息和散射光信息的获取用计算机程序。信息处理单元30的计算部件31使用获取的光学信息并执行存储部件602中所存储的中性粒细胞胞外陷阱的检测用计算机程序。
首先，在步骤S1，测定单元20的控制部件500让试样制备部件100制备测定用试样。步骤S1的测定用试样的制备按照后述图5和图6所示处理步骤进行。
然后，在步骤S2，控制部件500让检测部件200测定从测定用试样获得的荧光和散射光。步骤S2的荧光和散射光的测定按照图7所示处理步骤进行。
之后，在步骤S3，信息处理单元30的计算部件31通过执行中性粒细胞胞外陷阱检测用计算机程序来检测出中性粒细胞胞外陷阱。
（测定用试样制备步骤的处理顺序）
下面根据图5和图6说明分析装置10的测定用试样制备步骤的处理顺序的概要。测定用试样制备步骤对应于上述试样分析方法的步骤（A）。
首先，如图5所示，在步骤S101，控制部件500让生物试样收放部件400向试样吸移位置运送所需要的生物试样容器401。此时，控制部件500根据存储部件502中存储的试样识别信息让生物试样收放部件400选择收放有所需要的生物试样的生物试样容器401。然后，控制部件500让生物试样收放部件400将所选择的生物试样容器401运送到并置于试样吸移位置。
接着，在步骤S102，控制部件500让试样制备部件100定量吸移生物试样容器401中的生物试样。具体而言，控制部件500让试样制备部件100通过生物试样运送部件111从生物试样容器401吸移定量的生物试样。
在步骤S103，控制部件500让试样制备部件100向室90排出生物试样。具体而言，控制部件500让试样制备部件100将所吸移的定量的生物试样通过生物试样运送部件111排出到室90。
接着，如图6所示，在步骤S104，控制部件500让试样制备部件100定量吸移第一容器301中的第一试剂。具体而言，控制部件500让试样制备部件100通过第一试剂运送部件112从第一容器301吸移定量的第一试剂。在步骤S105，控制部件500让试样制备部件100将第一试剂排出到室90。具体而言，控制部件500让试样制备部件100通过第一试剂运送部件112向室90排出所吸移的定量的第一试剂。
在步骤S106，控制部件500让试样制备部件100定量吸移第二容器302中的第二试剂。接下来，在步骤S107，控制部件500让试样制备部件100将第二试剂排出到室90。除了通过第二试剂运送部件113吸移、排出第二试剂的一系列处理以外，步骤S106和步骤S107与图6的步骤S104及步骤S105相同。在本实施方式中，步骤S106和步骤S107与图6的步骤S104和步骤S105是并列进行的。
然后，在步骤S108，控制部件500让试样制备部件100搅拌、混合室90内的生物试样、第一试剂和第二试剂。以此，含血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞所含有的核酸被核酸染色性荧光色素染色，获得测定用试样。
然后处理进入图4的步骤S2的测定步骤。
（测定步骤的处理顺序）
下面根据图7说明分析装置10所进行的荧光和散射光的测定步骤的处理顺序的概要。测定步骤与前述试样分析方法的步骤（B）相对应。
在步骤S201，控制部件500让试样制备部件100向检测部件200的流动池231导入测定用试样。具体而言，控制部件500让试样制备部件100通过测定用试样运送部件131向检测部件200的流动池231运送室90内的测定用试样。然后，在步骤S202，控制部件500让检测部件200向测定用试样照射光。具体而言，控制部件500让检测部件200的光照部件201向在流动池231内流动的测定用试样照射光。此外，在步骤S203，控制部件500让检测部件200测定从测定用试样获得的荧光和散射光。具体而言，控制部件500向信息处理单元30的计算部件31输出光学信息，此处光学信息即为与检测部件200的受光部件202所接收的荧光和散射光强度分别对应的电信号。
其后，处理进入图4的步骤S3中的检测步骤。
(检测步骤的处理顺序)
下面根据图8说明分析装置10所进行的中性粒细胞胞外陷阱检测步骤的处理顺序的概要。检测步骤对应于上述试样分析方法的步骤（C）。
在步骤S301，信息处理单元30从测定单元20接收光学信息。在步骤S302，CPU601使用所接收的光学信息并进行粒子分类。具体而言，CPU601使用所接收的光学信息，在荧光强度和散射光强度的散点图上点绘粒子。由于使用荧光强度和散射光强度，因此如图1的散点图所示，粒子主要分类为出现在检测区域A1的粒子群、出现在检测区域A2的粒子群、出现在检测区域A3的粒子群。接下来，在图8的步骤S303，CPU601判断有无中性粒细胞胞外陷阱。具体而言，CPU601提取出现在检测区域A1的粒子。如果在图1的散点图的检测区域A1提取到粒子，则CPU601判断从中性粒细胞释放出了中性粒细胞胞外陷阱。此时，也可以使CPU601根据出现在检测区域A1的粒子数目是否在一定值以上来判断是否释放了中性粒细胞胞外陷阱。此一定值是在考虑到噪声等因素的基础上得到的、能判断为未出现中性粒细胞胞外陷阱的值。其后，在图8的步骤S304，CPU601向显示部件32等输出检测结果。
（处理顺序的变形例）
向生物试样中添加第一试剂和第二试剂时也可以按照先添加第一试剂再添加第二试剂的顺序进行。具体而言，也可以在步骤S104和步骤S105的一系列步骤之后实施步骤S106和步骤S107的一系列步骤。向生物试样中添加第一试剂和第二试剂时也可以按照添加第二试剂后再添加第一试剂的顺序进行。具体而言，也可以在步骤S106和步骤S107的一系列步骤之后实施步骤S104和步骤S105的一系列步骤。也可以使用含有核酸染色性荧光色素、渗透压调整剂及表面活性剂的试剂并由此取代第一试剂和第二试剂。
当受光部件202没有前向散射光受光部件202a和侧向散射光受光部件202b而有荧光受光部件202c时，CPU601使用所接收的荧光强度，检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。
4.试剂
本实施方式涉及的试剂是用于上述试样分析方法的试剂。本实施方式涉及试剂含有渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素。
本实施方式涉及的试剂所使用的渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素与上述试样分析方法所使用的渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素一样。渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素可以含在不同的试剂中，也可以含在一种试剂中。
本实施方式涉及的试剂也可以进一步含有表面活性剂。本实施方式涉及的试剂的表面活性剂与上述试样分析方法所使用的表面活性剂一样。当本实施方式涉及的试剂含有表面活性剂时，表面活性剂、渗透压调整剂和核酸染色性荧光色素可以分别含在不同的试剂中，也可以含在一种试剂中。另外，本实施方式涉及的试剂由含有渗透压调整剂的试剂和含有核酸染色性荧光色素的试剂构成时，表面活性剂可以含在含有渗透压调整剂的试剂和含有核酸染色性荧光色素的试剂的其中一者中，也可以含在二者中。
本实施方式涉及的试剂也可以进一步含有芳香族有机酸、其他溶剂、助剂等。用于本实施方式中的试剂的芳香族有机酸与上述试样分析方法所使用的芳香族有机酸一样。溶剂如有：水；缓冲液；有机溶剂、上述物质中至少二种的混合物等，对其不作特别限定。缓冲液比如有磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、HEPES缓冲液等，对其不作特别限定。有机溶剂例如有乙醇、乙二醇、二甲亚砜等，对其不作特别限定。助剂例如有螯合剂、防腐剂等，对其不作特别限制。
本实施方式涉及的试剂可以通过将渗透压调整剂、核酸染色性荧光色素和表面活性剂分别与试剂形态相应地混入适当的溶剂中来制得。
本实施方式涉及的试剂能够封入容器中作为试剂盒供使用。本实施方式涉及的试剂盒的一例见图9。图9所示试剂盒800包括：装有第一试剂801的容器802、装有第二试剂803的容器804、附属文书805、箱806。第一试剂801含有核酸染色性荧光色素。第二试剂803含有渗透压调整剂和表面活性剂。附属文书805包括用试剂盒800检测中性粒细胞胞外陷阱的操作顺序等的记述。箱806收放：装有第一试剂801的容器802、装有第二试剂803的容器804、附属文书805。图9所示试剂盒是第一试剂801和第二试剂803分别封入不同容器所得到的试剂盒，但也可以将第一试剂801和第二试剂803的混合物封入一个容器。
实施例
简称的说明
PMA： 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯
NETs：中性粒细胞胞外陷阱
（实施例1及比较例1）
向健康者末梢血1000µL中混入PMA至终浓度为162nM。所得到的混合物在室温（25℃）静置3小时，引致NETs。混合17µL所得到的混合物、1µL不会透过细胞膜的核酸染色性荧光色素（赛默飞世尔科技公司制，商品名：Sytox green stain）、以及磷酸缓冲生理盐水（成分：10mM磷酸缓冲液（pH7.4）和150mM氯化钠）至渗透压达到317.8hPa。以此破坏末梢血中所含有的中性粒细胞等血液细胞的细胞膜，从被破坏部位向中性粒细胞等血液细胞内导入核酸染色性荧光色素。所得到的试样作为实施例1的测定用试样。另，除了用纯化水取代PMA外，通过与实施例1的测定用试样的制备时同样的操作获得实施例1的测定用对照试样。
向健康者末梢血1000µL中混合PMA至终浓度为162nM。所得到的混合物在室温（25℃）静置3小时。混合17µL所得到的混合物、1µL核酸染色性荧光色素、磷酸缓冲生理盐水至渗透压达到6673.8hPa，获得比较例1的测定用试样。另，除了用纯化水取代PMA外，通过与比较例1的测定用试样的制备时同样的操作获得比较例1的测定用对照试样。另外，在比较例1，由于使用了磷酸缓冲生理盐水，所以比较例1的测定用试样和测定用对照试样中所含有的中性粒细胞的细胞膜未被破坏。
用流式细胞仪测定测定用试样和测定用对照试样所分别含有的核酸的荧光和散射光，获得散点图。
实施例1的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图如图10所示。比较例1的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图如图11所示。图中，（A）表示测定用对照试样的荧光强度和侧向散射光强度关系的结果，（B）表示测定用试样的荧光强度和侧向散射光强度关系的结果，（C）表示测定用对照试样的荧光强度和前向散射光强度关系的结果，（D）表示测定用试样的荧光强度和前向散射光强度关系的结果。
从图10所示结果得知，实施例1的测定用试样的散点图右下部分可见聚簇，而实施例1的测定用对照试样的散点图中未见聚簇。实施例1的测定用试样引致了NETs。因此，在图10中，实施例1的测定用试样散点图右下部分的聚簇A是被认为是NETs释放后的粒子的聚簇。通常，健康者末梢血的白细胞大部分是淋巴细胞和中性粒细胞。已知淋巴细胞侧向散射光强度比中性粒细胞低。在图10中，实施例1的测定用试样散点图的左上部分的聚簇B是具有较小的侧向散射光强度的粒子聚集而成的集团，其被认为是淋巴细胞的聚簇。另外，实施例1的测定用试样散点图右上部分的聚簇C是具有较大侧向散射光强度的粒子聚集而成的集团，因此其被认为是未释放NETs的中性粒细胞的聚簇。由此结果得知，荧光强度比未释放NETs的中性粒细胞的荧光强度小，且散射光强度比淋巴细胞散射光强度大的粒子的聚簇是NETs释放后的粒子的聚簇。
另一方面，从图11所示结果得知，比较例1的测定用试样散点图和测定用对照试样的散点图之间几乎没有差别。由此显示出的是，关于比较例1的测定用试样和测定用对照试样，未破坏中性粒细胞等血液细胞，未将核酸染色性荧光色素导入中性粒细胞等血液细胞中。
图10和图11各自的散点图中的目标位置上出现的粒子的比例按照式（XV）求得：式（XV）〔出现在目标位置的粒子的比例〕=〔〔出现在目标位置的粒子数目〕÷〔散点图中的全部粒子数目〕〕 （XV）。另外，用作目标位置的位置满足以下条件：荧光强度小于未释放NETs的中性粒细胞的荧光强度，且散射光强度大于淋巴细胞散射光强度。
实施例1的测定用试样、实施例1的测定用对照试样、比较例1的测定用试样和比较例1的测定用对照试样各自的散点图中的目标位置上出现的粒子比例的结果如图12所示。图中，柱1表示实施例1的测定用试样散点图中的目标位置出现的粒子的比例，柱2表示实施例1的测定用对照试样散点图中的目标位置出现的粒子的比例，柱3表示比较例1的测定用试样散点图中的目标位置出现的粒子的比例，柱4表示比较例1的测定用对照试样各自的散点图中的目标位置出现的粒子的比例。
从图12所示结果得知，破坏中性粒细胞细胞膜并导入核酸染色性荧光色素的实施例1相对于比较例1来说，出现在目标位置上的粒子的比例更高。因此，由此结果可知，通过破坏中性粒细胞细胞膜并导入核酸染色性荧光色素这一做法能够高精度地检测出NETs。
(实施例2~9和比较例2~5)
将含有健康者末梢血和PMA的混合物17µL､核酸染色性荧光色素(赛默飞世尔科技公司制,商品名:Sytox green stain)､磷酸缓冲生理盐水混合至渗透压达到249.7(实施例2)､272.4(实施例3)､317.8(实施例4)､385.9(实施例5)､567.5(实施例6)､885.3(实施例7)､1203.1(实施例8)､1679.8(实施例9)､1974.9(比较例2)､2860.2(比较例3)､3473.1(比较例4)或6673.8(比较例5),除此之外,通过与实施例1同样的操作获得实施例2~9和比较例2~5的测定用试样｡此外，用纯化水取代ＰＭＡ，除此之外，通过与制备实施例２～９、比较例２～５的测定用试样时同样的操作得到实施例２～９、比较例２～５的测定用对照试样。
用流式细胞仪测定测定用试样和测定用对照试样各自所含有的核酸的荧光和散射光，获得散点图。按照下式（XVI）求得NETs的检测灵敏度：〔NETs的检测灵敏度〕=〔〔出现在目标位置的粒子数目A〕÷〔出现在目标位置的粒子数目B〕〕（XVI）（式中，〔出现在目标位置的粒子数目A〕表示出现在测定用试样散点图中目标位置的粒子数目，〔出现在目标位置的粒子数目B〕表示出现在测定用对照试样散点图中目标位置的粒子数目）。出现在目标位置的粒子数目A和出现在目标位置的粒子数目B按式（XV）求出。
用实施例2~9和比较例2~5各自的测定用试样和测定用对照试样所得出的渗透压和NETs的检测灵敏度的关系结果如表1所示。
【表1】
从表1所示结果得知，测定用试样的渗透压为245~1680hPa时，灵敏度超过1.8。这些结果说明，测定用试样的渗透压为245~1680hPa时能够高精度地检测出NETs。
（实施例10）
第一试剂使用的是染色剂（希森美康产品，商品名：ストマトライザー４ＤＳ）。在纯化水中添加十二烷基三甲基氯化铵、聚氧乙烯（30）十六烷基醚、苯二甲酸氢钾、乙二胺四乙酸二钾，得到表2所示成分的混合物。使用氢氧化钠，将所得到的混合物的pH调整为pH6.0，获得第二试剂。混合20μＬ末梢血、20μＬ第一试剂和1000μＬ第二试剂。将所得到的混合物在40℃培养20秒，获得测定用试样（渗透压：2633.2hPa）。
【表2】
用流式细胞仪测定测定用试样和测定用对照试样所分别含有的核酸的荧光和散射光，获得散点图。
实施例10的测定用试样和测定用对照试样各自的散点图如图13所示。图中，（A）显示的是所得到的测定用对照试样的荧光强度和侧向散射光强度之间的关系的结果，（B）显示的是所得到的测定用试样的荧光强度和侧向散射光强度之间的关系的结果，（C）显示的是所得到的测定用对照试样的荧光强度和前向散射光强度之间的关系的结果,（D）显示的是所得到的测定用试样的荧光强度和前向散射光强度的关系的结果。
从图13所示结果得知，NETs释放后的粒子的聚簇与其他聚簇得以明确辨别。由此可知，通过将生物试样、核酸染色性荧光色素、表面活性剂混合至渗透压在2633.2hPa以下就能更高精度地检测出NETs。
编号说明
10 分析装置
20 测定单元
30 信息处理单元
31 计算部件
32 显示部件
33 输入部件
90 室
100 试样制备部件
111 生物试样运送部件
112 第一试剂运送部件
113 第二试剂运送部件
131 测定用试样运送部件
200 检测部件
201 光照部件
202 受光部件
202a 前向散射光受光部件
202b 侧向散射光受光部件
202c 荧光受光部件
203 鞘流部件
211 光源
212 准直镜
213 聚光镜
214 光束阻挡器
221 前向光聚集镜
222 针孔
223 光电二极管
224 侧向光聚集镜
225 分色镜
226 光电二极管
227 分光过滤器
228 雪崩光电二极管
231 流动池
300 试剂收放部件
301 第一容器
302 第二容器
400 生物试样收放部件
401 生物试样容器
500 控制部件
501 CPU
502 存储部件
601 CPU
602 存储部件
800 试剂盒
801 第一试剂
802 容器
803 第二试剂
804 容器
805 附属文书
806 箱

Claims (17)

1.一种试样分析方法，包括以下步骤：
（A）通过核酸染色性荧光色素对含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸进行染色，制备测定用试样；
（B）获取用光照射所述测定用试样所得到的荧光信息；
（C）根据所述荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中获得的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。
2.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在步骤（A），破坏所述中性粒细胞的细胞膜并导入所述核酸染色性荧光色素，制备测定用试样。
3.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在步骤（A），通过破坏所述中性粒细胞的细胞膜并导入所述核酸染色性荧光色素来使从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞获得的荧光强度大于从中性粒细胞胞外陷阱获得的荧光强度。
4.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在步骤（B），进一步获取光照所述测定用试样所得到的散射光信息。
5.根据权利要求4所述的试样分析方法，其特征在于：
所述散射光信息是侧向散射光信息。
6.根据权利要求4所述的试样分析方法，其特征在于：
在步骤（C），检测出散射光强度大于从淋巴细胞获得的散射光强度的粒子作为所述中性粒细胞胞外陷阱。
7.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在所述步骤（B），通过流式细胞仪获取所述荧光信息。
8.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在所述步骤（A），至少混合所述生物试样和所述核酸染色性荧光色素并使得渗透压在245hPa以上1680hPa以下，制备所述测定用试样。
9.根据权利要求1所述的试样分析方法，其特征在于：
在所述步骤（A），至少混合所述生物试样、所述核酸染色性荧光色素、表面活性剂并使得渗透压在2635hPa以下，制备所述测定用试样。
10.一种试样分析装置，其含有：
试样制备部件，其通过核酸染色性荧光色素染色含有血液细胞的生物试样中未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞中所含有的核酸，制备测定用试样；
检测部件，其获取用光照射所述测定用试样所得到的荧光信息；
信息处理部件，其根据所述检测部件所获取的荧光信息检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞得到的荧光强度的粒子作为中性粒细胞胞外陷阱。
11.根据权利要求10所述的试样分析装置，其特征在于：
所述检测部件进一步获取用光照射所述测定用试样所得到的散射光信息。
12.根据权利要求11所述的试样分析装置，其特征在于：
所述散射光信息是侧向散射光信息。
13.根据权利要求11所述的试样分析装置，其特征在于：
所述信息处理部件检测出荧光强度小于从未释放中性粒细胞胞外陷阱的中性粒细胞得到的荧光强度、且散射光强度大于从淋巴细胞获得的散射光强度的粒子作为所述中性粒细胞胞外陷阱。
14.根据权利要求10所述的试样分析装置，其特征在于：
所述试样制备部件至少混合所述生物试样和所述核酸染色性荧光色素并使得渗透压在245~1680hPa，制备所述测定用试样。
15.根据权利要求10所述的试样分析装置，其特征在于：
所述试样制备部件混合所述生物试样、所述核酸染色性荧光色素、表面活性剂并使得渗透压在2635hPa以下，制备所述测定用试样。
16.一种用于权利要求1所述试样分析方法的试剂，其含有所述核酸染色性荧光色素。
17.根据权利要求16所述的试剂，其还含有表面活性剂。
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