CN114641679A - 颗粒分析方法和颗粒分析器 - Google Patents
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Abstract
提供了在使用异染性正色染料分析血液样品中包含的颗粒时能够获得更多临床上有用的信息的手段。在分析血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法中，利用异染性正色染料对颗粒进行染色；利用光照射经染色的颗粒；测量源自异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，第一荧光和第二荧光由血液样品中包含的每个颗粒发射；按照颗粒中的每一个的大小对由颗粒中的每一个发射的第一荧光的强度和第二荧光的强度进行归一化，以获得颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光中的每一个的荧光浓度；在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，该多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个；并且创建其中第一荧光的强度是类的RNA量直方图和其中第二荧光的强度是包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类的类的DNA量直方图。
Description
技术领域
本发明涉及一种颗粒分析方法和一种颗粒分析器。
背景技术
常规地，血液样品中包含的颗粒已经被分类和计数。例如，在光学自动血细胞分析器中，使用流式细胞仪来分析血液样品中的颗粒。具体而言，在流式细胞术方法中，使用通过将来自光源(诸如激光器)的光施加到流过池的利用荧光染料等染色的细胞上而获得的散射光和荧光的信息，除了细胞的数量和大小之外，还可以获得诸如细胞内的核酸的量的信息。流式细胞术方法已经被用于来自网织红细胞(RET)的全自动测量的血细胞计数器中，并且网织红细胞中的核酸利用核酸染色荧光染料进行染色，以通过荧光强度来检测与成熟红细胞的不同(非专利文献1)。在此，网织红细胞是RNA保留在其中的去核后的未成熟红细胞，并在24至48小时后变成成熟红细胞，并且RNA相应地逐渐消失。因此，网织红细胞的数量(和比率)的测量对于评估骨髓中的红细胞造血能力很重要。网织红细胞的成熟度的程度被划分成与RNA含量成比例的三个分数，并且这些部分被共同地被评价为未成熟网织红细胞分数(IRF)。当将IRF的比率与网织红细胞的数量进行比较时，其在临床上可用于区分溶血性贫血、再生障碍性贫血等，并且作为用于癌症的化疗之后的造血状态的指标(非专利文献2)。
此外，存在作为其中应用了网织红细胞的检测原理的分析参数的未成熟血小板分数(IPF)。在此，检测刚从骨髓中释放的未成熟血小板的尝试已经进行持续了很长时间，并且存在名为网织血小板(reticulated platelet，RP)的许多报道。据说，与成熟血小板相比，RP在细胞质中包含许多RNA，并且最初被报道为在显微镜下观察到的利用新的亚甲蓝染料染色的血小板。此后，已经开发了一种利用流式细胞仪测量利用核酸染色染料进行染色的RP的方法，并且已经表明，在特发性血小板减少性紫癜(ITP)和化疗或造血干细胞移植后的骨髓恢复期间，RP增加。认为外周血中的RP反映了骨髓的血小板生成能力，并且能够在不进行骨髓抽吸的情况下估计骨髓的血小板生成能力在例如骨髓检查困难的情况下是有用的。对于RP的测量，临床上使用IPF分析系统，在该系统中应用了安装在普通血液分析器中的网织红细胞测量功能的原理。这个未成熟血小板分数(IPF)的成熟度的程度也被化分成三个分数，并且在所划分的区域中，以荧光强度的降序来评价未成熟度较高。
常规地，已知用于使用流式细胞术型自动血细胞分析器测量未成熟网织红细胞分数(IRF)和未成熟血小板分数(IPF)的许多技术。然而，全部临床使用的设备发射单个颜色的荧光作为荧光染料。因此，要获得的核酸信息被限于从一个荧光波长带获得的信息。因此，要获得的核酸信息不仅包括源自RNA的信息还包括源自DNA的信息，并且不可能从该信息中仅提取RNA信息。结果，认为IRF和IPF的所测量的值被获得为大于真实值的值，并且存在不能测量网织红细胞和网织血小板的真实未成熟度的问题。
作为血液样品分析的结果获得的DNA信息被认为成为示出血细胞方面的异常(例如，各种小体(诸如Howell-Jolly小体和Pappenheimer小体)、疟原虫、巴贝斯虫、泰勒虫属、锥虫属和丝虫属的微鞭毛体等的存在)的潜在指示符。然而，由于从常规自动血细胞分析器获得的核酸信息必须是RNA信息和DNA信息的混合物，所以不可能使潜在有用的DNA信息变得明显。
顺便提及，已经提出了一种用于通过流式细胞术型自动血细胞分析器来分析利用吖啶橙(AO)染色的血液样品的技术(专利文献1)，该吖啶橙是示出其中组织组分表现出与染料的原始色调不同的可染性的调制现象(异染性)的荧光染料(异染性正色染料)。具体而言，专利文献1公开了一种用于基于流式细胞术的结果根据每个散射光按照细胞的大小和形状来归一化利用AO染色的血细胞的荧光强度，以获得每个细胞的荧光浓度，并基于由此获得的每个细胞的荧光浓度对血液样品中的细胞进行分类的技术。然后，根据专利文献1中描述的技术，据说可以根据网织红细胞中的RNA量，由通过上述方法分类的网织红细胞计算作为未成熟度的指示符的参数。此外，据说可以根据血小板中的RNA的量被提供为未成熟度的指示符的网织血小板的数量可以从类似分类的血小板中测量。
引用列表
专利文献
专利文献1：US2009/0130647A1
非专利文献
非专利文献1：Yasunori Abe等人,Journal of Thrombosis and Hemostasis,TheJapanese Society on Thrombosis and Hemostasis,18(4):289-301(2007)
非专利文献2：Takayuki Takubo,The Journal of the Japanese Society ofInternal Medicine,The Japanese Society of Internal Medicine,Vol.100,No.11:3230-3239(2011)
发明内容
技术问题
然而，专利文献1中描述的技术简单地基于按照血液样品中的颗粒的大小和形状归一化的每个细胞的荧光浓度来分类(聚类)血液样品中的细胞。因此，还没有获得足够的临床上有用信息。
因此，本发明的目的是提供在使用异染性正色染料分析血液样品中包含的颗粒时能够获得更多临床上有用的信息的手段。
问题的解决方案
鉴于上述问题，本发明人进行了勤奋的研究。结果，本发明人已经发现，通过基于按照在血液样品中包含的每个颗粒的大小归一化的荧光浓度而将血液样品中的颗粒分类(聚类)成多个颗粒聚类，然后对包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建第一荧光强度作为类的RNA量直方图和第二荧光强度作为类的DNA量直方图，可以解决以上问题，并且因此完成了本发明。
也就是说，根据本发明的一个方面，提供了一种用于分析在血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法。该颗粒分析方法包括：利用异染性正色染料对颗粒进行染色；利用光照射经染色的颗粒；测量源自异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，第一荧光和第二荧光由血液样品中包含的每个颗粒发射；按照颗粒中的每一个的大小对由颗粒中的每一个发射的第一荧光的强度和第二荧光的强度进行归一化，以获得颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光中的每一个的荧光浓度；并且在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，该多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个。颗粒分析方法包括对包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建第一荧光的强度作为类的RNA量直方图和第二荧光的强度作为类的DNA量直方图。
根据本发明的另一方面，作为能够实行根据本发明上述方面的颗粒分析方法的装置，还提供了一种颗粒分析器，该颗粒分析器包括：光源，该光源将光施加到血液样品中包含的颗粒；流动池，血液样品流过该流动池；光检测器，该光检测器包括检测具有不同波长的第一荧光的强度和第二荧光的强度中的每一个的多个荧光检测器；以及数据处理部，该数据处理部按照颗粒中的每一个的大小对由血液样品中包含的颗粒中的每一个发射的第一荧光和第二荧光的强度进行归一化以确定颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光的每个荧光浓度，在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个的多个颗粒聚类，并且对包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建第一荧光的强度作为类的RNA量直方图和第二荧光的强度作为类的DNA量直方图。
根据本发明的又一方面，作为与本发明的上述方面类似的颗粒分析方法，代替上述方面的特性，提供了一种方法，该方法包括：对于包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，计算荧光强度比，该荧光强度比是包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度和第二荧光的强度的比；并且创建其中荧光强度比是类的荧光强度比直方图。
根据本发明的又一方面，作为能够实行根据本发明上述方面的颗粒分析方法的装置，还提供了一种颗粒分析器，该颗粒分析器包括：光源，该光源将光施加到血液样品包含中的颗粒；流动池，血液样品流过该流动池；光检测器，该光检测器包括检测具有不同波长的第一荧光的强度和第二荧光的强度中的每一个的多个荧光检测器；以及数据处理部，该数据处理部按照颗粒中的每一个的大小对由血液样品中包含的每个颗粒发射的第一荧光和第二荧光的强度进行归一化以确定颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光的荧光浓度，在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个的多个颗粒聚类，并且对包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，计算荧光强度比，该荧光强度比是包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度和第二荧光的强度的比，并且创建其中荧光强度比是类的荧光强度比直方图。
根据本发明，当使用异染性正色染料分析血液样品中包含的颗粒时，可以获得更多临床上有用的信息。
附图说明
图1是示出测量样品的制备的示意图。
图2是示出根据本发明的一方面的用于实行颗粒分析方法的装置的系统配置的图。
图3是示出作为根据本发明一方面的用于实行颗粒分析方法的装置的实施例的流式细胞仪的概要的系统图。
图4是前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)的二维散点图(FS×SS细胞直方图)的测量示例。
图5是第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2)的二维散点图(FL1×FL2细胞直方图)的测量示例。
图6是基于通过“归一化”的处理确定每个颗粒中的CRc和CDc而获得的结果而创建的第一荧光(FL1)的荧光浓度(CRc)和第二荧光(FL2)的荧光浓度(CDc)的二维图(在本说明书中也称为“RNP图”)。
图7A是通过门控从图6中示出的RNP图中分离几个颗粒聚类而创建的RNA量直方图和DNA量直方图。具体来说，图7A是用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图(图7A中的左部)和DNA量直方图(图7A中的右部)。
图7B是通过门控从图6中示出的RNP图中分离几个颗粒聚类而创建的RNA量直方图和DNA量直方图。具体而言，图7B是用于血小板聚类(PLTn)的RNA量直方图(图7B中的左部)和DNA量直方图(图7B中的右部)。
图7C是通过门控从图6中示出的RNP图中分离几个颗粒聚类而创建的RNA量直方图和DNA量直方图。具体地，图7C是用于有核细胞聚类(NCn)的RNA量直方图(图7C中的左部)和DNA量直方图(图7C中的右部)。
图8A是针对为其创建了RNA量直方图和DNA量直方图的颗粒聚类(在这种情况下为红细胞聚类(RBCn))创建的二维图的示例。在二维图中，包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度(FL1)或第二荧光的强度(FL2)是一个轴线，以及包括在颗粒聚类中的每个颗粒的大小是另一轴线。
图8B是针对为其创建了RNA量直方图和DNA量直方图的颗粒聚类(在这种情况下为血小板聚类(PLTn))创建的二维图的示例。在二维图中，包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度(FL1)或第二荧光的强度(FL2)是一个轴线，以及包括在颗粒聚类中的每个颗粒的大小是另一轴线。
图8C是针对为其创建了RNA量直方图和DNA量直方图的颗粒聚类(在这种情况下为有核细胞群(NCn))创建的二维图的示例。在二维图中，包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度(FL1)或第二荧光的强度(FL2)是一个轴线，以及包括在颗粒聚类中的每个颗粒的大小是另一轴线。
图9A是稍后描述的示例中，通过将本发明应用于没有形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的RNP图。
图9B示出了在下述实施例中通过将本发明应用于没有形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的RNA量直方图(图9B中的左部)和DNA量直方图(图9B中的右部)。
图9C是在稍后描述的示例中通过将本发明应用于没有形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的二维图，其中包括在红细胞聚类或血小板聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴，以及包括在聚类中的每个颗粒的大小是纵轴。
图9D是在稍后描述的示例中通过将本发明应用于没有形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的二维图，其中包括在红细胞聚类或血小板聚类中的每个颗粒的第二荧光(FL2)的强度是横轴，以及包括在聚类中的每个颗粒的大小是纵轴。
图10A是稍后描述的示例中，通过将本发明应用于具有红细胞的形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的RNP图。
图10B示出了在下述实施例中通过将本发明应用于具有红细胞的形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的RNA量直方图(图10B中的左部)和DNA量直方图(图10B中的右部)。
图10C是在稍后描述的示例中通过将本发明应用于具有红细胞的形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的二维图，其中包括在红细胞聚类或血小板聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴，以及包括在聚类中的每个颗粒的大小是纵轴。
图10D是在稍后描述的示例中通过将本发明应用于具有红细胞的形态学发现的血液样品来测量网织红细胞分数时创建的二维图，其中包括在红细胞聚类或血小板聚类中的每个颗粒的第二荧光(FL2)的强度是横轴，以及包括在聚类中的每个颗粒的大小是纵轴。
图11A是在稍后描述的示例中当通过将本发明的第二方面应用于没有红细胞形态学发现的血液样品来进行测量时创建的RNP图。
图11B是在稍后描述的示例中通过将本发明的第二方面应用于没有红细胞的形态学发现的血液样品进行测量时创建的荧光强度比直方图，并且其中荧光强度比(FL1/FL2)(其是包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比的值)作为类。
图11C是图11B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。
图12A是在稍后描述的示例中当通过将本发明的第二方面应用于具有红细胞形态学发现(HJ小体)的血液样品来进行测量时创建的RNP图。
图12B是在稍后描述的示例中通过将本发明的第二方面应用于具有红细胞的形态学发现(HJ小体)的血液样品进行测量时创建的荧光强度比直方图，并且其中荧光强度比(FL1/FL2)(其是包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比的值)作为类。
图12C是图12B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。
图13A是在稍后描述的示例中当通过将本发明的第二方面应用于具有红细胞形态学发现(有核红细胞(NRBC))的血液样品来进行测量时创建的RNP图。
图13B是在稍后描述的示例中通过将本发明的第二方面应用于具有红细胞的形态学发现(有核红细胞(NRBC))的血液样品进行测量时创建的荧光强度比直方图，并且其中荧光强度比(FL1/FL2)(其是包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比的值)作为类。
图13C是图12B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。
具体实施方式
在下文中，将参照附图描述本发明的实施例。
本发明的一方面(第一方面)是一种分析血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法，包括：利用异染性正色染料对颗粒进行染色；利用光照射经染色的颗粒；测量源自异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，第一荧光和第二荧光由血液样品中包含的每个颗粒发射；按照颗粒中的每一个的大小对由颗粒中的每一个发射的第一荧光的强度和第二荧光的强度进行归一化，以获得颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光中的每一个的荧光浓度；并且在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，该多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个，并且对包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建第一荧光的强度作为类的RNA量直方图和第二荧光的强度作为类的DNA量直方图。
在下文中，将参考使用流式细胞仪通过流式细胞仪方法进行分析的情况作为示例，具体描述用于实行根据本方面的颗粒分析方法的优选实施例。然而，本发明的技术范围应基于请求保护范围中的描述来确定，而不仅限于以下具体实施例。
图1是示出测量样品的制备的示意图。在根据本发明的颗粒分析方法中，首先，提供包含血液中的颗粒的样本(血液样本)，并且使用预定的正色染料(异染性正色染料)(通常，将染料和血液样本混合)来制备测量样本。结果，将血液样品中包含的颗粒利用预定的正色染料进行染色。在通过流式细胞术方法进行的颗粒的分析中，利用光照射上面制备的测量样品，由此从样品中包含的颗粒生成的散射光和荧光被检测为电信号。然后，基于所检测的电信号，来分析样品中包含的颗粒。
(测量样本的制备)
在本方面中，如上所述，提供包含血液中的颗粒的样本(血液样本)作为待测量的样本(测量样本)，并且使用预定的正色染料(异染性正色染料)(通常，将染料和血液样本混合)来制备测量样本。在这种情况下，例如，如图1所示，当以固定量分配所需量的正色染料10时，将正色染料在20至50℃的范围内加温。向如此加温和分配的正色染料10A中，加入包含血液中颗粒的样品(血液样品)20，并将混合物搅拌持续5至10秒。如此获得的测量样品30在20至50℃的范围内保持温热并保持持续10至40秒。结果，在本发明中，可以在15至60秒内完成测定样品30的制备。
在这种情况下，例如，以每次1mL的方式分配异染性正色染料10，并且向所分配的异染性正色染料10A中以每次2μL的方式添加血液样品20，该血液样品被制备成使得待测量的颗粒的数量为大约1×107个颗粒/μL。作为异染性正色染料10，例如，可以使用使用pH为7.4的tris缓冲溶液制备的0.5至1.5mg/dL的吖啶橙。特别地，染料浓度优选地为约0.75mg/dL。将这种异染性正色染料10分配为1mL，并在分配期间加温到45℃，将2μL的血液样品20加入到已加温的1mL的正色染料10A中，并将混合物搅拌持续5秒钟。将所获得的样品的温度保持处于45℃并保持持续30秒，由此可以制备作为合适样品的测量样品30。替代性地，可以通过将缓冲溶液(诸如具有为pH6.4至pH8.2的磷酸盐缓冲溶液或tris缓冲溶液)和血液样品20依次加入分离地冷冻干燥的吖啶橙中来制备测量样品。
“异染性”是最初指的是其中利用染料进行染色的组分显示出不同于染料的原始色调的可染性的调制现象的术语。在本说明书中，这个术语用于将“异染性正色染料”定义为具有根据要利用异染性正色染料或染色方法染色的目标的类型而发射具有不同波长的多种荧光的性质的染料。异染性正色染料的具体示例包括吖啶橙(AO)、脯氨酸、吖啶黄、阿的平等。可以使用这些异染性正色染料而没有特别的限制，只要它们是其中由堆积组分和嵌入组分分别发射的荧光的波长不同的染料，这将在后面描述。然而，由异染性正色染料的堆积组分发射的荧光优选地为橙色荧光，并且由嵌入组分发射的荧光优选地为绿色荧光。从这个观点来看，吖啶橙(AO)特别优选地用作异染性正色染料。
(所制备的样本的测量和分析)
图2是示出根据本发明的一方面的用于实行颗粒分析方法的装置的系统配置的图。图3是示出作为根据本发明的用于实行颗粒分析方法的装置的实施例的流式细胞仪的概要的系统图。
如图2和图3所示，该装置由制备上面参照图1描述的测量样品30的样品制备单元40和通过流式细胞仪方法分析测量样品30的流式细胞仪50构成。流式细胞仪50具有作为检测区域的流动池51和激光光源52，测量样品30流过该流动池，该激光光源是利用光照射流过流动池51的测量样品30(具体地，样品中包含的颗粒)的光源。激光光源52隔着照射聚光透镜53而相对于流动池51设置。在流式细胞仪50中，隔着散射光会聚透镜54而布置小角度前向散射光检测器(FSs)61和大角度前向散射光检测器(FLs)62，这些检测器检测由于流动池51中的测量样品30的光照射而从测量样品30中的每个颗粒生成的前向散射光。大角度前向散射光检测器(FLs)62的布置并不是必须的。进一步，在流式细胞仪50中，经过分束器55设置侧向散射光检测器(SS)63，该侧向散射光检测器检测由于流动池51中的测量样品30的光照射而从测量样品30中的每个颗粒生成的侧向散射光。另外，在流式细胞仪50中，分别经过分束器56和57以及波长选择滤光器58和59而布置用于检测具有不同波长的并且由于流动池51中的测量样品30的光照射从测量样品30中的每个颗粒生成的两种荧光的第一荧光检测器(FL1)64和第二荧光检测器(FL2)65。可以使用分色镜来代替分束器。以上提及的检测器61、62、63、64和65中的每一个作为检测从利用光照射的测量样品30中包含的每一个颗粒生成的散射光和荧光的强度的光检测器(散射光检测器、荧光检测器)起作用。
流式细胞仪50具有处理器(CPU)70。该处理器(CPU)70还作为数据处理部起作用，该数据处理部基于由光检测器检测的每个颗粒生成的散射光和荧光的强度来分析血液样本中包含的颗粒，并实行与根据本方面的颗粒分析方法中的数据处理(通过荧光强度的归一化计算荧光浓度、聚类样本中包含的颗粒、以及创建核酸量直方图)相关的处理。
随后，将详细描述根据本发明的使用具有图2和图3中示出配置的装置的颗粒分析方法。
首先，将由上述样品制备单元40制备的测量样品30供给流式细胞仪50的流动池51，以便开始分析。当测量样品30被供应到流动池51时，激光源52利用光照射流过流动池51的测量样品30(具体而言，样品中包含的颗粒)。在此，照射光的波长没有特别限制，但是照射光的中心波长优选地为408nm、445nm、473nm或488nm。
当利用光照射测量样品30时，从测量样品30中包含的每个颗粒生成前向散射光(前向散射光(FS))，并且前向散射光(FS)通过小角度前向散射光检测器(FSs)61和大角度前向散射光检测器(FLs)62进行检测。当利用光照射测量样品30时，从测量样品30中包含的每个颗粒生成侧向散射光(侧向散射光(SS))，并且侧向散射光(SS)通过侧向散射光检测器(SS)63进行检测。此外，当利用光照射测量样品30时，从测量样品30中包含的每个颗粒生成荧光。在此，在根据本方面的方法中，血液样品中包含的颗粒利用异染性正色染料进行染色。因此，当利用光照射测量样品30时，从测量样品30中包含的每个颗粒生成具有彼此不同波长的多种(例如，两种)荧光。具体而言，多种荧光包括源自异染性正色染料的堆积组分的荧光(在本说明书中也称为“第一荧光(FL1)”)和源自异染性正色染料的嵌入组分的荧光(在本说明书中也称为“第二荧光(FL2)”。源自堆积组分的荧光(第一荧光(FL1))是通过静电相互作用将异染性正色染料堆积到核酸上而生成的荧光，并且是当吖啶橙(AO)用作染料时具有约645至655nm的中心波长的荧光。第一荧光(FL1)的荧光强度主要与核酸当中的核糖核酸(RNA)的丰度相关。另一方面，源自嵌入组分的荧光(第二荧光(FL2))是通过将异染性正色染料嵌入到核酸中而生成的荧光，并且是当吖啶橙(AO)用作染料时具有大约520至530nm的中心波长的荧光。第二荧光(FL2)的荧光强度主要与核酸当中的脱氧核糖核酸(DNA)的丰度相关。分别由第一荧光检测器(FL1)64和第二荧光检测器(FL2)65检测由于测量样品30的光照射从测量样品30中包含的每个颗粒生成的第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2)。
如上所述，由检测器检测的散射光(前向散射光(FS)和侧向散射光(SS))的强度和荧光(第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2))的强度在各检测器处被转换成电信号，并被传输到处理器(CPU)70。然后，处理器(CPU)70使用如此获得的电信号来执行各种数据处理。例如，处理器(CPU)70基于前向散射光(FS)的强度来计算与每个颗粒的大小相关的参数，并基于侧向散射光(SS)的强度来计算与每个颗粒的大小和每个颗粒中包含的颗粒的量相关的参数。处理器(CPU)70基于第一荧光(FL1)的强度和第二荧光(FL2)的强度来分别计算与每个颗粒中的堆积组分的量和嵌入组分的量相关的参数。在此，如上所述，第一荧光(FL1)的荧光强度主要与核酸当中的核糖核酸(RNA)的丰度相关，以及第二荧光(FL2)的荧光强度主要与核酸当中的脱氧核糖核酸(DNA)的丰度相关。因此，根据从第一荧光(FL1)的强度和第二荧光(FL2)的强度导出的电信号而计算的、与每个颗粒中的堆积组分的量和嵌入组分的量相关的参数可以被认为是分别与每个颗粒中的RNA量和DNA量相关的参数。
在本实施例中，处理器(CPU)70然后按照每个颗粒的大小对由每个颗粒发射的第一荧光(FL1)的强度和第二荧光(FL2)的强度进行归一化。因此，可以分别获得每个颗粒中的第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2)的荧光浓度。根据散射理论，已知前向散射光(FS)的强度(散射截面)与发射前向散射光的颗粒的大小(直径)成比例。因此，当由每个颗粒发射的荧光(FL1，FL2)的强度除以与每个颗粒的大小相关的参数(前向散射光(FS)的强度或基于这个强度计算的直径)时，可以获得在假设颗粒具有相同大小的情况下的荧光强度(即，荧光浓度)。在本说明书中，这种处理被称为“归一化”。在本说明书中，为了方便起见，由每个颗粒发射的第一荧光(FL1)的荧光浓度被称为CRc(细胞RNA浓度；细胞内RNA浓度)，并且由每个颗粒发射的第二荧光(FL2)的荧光浓度被称为CDc(细胞DNA浓度；细胞内DNA浓度)。在下文中，将首先描述通过测量血液样本直到归一化完成时获得的一些信息。
图4是前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)的二维散点图(FS×SS细胞直方图)的测量示例。在图4中，紫色事件指示红细胞组分，绿色事件指示血小板组分，以及蓝色事件表示有核细胞组分。如图4所示，在FS×SS细胞直方图中，紫色事件(红细胞组分)的聚类和蓝色事件(有核细胞组分)的聚类被显示为重叠。紫色事件(红细胞组分)中的一些存在于绿色事件(血小板组分)的聚类中。因此，当按原样使用FS×SS细胞直方图时，无论如何应用门控，都不能将特定的血细胞组分与其他血细胞组分分离。
图5是第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2)的二维散点图(FL1×FL2细胞直方图)的测量示例。如图5所示，在FL1×FL2细胞直方图中，紫色事件(红细胞组分)的聚类和绿色事件(血小板组分)的聚类被显示为重叠。另一方面，蓝色事件(有核细胞组分)的聚类独立地存在于细胞直方图的右上部。因此，通过为蓝色事件(有核细胞组分)的聚类设置门控，可以只对有核细胞组分进行门控，如图5所示。
随后，图6是基于通过上文描述的“归一化”的处理确定每个颗粒中的CRc和CDc而获得的结果而创建的第一荧光(FL1)的荧光浓度(CRc)和第二荧光(FL2)的荧光浓度(CDc)的二维图(在本说明书中也称为“RNP图”)。在图6中示出的RNP图中，还显示了可以通过以上提及的门控删除的蓝色事件(有核细胞组分)，用于确认存在的位置。也就是说，基于以上提及的定义，在RNP图中，横轴示出了每个颗粒的第一荧光(FL1)的荧光浓度(CRc)，以及纵轴示出了每个颗粒的第二荧光(FL2)的荧光浓度(CDc)。由此可见，其中颗粒中的RNA浓度和DNA浓度两者相对较高的有核细胞组分(有核细胞聚类；PCn)在RNP图的右上区域中形成聚类。此外，还可以看出其中颗粒中的RNA浓度和DNA浓度两者相对较低的红细胞组分(红细胞聚类；RBCn)在RNP图的左下区域中形成聚类，以及其中颗粒中的RNA浓度相对较高而DNA浓度相对较低的血小板组分(血小板聚类；PLTn)在RNP图的右下区域中形成聚类。
如上所述，执行以上描述的“归一化”处理，以分别获得每个颗粒中的第一荧光(FL1)和第二荧光(FL2)的荧光浓度，并且因此创建将这些荧光浓度作为两个轴的二维图，由此可以对血液样品中包含的颗粒进行聚类。在根据本方面的颗粒分析方法中，必要的是，将血液样品中包含的每个颗粒聚集成包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个的多个颗粒聚类，并且优选的是将血液样品中包含的每个颗粒聚集成包括红细胞聚类(RBCn)、血小板聚类(PLTn)和有核细胞聚类(NCn)中的全部的多个颗粒聚类。
接下来，在根据本方面的颗粒分析方法中，根据以上创建的RNP图(图6)，对于包括在通过使用RNP图进行聚类而生成的多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，创建第一荧光(FL1)的强度(CRc)作为类的直方图(在本说明书中也称为“RNA量直方图”)和第二荧光(FL2)的强度(CDc)作为类的直方图(在本说明书中也称为“DNA量直方图”)。
图7A是通过门控将红细胞聚类(RBCn)从图6中示出的RNP图中分离而创建的、用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图(图7A的左部)和DNA量直方图(图7A的右部)。类似地，图7B是通过门控将血小板聚类(PLTn)从图6中示出的RNP图中分离而创建的、用于血小板聚类(PLTn)的RNA量直方图(图7B左侧)和DNA量直方图(图7B右侧)。图7C是通过门控将有核细胞群集(NCn)从图6中示出的RNP图中分离而创建的、用于有核细胞群集(NCn)的RNA量直方图(图7C中的左边)和DNA量直方图(图7C中的右边)。
根据本方面的颗粒分析方法优选地还包括基于以上创建的用于至少一个颗粒群的RNA量直方图和DNA量直方图来分析血液样品中包含的颗粒。这个分析可以由包括在流式细胞仪50中的处理器(CPU)70(数据处理部)来执行，可以由另一计算机来执行，或者可以由医学专业人员(诸如医生、护士或临床实验室技术人员)来执行。
具体而言，例如，基于图7A中示出的用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图(图7A中的左部)，可以测量血液样品中包含的网织红细胞(Retic)的数量或比率和/或血液样品的未成熟网织红细胞分数(IRF)。在此，图7A中示出的用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图(图7A中的左部)是使用RNP图使用通过门控分离的红细胞聚类的数据而创建的。因此，RNA量直方图中的每个图中的FL1(RNA量)的数据以高精度反映了每个颗粒中的堆积组分的量，并且极不可能的是如常规技术中那样示出包括DNA量的假高值。因此，根据本方面的颗粒分析方法具有这样的优点，即：基于图7A中示出的用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图，可以以极高的精度测量各种参数(血液样品中包含的网织红细胞的数量或比率和/或血液样品的未成熟网织红细胞分数(IRF))。在网织红细胞中，血细胞中的RNA量大于正常红细胞中。因此，当在图7A中示出的用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图中的横轴上设置预定阈值时，可以将RNA量等于或大于阈值的红细胞聚类中的颗粒被确定为网织红细胞。进一步，横轴上对应于网织红细胞的区域根据FL1的荧光强度(RNA量)被分成三个，并且被分成三个区域：从具有最高荧光强度的侧部开始的HFR(高荧光比)、MFR(中荧光比)和LFR(低荧光比)，并且可以根据每个区域中包括的网织红细胞的数量或比率将未成熟网织红细胞分数(IRF)测量为网织红细胞的未成熟度。
在根据本方面的颗粒分析方法中，不同于常规技术，对于至少一个颗粒聚类，可以通过从关于RNA量的信息中分离来将关于血液样品中包含的每个颗粒的DNA量的信息获得为DNA量直方图。因此，使用以上描述的DNA量直方图的分析也提供了有用的发现。例如，根据依据本方面的颗粒分析方法，可以基于图7A中示出的用于红细胞聚类的DNA量直方图(RBCn)来确定红细胞聚类中的异常的存在或不存在。在此，“异常”是包括其中包括在红细胞聚类中的颗粒中的DNA量与正常状态相比增加的所有状态的概念。“异常”的示例包括红细胞聚类中包括的颗粒中存在各种小体(诸如Howell-Jolly小体和Pappenheimer小体)、疟原虫、巴贝斯虫、泰勒虫属、锥虫属和丝虫的微鞭毛体等。也就是说，在具有这些“异常”的红细胞聚类中的颗粒中，血细胞中的DNA量与正常红细胞相比较大。因此，当在图7A中示出的用于红细胞聚类(RBCn)的DNA量直方图中的横轴上设置预定阈值时，如果存在红细胞聚类中的其中DNA量等于或大于阈值的颗粒，则可以确定该颗粒很可能具有上述“异常”(异常网织红细胞分数；ARF)中的一些。
在上文中，已经参照图7A描述了基于用于红细胞聚类(RBCn)的RNA量直方图或DNA量直方图的分析的具体实施例。然而，可以基于图7B中示出的用于血小板聚类(PLTn)的RNA量直方图或DNA量直方图进行类似的分析，并且可以基于图7C中示出的用于有核细胞聚类(NCn)的RNA量直方图或DNA量直方图进行类似的分析。例如，存在这样的优点，即，基于图7B中示出的用于血小板聚类(PLTn)的RNA量直方图，可以以极高的精度测量各种参数(血液样品中的未成熟血小板分数(IPF))。当在图7B中示出的用于血小板聚类(PLTn)的DNA量直方图的横轴上设置预定阈值时，如果存在血小板聚类中的其中DNA量等于或大于阈值的颗粒，则可以确定该颗粒可能具有上述“异常”(异常血小板分数；APF)中的一些。类似地，基于用于有核细胞聚类(NCn)的RNA量直方图和DNA量直方图，可以分别确定包括在有核细胞聚类(NCn)中的颗粒的不成熟度(未成熟有核细胞比例)和异常的存在或不存在(异常有核细胞分数)。
在根据本方面的颗粒分析方法的优选实施例中，对于其中如上所述创建了RNA量直方图和DNA量直方图的颗粒聚类，创建二维图，其中包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度或第二荧光(FL2)的强度作为一个轴，包括在颗粒聚类中的每个颗粒的大小作为另一轴。
作为这种二维图的示例，图8A是其中对于红细胞聚类(RBCn)，包括在该聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴以及包括在该聚类中的每个颗粒的大小(在这种情况下，是前向散射光(FS)的强度)是纵轴的二维图。然后，在二维图中，纵轴(前向散射光的强度(FS))被分成多个区域(在这种情况下，从最小到最大的四个区域RC0到RC3)。因此，可以基于四个区域中的每一个中的颗粒的数量或比率，将红细胞聚类重新分类为多个亚聚类。在这种情况下，红细胞聚类被重新分类为从最大颗粒大小开始的四个亚聚类：大红细胞亚聚类(RC3)、正常红细胞亚聚类(RC2)、破裂红细胞亚聚类(RC1)和小红细胞亚聚类(RC0)。
在此，由于图8A中示出的二维图的横轴示出了第一荧光(FL1)的强度，其是每个颗粒中的RNA量(换句话说，未成熟度)的指示符，所以基于图8A中示出的示出红细胞聚类(RBCn)的二维图，可以同时获得关于未成熟度的信息和关于包括在红细胞聚类中的每个颗粒的大小的信息。因此，它开辟了获得不能仅从信息中的一种(例如，未成熟网织红细胞分数(IRF)的值)中获取的临床上有用的发现的可能性。
图8B和图8C是分别为血小板聚类(PLTn)和有核细胞聚类(NCn)类似创建的二维图。具体而言，图8A是其中对于血小板聚类(PLTn)，包括在该聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴以及包括在该聚类中的每个颗粒的大小(在这种情况下，是前向散射光(FS)的强度)是纵轴的二维图。然后，在二维图中，纵轴(前向散射光(FS)的强度)被分成多个区域(在这种情况下，从最小到最大的四个区域PC0到PC3)。因此，可以基于四个区域中的每一个中的颗粒的数量或比率，将血小板聚类重新分类为多个亚聚类。在这种情况下，血小板聚类被重新分类为从最大颗粒大小开始的四个亚聚类：巨血小板亚聚类(PC3)、大血小板亚聚类(PC2)、正常血小板亚聚类(PC1)和小血小板亚聚类(PC0)。
在此，由于图8B中示出的二维图的横轴示出了第一荧光(FL1)的强度，其是每个颗粒中的RNA量(换句话说，未成熟度)的指示符，所以基于图8B中示出的示出血小板聚类(PLTn)的二维图，可以同时获得关于未成熟度的信息和关于包括在血小板聚类中的每个颗粒的大小的信息。因此，它开辟了获得不能仅从信息中的一种((未成熟血小板分数(IPF)的值)中获取的临床上有用的发现的可能性。
图8C是其中对于有核细胞聚类(NCn)，而将包括在该聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度作为横轴并且将包括在该聚类中的每个颗粒的大小(在这种情况下，是前向散射光(FS)的强度)作为纵轴的二维图。然后，在二维图中，纵轴(前向散射光(FS)的强度)被分成多个区域(在这种情况下，从最小到最大的四个区域NC0到NC3)。因此，可以基于四个区域中的每一个中的颗粒的数量或比率，将有核细胞聚类重新分类为多个亚聚类。在这种情况下，有核细胞聚类被重新分类为从最大颗粒大小开始的四个亚聚类：大有核细胞亚聚类(NC3)、正常有核细胞亚聚类(NC2)、破裂有核细胞亚聚类(NC1)和小有核细胞亚聚类(NC0)。基于图8C中示出的示出有核细胞群(NCn)的二维图，可以同时获得关于未成熟度的信息和关于包括在有核细胞群中的每个颗粒的大小的信息。因此，它开辟了获得不能仅从信息中的一种中获取的临床上有用的发现的可能性。
基于以上提及的二维图中示出的结果，可以从例如小红细胞亚聚类(RC0)、小血小板亚聚类(PC0)和小有核细胞亚聚类(NC0)中的颗粒的总数获取细胞外小泡(extracellular vesicle，EV)的总数。由于可以同时获得关于当时获取的EV的未成熟度的分布的信息，所以可以提供临床上有用的发现。图8A至图8C中示出的二维图分别显示了与包括在红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的颗粒相对应的事件。然而，如在稍后描述的示例中，与包括在多个颗粒聚类的每一个中的颗粒相对应的事件可以被组合并显示在一个二维图中。
本发明的另一方面(第二方面)还提供了一种分析血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法。根据第二方面的颗粒分析方法在以下点上与本发明的上述方面(第一方面)是共同的。也就是说，根据第二方面的颗粒分析方法包括：利用异染性正色染料对颗粒进行染色；利用光照射经染色的颗粒；测量源自异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，第一荧光和第二荧光由血液样品中包含的每个颗粒发射；按照颗粒中的每一个的大小对由颗粒中的每一个发射的第一荧光的强度和第二荧光的强度进行归一化，以获得颗粒中的每一个中的第一荧光和第二荧光中的每一个的荧光浓度；并且在通过归一化获得的荧光浓度的二维图中，将颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，该多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个。另一方面，根据第二方面的颗粒分析方法的特征在于，对于包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，计算荧光强度比，该荧光强度比是包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度和第二荧光的强度的比；并且创建其中荧光强度比是类的荧光强度比直方图。在下文中，将针对与第一方面的那些点不同的点来描述用于实行根据第二方面的颗粒分析方法的优选实施例。
如上所述，同样在根据第二方面的颗粒分析方法中，使用如图6所示的RNP图将血液样本中包含的颗粒聚类成多个颗粒聚类与根据第一方面的颗粒分析方法是共同的。
随后，在根据第二方面的颗粒分析方法中，对于包括在多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，计算荧光强度比，该荧光强度比是包括在颗粒聚类中的每个颗粒的第一荧光的强度和第二荧光的强度的比。例如，从图6中示出的RNP图对红细胞聚类(RBCn)进行门控，并且对于包括在红细胞聚类(RBCn)中的每个颗粒，计算第二荧光(FL2)的强度与第一荧光(FL1)的强度的比率(荧光强度比(FL2/FL1))。然后，创建直方图(荧光强度比直方图)，其中包括在红细胞聚类(RBCn)中的每个颗粒被用作元素，并且将荧光强度比(FL2/FL1)作为类。
认为以这种方式计算的每个颗粒的荧光强度比(FL2/FL1)基本上反映了每个颗粒中DNA量与RNA量的比率(DNA量/RNA量)。在此，在正常的红细胞中，细胞中的DNA量和RNA量两者不是很大。因此，例如，在其中如上所述计算的荧光强度比(FL2/FL1)的值大于预定阈值(例如，2.0)的颗粒中，可设想的是颗粒中的DNA量相对于RNA量如此之大以至于其偏离正常范围。因此，对于包括在红细胞聚类中的这种颗粒，怀疑存在第一方面中描述的“异常”，即各种小体(诸如Howell-Jolly小体和Pappenheimer小体)、疟原虫、巴贝斯虫、泰勒虫属、锥虫属和丝虫的微鞭毛体等。替代性地，怀疑颗粒是有核红细胞(NRBC)。以这样的方式，可以基于上面创建的荧光强度比直方图来分析包括在血液样本中的颗粒，并且这种分析还提供了临床上有用的发现。不用说，即使当荧光强度比是第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比率(FL1/FL2)时，也可以进行相同的分析。在第一方面中计算的每个颗粒中的荧光浓度(CRc和CDc)各自通过将第一荧光(FL1)的强度和第二荧光(FL2)的强度除以前向散射光(FS)的强度或基于前向散射光(FS)的强度计算的直径获得。因此，在计算第二方面中的荧光强度比时，即使当使用第一荧光的荧光浓度(CRc)和第二荧光的荧光浓度(CDc)的比率来代替第一荧光(FL1)的强度和第二荧光(FL2)的强度的比率时，也可以获得相同的值。
综上所述，根据第二方面的颗粒分析方法的优选实施例还包括当荧光强度比是第二荧光的强度与第一荧光的强度的比率的值(FL2/FL1)时测量其中荧光强度比高于荧光强度比的预定阈值(例如2.0)的颗粒的数量或比率，或者当荧光强度比是第一荧光的强度与第二荧光的强度的比率的值(FL1/FL2)时测量其中荧光强度比小于荧光强度比的预定阈值(例如，0.5)的颗粒的数量或比率，并基于测量的结果确定包括在颗粒聚类中的颗粒中异常的存在或不存在。在这种情况下怀疑其存在的“异常”的具体示例如上所述。
示例
在下文中，将参照示例具体描述本发明的实施例。然而，本发明的技术范围不限于以下示例。
<<对其应用本发明第一方面的测量示例>>
[没有形态学发现的血液样品中的网织红细胞比率的测量的示例]
针对从成年男性收集的血液样品测量网织红细胞分数。在通过显微镜观察对血液样品进行的血液形态学测试中，没有发现关于红细胞和血小板的形态学发现。在此，男性体内的网织红细胞分数的标准值为0.76％至2.18％。
首先，作为对照部分，使用可商购的多项目自动血细胞分析器(由SysmexCorporation制造的XN系列)，并根据所附手册测量网织红细胞分数。结果，获得血液样品中的网织红细胞分数为2.7％的结果。
另一方面，作为对其应用本发明的第一方面的测量实例，首先，提供如上所述的相同血液样品，并且将5μL血液样品添加到2mL的0.006g/L吖啶橙(AO)(其是异染性正色染料)溶液中，并且混合以制备测量样品。然后，使用全自动血细胞计数器(由Nihon KohdenCorporation制造，MEK-9000系列，Celltac G+原型)进行测量。接下来，使用所获得的FS、SS、FL1(525nm的荧光波长)和FL2(650nm的荧光波长)的数据，创建如图6所示的RNP图。在此，使用上述血液样本实际创建的RNP图在图9A中示出。然后，通过设置(门控)到红细胞聚类的门，从RNP图中分离数据，并为包括在分离的红细胞聚类中的颗粒创建如图7A所示的RNA量直方图和DNA量直方图。在此，图9B示出了使用血液样品实际创建的RNA量直方图(图9B的左部)和DNA量直方图(图9B的右部)。然后，基于RNA量直方图的峰值为横轴(反映RNA量的第一荧光(FL1)的强度)设置阈值，并且横轴上的值等于或大于阈值的颗粒被确定为网织红细胞(Retic)。然后，当将网织红细胞分数计算为网织红细胞占包括在红细胞聚类中的颗粒的比率时，血液样品中的网织红细胞分数为2.97％。如上所述，在其中未发现红细胞和血小板的形态学发现的血液样品中，当应用本发明的第一方面时，获得了几乎等于对照部分中的网织红细胞分数的网织红细胞分数的值。
基于RNP图(图9A)，对于其中上面创建了RNA量直方图(图9B中的左部)和DNA量直方图(图9B中的右部)的红细胞聚类，创建了其中包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴以及包括在红细胞聚类中的每个颗粒的大小是纵轴(图9C)的二维图。类似地，创建其中包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第二荧光(FL2)的强度是横轴以及包括在红细胞聚类中的每个颗粒的大小是纵轴(图9D)的二维图。在图9C和图9D中示出的二维图中，前向散射光的强度(FS)被用作纵轴(每个颗粒的大小)。在这些二维图中，除了包括在红细胞聚类中的颗粒的事件之外，以与以上用于包括在血小板聚类中的颗粒相同的方式从RNP图的数据中门控的颗粒的事件也以不同的颜色一起显示。
(具有红细胞的形态学发现的血液样品中的网织红细胞分数的测量的示例)
针对从成年男性收集的血液样品测量网织红细胞分数。在通过显微镜观察进行的血液样品的血液形态学测试中，发现了关于红细胞的形态学发现。具体来说，在100个白细胞计数中，计数了17个有核红细胞(NRBC)。在超过一半的红细胞中证实了Howell-Jolly小体(HJ小体)的存在，并且在一些红细胞中也证实了Pappenheimer小体(PH小体)的存在。
首先，作为对照部分，使用可商购的多项目自动血细胞分析器(由SysmexCorporation制造的XN系列)，并根据所附手册测量网织红细胞分数。结果，获得血液样品中的网织红细胞分数为7.97％的结果。
另一方面，作为对其应用本发明的第一方面的测量实例，首先，提供如上所述的相同血液样品，并且将5μL血液样品添加到2mL的0.006g/L吖啶橙(AO)(其是异染性正色染料)溶液中，并且混合以制备测量样品。然后，使用全自动血细胞计数器(由Nihon KohdenCorporation制造，MEK-9000系列，Celltac G+原型)进行测量。接下来，使用所获得的FS、SS、FL1(525nm的荧光波长)和FL2(650nm的荧光波长)的数据，以与上述相同的方式创建如图6所示的RNP图。在此，使用上述血液样本实际创建的RNP图在图10A中示出。然后，通过设置(门控)到红细胞聚类的门，从RNP图中分离数据，并为包括在分离的红细胞聚类中的颗粒创建如图7A所示的RNA量直方图和DNA量直方图。在此，图10B示出了使用血液样品实际创建的RNA量直方图(图10B的左部)和DNA量直方图(图10B的右部)。然后，基于RNA量直方图的峰值为横轴(反映RNA量的第一荧光(FL1)的强度)设置阈值，并且横轴上的值等于或大于阈值的颗粒被确定为网织红细胞(Retic)。然后，当将网织红细胞分数计算为网织红细胞占包括在红细胞聚类中的颗粒的比率时，血液样品中的网织红细胞分数为2.97％。如上所述，作为其中发现关于红细胞的形态学发现的血液样品的网织红细胞分数的测量的结果，当应用本发明的第一方面时，获得了接近标准值的值，并且另一方面，在对照部分中，获得了具有大偏差的值。在此，在对照部分的测量方法中，在不使用异染性正色染料的情况下由颗粒发射的荧光是单个颜色。因此，不可能区分和检测源自RNA的堆积组分和源自DNA的嵌入组分。结果，在本发明的应用示例中，在图10B中的右部上示出的各种小体和有核红细胞的存在(其可被检测以区别于网织红细胞)被错误地包括在对照部分的网织红细胞中并被计数，使得认为网织红细胞分数的测量值大大偏离实际值。当网织红细胞分数的测量值大大偏离实际值时，存在怀疑其中网织红细胞分数较高的疾病(例如，溶血性贫血、缺铁性贫血、恶性贫血)的存在的问题。
基于RNP图(图10A)，对于其中上面创建了RNA量直方图(图10B中的左部)和DNA量直方图(图10B中的右部)的红细胞聚类，创建了其中包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度是横轴以及包括在红细胞聚类中的每个颗粒的大小是纵轴的二维图(图10C)。类似地，创建其中包括在红细胞聚类中的每个颗粒的第二荧光(FL2)的强度是横轴以及包括在红细胞聚类中的每个颗粒的大小是纵轴的二维图(图10D)。在图10C和图10D中示出的二维图中，前向散射光(FS)的强度被用作纵轴(每个颗粒的大小)。在这些二维图中，除了包括在红细胞聚类中的颗粒的事件之外，以与以上用于包括在血小板聚类中的颗粒相同的方式从RNP图的数据中门控的颗粒的事件也以不同的颜色一起显示。挨次，例如，在图10D中示出的FS×FL2的二维图中，与图9D中示出的FS×FL2的二维图相比，红细胞聚类的事件被分布以便在横轴方向上扩展。这对应于其存在已经在图10B中的右部上示出的DNA量直方图中得到证实的各种小体和有核红细胞。比较图9D和图10D中示出的二维图，可以看出，在具有红细胞的形态学发现的血液样品中，包括在红细胞聚类中的颗粒的大小相对较小，并且还可以看出，例如，包括在血小板聚类中的颗粒的数量相对较大。
<<对其应用本发明第二方面的测量示例>>
(没有形态学发现的血液样品的测量的示例)
通过应用本发明的第二方面来测量从成年男性采集的血液样品。在通过显微镜观察对血液样品进行的血液形态学测试中，没有发现关于红细胞和血小板的形态学发现。
首先，将以上提供的5μL的血液样品加入到2mL的0.006g/L吖啶橙(AO)的溶液(其为异染性正色染料)中，并混合以制备测量样品。然后，使用全自动血细胞计数器(由NihonKohden Corporation制造，MEK-9000系列，Celltac G+原型)进行测量。接下来，使用所获得的FS、SS、FL1(525nm的荧光波长)和FL2(650nm的荧光波长)的数据，创建如图6所示的RNP图。在此，使用上述血液样本实际创建的RNP图在图11A中示出。然后，通过设置(门控)到红细胞聚类的门，从RNP图中分离数据。对于包括在所分离的红细胞聚类中的颗粒，计算荧光强度比，该荧光强度比是每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比率的值(FL1/FL2)，并且创建其中荧光强度比作为类的荧光强度比直方图。在此，使用上述血液样品实际创建的荧光强度比直方图在图11B中示出。在图11B中示出的荧光强度比直方图中，作为荧光强度比的异常值的指示符的阈值被设置为FL1/FL2＝2.0。图11C是图11B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。根据图11B和图11C中示出的荧光强度比直方图，其中荧光强度比高于阈值2.0的颗粒的数量为三。这个结果与血液形态学试验中不存在关于红细胞的形态学发现相一致。
(具有红细胞(1)的形态学发现的血液样品的测量的示例)
通过应用本发明的第二方面来测量从成年男性采集的血液样品。在通过显微镜观察进行的血液样品的血液形态学测试中，发现了关于红细胞的形态学发现。具体而言，在红细胞中证实了Howell-Jolly小体(HJ小体)的存在。
使用这个血液样品，通过与上述相同的方法制备测量样品，并使用全自动血细胞计数器(由Nihon Kohden Corporation制造，MEK-9000系列，Celltac G+原型)进行测量。接下来，使用所获得的FS、SS、FL1(525nm的荧光波长)和FL2(650nm的荧光波长)的数据，创建如图6所示的RNP图。在此，使用上述血液样本实际创建的RNP图在图12A中示出。然后，通过设置(门控)到红细胞聚类的门，从RNP图中分离数据。对于包括在所分离的红细胞聚类中的颗粒，计算荧光强度比，该荧光强度比是每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比率的值(FL1/FL2)，并且创建其中荧光强度比是类的荧光强度比直方图。在此，使用上述血液样品实际创建的荧光强度比直方图在图12B中示出。在图12B中示出的荧光强度比直方图中，作为荧光强度比的异常值的指示符的阈值被设置为FL1/FL2＝2.0。图12C是图12B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。根据图12B和图12C中示出的荧光强度比直方图，对其中荧光强度比高于阈值2.0的57个颗粒进行计数，并且它们的荧光强度比集中在略高于2.0的区域中。这个结果与在血液形态学测试中观察到HJ小体的存在相一致。
(具有红细胞(2)的形态学发现的血液样品的测量的示例)
通过应用本发明的第二方面来测量从成年男性采集的血液样品。在通过显微镜观察进行的血液样品的血液形态学测试中，发现了关于红细胞的形态学发现。具体而言，在100次白细胞计数中证实了有核红细胞(NRBC)的出现。
使用这个血液样品，通过与上述相同的方法制备测量样品，并使用全自动血细胞计数器(由Nihon Kohden Corporation制造，MEK-9000系列，Celltac G+原型)进行测量。接下来，使用所获得的FS、SS、FL1(525nm的荧光波长)和FL2(650nm的荧光波长)的数据，创建如图6所示的RNP图。在此，使用上述血液样本实际创建的RNP图在图13A中示出。然后，通过设置(门控)到红细胞聚类的门，从RNP图中分离数据。对于包括在所分离的红细胞聚类中的颗粒，计算荧光强度比，该荧光强度比是每个颗粒的第一荧光(FL1)的强度与第二荧光(FL2)的强度的比率的值(FL1/FL2)，并且创建其中荧光强度比作为类的荧光强度比直方图。在此，使用上述血液样品实际创建的荧光强度比直方图在图13B中示出。在图13B中示出的荧光强度比直方图中，作为荧光强度比的异常值的指示符的阈值被设置为FL1/FL2＝2.0。图13C是图13B中的阈值(FL1/FL2＝2.0)附近的区域的放大图。根据图13B和图13C中示出的荧光强度比直方图，对其中荧光强度比高于阈值2.0的25个颗粒进行计数，并且它们的荧光强度比广泛分布在2.0至3.3的区域中。这个结果与在血液形态学测试中观察到有核红细胞(NRBC)的存在相一致。
如上所述，通过使用异染性正色染料应用本发明来分析血液样品中的颗粒，使得可以获得更多临床上有用的信息。
本申请基于2020年2月5日提交的日本专利申请号2020-018264，并且其公开的内容通过引用整体结合于此。
附图标记列表
10 异染性正色染料
10A 所分配的异染性正色染料
20 血液样品
30 测量样品
40 样品制备单元
50 流式细胞仪
51 流动池
52 激光光源
53 照射光会聚透镜
54 散射光会聚透镜
55、56、57 分束器
58、59 波长选择滤光器
61 小角度前向散射光检测器(FSs)
62 大角度前向散射光检测器(FLs)
63 侧向散射光检测器(SS)
64 第一荧光检测器(FL1)
65 第二荧光检测器(FL2)
70 处理器(CPU)
Claims (23)
1.一种分析血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法，包括：
利用异染性正色染料对所述颗粒进行染色；
利用光照射经染色的所述颗粒；
测量源自所述异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自所述异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，所述第一荧光和所述第二荧光由所述血液样品中包含的每个颗粒发射；
按照所述颗粒中的每一个的大小对由所述颗粒中的每一个所发射的所述第一荧光的强度和所述第二荧光的强度进行归一化，以获得所述颗粒中的每一个中的所述第一荧光和所述第二荧光中的每一个的荧光浓度；
在通过所述归一化获得的所述荧光浓度的二维图中，将所述颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，所述多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个；并且
对包括在所述多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建所述第一荧光的强度作为类的RNA量直方图和所述第二荧光的强度作为类的DNA量直方图。
2.根据权利要求1所述的颗粒分析方法，还包括基于所述RNA量直方图和所述DNA量直方图来分析所述血液样品中包含的颗粒。
3.根据权利要求2所述的颗粒分析方法，包括对所述红细胞聚类创建所述RNA量直方图和所述DNA量直方图，
其中，所述分析包括基于所述红细胞聚类的RNA量直方图来测量所述血液样品中包含的网织红细胞的数量或比率和/或所述血液样品的未成熟网织红细胞分数(IRF)。
4.根据权利要求2或3所述的颗粒分析方法，包括对所述红细胞聚类创建所述RNA量直方图和所述DNA量直方图，
其中，所述分析包括基于所述红细胞聚类的DNA量直方图来确定所述红细胞聚类中的异常的存在或不存在。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的颗粒分析方法，包括对所述血小板聚类创建所述RNA量直方图和所述DNA量直方图，
其中，所述分析包括基于所述血小板聚类的RNA量直方图来测量所述血液样品中的未成熟血小板分数(IPF)。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的颗粒分析方法，包括对所述血小板聚类创建所述RNA量直方图和所述DNA量直方图，
其中，所述分析包括基于所述血小板聚类的DNA量直方图来确定所述血小板聚类中的异常的存在或不存在。
7.根据权利要求4或6所述的颗粒分析方法，其中，所述异常是包括在所述颗粒聚类中的所述颗粒中存在小体、疟原虫、巴贝斯虫、泰勒虫属、锥虫属和丝虫的微鞭毛体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的颗粒分析方法，还包括，对于其中创建了所述RNA量直方图和所述DNA量直方图的至少一个颗粒聚类，创建将包括在所述颗粒聚类中的每个颗粒的所述第一荧光的强度或所述第二荧光的强度作为一个轴并且将包括在所述颗粒聚类中的每个颗粒的大小作为另一个轴的二维图。
9.根据权利要求8所述的颗粒分析方法，还包括将所述二维图中指示所述颗粒中的每一个的大小的轴划分成多个区域，并基于通过划分形成的所述多个区域中的每一个中的颗粒的数量或比率，而将所述至少一个颗粒聚类重新分类成多个亚聚类。
10.根据权利要求9所述的颗粒分析方法，其中，所述二维图包括用于红细胞聚类的二维图，
所述颗粒分析方法还包括将所述红细胞聚类重新分类为包括正常红细胞的亚聚类、大红细胞亚聚类、破碎红细胞亚聚类和/或小红细胞亚聚类的多个亚聚类。
11.根据权利要求9或10所述的颗粒分析方法，其中，所述二维图包括用于血小板聚类的二维图，
所述颗粒分析方法还包括将所述血小板聚类重新分类为包括正常血小板的亚聚类、巨大血小板亚聚类、大血小板亚聚类和/或小血小板亚聚类的多个亚聚类。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的颗粒分析方法，其中，所述二维图包括用于有核细胞聚类的二维图，
所述颗粒分析方法还包括将所述有核细胞聚类重新分类为包括正常有核细胞的亚聚类、大有核细胞亚聚类、破裂有核细胞亚聚类和/或小有核细胞亚聚类的多个亚聚类。
13.一种分析血液样品中包含的颗粒的颗粒分析方法，包括：
利用异染性正色染料对所述颗粒进行染色；
利用光照射经染色的所述颗粒；
测量源自所述异染性正色染料的堆积组分的第一荧光的强度和源自所述异染性正色染料的嵌入组分的第二荧光的强度，所述第一荧光和所述第二荧光由所述血液样品中包含的每个颗粒发射；
按照所述颗粒中的每一个的大小对由所述颗粒中的每一个所发射的所述第一荧光的强度和所述第二荧光的强度进行归一化，以获得所述颗粒中的每一个中的所述第一荧光和所述第二荧光中的每一个的荧光浓度；
在通过所述归一化获得的所述荧光浓度的二维图中，将所述颗粒中的每一个聚类成多个颗粒聚类，所述多个颗粒聚类包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个；并且
对于包含在所述多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类，计算荧光强度比并且创建将所述荧光强度比作为类的荧光强度比直方图，其中，所述荧光强度比是包含在所述颗粒聚类中的每个颗粒的所述第一荧光的强度和所述第二荧光的强度之比。
14.根据权利要求13所述的颗粒分析方法，还包括基于所述荧光强度比直方图来分析所述血液样品中包含的颗粒。
15.根据权利要求13或14所述的颗粒分析方法，还包括：
当所述荧光强度比是所述第二荧光的强度与所述第一荧光的强度的比率的值时测量其中所述荧光强度比高于所述荧光强度比的预定阈值的颗粒的数量或比率，或者
当所述荧光强度比是所述第一荧光的强度与所述第二荧光的强度的比率的值时测量其中所述荧光强度比小于所述荧光强度比的预定阈值的颗粒的数量或比率；并且，
基于测量的结果来确定包括在所述颗粒聚类中的所述颗粒中的异常的存在或不存在。
16.根据权利要求15所述的颗粒分析方法，其中，所述异常是包括在所述颗粒聚类中的所述颗粒中存在小体、疟原虫、巴贝斯虫、泰勒虫属、锥虫属和丝虫的微鞭毛体、或者在所述颗粒聚类中存在有核红细胞。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的颗粒分析方法，其中，所述第一荧光是橙色荧光，并且所述第二荧光是绿色荧光。
18.根据权利要求17所述的颗粒分析方法，其中，所述异染性正色染料是吖啶橙(AO)。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的颗粒分析方法，其中，被照射到所述血液样品中包含的颗粒上的光的中心波长为408nm、445nm、473nm或488nm。
20.一种颗粒分析器，包括：
光源，所述光源将光照射到在血液样品中包含的颗粒；
流动池，所述血液样品流过所述流动池；
光检测器，所述光检测器包括检测具有不同波长的第一荧光的强度和第二荧光的强度中的每一个的多个荧光检测器；以及
数据处理部，所述数据处理部按照所述颗粒中的每一个的大小对由所述血液样品中包含的颗粒中的每一个所发射的所述第一荧光和所述第二荧光的强度进行归一化以确定所述颗粒中的每一个中的所述第一荧光和所述第二荧光的每个荧光浓度，并且，在通过所述归一化获得的所述荧光浓度的二维图中，所述数据处理部将所述颗粒中的每一个聚类成包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个的多个颗粒聚类，并且对包括在所述多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类创建所述第一荧光的强度作为类的RNA量直方图和所述第二荧光的强度作为类的DNA量直方图。
21.根据权利要求20所述的颗粒分析器，其中，所述数据处理部基于所述RNA量直方图和所述DNA量直方图来分析所述血液样品中包含的颗粒。
22.一种颗粒分析器，包括：
光源，所述光源将光照射到在血液样品中包含的颗粒；
流动池，所述血液样品流过所述流动池；
光检测器，所述光检测器包括检测具有不同波长的第一荧光的强度和第二荧光的强度中的每一个的多个荧光检测器；以及
数据处理部，所述数据处理部按照所述颗粒中的每一个的大小对由所述血液样品中包含的每个颗粒所发射的第一荧光和第二荧光的强度进行归一化以确定所述颗粒中的每一个中的所述第一荧光和所述第二荧光的荧光浓度，并且，在通过所述归一化获得的荧光浓度的二维图中，所述数据处理部将所述颗粒中的每一个聚类成包括红细胞聚类、血小板聚类和有核细胞聚类中的至少两个的多个颗粒聚类，并且对包括在所述多个颗粒聚类中的至少一个颗粒聚类计算荧光强度比并且创建所述荧光强度比作为类的荧光强度比直方图，其中，所述荧光强度比是包括在所述颗粒聚类中的每个颗粒的所述第一荧光的强度和所述第二荧光的强度的比。
23.根据权利要求22所述的颗粒分析器，其中所述数据处理部基于所述荧光强度比直方图来分析所述血液样品中包含的颗粒。
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