WO2007129485A1 - 粒子分類方法および装置 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to cell classification in blood, and more particularly to a particle classification method and apparatus for measuring reticulocytes, red blood cells, and platelets.
- Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 4 326061
- Patent Document 2 JP-A-5-322882
- a conventional blood analyzer using a flow cytometer has a problem that a staining time of, for example, 30 minutes or more is required when preparing a sample using a staining reagent.
- the presence of non-cell-derived particles such as dust in the cell suspension may raise the background of the measurement device.
- an object of the present invention is to accurately measure erythrocytes and / or platelets using atalidine orange as an index for staining platelets.
- an object of the present invention is to stain cells with atalidine orange, and to measure cells in the blood and non-cells based on values obtained by normalizing the fluorescence intensity of the cells with the size and shape of the cells.
- the purpose is to classify the derived particles and accurately measure the number of red blood cells and platelets.
- a particle classification method for classifying cells in blood using atalidine orange includes a step of staining cells in blood using atalidine orange, and cells in blood. And a step of determining the degree of staining using platelets in blood as an index of staining, and a step of classifying cells in blood.
- a step of staining cells in blood using atalidine orange Irradiating the cells with light, normalizing the fluorescence intensity of the cells with the size and shape of the cells, classifying the cells in the blood based on the normalized values, It is characterized by having.
- a step of staining cells in blood using atalidine orange and Normalizing the steps of irradiating cells in the blood with light, normalizing the fluorescence intensity of the cells based on the size and shape of the cells, determining the degree of staining using platelets in the blood as an indicator of staining, and normalizing Classifying the cells in the blood based on the obtained values.
- the step of judging the degree of staining using platelets as an indicator of staining comprises: platelets It is characterized by judging the strength of orange fluorescent component and Z or green fluorescent component.
- double-stranded DNA is fluorescent (green) centered at 530 nm by intercalating between base pairs, and single-stranded nucleic acids such as RNA.
- the fluorescence centered around 640 nm is caused by stacking by electrostatic interaction. Range), the orange fluorescent component and the green fluorescent component can be used as criteria.
- the center wavelength of the light irradiated to the cell in blood is 40. 8 nm, 445 nm, 473 nm or 488 nm.
- the step of staining cells in blood using atalidine orange comprises: A sample prepared by mixing a staining reagent containing atalidine orange and a buffer and a blood sample is set at a predetermined temperature and stained for a predetermined time.
- the cells to be classified are red blood cells, platelets, disrupted red blood cells, nucleated red blood cells, It is characterized by the fact that it is a malaria parasite, no, or ueljori.
- a light source for irradiating light to cells in blood a flow cell for flowing a sample, a forward scattered light detector for detecting forward scattered light, and a side A side scattered light detector for detecting the scattered light, a fluorescence detector for detecting the fluorescence, a staining judgment means for judging the quality of the staining of the blood platelets, and a means for judging the reticulocyte or platelet. It is characterized by comprising.
- a light source for irradiating light to cells in blood a flow cell for flowing a sample, a forward scattered light detector for detecting forward scattered light, and a side
- a side scattered light detector that detects side scattered light
- a fluorescence detector that detects fluorescence
- a normalization means that normalizes the fluorescence intensity of cells by the size and shape of the cells, and based on the normalized values
- a light source for irradiating light to cells in blood a flow cell for flowing a sample, a forward scattered light detector for detecting forward scattered light, and a side Side scattered light detector that detects side scattered light, fluorescence detector that detects fluorescence, normalization means to normalize the fluorescence intensity of cells by the size and shape of the cells, and judge whether platelet staining is good or bad
- a means for classifying cells and non-cell-derived particles in the blood based on the standardized values.
- reticulocytes can be accurately classified and measured.
- the cells in the blood are irradiated.
- the center wavelength of the light is 408 nm, 445 nm, 473 nm, or 488 nm, the influence of autofluorescence of red blood cells is eliminated, and SZN can be detected satisfactorily.
- a sample prepared by mixing a blood reagent and a staining reagent containing atrazine orange and a buffer solution is set at a predetermined temperature, and is set for a predetermined time. It becomes possible to dye
- the particle classification apparatus based on a value in which the fluorescence intensity of the cell is standardized by the size and shape of the cell, the cell concentration in the blood is determined.
- non-cell-derived particles can be classified and the number of red blood cells and platelets can be accurately measured.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing adjustment of a measurement sample.
- a sample comprising a blood component containing cells in blood and a staining reagent are mixed and reacted to prepare a sample, and the sample is placed in a detection region. It is set so that scattered light and fluorescence generated in the sample by irradiating light are detected as electrical signals, and cells in blood components are analyzed based on the detected electrical signals.
- a sample collected as a blood component is prepared as a sample to be measured.
- a required amount of staining reagent 10 is dispensed into a certain amount, it is heated in the range of 20 to 50 ° C., and this heated and dispensed staining reagent 10A is Add a specified amount of sample 20 consisting of blood components and stir for 5 ⁇ : LO seconds, sample thus obtained Keep 30 at 20-50 ° C and hold for 10-40 seconds.
- the preparation of the sample 30 can be completed in 15 to 60 seconds.
- the staining reagent 10 was dispensed into 1 mL, and the number of cells to be measured was adjusted to about 1 X 10 7 Z ⁇ L with respect to the dispensed staining reagent 10A. Add 2 L of Sample 20 above. Further, as the staining reagent 10, 0.5 to 1.5 mg ZdL atalidine orange adjusted with a Tris buffer having a dye concentration of ⁇ 7.4 is used. In particular, a dye concentration of 0.75 mgZdL is suitable, and this staining reagent 10 is dispensed into 1 mL and heated to 45 ° C.
- FIG. 2 shows a system configuration as an apparatus for carrying out the cell classification method in blood components according to the present invention. That is, in FIG. 2, reference numeral 40 indicates a sample preparation means for preparing the above-described sample. Reference numeral 50 is a flow cytometer, and the sample 30 prepared by the sample preparation means 40 is generated from light irradiation means for irradiating light in the detection region and cells contained in the light irradiated sample. Cell detection means for detecting scattered light and fluorescence as electrical signals, and cell analysis means for analyzing cells in blood components based on the detected cell parameters. The The processor 70 determines the dyeing condition and determines the standard. In the case of a flow cytometer, the detection area is set as a flow cell.
- FIG. 3 is a system diagram showing an outline of a flow cytometer as an embodiment of an apparatus for carrying out the cell classification method in blood components according to the present invention.
- reference numeral 51 denotes a flow cell that serves as a detection region for the prepared sample.
- a laser light source 52 is arranged with respect to the flow cell 51 via an irradiation light condensing lens 53.
- the forward scattered light obtained by irradiating the sample in the flow cell 51 passes through the scattered light condensing lens 54, and the forward small angle scattered light detectors (FSs) 61 and the forward large angle scattered light, respectively.
- Each detector (FLs) 62 is configured to be detected.
- the side scattered light and fluorescence obtained by irradiating the sample to the flow cell 51 are detected by a side scattered light detector (SS) 63 via a beam splitter 55, and
- the first fluorescence detector (FL1) 64 and the second fluorescence detector (FL2) 65 are configured to be detected via beam splitters 56 and 57 and wavelength selection filters 58 and 59, respectively.
- the sample as a blood component adjusted by the sample adjusting means 40 is supplied to the flow cell 51 of the flow cytometer 50, and the calibration of the sample is started (STEP-1). Therefore, the electrical signals detected by the forward small-angle scattered light detector (FSs) 61, the side scattered light detector (SS) 63, the first fluorescence detector (FL1) 64, and the second fluorescence detector (FL2) 65 are used. Based on V, measure the size of red blood cells and platelets (FS), the amount of granules (SS), the amount of DNA (FL1) and the amount of RNA (FL2) (STEP-2). Then, create a scattergram by standardizing the amount of DNA and RNA with the FS and SS, respectively.
- FSs forward small-angle scattered light detector
- SS side scattered light detector
- FL1 64 the first fluorescence detector
- FL2 second fluorescence detector
- the scattergram in the case of standardization by size represents a scattergram of intracellular DNA concentration (cDNAc: cell DNA concentration) and intracellular RNA concentration (cRNAc: cell RNA concentration).
- cDNAc cell DNA concentration
- cRNAc cell RNA concentration
- a threshold is set in the scattergram to classify red blood cells and platelets (cells in the blood), cell-derived particles, and non-cell-derived particles (STEP-3).
- RNA scattergram reticulocytes appear in a region where the cRNAc of the red blood cell distribution is high. Broken erythrocytes appear frequently in the middle of red blood cell distribution and platelet distribution. Nucleated erythrocytes have nuclei and a lot of DNA components, so they appear in different regions from erythrocytes and platelets in the standard scattergram of DNAZ-standardized RNA. Similarly, because the Howell Jolly body is a nuclear fragment composed of DNA, it appears in a different region from red blood cells and platelets. In addition, because all Plasmodium fluoresces, it appears in a region different from red blood cells and platelets in the normalized DNAZ normalized RNA scattergram.
- the staining of the sample is confirmed to be good or bad, if the staining is poor, the sample is recreated and the measurement from STEP-1 described above is performed (STEP-5 and STEP — 6). If the result of staining is good, the prepared sample is passed through the flow cell 51 of the flow cytometer 50, and the measurement of the sample is started (STEP-7). In addition, such an index for determining whether or not dyeing of the sample is good or bad will be described later.
- a forward small angle scattered light detector (FSs) 61 a forward small angle scattered light detector (FSs) 61, a side scattered light detector (SS) 63, a first fluorescence detector (FL1) 64, and a second fluorescence detector (FL2) 65.
- FSs forward small angle scattered light detector
- SS side scattered light detector
- FL1 first fluorescence detector
- FL2 second fluorescence detector
- the size of red blood cells and platelets (FS) the amount of granules (SS), the amount of DNA (FL1) and the amount of RNA (FL 2) are measured (STEP_8).
- the threshold value in the scattergram is set, red blood cells and platelets are classified, and the number is calculated (STEP-9).
- Figure 5 shows an example of the RNA histogram obtained in this case. Therefore, the address HPadd on the right side of the half peak of the mature erythrocyte population in the RNA histogram is detected, and the address 2HPadd twice that address is detected (STEP-11). As a result, the population on the right side of the double address 2HPadd can be calculated as reticulocytes (STEP-12). In addition, from the calculated reticulocytes, a parameter serving as an index of juvenile degree can be calculated for each amount of RNA in the reticulocytes (STEP-13). Furthermore, aggregates in reticulocytes can be measured based on the electrical signal detected by the forward large angle scattered light detector (FLs) 62 (STEP-14). With the above, a series End the measurement.
- FLs forward large angle scattered light detector
- a forward small angle scattered light detector (FSs) 61 a forward small angle scattered light detector (FSs) 61, a side scattered light detector (SS) 63, a first fluorescence detector (FL1) 64, and a second fluorescence detector (FL2) 65.
- FSs forward small angle scattered light detector
- SS side scattered light detector
- FL1 first fluorescence detector
- FL2 second fluorescence detector
- FIG. 6 are scattergrams of blood component cells showing the distribution state of platelets for the above-described determination of whether the sample staining is good or bad. .
- Reti is reticulocyte
- Pit is platelet
- RBC red blood cell
- GR leukocyte granulocyte
- MO monocyte
- LY lymphocyte
- ALY is atypical lymphocyte.
- the staining of secondary granules such as leukocyte eosinophils (EOS) and neutrophils (NEUT) is dyed a bright orange color by ataridine orange, which is related to the quality of staining.
- EOS leukocyte eosinophils
- NEUT neutrophils
- the staining of orange fluorescent component and the orange fluorescent component of platelets is weak compared to reticulocytes.
- the two dyeings are proportional. For example, when staining is insufficient, the orange fluorescent component of reticulocytes and platelets is not stained. Ie, red It can be said that the staining attitude of blood cells and platelets reflects the quality of staining. Therefore, the determination of the quality of staining in the ataridin orange staining may be performed using the staining attitude of platelets as an index as described below.
- [0045] is a scattergram of normalized DNAZ normalized RNA in a state of insufficient staining.
- the staining of RNA components in reticulocytes is insufficient, resulting in the same staining attitude as mature red blood cells, and the red blood cell distribution itself shifts to the lower left.
- the orange fluorescent component of the platelets becomes poorly stained and the platelet distribution also shifts to the lower left. If you do not realize that the staining is insufficient, and if you have a reticulocyte count, the reticulocyte count will be a false low.
- FIG. 6 (c) is a scattergram of normalized DNAZ normalized RNA with overstaining.
- the knock ground is increased and the fluorescence of mature erythrocytes becomes pseudo-excessive, so that they are counted as reticulocytes. For this reason, the reticulocyte count becomes a false high.
- the distribution of red blood cells shifts in the upper right direction. At the same time, the platelet distribution also shifts to the upper right for the same reason.
- the staining attitude of platelets is used as an index.
- a good staining state Fig. 6 (b)
- the distribution of platelets and erythrocytes and their distance are constant in the scattergram of normalized DNAZ normalized RNA. Therefore, if the staining is good, the distribution positions of platelets, red blood cells, and reticulocytes are stable, and the distribution distance is constant even if the staining is poor.
- the quality of staining of reticulocytes can be confirmed by the distribution position of platelets and the distribution distance of platelets, red blood cells, and reticulocytes in the normalized DNAZ standardized RNA scattergram.
- non-cell-derived particles such as dust in the cell suspension may increase the background of the measurement apparatus.
- scattergram standardized DNAZ standardized RNA scattergram
- non-cellular particles utilize the fact that both green and orange fluorescent components are very small compared to cells in the blood.
- Cell-derived particles such as cells such as red blood cells, reticulocytes, platelets, and broken cells such as broken red blood cells (FRC). It is easy to classify non-cell-derived particles such as dust ( Dust ) in the playing liquid.
- side scatter includes information on the shape and the amount of granules.
- shape (SS) and the amount of granules (SS) is not necessarily one. It ’s not to show only the information.
- FIG. 1 is a schematic explanatory diagram showing adjustment of a measurement sample.
- FIG. 2 is an explanatory diagram showing a system configuration as an apparatus for carrying out the particle classification method according to the present invention.
- FIG. 3 is a system diagram showing an outline of a flow cytometer as an embodiment of an apparatus for carrying out the particle classification method according to the present invention.
- FIG. 4 is a flowchart showing a program for executing a cell analysis method in blood components by a flow cytometer constituting the particle classification apparatus according to the present invention shown in FIG.
- FIG. 5 is an RNA histogram showing the distribution of reticulocytes obtained from the erythrocyte population detected and measured by the cell analysis method in blood components as the particle classification method according to the present invention.
- FIG. 6 are the distribution states of platelets, each indicating an indicator of the staining state of the sample adjusted in the cell analysis method for blood components as the particle classification method according to the present invention.
- D is a scattergram of blood component cells showing a state in which cells and non-cell-derived particles are classified in the method for analyzing cells in blood components as a particle classification method according to the present invention. It is a Yattagram.
- FSs Forward small-angle scattered light detector
- FLs Forward large-angle scattered light detector
- SS Side scattered light detector
- FL1 First fluorescence detector
- FL2 Second fluorescence detector
Abstract
アクリジンオレンジを用いて、血液中の細胞を正確に測定する粒子分類方法および装置を提供する。アクリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、血液中の細胞に光を照射するステップと、血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、血液中の細胞を分類するステップとにより血液中の細胞を分類する。
Description
粒子分類方法および装置
技術分野
[0001] 本発明は、血液中の細胞分類に関するものであって、特に網赤血球、赤血球およ び血小板を測定する粒子分類方法および装置に関するものである。
背景技術
[0002] 白血球分類と網赤血球測定を、蛍光染料であるアタリジンオレンジを用いて染色す ることにより、 1台の装置で測定することが提案されている (特許文献 1参照)。
[0003] さらには、白血球分類と網赤血球測定と血球計数を、蛍光染料であるアタリジンォ レンジを用いて染色することにより、 1台の装置で測定することが提案されている (特 許文献 2参照)。
[0004] 特許文献 1 :特開平 4 326061号公報
特許文献 2：特開平 5— 322882号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力し、従来にお!、ては、アタリジンオレンジによる染色の良否の判定にっ ヽて検 討されておらず、過染色または染色不十分であると網赤血球数など細胞の測定が正 確に行えな 、と 、う問題があった。
また、従来のフローサイトメータを使用した血液分析装置においては、染色試薬を 使用した試料の作成に際して、染色時間が例えば 30分以上必要となる問題があつ た。
さらに、細胞浮遊液にゴミなどの非細胞由来粒子の存在により、計測装置のバック グランドが上昇してしまうことがあった。
[0006] 従って、本発明の目的は、アタリジンオレンジを用いて血小板を染色の指標として 赤血球および/または血小板を正確に測定することにある。
[0007] また、本発明の目的は、アタリジンオレンジを用いて細胞を染色し、細胞の蛍光強 度を細胞の大きさや形状で規格化された値に基づいて血液中の細胞および非細胞
由来粒子を分類して、赤血球数および血小板数を正確に測定することにある。 課題を解決するための手段
[0008] 本発明の請求項 1に記載のアタリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する 粒子分類方法は、アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、 血液中の細胞に光を照射するステップと、血液中の血小板を染色の指標として染色 具合を判断するステップと、血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴 とする。
[0009] 本発明の請求項 2に記載のアタリジンオレンジを用いた血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するス テツプと、血液中の細胞に光を照射するステップと、細胞の蛍光強度を細胞の大きさ や形状で規格化するステップと、規格化された値に基づ!ヽて血液中の細胞を分類す るステップと、を有することを特徴とする。
[0010] 本発明の請求項 3に記載のアタリジンオレンジを用 V、て血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するス テツプと、血液中の細胞に光を照射するステップと、細胞の蛍光強度を細胞の大きさ や形状で規格化するステップと、血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判 断するステップと、規格化された値に基づ!ヽて血液中の細胞を分類するステップと、 を有することを特徴とする。
[0011] 本発明の請求項 4に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法にぉ ヽて、血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップは 、血小板のオレンジ蛍光成分および Zまたは緑色蛍光成分力 判断することを特徴 とする。すなわち、検出された電気信号に基づいて緑色に蛍光染色された部分 (緑 蛍光成分)とオレンジ色に蛍光染色された部分 (オレンジ蛍光成分)をそれぞれ細胞 の大きさ (FS)または形状 (SS)で規格ィ匕し、その規格ィ匕データ力 赤血球と血小板 の分布の中心値を計測し、その距離を算出することにより染色具合を判断する。なお 、アタリジンオレンジによる蛍光染色では、 2本鎖 DNAに対しては、塩基対間にイン ター力レートすることにより 530nmを中心とした蛍光 (緑)を、また RNA等 1本鎖核酸 に対しては、静電相互作用によりスタツキングを起こして 640nmを中心とした蛍光 (ォ
レンジ)を発するので、オレンジ蛍光成分と緑蛍光成分を判断基準として用いることが 可能となる。
[0012] 本発明の請求項 5に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、血液中の細胞に光を照射して発生した散乱光および蛍 光を電気信号として検出し、検出された電気信号に基づ 、て赤血球の RNAヒストグ ラムを作成し、前記 RNAのハーフピークの右側アドレスを検出すると共にその 2倍の アドレスを検出し、この右側の集団を網赤血球として分類することを特徴とする。
[0013] 本発明の請求項 6に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、血液中の細胞に光を照射し発生した前方散乱光および 蛍光を電気信号として検出し、細胞の緑およびオレンジの蛍光強度を細胞の大きさ や形状で規格ィヒしたスキヤッタグラムを用いて、赤血球、網赤血球、血小板などの細 胞および破砕細胞などの細胞由来粒子および浮遊液中のゴミなどの非細胞由来粒 子を分類することを特徴とする。
[0014] 本発明の請求項 7に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、血液中の細胞に照射される光の波長の中心波長は、 40 8nm、 445nm、 473nmまたは 488nmであることを特徴とする。
[0015] 本発明の請求項 8に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するス テツプは、アタリジンオレンジと緩衝液を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整 された試料を所定の温度に設定し、所定時間染色することを特徴とする。
[0016] 本発明の請求項 9に記載のアタリジンオレンジを用 V、た血液中の細胞を分類する 粒子分類方法においては、分類される細胞が、赤血球、血小板、破砕赤血球、有核 赤血球、マラリア原虫、ノ、ゥェルジョリ一小体であることを特徴とする。
[0017] 本発明の請求項 10に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射 する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、 側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、血小 板の染色の良否を判断する染色判断手段と、網赤血球または血小板を判断する手 段と、から構成することを特徴とする。
[0018] 本発明の請求項 11に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射 する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、 側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、細胞 の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化する規格化手段と、規格化された値に 基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段と、力 構成すること を特徴とする。
[0019] 本発明の請求項 12に記載の粒子分類装置においては、血液中の細胞に光を照射 する光源と、試料を流すフローセルと、前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、 側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、蛍光を検出する蛍光検出器と、細胞 の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化する規格化手段と、血小板の染色の良 否を判断する染色判断手段と、規格化された値に基づ!ヽて血液中の細胞および非 細胞由来粒子を分類する手段と、から構成することを特徴とする。
発明の効果
[0020] 本発明の請求項 1に記載の粒子分類方法においては、細胞が良好に染色された 細胞を測定するため、正確に血液中の細胞、特に網赤血球、赤血球および血小板 を分類し、測定することができる。
[0021] 本発明の請求項 2および請求項 3に記載の粒子分類方法においては、規格された 値に基づいて細胞を測定するため、精度よく血液中の細胞を分類し、測定することが できる。
[0022] 本発明の請求項 4に記載の粒子分類方法においては、血小板を染色の指標として 用いることにより、細胞が良好に染色された細胞を測定するため、正確に血液中の細 胞、特に網赤血球および血小板を分類し、測定することができる。
[0023] 本発明の請求項 5に記載の粒子分類方法においては、網赤血球を正確に分類し、 測定することが可能となる。
[0024] 本発明の請求項 6に記載の粒子分類方法においては、血液中の細胞および非細 胞由来粒子を分類して赤血球数および血小板数を正確に分類し、測定することが可 能となる。
[0025] 本発明の請求項 7に記載の粒子分類方法においては、血液中の細胞に照射され
る光の中心波長は、 408nm、 445nm、 473nmまたは 488nmであることにより、赤血 球の自家蛍光の影響をなくし、 SZNの良好な検出をすることが可能となる。
[0026] 本発明の請求項 8に記載の粒子分類方法においては、アタリジンオレンジと緩衝液 を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整された試料を所定の温度に設定し、所 定時間染色することにより、速やかに染色することが可能となる。
[0027] 本発明の請求項 9に記載の粒子分類方法にぉ 、ては赤血球、血小板、破砕赤血 球、有核赤血球、マラリア原虫、ハウェルジヨリー小体を正確に分類することが可能と なる。
[0028] 本発明の請求項 10に記載の粒子分類装置においては、良好に染色された細胞を 測定するため、正確に血液中の細胞、特に網赤血球および血小板を分類し、測定す ることがでさる。
[0029] 本発明の請求項 11および請求項 12に記載の粒子分類装置においては、細胞の 蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格ィ匕された値に基づ 、て、血液中の細胞およ び非細胞由来粒子を分類して、赤血球数および血小板数を正確に測定することがで きる。
発明を実施するための最良の形態
[0030] 次に、本発明に係る粒子分類方法および装置の実施例として、血液成分中の細胞 の分類を行う方法および装置について、図面を参照しながら以下詳細に説明する。
[0031] 図 1は、測定試料の調整を示す概略図である。まず、本発明に係る粒子分類方法 にお!/ヽては、血液中の細胞を含む血液成分からなる試料と染色試薬とを混合し反応 させて試料を調製し、前記試料を検出領域にぉ ヽて光を照射して試料に含まれる細 胞力 発生する散乱光および蛍光を電気信号として検出し、検出された電気信号に 基づいて血液成分中の細胞の分析を行うように設定される。
[0032] [測定試料の調製]
本発明においては、測定を行う試料として、血液成分として採取した試料の調製を 行う。この場合、図 1に示すように、所要量の染色試薬 10を一定量に分注する時に、 20〜50°Cの範囲に加温し、この加温され分注された染色試薬 10Aに、血液成分か らなる所定量の試料 20を添加して、 5〜： LO秒間攪拌し、このようにして得られた試料
30を 20〜50°Cの範囲に保温して、 10〜40秒間保持する。この結果、本発明にお いては、前記試料 30の調製を、 15〜60秒間において完了することができる。
[0033] しかるに、本実施例においては、前記染色試薬 10を lmLに分注し、この分注され た染色試薬 10Aに対し、測定目的細胞数が 1 X 107個 Z μ L程度に調製した前記試 料 20を 2 L添加する。また、前記染色試薬 10としては、色素濃度は ρΗ7.4のトリス 緩衝液で調整した 0.5〜1.5mgZdLのアタリジンオレンジを使用する。特に、色素濃 度が 0.75mgZdLが好適であり、この染色試薬 10を lmLに分注すると共にその分 注時に 45°Cに加温し、加温した lmLの染色試薬 10Aに 2 μ Lの前記試料 20を添カロ して 5秒間攪拌し、得られた試料を 45°Cに保温して 30秒間保持することにより、適正 な試料 30を調製できる。また、別途乾燥凍結したアタリジンオレンジに pH6.4〜pH8 .2のリン酸緩衝液ゃトリス緩衝液などの緩衝液と血液検体 20を順次カ卩えることにより 調製してちょい。
[0034] [調製された試料の測定および分析]
図 2は、本発明に係る血液成分中の細胞分類方法を実施するための装置としての システム構成を示すものである。すなわち、図 2において、参照符号 40は前述した試 料の調製を行う試料調製手段を示す。そして、参照符号 50はフローサイトメータであ つて、前記試料調製手段 40で調製された試料 30を、検出領域において光を照射す る光照射手段と、光照射された試料に含まれる細胞から発生する散乱光および蛍光 を電気信号として検出する細胞のパラメータ検出手段と、検出された細胞のパラメ一 タに基づいて血液成分中の細胞の分析を行う細胞分析手段とを備えたものとして構 成される。またプロセッサ 70により染色具合の判断や規格ィ匕が行なわれる。なお、フ ローサイトメータの場合、前記検出領域は、フローセルとして設定される。
[0035] 図 3は、本発明に係る血液成分中の細胞分類方法を実施するための装置の一実 施例としてのフローサイトメータの概略を示す系統図である。図 3において、参照符号 51は調製された試料の検出領域となるフローセルを示す。そして、このフローセル 5 1に対してレーザ光源 52が照射光集光レンズ 53を介して配置されて 、る。前記フロ 一セル 51において試料に照射されて得られる前方への散乱光は、散乱光集光レン ズ 54を介して、それぞれ前方小角散乱光検出器 (FSs) 61および前方大角散乱光
検出器 (FLs) 62によりそれぞれ検出されるように構成される。また、前記フローセル 5 1にお!ヽて試料に照射されて得られる側方への散乱光および蛍光は、ビームスプリツ タ 55を介して側方散乱光検出器 (SS) 63により検出されると共に、それぞれビームス プリッタ 56, 57および波長選択フィルタ 58, 59を介して、第 1蛍光検出器 (FL1) 64 および第 2蛍光検出器 (FL2) 65により検出されるように構成される。なお、ビームス プリッタの代りにダイクロイツクミラーを用いてもょ 、。
[0036] そこで、前記構成力もなるフローサイトメータ 50を使用して、本発明に係る血液成分 中の血液分析方法について、図 4に示すフローチャートを参照しながら説明する。
[0037] 最初に、前述した試料調整手段 40により調整された血液成分としての試料を、フロ 一サイトメータ 50のフローセル 51に供給して、試料の校正を開始する（STEP— 1)。 そこで、前方小角散乱光検出器 (FSs) 61と側方散乱光検出器 (SS) 63、第 1蛍光 検出器 (FL1) 64および第 2蛍光検出器 (FL2) 65により検出される電気信号に基づ V、て、赤血球と血小板の大きさ（FS)と、顆粒の量（SS)、 DNA量（FL1)と RNA量 ( FL2)を測定する（STEP— 2)。そして、 DNA量および RNA量をそれぞれその FS や SSで規格ィ匕してスキヤッタグラムを作成する。大きさで規格ィ匕した場合のスキヤッ タグラムは、細胞内 DNA濃度（cDNAc: cell DNA concentration)及び細胞内 R NA濃度（cRNAc: cell RNA concentration)のスキヤッタグラムを表している。そ のスキヤッタグラムに、ある閾値を設けて、赤血球と血小板 (血液中の細胞）、細胞由 来粒子および非細胞由来粒子を分類する（STEP— 3)。
[0038] このとき、例えば試料中に破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ノ、ゥェルジョリ 一小体が存在する場合は、図 6の（d)では 4つの分布 (赤血球、破砕赤血球、血小板 、ゴミ）が存在する。図 6の (a)〜 (c)に示すように、染色試料が良好な染色である場 合、規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにお!、て血小板の分布と網赤血 球を含む赤血球の分布はある一定の距離関係にある。また、染色が良好であれば、 規格ィ匕 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにぉ 、て、血小板の分布位置が一定 である〔図 6の（b)〕。しかし、染色が不良で薄かったり〔図 6の（a)〕、濃かったり〔図 6 の（c)〕すると、血小板の分布位置が変動する。この血小板の分布位置が一定である ことを確認することで、試料の染色の良'不良の確認判定を行う（STEP— 4および S
TEP— 5)。
[0039] 規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにおいて、網赤血球は赤血球分布 の cRNAcが高い領域に出現する。破砕赤血球は、赤血球分布および血小板分布 の中間部分に多く出現する。有核赤血球は核を持ち DNA成分を多く有するため、 規格ィ匕 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにぉ 、て、赤血球および血小板とは 異なる領域に現れる。同様に、ハウェルジヨリー小体は DNAで構成される核断片で あるため、赤血球および血小板とは異なる領域に現れる。また、全てのマラリア原虫 は蛍光を発するため、規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにおいて、赤血 球および血小板とは異なる領域に現れる。
[0040] 前記試料の染色の良'不良の確認判定により、染色が不良であれば、再度試料を 作り直して前述した STEP— 1からの測定を行うように設定される（STEP— 5および S TEP— 6)。染色の結果が良好であれば、調製された試料を前記フローサイトメータ 5 0のフローセル 51に流して、試料の測定を開始する（STEP— 7)。なお、このような試 料の染色の良 ·不良の確認判定の指標については、後述する。
[0041] まず、前方小角散乱光検出器 (FSs) 61と側方散乱光検出器 (SS) 63、第 1蛍光検 出器 (FL1) 64および第 2蛍光検出器 (FL2) 65により検出される電気信号に基づ 、 て、赤血球と血小板の大きさ（FS)と、顆粒の量（SS)、 DNA量（FL1)と RNA量（FL 2)を測定する（STEP_8)。そして、 DNA量および RNA量をそれぞれその大きさで 規格ィ匕してスキヤッタグラムを作成する。そのスキヤッタグラムにある閾値を設けて、赤 血球と血小板を分類して、その数を算出する（STEP— 9)。赤血球の RNAヒストグラ ムを作成する（STEP— 10)。図 5は、この場合に得られる RNAヒストグラムの一例で ある。そこで、前記 RNAヒストグラムの成熟赤血球集団のハーフピークの右側のアド レス HPaddを検出し、そのアドレスの 2倍のアドレス 2HPaddを検出する（STEP— 11 )。これにより、前記 2倍のアドレス 2HPaddより右側の集団を、網赤血球として算出す ることができる（STEP— 12)。また、前記算出された網赤血球から、網赤血球中の R NA量の多さ毎に幼若度具合の指標となるパラメータを算出することができる（STEP — 13)。さらに、前方大角散乱光検出器 (FLs) 62により検出される電気信号に基づ いて、網赤血球中の凝集物を測定することができる（STEP— 14)。以上により、一連
の測定を終了する。
[0042] 次に、本発明に係る血液成分中の血小板分析方法について、図 4に示すフローチ ヤートを参照しながら説明する。前述した STEP— 1〜STEP— 6までの試料の染色 の良 ·不良の確認判定を行う工程は同じであるので省略する。そこで、試料の染色の 良 ·不良の確認判定を行った結果 (STEP— 5)、染色が良好であれば、血小板数測 定の設定を行う（STEP— 15)。次いで、調製された試料を前記フローサイトメータ 50 のフローセル 51に流して、試料の測定を開始する（STEP— 16)。まず、前方小角散 乱光検出器 (FSs) 61と側方散乱光検出器 (SS) 63、第 1蛍光検出器 (FL1) 64およ び第 2蛍光検出器 (FL2) 65により検出される電気信号に基づいて、赤血球と血小板 の大きさ（FS)と、顆粒の量（SS)、 DNA量（FL1)と RNA量 (FL2)を測定する（ST EP-17)。そして、 DNA量および RNA量をそれぞれその FSや SSで規格化してスキ ャッタグラムを作成する。そのスキヤッタグラムにある閾値を設けて、赤血球と血小板、 その他の粒子を分類する（STEP— 18)。そして、血小板のヒストグラムを作成して血 小板数を算出する（STEP— 19)。また血小板の RNAヒストグラムから RNA量の多さ ごとに幼若度具合の指標となる網血小板数を測定する（STEP— 20)。この方法によ つて正確に血小板数、網血小板数を測定することができる。
[0043] 図 6の（a)、 (b)、 (c)は、前述した試料の染色の良 ·不良の確認判定を行うための 血小板の分布状態を示す血液成分細胞のスキヤッタグラムである。縦軸を規格化 D NAとし、横軸を規格化 RNAとしてスキヤッタグラムを作成する。それぞれ染色が不 十分な状態〔図 6の (a)〕、良好な染色状態〔図 6の (b)〕、過染色状態〔図 6の (c)〕を 示す。なお、図中において、 Retiは網赤血球、 Pitは血小板、 RBCは赤血球、 GRは 白血球顆粒球、 MOは単球、 LYはリンパ球、 ALYは異型リンパ球をそれぞれ示す。
[0044] 白血球の好酸球 (EOS)や好中球 (NEUT)などの 2次顆粒の染まり具合は、染色 の良否に関係なぐアタリジンオレンジにより鮮やかなオレンジ色に染まる。一方、網 赤血球のアタリジンオレンジによりオレンジ色に染まった蛍光成分 (以下、「オレンジ 蛍光成分」とする）と、血小板のオレンジ蛍光成分の染まり具合は、網赤血球に比べ て微弱であり、その 2つの染まり方は比例している。例えば、染色が不十分な場合に おいて、網赤血球、血小板のオレンジ蛍光成分は染まっていない。すなわち、網赤
血球と血小板の染色態度は、染色の良否を反映しているということができる。そこで、 アタリジンオレンジ染色における染色の良否判定は、以下に説明するように血小板の 染色態度を指標にするとよい。
[0045] (1)〔図 6の（a)〕は、染色が不十分な状態の規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッ タグラムである。この場合、網赤血球中の RNA成分の染色が不十分なため成熟赤血 球と同じ染色態度となり、その赤血球分布自体が左下側にシフトする。同時に、血小 板のオレンジ蛍光成分も染色不良となり、血小板分布も左下方向にシフトする。もし、 染色不十分であることに気が付かずに、網赤血球カウントをしたら、網赤血球数は偽 低値となる。
(2)〔図 6の（c)〕は、染色が過染色な状態の規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッ タグラムである。この場合、ノ ックグラウンドが上がり、成熟赤血球の蛍光が擬似的に 過剰となるため、網赤血球としてカウントされてしまう。このため、網赤血球数は偽高 値となる。また赤血球の分布が右上方向にシフトする。これと同時に、同様の理由で 血小板分布も右上方向にシフトする。
(3)そこで、血小板の染色態度を指標にする。良好な染色状態〔図 6の (b)〕におい ては、規格化 DNAZ規格化 RNAのスキヤッタグラムにおいて、血小板と赤血球の分 布とその距離は一定である。そこで、染色が良好であれば、血小板と赤血球、網赤血 球の分布位置は安定しているし、染色が不良であってもその分布距離は一定であり
、同じように変動することから、網赤血球の染色の良否は規格化 DNAZ規格化 RN Aのスキヤッタグラムにおける血小板の分布位置と、血小板と赤血球、網赤血球の分 布距離で確認できる。
[0046] 細胞浮遊液にゴミ (Dust)などの非細胞由来粒子の存在により、計測装置のバック グランドが上昇してしまうことがある。この場合には、細胞の緑およびオレンジの蛍光 強度を細胞の大きさや形状で規格化したスキヤッタグラム (規格化 DNAZ規格化 R NAのスキヤッタグラム）を用いて、図 6の（d)に示すように、規格化 DNAZ規格化 R NAのスキヤッタグラムにお!、て、非細胞粒子は血液中の細胞と比較して緑とオレン ジの両方の蛍光成分が非常に小さいことを利用し、赤血球、網赤血球、血小板など の細胞および破砕赤血球 (FRC)などの破砕細胞などカゝらなる細胞由来粒子と、浮
遊液中のゴミ（Dust)などの非細胞由来粒子とを、容易に分類することができることが ゎカゝる。
[0047] 以上、本発明の好適な実施例について説明したが、本発明は前記実施例に限定さ れることなぐ本発明の精神を逸脱しない範囲内において多くの設計変更を行うこと が可能である。例えば、側方散乱 (SS)には、形状と顆粒の量の情報を含むことは当 業者にとって明らかであり、本記載において、形状 (SS)や顆粒の量 (SS)との記載 は必ずしも一方の情報のみを示すことはな 、ことは 、うまでもな!/、。
図面の簡単な説明
[0048] [図 1]測定試料の調整を示す概略説明図である。
[図 2]本発明に係る粒子分類方法を実施する装置としてのシステム構成を示す説明 図である。
[図 3]本発明に係る粒子分類方法を実施するための装置の一実施例としてのフロー サイトメータの概略を示す系統図である。
[図 4]図 3に示す本発明に係る粒子分類装置を構成するフローサイトメータにより血液 成分中の細胞分析方法を実施するプログラムを示すフローチャート図である。
[図 5]本発明に係る粒子分類方法としての血液成分中の細胞分析方法において検 出および測定される赤血球集団から得られる網赤血球の分布を示す RNAヒストグラ ムである。
[図 6] (a)、（b)、（c)はそれぞれ本発明に係る粒子分類方法としての血液成分中の 細胞分析方法において調整された試料の染色状態のそれぞれ指標を示す血小板 の分布状態を示す血液成分細胞のスキヤッタグラム、 (d)は本発明に係る粒子分類 方法としての血液成分中の細胞分析方法にお!、て、細胞および非細胞由来粒子が 分類された状態を示すスキヤッタグラムである。
符号の説明
[0049] 10 染色試薬
10A 分注された染色試薬
20 血液成分としての試料
30 調製された試料
試料調製手段
フローサイトメータ
フローセノレ
レーザ光源
照射光集光レンズ
散乱光集光レンズ
、 56、 57 ビームスプリッタ 、 59 波長選択フィルタ
前方小角散乱光検出器 (FSs) 前方大角散乱光検出器 (FLs) 側方散乱光検出器 (SS) 第 1蛍光検出器 (FL1) 第 2蛍光検出器 (FL2) プロセッサ
Claims
[1] アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法において、 アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、
血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特徴とする粒子分類方法。
[2] アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法にぉ 、て、 アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化するステップと、
規格化された値に基づ ヽて血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特 徴とする粒子分類方法。
[3] アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を分類する粒子分類方法にぉ 、て、 アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップと、
血液中の細胞に光を照射するステップと、
細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化するステップと、
血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップと、
規格化された値に基づ ヽて血液中の細胞を分類するステップと、を有することを特 徴とする粒子分類方法。
[4] 血液中の血小板を染色の指標として染色具合を判断するステップは、血小板のォ レンジ蛍光成分および Zまたは緑蛍光成分力 判断することを特徴とする請求項 1 又は 3記載の粒子分類方法。
[5] 血液中の細胞に光を照射して発生した散乱光および蛍光を電気信号として検出し 、検出された電気信号に基づいて赤血球の RNAヒストグラムを作成し、前記 RNAの ハーフピークの右側アドレスを検出すると共にその 2倍のアドレスを検出し、この右側 の集団を網赤血球として分類することを特徴とする請求項 1な 、し 4の ヽずれかに記 載粒子分類方法。
[6] 血液中の細胞に光を照射し発生した前方散乱光および蛍光を電気信号として検出
し、細胞の緑およびオレンジの蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格ィ匕したスキヤッ タグラムを用 、て、細胞や破砕細胞などの細胞由来粒子および非細胞由来粒子を 分類することを特徴とする請求項 1な!ヽし 5の ヽずれかに記載の粒子分類方法。
[7] 血液中の細胞に照射される光の波長の中心波長は、 408nm、 445nm、 473nmま たは 488nmであることを特徴とする請求項 1な 、し 6の 、ずれかに記載の粒子分類 方法。
[8] アタリジンオレンジを用いて血液中の細胞を染色するステップは、アタリジンオレン ジと緩衝液を含む染色試薬と血液検体を混合させて調整された試料を所定の温度 に設定し、所定時間染色することを特徴とする請求項 1な 、し 7の 、ずれかに記載の 粒子分類方法。
[9] 分類される細胞が、赤血球、血小板、破砕赤血球、有核赤血球、マラリア原虫、ハ ゥェルジョリ一小体であることを特徴とする請求項 1な 、し 8の 、ずれかに記載の粒子 分類方法。
[10] 血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
血小板の染色の良否を判断する染色判断手段と、
網赤血球または血小板を判断する手段と、カゝら構成することを特徴とする粒子分類 装置。
[11] 血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化する規格化手段と、
規格化された値に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段
と、から構成することを特徴とする粒子分類装置。
血液中の細胞に光を照射する光源と、
試料を流すフローセルと、
前方散乱光を検出する前方散乱光検出器と、
側方散乱光を検出する側方散乱光検出器と、
蛍光を検出する蛍光検出器と、
細胞の蛍光強度を細胞の大きさや形状で規格化する規格化手段と、
血小板の染色の良否を判断する染色判断手段と、
規格化された値に基づいて血液中の細胞および非細胞由来粒子を分類する手段 と、から構成することを特徴とする粒子分類装置。
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