MXPA96005787A - Deteccion de reticulocitos - Google Patents

Abstract

Un proceso para determinar la población de reticulocitos en muestras de sangre, cuyo proceso incluye el uso de corifosfina o para manchar reticulocitos, y cuyo proceso es particularmente adecuado para la detección mediante técnicas de citometría de flujo. Laóptica (10) de un citómetro de flujoútil en el proceso, incluye un dispositivo de láser de ion de argón (12) como una fuente de luz, que ilumina una muestra de sangre que fluye a través de una celda de flujo (14). La luz dispersada y la fluorescencia caen sobre un espejo dicroico (22), que sirve para reflejar la luz dispersada enángulo recto (24), y para transmitir la fluorescencia (26). Un espejo dicroico (30) sirve para reflejar la fluorescencia verde (32) y transmitir la fluorescencia roja (38). La figura más representativa de la invención es la número 1.

Description

DETECCIÓN DE RETICULOCITOS Campo Técnico La presente invención se refiere a la detección y enumeración de reticulocitos en una muestra de sangre. Más particularmente, la presente invención se refiere a un colorante que es adecuado para manchar ácido ribonucleico (ARN) , y polímeros de ácido ribonucleico, y es particularmente adecuada para detectar reticulocitos mediante técnicas de citometría de flujo de fluorescencia. Técnica Antecedente Los reticulocitos son glóbulos rojos sanguíneos (GRS) inmaduros de los cuales se ha perdido el núcleo. Se sabe que los reticulocitos contienen ARN, y la detección y enumeración de los reticulocitos en una muestra de sangre es valiosa para los clínicos. La cuenta de reticulocitos de una muestra de sangre se ha utilizado como un indicador de la actividad eritropoyética, como un valor de diagnóstico y pronóstico en hemorragia aguda, anemia hemolítica, y trasplante de médula ósea, y como una medida de respuesta a la terapia con hierro, vitamina B12, y ácido fólico. Como se sabe en la técnica, los reticulocitos son precursores de glóbulos rojos sanguíneos maduros, y por consiguiente, el término reticulocito abarca la evolución y el desarrollo de la célula mediante lo cual se genera un glóbulo rojo sanguíneo maduro.

En el pasado, los reticulocitos en una muestra de sangre se han determinado tanto mediante métodos manuales como automatizados, mediante la utilización de manchas apropiadas tales como nuevo azul de metileno (NAM) , azul de cresilo brillante (ACB) , naranja de acridina, y pironina Y, y naranja de tiazol . El manchado vital con el colorante nuevo azul de metileno se considera como el método de referencia para las determinaciones de reticulocitos, y en el uso, este colorante precipita el ARN. El método es manual, requiere de la cuenta de grandes números (por ejemplo, 500 a 1000) de células con un microscopio, es lento, tedioso, y está sujeto a errores estadísticos. El nuevo azul de metileno no es fluorescente, y con frecuencia es difícil de diferenciar el ARN verdaderamente precipitado de la mancha precipitada. El naranja de acridina ha tenido algún uso en el manchado de reticulocitos tanto con procedimientos manuales como automatizados. El naranja de acridina precipita el ARN; esto impide hacer estimaciones cuantitativas del contenido de ARN, debido al sofocamiento potencial. Más aún, el naranja de acridina no conduce a una distribución fluorescente difusa de las células manchadas . Los perfiles de edad de las células (basándose en el contenido de ARN que es proporcional a la fluorescencia) no son confiables. El naranja de acridina tiene una gran afinidad para la tubería plástica en citómetros de flujo, lo cual conduce a un mayor fondo y a largos procedimientos para remover el colorante de la tubería de citómetro de flujo. En adición, las células manchadas con naranja de acridina son difíciles de separar del pico celular rojo autofluorescente, y la cuenta de reticulocitos normalmente es más baja que la obtenida con el nuevo azul de metileno. El uso de pironina Y requiere la fijación previa de los eritrocitos con formalina; esto es problemático, tardado, y en general da malos resultados. Más aún, la pironina Y tiene muy baja eficiencia de quantum, conduciendo a señales fluorescentes muy bajas. Un ejemplo de la utilización de naranja de tiazol para detectar reticulocitos, se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,883,867, expedida el 28 de noviembre de 1989, la cual es una Continuación Parcial de la Solicitud con Número de Serie 793,813, presentada el Io de noviembre de 1985, ahora abandonada . Un ejemplo de la utilización de tioflavina T para detectar reticulocitos, se puede encontrar en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,571,388, expedida el 18 de febrero de 1986. Shapiro, Howard M. Practical Flow Cytometry. página 144, Alan R. Liss, Inc. 1985, en la Tabla 7-3, enlista compuestos heteroaromáticos tricíclicos para manchar ADN y/o ARN. Aunque la Tabla 7-3 enlista corifosfina 0 (CPO) , sin embargo, no incluye CPO como un reticulocito o mancha de ARN. Descripción de la Invención La presente invención proporciona un colorante y reactivos que incorporan a este colorante para la determinación cuantitativa de reticulocitos en la sangre entera. La presente invención proporciona un proceso para la determinación cuantitativa de reticulocitos, en donde el colorante es corifosfina O. La presente invención proporciona además un método para detectar reticulocitos, el cual incluye manchar una muestra con corifosfina 0; excitar la muestra con luz de una longitud de onda de excitación; y medir la fluorescencia emitida a partir de esta muestra. También se proporciona un método para detectar reticulocitos, en donde la muestra se excita y se mide la fluorescencia por medio de un citómetro de flujo. La presente invención proporciona además un método para manchar diferencialmente células, provocando una menor interferencia por las plaquetas, los glóbulos rojos sanguíneos nucleados, y los Cuerpos de Howell-Jolly. La presente invención proporciona un método para manchar células, cuyo método produce un complejo de ARN-colorante, que es más estable que los complejos producidos por otros métodos conocidos, y que da como resultado un incremento en el tiempo durante el cual se puede ver el color total generado por el complejo de ARN-colorante. Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra un diagrama esquemático de la óptica de un citómetro de flujo que se puede emplear en la implementación del método de la presente invención. La Figura 2 muestra un ejemplo del histograma citométrico de flujo de un donador normal. La Figura 3 muestra un ejemplo del histograma citométrico de flujo de un paciente anormal (alto) . La Figura 4 muestra una curva de dosis/respuesta de ARN y reactivo de corifosfina 0. La Figura 5 muestra la correlación de un método de corifosfina 0 de la presente invención, contra un método de naranja de tiazol. La Figura 6 muestra la estabilidad de la corifosfina 0. La Figura 7 da un análisis de glóbulos rojos sanguíneos y plaquetas. La Figura 8 da un análisis de glóbulos rojos sanguíneos y glóbulos blancos sanguíneos . Modos para Realizar la Invención Para mayor conveniencia, el colorante de la invención para manchar reticulocitos es referido como corifosfina 0 (CPO), también conocido como amarillo básico 7. La corifosfina O está disponible en Pfaltz & Bauer, Inc. División de Aceto Corporation, Waterbury, Connecticut. El solicitante ha descubierto que la corifosfina 0 es un colorante efectivo para manchar reticulocitos. La función de la mancha del reticulocito es delinear adicionalmente el reticulocito para enumeración de dispersión de luz en un citómetro de flujo. Por consiguiente, mediante la utilización de corifosfina 0 como la mancha, es posible detectar y enumerar los reticulocitos en una muestra de sangre entera. La corifosfina 0 es un colorante de fluorocromo que no precipita el ácido ribonucleico intracelular del reticulocito. El uso de corifosfina 0 ofrece la ventaja de manchar diferencialmente las células, provocando menos interferencia por las plaquetas, los glóbulos rojos sanguíneos nucleados, y los Cuerpos de Howell-Jolly . La corifosfina O ofrece la ventaja adicional de incrementar la estabilidad del complejo de ARN-colorante, incrementado de esta manera el tiempo durante el cual se puede ver el color total generado por el complejo de ARN-colorante. El color generado de esta manera estable durante un período de tiempo mucho más largo que los colorantes utilizados en la técnica, por ejemplo, el color generado mediante el uso de naranja de tiazol es estable durante aproximadamente 2 horas, mientras que el color generado mediante el uso de corifosfina 0 es estable durante aproximadamente 8 a 24 horas . De conformidad con la presente invención, cuando se manchan reticulocitos en una muestra de sangre, de preferencia se emplea corifosfina 0 como una solución acuosa, de preferencia en una solución salina isotónica, y más preferiblemente en ISOTON" II, Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 3,962,125, Coulter Corporation, Miami, Florida, en una concentración de corifosfina 0 de aproximadamente .8 a 80 miligramos/li ro, de preferencia de 1 a 40, y más preferiblemente de 5 a 10 miligramos/litro, cuya solución puede contener una cantidad menor de metanol. La muestra de sangre, que puede ser sangre entera o una fracción de sangre, se mancha con la solución de corifosfina 0 mezclando la muestra de sangre con la solución de corifosfina 0. Los volúmenes de muestra de sangre y solución utilizados son tales que las concentraciones de glóbulos rojos sanguíneos son suficientes para pasar a través del instrumento. Por consiguiente, la concentración está en la escala de 1:50 a 1:5,000, de preferencia de 1:100 a 1:1,000, y más preferiblemente de 1:200 a 1:800. Luego la muestra se incuba durante un mínimo de aproximadamente 60 segundos a aproximadamente 8 horas, de preferencia 30 minutos, y luego se pasa a través de un citómetro de flujo. El solicitante ha descubierto que la corifosfina 0 es una mancha vital, y de acuerdo con lo anterior, no se requiere la fijación. La corifosfina 0, cuando se desenlaza del ácido ribonucleico (ARN) proporciona poca o ninguna fluorescencia roja, y exhibe un fuerte pico de absorción en aproximadamente 491.5 nanómetros. Cuando se enlaza la corifosfina 0 al ARN en los reticulocitos, las propiedades ópticas de la misma cambian dramáticamente. En particular, cuando se enlaza la corifosfina 0 con el ARN en los reticulocitos, exhibe una fuerte fluorescencia roja. El máximo de excitación está en aproximadamente 491.5 nanómetros, y el máximo de emisión está en aproximadamente 630 a 700 nanómetros. dando un cambio de Stokes de aproximadamente 160 nanóme ros. Como un resultado del pico de excitación de la corifosfina 0 enlazada que es del orden de aproximadamente 490 nanómetros, en la utilización del citómetro de flujo automático, la fuente de luz puede ser una lámpara de mercurio que tenga una línea de energía en aproximadamente 485 nanómetros, o un dispositivo de láser de ion de argón que tenga una fuerte emisión en aproximadamente 488 nanómetros. Aunque la excitación se puede efectuar en otras longitudes de onda, los reticulocitos manchados con corifosfina O de preferencia se excitan en una longitud de onda de aproximadamente 450 nanómetros a aproximadamente 500 nanómetros . Cuando la corifosfina 0 se desenlaza del ácido desoxirribonucleico (ADN) en los glóbulos blancos sanguíneos, proporciona poca o ninguna fluorescencia verde, mientras que cuando la corifosfina 0 se enlaza con el ADN en los glóbulos blancos sanguíneos, exhibe una fuerte fluorescencia verde. La falta de fluorescencia del colorante de corifosfina cuando no se enlaza con el ácido nucleico, proporciona un bajo fondo, y permite a un operador seleccionar un umbral fluorescente (o "compuertas") para un citómetro de flujo automático. Debido a que la corifosfina 0 cuando se enlaza con el ARN, emite fluorescencia roja, y cuando se enlaza con ADN, emite fluorescencia verde, el uso de corifosfina 0 ofrece la ventaja de manchar diferencialmente las células, provocando menos interferencia por las plaquetas, los glóbulos rojos sanguíneos nucleados, los glóbulos blancos sanguíneos, y los Cuerpos de Howell-Jolly . Esto hace posible dar compuerta a los glóbulos rojos sanguíneos, y por consiguiente, obtener una cuenta más precisa. Además cuando se enlaza la corifosfina 0, la cantidad o intensidad de fluorescencia verde es proporcional a la cantidad de fondo o manchado no específico, debido al enlace de la corifosfina 0 a "otras" estructuras. Estas estructuras o elementos celulares incluyen ADN y vesículas subcelulares tales como lisosomas, endosomas, y granulos. Cada uno de estos elementos se enlaza con la corifosfina 0 de una manera diferente, dando como resultado diferentes cantidades de fluorescencia. Sin embargo, solamente el ARN de una sola cadena se enlazará con la corifosfina O, y la fluorescencia solamente será roja. Determinamos la máxima cantidad de fluorescencia verde de la población de glóbulos rojos sanguíneos maduros como el "umbral" tanto para los glóbulos rojos sanguíneos como para los reticulocitos. Todas las demás células tendrán una fluorescencia verde arriba de este umbral. La diferencia en la intensidad de fluorescencia verde ofrece la ventaja de manchar diferencialmente las células, haciendo posible dar compuerta hacia afuera a las células no específicas, tales como plaquetas y glóbulos blancos sanguíneos . El colorante de corifosfina O no precipita el ARN, y como resultado, los reticulocitos manchados con corifosfina 0 mantienen una distribución relativamente homogénea del ARN intracelular, mediante lo cual, hay una relación casi lineal entre la señal fluorescente medida para un reticulocito individual y su contenido de ARN. Clínicamente, esto proporciona al médico información adicional más allá de la cuenta de reticulocitos, en que el contenido de ARN es una función de la edad del reticulocito. De conformidad con lo anterior, mediante la utilización de corifosfina O, un clínico tiene la capacidad para obtener los perfiles de edad de los reticulocitos, así como simples cuentas de reticulocitos. En el uso de corifosfina 0 para manchar reticulocitos en una muestra de sangre, las señales fluorescentes a partir de los reticulocitos manchados están bien separadas de aquellas de los eritrocitos maduros, mediante lo cual, se pueden leer directamente los resultados en un citómetro de flujo automático sin una extensa manipulación de datos . Los reticulocitos, el ARN, o el ADN manchados con corifosfina 0, aunque de preferencia se enumeran en un citómetro de flujo automático, también se pueden contar mediante un procedimiento manual o por microscopio automatizado. El concepto fundamental de la citometría de flujo es esencialmente el paso de las células, una a la vez, a través de una región de detección específica. Por medio de enfoque hidrodinámico, las células sencillas se pasan a través de la zona de detección, que consiste en una fuente de luz de láser enfocada y un sistema de detección para la medición de la luz dispersada y fluorescente. Los citómetros de flujo automáticos son bien conocidos en la técnica, y la presente invención no se limita al uso de cualquier citómetro de flujo particular. Un ejemplo específico de la óptica de un citómetro de flujo empleado en la presente invención se describe más adelante en la presente con referencia a la Figura l.La óptica mostrada en la Figura 1 se utiliza en un citómetro de flujo para medir la luz dispersada en ángulo recto, la fluorescencia roja, y la fluorescencia verde. La óptica generalmente indicada por 10 utiliza un dispositivo de láser de ion de argón 12 como una fuente de luz, y opera en una longitud de onda de 488 nanómetros, produciendo una salida de 15 mW. La luz emitida desde el dispositivo de láser 12 se hace converger mediante un lente cilindrico 16, e ilumina una muestra de sangre que fluye a través de una celda de flujo 14 en un elemento convencional . Cuando los glóbulos rojos sanguíneos manchados en la muestra son irradiados por la luz de láser, producen luz dispersada y fluorescencia. La luz dispersada en ángulo recto y la fluorescencia convergen con un lente condensador 18, y pasan a través de una abertura 20 para caer sobre un espejo dicroico 22. El espejo dicroico 22 refleja la luz dispersada en ángulo recto 24, y transmite la fluorescencia 26. La luz dispersada en ángulo recto 24 reflejada desde el espejo dicroico 22, se detecta en un tubo fotomultiplicador o fotodiodo 28. De la fluorescencia 26 que pasa a través del espejo dicroico 22, la fluorescencia verde 32 se refleja mediante un espejo dicroico 30, y la fluorescencia roja 38 se transmite a través de ese espejo. La fluorescencia verde reflejada 32 pasa a través de un filtro de color 34, y se detecta en un tubo fotomultiplicador 36. La fluorescencia roja transmitida 38 pasa a través de un filtro de color 40, y se detecta en un tubo fotomultiplicador 42.

• ' Por consiguiente, por ejemplo, los reticulocitos manchados con corifosfina 0, se pueden detectar y enumerar en el citómetro de flujo Coulter'"' XL vendido por Coulter Corporation, Miami, Florida. En la utilización de estos citómetros de flujo automáticos, se establecen compuertas fluorescentes mediante la utilización de la posición de los glóbulos rojos maduros en la muestra, y luego se establecen las compuertas fluorescentes para enumerar los reticulocitos. El uso de un citómetro de flujo automático para la detección y enumeración de los reticulocitos manchados con corifosfina 0, proporciona resultados que se correlacionan estrechamente con los resultados obtenidos mediante un método convencional conocido para enumerar reticulocitos que utilice azul de metileno o naranja de acridina, o naranja de tiazol. El uso de reticulocitos manchados con corifosfina 0 en un citómetro de flujo automático, es particularmente conveniente, porque hay un fondo de baja fluorescencia, y se pueden seleccionar fácilmente compuertas fluorescentes. Más aún, no hay precipitación del ARN del reticulocito intracelular, mediante lo cual, no se necesitan fijar las células. En adición, hay una relación lineal entre la señal fluorescente para un reticulocito individual, que proporciona información con respecto a la edad del reticulocito. Los reticulocitos manchados con corifosfina 0, aunque de preferencia se enumeran en un citómetro de flujo automático, también se pueden contar mediante un procedimiento manual o mediante un microscopio automatizado. De conformidad con lo anterior, el presente método incluye los pasos de: (a) mezclar una muestra de sangre que se va a probar, con la composición del reactivo objeto, incluyendo la composición colorante derivada objeto, para formar una suspensión de células; (b) incubar dicha suspensión de células durante un período de tiempo no menor de 1 minuto y no mayor de 24 horas, a una temperatura no menor de 2°C y no mayor de 25 °C; (c) medir la fluorescencia derivada de las células en un citómetro de flujo; (d) generar los histogramas de datos correlacionados de la fluorescencia roja contra la fluorescencia verde pasada, y el dispersor de luz (LFS vs SS) ; (e) seleccionar el umbral de fluorescencia de la población de reticulocitos; y (f) calcular el reticulocito total como un porcentaje de reticulocitos por glóbulos rojos sanguíneos totales (glóbulos rojos sanguíneos totales en miles de millones/mililitro) a partir de un analizador de hematología, tal como el COULTER STKS (Coulter Corporation, Miami, Florida) . El siguiente ejemplo no limitante ilustra diferentes características de la presente invención. El siguiente ejemplo del manchado se utiliza para obtener los resultados ilustrados en las Figuras 4 a 8. EJEMPLO 1 Se recolectó una muestra en EDTA de trifosfato (K3EDTA) . Se agregaron 0.002 mililitros de muestra de sangre entera de un paciente a 0.1 mililitros de reactivo. La muestra se mezcló y se dejó incubar a la temperatura ambiente un mínimo de 15 minutos pero no más de 8 horas. Luego la muestra se mezcló nuevamente justo antes del análisis en un citómetro de flujo XL calibrado. Las Figuras 2 a 4 muestran los datos para el análisis de reticulocitos de sangre normal y anormal utilizando corifosfina 0. En particular, la Figura 2 muestra un histograma de fluorescencia de sangre de una persona normal, que demuestra la distribución de los eventos de eritrocitos detectados por el tubo fotomultiplicador de 525 nanómetros, y por el tubo fotomultiplicador de 630 nanómetros. Como se muestra en la Figura 2, la región E delinea el reticulocito separado de los glóbulos blancos sanguíneos y de las plaquetas . La Figura 3 muestra un histograma de fluorescencia de una sangre anormal, que demuestra la distribución de eventos de eritrocitos detectados por el tubo fotomultiplicador de 525 nanómetros y por el tubo fotomultiplicador de 630 nanómetros. Como se puede ver en la Figura 3 , hay un mayor número de eventos en el área del reticulocito (región E) . Como se muestra en la Figura 3, la corifosfina 0 reacciona específicamente con el ARN, y un incremento en la cantidad de ARN en la muestra da como resultado un incremento en la fluorescencia. La Figura 4 muestra una gráfica de la respuesta a la dosis para el reactivo, cuando se mezcla con cantidades crecientes de ácido ribonucleico (ARN) . Mientras más ARN se agregue, más se incrementa la intensidad de fluorescencia. La Figura 5, por consiguiente, muestra la correlación de un método de corifosfina O de la presente invención, contra un método de naranja de tiazol (método de referencia) . Como se muestra en la Figura 5, los resultados son los mismos para la corifosfina 0 que con el método de referencia. Por consiguiente, la corifosfina 0 es una medida de reticulocitos. La Figura 6 demuestra la estabilidad de la corifosfina 0, como una función del tiempo contra el porcentaje de reticulocitos. La Figura 6 muestra que, después de mezclar la sangre con el reactivo, se necesitan aproximadamente 15 minutos para establecer el equilibrio. Una vez que se establece el equilibrio, el complejo de corifosfina 0-ARN permanece estable durante cuando menos 8 horas. El naranja de tiazol, el naranja de acridina, y la tioflavina T, por otra parte, tienen una estabilidad de menos de 2 horas. La Figura 7 da un análisis de glóbulos rojos sanguíneos y plaquetas. Se utilizaron muestras con una mayor cantidad de plaquetas. El análisis de los glóbulos rojos sanguíneos y de las plaquetas, muestra que la distribución de plaquetas es diferente de la distribución de reticulocitos. La Figura 8 da un análisis de glóbulos rojos sanguíneos y de glóbulos blancos sanguíneos. Se utilizaron muestras con una mayor cantidad de glóbulos blancos sanguíneos. El análisis de los glóbulos rojos sanguíneos y de los glóbulos blancos sanguíneos muestra que la distribución de los glóbulos blancos sanguíneos es diferente de la distribución de los glóbulos rojos sanguíneos y de los reticulocitos . Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores, y por consiguiente, la invención se puede practicar de una manera diferente a la descrita particularmente .

Claims (13)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Un método para detectar reticulocitos en una muestra, caracterizado porque se mancha la muestra con corifosfina 0; se excita la muestra con luz de una longitud de onda de excitación; y se mide la fluorescencia emitida a partir de esta muestra.
2. 2. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra se excita, y se mide la fluorescencia por medio de un citómetro de flujo..
3. 3. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra se excita, y se mide la fluorescencia por medio de microscopio de fluorescencia .
4. 4. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado además porque la muestra se excita en el citómetro de flujo con luz a partir de una lámpara de arco de mercurio .
5. 5. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado además porque la muestra se excita en el citómetro de flujo con luz a partir de un dispositivo de láser de argón.
6. 6. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado además porque la muestra comprende sangre entera.
7. 7. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado además porque los reticulocitos se detectan sin su fijación.
8. 8. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado además porque los reticulocitos se manchan de una manera diferencial.
9. 9. Un reactivo para manchar reticulocitos en una muestra de sangre entera, para la cuantificación, cuyo reactivo se caracteriza porque incluye una solución acuosa de corifosfina 0 y un sistema regulador del pH.
10. 10. El reactivo de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 9, caracterizado además porque el sistema regulador del pH tiene un pH de 6.0 a 8.0.
11. 11. Un método para generar un complejo de ARN-colorante estable, en una muestra que contiene reticulocitos, caracterizado por los pasos de mezclar la muestra que se va a probar con un reactivo que comprende una solución acuosa de corifosfina O, y permitir que la muestra y el reactivo reaccionen durante un tiempo suficiente para que el reactivo sea efectivamente recuperado por los reticulocitos.
12. 12. Un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, caracterizado además porque el complejo de ARN-colorante es estable durante aproximadamente 8 a 24 horas.
13. 13. Un método para cuantificar reticulocitos en una muestra de sangre entera mediante citómetría de flujo, caracterizado por los pasos de: (a) mezclar una muestra de sangre que se va a probar, con un reactivo que comprende una solución acuosa de corifosfina 0; (b) permitir que la muestra y el reactivo reaccionen durante un tiempo suficiente para que el reactivo sea efectivamente recuperado por los reticulocitos; (c) pasar la mezcla a través de un citómetro de flujo; (d) medir la intensidad de la fluorescencia roja contra la fluorescencia verde de la población de glóbulos rojos sanguíneos que entran, en el dispersor de luz; y (e) determinar la cantidad o el porcentaje de reticulocitos en la muestra a partir de dicha medición.