JP2002005925A - 破砕赤血球の測定方法 - Google Patents
破砕赤血球の測定方法Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume, or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
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- G01N15/1456—Electro-optical investigation, e.g. flow cytometers without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
-
- G01N2015/012—
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/101666—Particle count or volume standard or control [e.g., platelet count standards, etc.]
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＦＲＣ％を再現性よく正確に自動測定するこ
と。 【解決手段】 血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測
定用試料を調製し、前記測定用試料をフローサイトメー
タに併して試料中の粒子の各々について散乱光強度と蛍
光強度を測定し、測定された散乱光強度および蛍光強度
に基づいて粒子の２次元分布を作成し、２次元分布中に
赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤
血球数Ａを計数し、前記赤血球分布領域内で散乱光強度
および蛍光強度が低い領域に破砕赤血球分布領域を設定
してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ
／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破
砕赤血球含有率Ｆを算出する工程からなること。
と。 【解決手段】 血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測
定用試料を調製し、前記測定用試料をフローサイトメー
タに併して試料中の粒子の各々について散乱光強度と蛍
光強度を測定し、測定された散乱光強度および蛍光強度
に基づいて粒子の２次元分布を作成し、２次元分布中に
赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤
血球数Ａを計数し、前記赤血球分布領域内で散乱光強度
および蛍光強度が低い領域に破砕赤血球分布領域を設定
してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ
／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破
砕赤血球含有率Ｆを算出する工程からなること。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は破砕赤血球（ＦＲ
Ｃ）の測定方法に関し、とくに、心血管異常、先天性又
は後天性溶血貧血、播種性血管内凝固、尿毒症、ＴＴＰ
のような種々の疾病において観察される末梢血の破砕赤
血球の定量方法に関する。
Ｃ）の測定方法に関し、とくに、心血管異常、先天性又
は後天性溶血貧血、播種性血管内凝固、尿毒症、ＴＴＰ
のような種々の疾病において観察される末梢血の破砕赤
血球の定量方法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】最近、Ｂ
ＭＴ−ＴＭＡ（骨髄移植後血栓性微小血管症）の研究に
より、末梢血におけるＦＲＣ％（破砕赤血球含有百分
率）はその早期診断の重要な指標として注目され、ＢＭ
Ｔ−ＴＭＡ評価システム（グレード０〜４）が、次のよ
うに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と共にＦＲＣ％に
基づいて開発された（Bone Marrow Transplantation, 1
5, p. 247-253, 1995年）。 グレード０；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≦１．２％ グレード１；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≧１．３％ グレード２；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ１．３−４．８％ グレード３；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ４．９−９．６％ グレード４；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ≧９．７％
ＭＴ−ＴＭＡ（骨髄移植後血栓性微小血管症）の研究に
より、末梢血におけるＦＲＣ％（破砕赤血球含有百分
率）はその早期診断の重要な指標として注目され、ＢＭ
Ｔ−ＴＭＡ評価システム（グレード０〜４）が、次のよ
うに乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）と共にＦＲＣ％に
基づいて開発された（Bone Marrow Transplantation, 1
5, p. 247-253, 1995年）。 グレード０；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≦１．２％ グレード１；ＬＤＨ正常及びＦＲＣ≧１．３％ グレード２；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ１．３−４．８％ グレード３；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ４．９−９．６％ グレード４；ＬＤＨ増加及びＦＲＣ≧９．７％
【０００３】ところでＦＲＣ％は、末梢血の塗抹標本を
目視で精査して算出することが可能であるが、その定量
は一般的に行われず、ＦＲＣ（破砕赤血球）の存在の有
無のみが検出される。また、自動赤血球計数装置におい
て標準化された赤血球粒度分布でＦＲＣの形跡を検出で
きる旨を報告した例がいくつか見られる（American Jou
rnal of Clinical Pathology, 90, p. 268-273, 1988
年）。しかしながら、今だにその定量は塗抹標本による
目視試験につまり目視法に依存しているが、その結果さ
え参照基準がないため試験する人の個人差によって大き
くばらつくという問題がある。
目視で精査して算出することが可能であるが、その定量
は一般的に行われず、ＦＲＣ（破砕赤血球）の存在の有
無のみが検出される。また、自動赤血球計数装置におい
て標準化された赤血球粒度分布でＦＲＣの形跡を検出で
きる旨を報告した例がいくつか見られる（American Jou
rnal of Clinical Pathology, 90, p. 268-273, 1988
年）。しかしながら、今だにその定量は塗抹標本による
目視試験につまり目視法に依存しているが、その結果さ
え参照基準がないため試験する人の個人差によって大き
くばらつくという問題がある。
【０００４】この発明はこのような事情を考慮してなさ
れたもので、フローサイトメータのスキャッタグラム上
に特定の領域を設定することにより、精度よくＦＲＣ％
を定量化することが可能な破砕赤血球の測定方法を提供
するものである。
れたもので、フローサイトメータのスキャッタグラム上
に特定の領域を設定することにより、精度よくＦＲＣ％
を定量化することが可能な破砕赤血球の測定方法を提供
するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この発明は、血液試料に
核酸染色蛍光色素を加えて測定用試料を調製し、前記測
定用試料をフローサイトメータに併して試料中の粒子の
各々について散乱光強度と蛍光強度を測定し、測定され
た散乱光強度および蛍光強度に基づいて粒子の２次元分
布を作成し、２次元分布中に赤血球分布領域を設定して
その領域内の粒子数から全赤血球数Ａを計数し、前記赤
血球分布領域内で散乱光強度および蛍光強度が低い領域
に破砕赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から
破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式
Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破砕赤血球含有率Ｆを算出す
る工程からなる破砕赤血球の測定方法を提供するもので
ある。
核酸染色蛍光色素を加えて測定用試料を調製し、前記測
定用試料をフローサイトメータに併して試料中の粒子の
各々について散乱光強度と蛍光強度を測定し、測定され
た散乱光強度および蛍光強度に基づいて粒子の２次元分
布を作成し、２次元分布中に赤血球分布領域を設定して
その領域内の粒子数から全赤血球数Ａを計数し、前記赤
血球分布領域内で散乱光強度および蛍光強度が低い領域
に破砕赤血球分布領域を設定してその領域の粒子数から
破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式
Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破砕赤血球含有率Ｆを算出す
る工程からなる破砕赤血球の測定方法を提供するもので
ある。
【０００６】
【発明の実施の形態】この発明に必要な血液試料の量
は、１０〜１００μＬ程度であり、この試料には、赤血
球中のＲＮＡ（リボ核酸）を染色して蛍光による検出を
可能にするため、核酸染色蛍光色素が加えられて測定用
試料として調製される。
は、１０〜１００μＬ程度であり、この試料には、赤血
球中のＲＮＡ（リボ核酸）を染色して蛍光による検出を
可能にするため、核酸染色蛍光色素が加えられて測定用
試料として調製される。
【０００７】核酸染色蛍光色素としては、オーラミン−
０、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、チオラ
ラビンＴ、ピロニンＹ、コリホスフィン０、３，３’−
ジメチルカルボシアニンアイオダイド、オキサジン７５
０、ポリメチン系蛍光色素などが挙げられる。測定試料
の調製にあたっては、上記色素を含む市販の網状赤血球
測定試薬と血液試料とを、１００：１〜１０００：１の
比で混合し、反応させることが好ましい。この際の反応
温度は２５〜５０℃程度が好ましく、さらに好ましくは
３５〜４５℃である。また、反応時間は試薬中に含まれ
る色素によって多少異なるが、１０秒〜５分程度が好ま
しく、より好ましくは２０秒〜２分程度、さらに好まし
くは２０秒〜６０秒程度である。
０、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、チオラ
ラビンＴ、ピロニンＹ、コリホスフィン０、３，３’−
ジメチルカルボシアニンアイオダイド、オキサジン７５
０、ポリメチン系蛍光色素などが挙げられる。測定試料
の調製にあたっては、上記色素を含む市販の網状赤血球
測定試薬と血液試料とを、１００：１〜１０００：１の
比で混合し、反応させることが好ましい。この際の反応
温度は２５〜５０℃程度が好ましく、さらに好ましくは
３５〜４５℃である。また、反応時間は試薬中に含まれ
る色素によって多少異なるが、１０秒〜５分程度が好ま
しく、より好ましくは２０秒〜２分程度、さらに好まし
くは２０秒〜６０秒程度である。
【０００８】この発明に用いるフローサイトメータと
は、粒子含有液体試料をシースフローセルに流して、一
列に配列した粒子に光を照射して各粒子から生じる散乱
光と蛍光などを検出するようにした装置であり、これに
は例えばシスメックス株式会社製の自動網赤血球測定装
置Ｒ−３５００を用いることができる。
は、粒子含有液体試料をシースフローセルに流して、一
列に配列した粒子に光を照射して各粒子から生じる散乱
光と蛍光などを検出するようにした装置であり、これに
は例えばシスメックス株式会社製の自動網赤血球測定装
置Ｒ−３５００を用いることができる。
【０００９】この発明における２次元分布には、散乱光
強度と蛍光強度を２軸とする座標平面に各血球（粒子）
からの散乱光および蛍光の強度を表わす座標にドットを
プロットしたスキャッタグラムを用いることができ、そ
の場合には、プロットされた１つのドットが１つの血球
（粒子）に対応する。
強度と蛍光強度を２軸とする座標平面に各血球（粒子）
からの散乱光および蛍光の強度を表わす座標にドットを
プロットしたスキャッタグラムを用いることができ、そ
の場合には、プロットされた１つのドットが１つの血球
（粒子）に対応する。
【００１０】各血球の散乱光および蛍光強度は、それぞ
れ血球サイズとリボ核酸（ＲＮＡ）含有量を表わし、２
次元分布上で血小板、成熟赤血球および網赤血球を識別
するために用いられる。ＦＲＣは赤血球より小さく血小
板よりＲＮＡ含有量が少ないので、２次元分布（スキャ
ッタグラム）から検出可能となる。
れ血球サイズとリボ核酸（ＲＮＡ）含有量を表わし、２
次元分布上で血小板、成熟赤血球および網赤血球を識別
するために用いられる。ＦＲＣは赤血球より小さく血小
板よりＲＮＡ含有量が少ないので、２次元分布（スキャ
ッタグラム）から検出可能となる。
【００１１】そこで、この発明では、２次元分布中に赤
血球分布領域（ゲートＧ１）を設定してその領域内の粒
子数を全赤血球数Ａとして計数し、前記赤血球分布領域
内で粒子の大きさが小さく核酸量の少ない（散乱光強度
と蛍光強度が低い）領域に破砕赤血球分布領域（ゲート
Ｇ２）を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂ
を計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／
Ａ）を用いてＦＲＣ％として算出する。なお、換算式ｆ
（Ｂ／Ａ）は、Ｂ／Ａと目視法によるＦＲＣ％との相関
を示す式を用いることができる。さらに、前記赤血球分
布領域内で破砕赤血球分布領域よりも粒子の大きさが大
きい（つまり、散乱光強度が高い）領域に小型赤血球分
布領域（ゲートＧ３）を設定してその領域の粒子数から
小型赤血球数Ｃを計数し、ｆ（Ｂ／Ａ）を破砕赤血球比
率Ｆとして算出し、算出した破砕赤血球比率ＦをＣ／Ａ
の値に基づいて補正するようにしている。
血球分布領域（ゲートＧ１）を設定してその領域内の粒
子数を全赤血球数Ａとして計数し、前記赤血球分布領域
内で粒子の大きさが小さく核酸量の少ない（散乱光強度
と蛍光強度が低い）領域に破砕赤血球分布領域（ゲート
Ｇ２）を設定してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂ
を計数し、Ｂ／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／
Ａ）を用いてＦＲＣ％として算出する。なお、換算式ｆ
（Ｂ／Ａ）は、Ｂ／Ａと目視法によるＦＲＣ％との相関
を示す式を用いることができる。さらに、前記赤血球分
布領域内で破砕赤血球分布領域よりも粒子の大きさが大
きい（つまり、散乱光強度が高い）領域に小型赤血球分
布領域（ゲートＧ３）を設定してその領域の粒子数から
小型赤血球数Ｃを計数し、ｆ（Ｂ／Ａ）を破砕赤血球比
率Ｆとして算出し、算出した破砕赤血球比率ＦをＣ／Ａ
の値に基づいて補正するようにしている。
【００１２】ここで、ゲート３を設けたのは、鉄欠乏性
貧血の患者の血液のように血液中に小型赤血球が多く存
在する場合に、それがゲート２に出現してＦＲＣとして
計数され、Ｆの値が実際よりも大きくなるため、それを
Ｃ／Ａに対応して補正するためである。なお、赤血球分
布領域（ゲートＧ１）の設定方法には、公知の方法、例
えば特許第２６７４７０４号に記載の方法を用いること
ができる。
貧血の患者の血液のように血液中に小型赤血球が多く存
在する場合に、それがゲート２に出現してＦＲＣとして
計数され、Ｆの値が実際よりも大きくなるため、それを
Ｃ／Ａに対応して補正するためである。なお、赤血球分
布領域（ゲートＧ１）の設定方法には、公知の方法、例
えば特許第２６７４７０４号に記載の方法を用いること
ができる。
【００１３】この発明において、破砕赤血球含有率ＦＲ
Ｃ％を算出する工程は、Ｃ／Ａが所定値αより大きいと
きに、ＦをＣ／Ａに基づいて補正するようにしてもよ
い。この発明は、Ｆは、Ｃ／Ａが所定値α以下のときに
Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）Ｃ／Ａで算出され、Ｃ／Ａが所定値よ
り大きいときにｆ＝（Ｂ／Ａ）・ｅｘｐ｛−ａ（Ｃ／
Ａ）｝（ａは定数）で算出されるようにしてもよい。し
てもよい。定数ａは例えば０．４〜０．５程度の値であ
り、好ましくはａ＝０．４３である。また、αには１〜
３％の間の値を用いることができる。 上記換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）は一次式Ｆ＝ｍ（Ｂ／Ａ）
＋ｎ（ｍ，ｎは定数） で表わすことができる。
Ｃ％を算出する工程は、Ｃ／Ａが所定値αより大きいと
きに、ＦをＣ／Ａに基づいて補正するようにしてもよ
い。この発明は、Ｆは、Ｃ／Ａが所定値α以下のときに
Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）Ｃ／Ａで算出され、Ｃ／Ａが所定値よ
り大きいときにｆ＝（Ｂ／Ａ）・ｅｘｐ｛−ａ（Ｃ／
Ａ）｝（ａは定数）で算出されるようにしてもよい。し
てもよい。定数ａは例えば０．４〜０．５程度の値であ
り、好ましくはａ＝０．４３である。また、αには１〜
３％の間の値を用いることができる。 上記換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）は一次式Ｆ＝ｍ（Ｂ／Ａ）
＋ｎ（ｍ，ｎは定数） で表わすことができる。
【００１４】実施例 以下、図面に示す実施例を用いてこの発明を詳述する。
これによってこの発明が限定されるものではない。 １．フローサイトメータ 図１は、この発明の実施例にフローサイトメータとして
用いる自動網赤血球測定装置（シスメックス株式会社製
Ｒ−３５００）の基本構成を示す構成説明図である。
これによってこの発明が限定されるものではない。 １．フローサイトメータ 図１は、この発明の実施例にフローサイトメータとして
用いる自動網赤血球測定装置（シスメックス株式会社製
Ｒ−３５００）の基本構成を示す構成説明図である。
【００１５】同図において、アルゴンレーザ光源１から
出射された波長４８８ｎｍのレーザ光Ｌ１は照射レンズ
系２によって集光されてシースフローセル３を照射す
る。粒子（血球）を含む試料液がシースフローセル３に
サンプルノズル４から供給される。各粒子は図示しない
シース液流により一列に配列されて流れ、粒子（血球）
Ｐが出射する前方散乱光と前方蛍光は、コレクターレン
ズ５とピンホール板６のピンホールを介してダイクロイ
ックミラー７に到達する。ダイクロイックミラー７はそ
の光を４８８ｎｍの波長の前方散乱光Ｌ２と５２０〜５
３０ｎｍの波長の前方蛍光Ｌ３に分離する。
出射された波長４８８ｎｍのレーザ光Ｌ１は照射レンズ
系２によって集光されてシースフローセル３を照射す
る。粒子（血球）を含む試料液がシースフローセル３に
サンプルノズル４から供給される。各粒子は図示しない
シース液流により一列に配列されて流れ、粒子（血球）
Ｐが出射する前方散乱光と前方蛍光は、コレクターレン
ズ５とピンホール板６のピンホールを介してダイクロイ
ックミラー７に到達する。ダイクロイックミラー７はそ
の光を４８８ｎｍの波長の前方散乱光Ｌ２と５２０〜５
３０ｎｍの波長の前方蛍光Ｌ３に分離する。
【００１６】前方散乱光Ｌ２は集光レンズ８で集光され
てその強度がフィトダイオード９によって前方散乱光強
度を表わす電気信号Ｓ１に変換される。前方蛍光Ｌ３は
フィルタ１０を介して迷光が除去された後、フォトマル
チプライヤチューブ１１によって蛍光強度を表わす電気
信号Ｓ２に変換される。信号Ｓ１，Ｓ２はそれぞれアン
プ１２，１３で増幅されてデータ処理部１４に入力さ
れ、データ処理部１４は処理した結果をディスプレイ１
５に表示させるようになっている。
てその強度がフィトダイオード９によって前方散乱光強
度を表わす電気信号Ｓ１に変換される。前方蛍光Ｌ３は
フィルタ１０を介して迷光が除去された後、フォトマル
チプライヤチューブ１１によって蛍光強度を表わす電気
信号Ｓ２に変換される。信号Ｓ１，Ｓ２はそれぞれアン
プ１２，１３で増幅されてデータ処理部１４に入力さ
れ、データ処理部１４は処理した結果をディスプレイ１
５に表示させるようになっている。
【００１７】ここで、データ処理部１４は信号Ｓ１，Ｓ
２から前方蛍光強度と前方散乱光強度をそれぞれパラメ
ータとする２次元分布（スキャッタグラム）を作成して
ディスプレイ１５に表示させると共に、その２次元分布
に設定される任意の領域内のドット数（粒子数）を計数
し、所望の演算を行い計数結果や演算結果をディスプレ
イ１５に表示させる。なお、２次元分布中の領域の設定
や演算プログラムのインストールなどは、図示しない入
力装置（キーボードやディスクドライブ）によって行わ
れる。
２から前方蛍光強度と前方散乱光強度をそれぞれパラメ
ータとする２次元分布（スキャッタグラム）を作成して
ディスプレイ１５に表示させると共に、その２次元分布
に設定される任意の領域内のドット数（粒子数）を計数
し、所望の演算を行い計数結果や演算結果をディスプレ
イ１５に表示させる。なお、２次元分布中の領域の設定
や演算プログラムのインストールなどは、図示しない入
力装置（キーボードやディスクドライブ）によって行わ
れる。
【００１８】また、図１の装置のサンプルノズル４に供
給される血液試料は例えば次のように調製される。 （１）１０μＬの血液を定量する。 （２）定量した血液を希釈液１９５０μＬで希釈する。 （３）希釈した試料に染色液４０μＬを加え撹拌しなが
ら３５℃で２５秒間インキュベートする。 （４）インキュベートした試料、約２．８μＬをサンプ
ルノズル４を介してシースフローセル３の中央へ送り込
む。
給される血液試料は例えば次のように調製される。 （１）１０μＬの血液を定量する。 （２）定量した血液を希釈液１９５０μＬで希釈する。 （３）希釈した試料に染色液４０μＬを加え撹拌しなが
ら３５℃で２５秒間インキュベートする。 （４）インキュベートした試料、約２．８μＬをサンプ
ルノズル４を介してシースフローセル３の中央へ送り込
む。
【００１９】なお、この実施例では、上記希釈液と染色
液にはそれぞれシスメックス株式会社製のレットサーチ
希釈液（成分：ｐＨ８．２５のトリス緩衝液、プリピオ
ン酸ナトリウム含有）とレットサーチ染色液（成分：オ
ーラミンＯ２９．５ｇ／Ｌのエチレングリコール溶液）
を使用している。
液にはそれぞれシスメックス株式会社製のレットサーチ
希釈液（成分：ｐＨ８．２５のトリス緩衝液、プリピオ
ン酸ナトリウム含有）とレットサーチ染色液（成分：オ
ーラミンＯ２９．５ｇ／Ｌのエチレングリコール溶液）
を使用している。
【００２０】２．測定方法の開発 （１）模擬破砕赤血球によるＦＲＣ検出領域の確立 健常な男性ドナーから提供された血液中の赤血球を、１
５００ｒｐｍの遠心分離によって白血球と血小板とを分
離した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝剤）中で３回洗浄し、赤
血球サンプルを作成した。赤血球サンプルの一部（サン
プルＡ）を５０℃で１００秒間インキュベートして破砕
赤血球を誘発させた。それによって適当な破砕赤血球が
得られることを走査電子顕微鏡で確認した。
５００ｒｐｍの遠心分離によって白血球と血小板とを分
離した後、ＰＢＳ（リン酸緩衝剤）中で３回洗浄し、赤
血球サンプルを作成した。赤血球サンプルの一部（サン
プルＡ）を５０℃で１００秒間インキュベートして破砕
赤血球を誘発させた。それによって適当な破砕赤血球が
得られることを走査電子顕微鏡で確認した。
【００２１】そこでサンプルＡを未処理の赤血球サンプ
ル（サンプルＢ）に０〜８０％の間の種々の比率で混合
し、一連の混合液サンプルを得た。各混合液サンプルを
目視法で観察、つまりメイギムザ染色法で染色した後、
それぞれについて１０００倍の倍率の顕微鏡で血液塗抹
標本上の１０００個の赤血球を観察し、ＦＲＣ％を計数
した。なお、ＦＲＣは大きさが２μｍ〜４μｍのものと
した。
ル（サンプルＢ）に０〜８０％の間の種々の比率で混合
し、一連の混合液サンプルを得た。各混合液サンプルを
目視法で観察、つまりメイギムザ染色法で染色した後、
それぞれについて１０００倍の倍率の顕微鏡で血液塗抹
標本上の１０００個の赤血球を観察し、ＦＲＣ％を計数
した。なお、ＦＲＣは大きさが２μｍ〜４μｍのものと
した。
【００２２】目視法によって得られた一連の混合液サン
プルのＦＲＣ％は０〜７％の範囲の値となり、図３に示
すようにサンプルＡのサンプルＢに対する含有率（％）
と有意な相関を示し、これら一連の混合液サンプルがこ
の発明の測定方法の開発に適当な模擬サンプルであるこ
とが確認された。
プルのＦＲＣ％は０〜７％の範囲の値となり、図３に示
すようにサンプルＡのサンプルＢに対する含有率（％）
と有意な相関を示し、これら一連の混合液サンプルがこ
の発明の測定方法の開発に適当な模擬サンプルであるこ
とが確認された。
【００２３】次に、これら一連の混合液サンプルを図１
に示す測定装置によって測定し、図２に示すように、横
軸を前方蛍光強度、縦軸を前方散乱光強度とする２次元
分布（スキャッタグラム）を得た。ここで、サイズの大
きい血球ほど高い前方蛍光強度を示し、核酸量の多い血
球ほど高い前方蛍光強度を示す。
に示す測定装置によって測定し、図２に示すように、横
軸を前方蛍光強度、縦軸を前方散乱光強度とする２次元
分布（スキャッタグラム）を得た。ここで、サイズの大
きい血球ほど高い前方蛍光強度を示し、核酸量の多い血
球ほど高い前方蛍光強度を示す。
【００２４】図２においてゲート（領域）Ｇ１は、予め
測定装置（図１）に設定されたプログラムによって区画
された赤血球（網赤血球および成熟赤血球）分布領域で
ある。なお、ゲートＧ１の下方の外側は血小板の分布領
域である。
測定装置（図１）に設定されたプログラムによって区画
された赤血球（網赤血球および成熟赤血球）分布領域で
ある。なお、ゲートＧ１の下方の外側は血小板の分布領
域である。
【００２５】そして、一連の混合液サンプルに対する測
定結果は、サンプルＡの含有率（％）が高くなるにつれ
て、血小板の分布領域の左上、つまり、ゲートＧ１内で
サイズが小さく核酸量の少ない領域におけるドット数
（粒子数）が増大する傾向を示したので、その領域中に
適当なゲートＧ２を図２に示すように設定し、測定装置
によるゲートＧ２中のドット（粒子）％を検出した。
定結果は、サンプルＡの含有率（％）が高くなるにつれ
て、血小板の分布領域の左上、つまり、ゲートＧ１内で
サイズが小さく核酸量の少ない領域におけるドット数
（粒子数）が増大する傾向を示したので、その領域中に
適当なゲートＧ２を図２に示すように設定し、測定装置
によるゲートＧ２中のドット（粒子）％を検出した。
【００２６】その結果、図４に示すようにゲートＧ２の
中のドット数（粒子数）と目視法によるＦＲＣ％との間
には有意な相関が見いだされた。 ｙ＝７．４１ｘ−０．４４,……（１） ｙ：目視法によるＦＲＣ％ ｘ：ゲートＧ２中のドット（粒子）％＝ゲートＧ２／ゲ
ートＧ１
中のドット数（粒子数）と目視法によるＦＲＣ％との間
には有意な相関が見いだされた。 ｙ＝７．４１ｘ−０．４４,……（１） ｙ：目視法によるＦＲＣ％ ｘ：ゲートＧ２中のドット（粒子）％＝ゲートＧ２／ゲ
ートＧ１
【００２７】（２）実際の血液サンプルに対するＦＲＣ
％の測定 正常なＭＣＶ（平均赤血球容積）および／又はＭＣＨＣ
（平均赤血球ヘモグロビン濃度）を有し破砕赤血球を含
有する９０検体のサンプルについて、式（１）の相関を
用いてＦＲＣ％を算出したところ、目視法による計数結
果に対して、図５に示すように良好な相関を得た。ま
た、算出ＦＲＣ％と目視法によるＦＲＣ％との間に有意
差はなかった（paired t-test, P=0.77）。
％の測定 正常なＭＣＶ（平均赤血球容積）および／又はＭＣＨＣ
（平均赤血球ヘモグロビン濃度）を有し破砕赤血球を含
有する９０検体のサンプルについて、式（１）の相関を
用いてＦＲＣ％を算出したところ、目視法による計数結
果に対して、図５に示すように良好な相関を得た。ま
た、算出ＦＲＣ％と目視法によるＦＲＣ％との間に有意
差はなかった（paired t-test, P=0.77）。
【００２８】（３）ＦＲＣ％の補正 鉄欠乏性貧血の患者などの小球性低色素性検体１７検体
のサンプルについて測定を行うと、赤血球は、ＦＲＣ検
出ゲートＧ２を設定したスキャッタグラム（図２）上で
正常なサンプルよりも低くプロットされることが観察さ
れた。その結果、ゲートＧ２の中のドット（粒子）が著
しく増加して見かけ上の高いＦＲＣ％が、式（１）から
算出されることが分かった。
のサンプルについて測定を行うと、赤血球は、ＦＲＣ検
出ゲートＧ２を設定したスキャッタグラム（図２）上で
正常なサンプルよりも低くプロットされることが観察さ
れた。その結果、ゲートＧ２の中のドット（粒子）が著
しく増加して見かけ上の高いＦＲＣ％が、式（１）から
算出されることが分かった。
【００２９】従って、これらのサンプルを識別するため
の特定のゲートＧ３を図６に示すように設定し、算出し
たＦＲＣ％を補正するために用いた。ゲートＧ３の中の
ドット（粒子）が増大するほど、図７に示すように算出
ＦＲＣ％は真の値（ここでは目視法による計数値）に対
する格差（倍率）が増大することから、図７に基づいて
次式を導出した。 ｙ＝ｅｘｐ（０．４３ｘ）…（２） ｙは（式（１）からの算出ＦＲＣ）／（目視法によるＦ
ＲＣ） ｘ：ゲートＧ３内のドット（粒子）％、つまり（ゲート
Ｇ３）／（ゲートＧ１）（％）
の特定のゲートＧ３を図６に示すように設定し、算出し
たＦＲＣ％を補正するために用いた。ゲートＧ３の中の
ドット（粒子）が増大するほど、図７に示すように算出
ＦＲＣ％は真の値（ここでは目視法による計数値）に対
する格差（倍率）が増大することから、図７に基づいて
次式を導出した。 ｙ＝ｅｘｐ（０．４３ｘ）…（２） ｙは（式（１）からの算出ＦＲＣ）／（目視法によるＦ
ＲＣ） ｘ：ゲートＧ３内のドット（粒子）％、つまり（ゲート
Ｇ３）／（ゲートＧ１）（％）
【００３０】なお、算出ＦＲＣ％の補正は、図７よりゲ
ートＧ３内のドット（粒子）％（ゲートＧ３／ゲートＧ
１）が１〜３％（例えば１．５％）を越えると必要とな
ることが分かる。また、真のＦＲＣ％は式（２）から次
のように与えることができる。 ＦＲＣ％＝（式（１）からの算出ＦＲＣ）／ｅｘｐ（０．４３×ゲートＧ３／ ゲートＧ１） …（３）
ートＧ３内のドット（粒子）％（ゲートＧ３／ゲートＧ
１）が１〜３％（例えば１．５％）を越えると必要とな
ることが分かる。また、真のＦＲＣ％は式（２）から次
のように与えることができる。 ＦＲＣ％＝（式（１）からの算出ＦＲＣ）／ｅｘｐ（０．４３×ゲートＧ３／ ゲートＧ１） …（３）
【００３１】前述の１７検体のサンプルについて、補正
したＦＲＣ％と目視法による計数値との間には、図８に
示すように有意な相関が見られ、有意差のないことも確
認された（paired t-test, P=0.43）。
したＦＲＣ％と目視法による計数値との間には、図８に
示すように有意な相関が見られ、有意差のないことも確
認された（paired t-test, P=0.43）。
【００３２】（４）正常な健常者のサンプルにおける平
均ＦＲＣ％ 健常者の正常な１８９検体のサンプルについて式（１）
によって算出すると、算出したＦＲＣ％は１％以下
（０．１４±０．１７％）となった。これは、算出した
ＦＲＣ％が決定的な誤診を与える危険性は極めて低いこ
とを示すものである。
均ＦＲＣ％ 健常者の正常な１８９検体のサンプルについて式（１）
によって算出すると、算出したＦＲＣ％は１％以下
（０．１４±０．１７％）となった。これは、算出した
ＦＲＣ％が決定的な誤診を与える危険性は極めて低いこ
とを示すものである。
【００３３】（５）治療中のＨＵＳ（尿毒症）患者にお
けるＦＲＣ％ この発明の方法により一人のＨＵＳ患者についてその治
療中のＦＲＣ％のモニターを行った。抗生物質と腹膜透
析による臨床的な治療により、ＦＲＣ％が１２日間で
８．６％から３．６％まで減少することが定量的に測定
された。
けるＦＲＣ％ この発明の方法により一人のＨＵＳ患者についてその治
療中のＦＲＣ％のモニターを行った。抗生物質と腹膜透
析による臨床的な治療により、ＦＲＣ％が１２日間で
８．６％から３．６％まで減少することが定量的に測定
された。
【００３４】
【発明の効果】破砕赤血球（ＦＲＣ）は、通常、血液塗
抹標本によって検査されるが、一般的にわずか１０００
個の赤血球に対して計数されるので再現性がよくないの
に対し、フローサイトメータを用いると平均３万個の血
球に対して計数されるので再現性が高い。従って、この
発明の方法によれば被験者のＦＲＣ％を再現性よく正確
にかつ能率的に算出できるので、この発明は疾病の診断
に有効に利用できる。
抹標本によって検査されるが、一般的にわずか１０００
個の赤血球に対して計数されるので再現性がよくないの
に対し、フローサイトメータを用いると平均３万個の血
球に対して計数されるので再現性が高い。従って、この
発明の方法によれば被験者のＦＲＣ％を再現性よく正確
にかつ能率的に算出できるので、この発明は疾病の診断
に有効に利用できる。
【図１】この発明の実施例に用いる自動網赤血球測定装
置の構成説明図である。
置の構成説明図である。
【図２】実施例において得られる２次元分布とゲートＧ
１，Ｇ２を示す説明図である。
１，Ｇ２を示す説明図である。
【図３】実施例におけるサンプルＡの含有率（％）と目
視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【図４】実施例におけるゲートＧ２中のドット（粒子）
％と目視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフであ
る。
％と目視法によるＦＲＣ％との関係を示すグラフであ
る。
【図５】実施例における目視法によるＦＲＣ％と算出し
たＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
たＦＲＣ％との関係を示すグラフである。
【図６】実施例における２次元分布とゲートＧ３を示す
説明図である。
説明図である。
【図７】実施例におけるゲートＧ３中のドット（粒子）
％（Ｇ３／Ｇ１）と算出ＦＲＣ／目視法によるＦＲＣと
の関係を示すグラフである。
％（Ｇ３／Ｇ１）と算出ＦＲＣ／目視法によるＦＲＣと
の関係を示すグラフである。
【図８】実施例における１７検体の小球性低色素性検体
において目視法によるＦＲＣ％と算出したＦＲＣ％との
関係を示すグラフである。
において目視法によるＦＲＣ％と算出したＦＲＣ％との
関係を示すグラフである。
１ アルゴンレーザ光源 ２ 照射レンズ系 ３ シースフローセル ４ サンプルノズル ５ コレクターレンズ ６ ピンホール板 ７ ダイクロイックミラー ８ 集光レンズ ９ フォトダイオード １０ フィルタ １１ フォトマルチプライヤチューブ １２ アンプ １３ アンプ １４ データ処理部 １５ ディスプレイ Ｌ１ レーザ光 Ｌ２ 前方散乱光 Ｌ３ 前方蛍光 Ｐ 粒子 Ｓ１ 信号 Ｓ２ 信号
フロントページの続き (72)発明者 西郷 勝康 神戸市西区桜が丘中町５−６−17 (72)発明者 熊谷 俊一 尼崎市瓦宮２−23−13 Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 CA03 DA02 DA05 EA01 EA14 GA04 GA07 GB01 GB21 HA01 HA09 JA01 KA05 KA09 LA02 NA01 NA06 2G045 AA02 CA07 FA37 GA02 GA10 GC11 GC15 JA02 JA06 2G059 AA01 BB13 CC18 DD03 DD04 DD13 EE02 EE07 FF01 FF03 GG01 HH02 HH06 JJ07 JJ11 KK04 LL04 MM01
Claims (7)
- 【請求項１】 血液試料に核酸染色蛍光色素を加えて測
定用試料を調製し、前記測定用試料をフローサイトメー
タに併して試料中の粒子の各々について散乱光強度と蛍
光強度を測定し、測定された散乱光強度および蛍光強度
に基づいて粒子の２次元分布を作成し、２次元分布中に
赤血球分布領域を設定してその領域内の粒子数から全赤
血球数Ａを計数し、前記赤血球分布領域内で散乱光強度
および蛍光強度が低い領域に破砕赤血球分布領域を設定
してその領域の粒子数から破砕赤血球数Ｂを計数し、Ｂ
／Ａを求め、さらに換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）を用いて破
砕赤血球含有率Ｆを算出する工程からなる破砕赤血球の
測定方法。 - 【請求項２】 赤血球分布領域内で散乱光強度が破砕赤
血球分布領域よりも高い領域に小型赤血球分布領域を設
定してその領域の粒子数から小型赤血球数Ｃを計数し、
前記破砕赤血球含有率ＦをＣ／Ａに基づいて補正する工
程をさらに備えた請求項１記載の破砕赤血球の測定方
法。 - 【請求項３】 破砕赤血球含有率Ｆを算出する工程は、
Ｃ／Ａが所定値αより大きいときに、ＦをＣ／Ａに基づ
いて補正することを特徴とする請求項２記載の破砕赤血
球の測定方法。 - 【請求項４】 Ｆは、Ｃ／Ａが所定値α以下のときにＦ
＝ｆ（Ｂ／Ａ）で算出され、Ｃ／Ａが所定値αより大き
いときにＦ＝ｆ（Ｂ／Ａ）・ｅｘｐ｛−ａ（Ｃ／Ａ）｝
（ａは定数）で算出される請求項２記載の破砕赤血球の
測定方法。 - 【請求項５】 ａ＝０．４３である請求項４記載の破砕
赤血球の測定方法。 - 【請求項６】 αは１〜３％の間の値である請求項３又
は４記載の破砕赤血球の測定方法。 - 【請求項７】 換算式Ｆ＝ｆ（Ｂ／Ａ）がＦ＝ｍ（Ｂ／
Ａ）＋ｎ（ｍ，ｎは定数）で表わされる請求項１記載の
破砕赤血球の測定方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000184853A JP4464534B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 破砕赤血球の測定方法 |
| US09/801,642 US6670191B2 (en) | 2000-06-20 | 2001-03-09 | Method for quantitatively analyzing fragmented red blood cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000184853A JP4464534B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 破砕赤血球の測定方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002005925A true JP2002005925A (ja) | 2002-01-09 |
| JP2002005925A5 JP2002005925A5 (ja) | 2007-06-28 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000184853A Expired - Fee Related JP4464534B2 (ja) | 2000-06-20 | 2000-06-20 | 破砕赤血球の測定方法 |
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| US (1) | US6670191B2 (ja) |
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| JP2012513031A (ja) * | 2008-12-18 | 2012-06-07 | バイオビジラント システムズ，インコーポレイテッド | 粒径及び蛍光の同時検出のための小型検出器 |
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