JP2002533712A - 遊離細胞標本の分析方法 - Google Patents
遊離細胞標本の分析方法Info
- Publication number
- JP2002533712A JP2002533712A JP2000591409A JP2000591409A JP2002533712A JP 2002533712 A JP2002533712 A JP 2002533712A JP 2000591409 A JP2000591409 A JP 2000591409A JP 2000591409 A JP2000591409 A JP 2000591409A JP 2002533712 A JP2002533712 A JP 2002533712A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- suspension
- cell
- stress
- platelets
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000012284 sample analysis method Methods 0.000 title 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 18
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 80
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 abstract description 14
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 abstract description 7
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 34
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 17
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 11
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 11
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 208000024320 Abnormal platelet count Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Natural products CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 206010027540 Microcytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000005485 Thrombocytosis Diseases 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical group [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N13/00—Investigating surface or boundary effects, e.g. wetting power; Investigating diffusion effects; Analysing materials by determining surface, boundary, or diffusion effects
- G01N13/04—Investigating osmotic effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/4905—Determining clotting time of blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1024—Counting particles by non-optical means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N2015/1029—Particle size
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、遊離細胞、特に血球の標本の分析方法に関する。血小板数は、空気の存在下で血球懸濁液を攪拌し、そして攪拌の前後に懸濁液中の小粒子の数を計数することにより得られる。細胞脆砕性は、細胞の標本にin vitroでストレスを施して、適用ストレスにより生じた細胞断片の数を検出することにより確定される。適用ストレスは赤血球断片および血小板に異なるように影響を及ぼすため、２種類の細胞を区別することができる。
Description
【０００１】 産業上の利用分野 本発明は、遊離細胞、特に血球の標本の分析方法に関する。
【０００２】 発明の背景 血球を計数し、大きさで分類する自動血液分析機は、臨床医学の分野における
大きな進歩を象徴しているが、しかしいくつかの欠点を依然として有している。
それらは本質的に、類似サイズの粒子を弁別することができない。自動計数は粒
子の総数に関しては正確であるが、しかし伝統的方法は、小赤血球、寄生虫も、
または血小板のような細胞の小片も計数しない。良質の血小板計数を必要とする
人は、手動計数法が自動的な大きさによる分類および計数計器に一般的に付随す
るいくつかのエラーを回避するという理由で、自動血液分析機がほとんどなくて
、より良質の完全血球計数を提供するアフリカかアジアに旅行するよう適切に助
言される。血小板計数に際してのエラーは、それらが不必要な検査、不適切な治
療または誤診を引き起こし得るので、患者に対する重大な結果を有する。擬似に
低血小板数の既知の原因は、ＥＤＴＡ依存性集塊、冷血小板凝集、血小板付随性
、血小板ではない類似サイズの粒子の存在である。
大きな進歩を象徴しているが、しかしいくつかの欠点を依然として有している。
それらは本質的に、類似サイズの粒子を弁別することができない。自動計数は粒
子の総数に関しては正確であるが、しかし伝統的方法は、小赤血球、寄生虫も、
または血小板のような細胞の小片も計数しない。良質の血小板計数を必要とする
人は、手動計数法が自動的な大きさによる分類および計数計器に一般的に付随す
るいくつかのエラーを回避するという理由で、自動血液分析機がほとんどなくて
、より良質の完全血球計数を提供するアフリカかアジアに旅行するよう適切に助
言される。血小板計数に際してのエラーは、それらが不必要な検査、不適切な治
療または誤診を引き起こし得るので、患者に対する重大な結果を有する。擬似に
低血小板数の既知の原因は、ＥＤＴＡ依存性集塊、冷血小板凝集、血小板付随性
、血小板ではない類似サイズの粒子の存在である。
【０００３】 血液学テキスト、試験所およびメーカーはすべて、長年、自動血小板計数の不
正確性に気づいており、異常血小板数を有するすべての患者に対する血液フィル
ムの手動検査を助言しており、これはほとんどの血液学試験所において慣行され
ている。今日、メーカーは、それらがセンサーに達する前に、光の屈折を検出す
る（血小板はより屈折性であるため）ことによって、あるいは血小板に適用され
た染料を検出することによりエラーを低減しようと試みている。血小板測定が正
常範囲外であるたびに手動的立証の実施をすることは、患者にとって心強いが、
しかし試験所にとっては経費が掛かる。しかしながら、従来、誤って正常範囲内
になった高血小板数を有する患者に対する手動的立証の必要性を試験所に警告す
る方法はなかった。したがって、自動血小板計数は、血小板の計数が低い場合に
は限定値を示し、計数が正常である場合には不確定値を示し、そして計数が高く
なる（血小板増加症）と、完全に確かであるというわけではなくなる。
正確性に気づいており、異常血小板数を有するすべての患者に対する血液フィル
ムの手動検査を助言しており、これはほとんどの血液学試験所において慣行され
ている。今日、メーカーは、それらがセンサーに達する前に、光の屈折を検出す
る（血小板はより屈折性であるため）ことによって、あるいは血小板に適用され
た染料を検出することによりエラーを低減しようと試みている。血小板測定が正
常範囲外であるたびに手動的立証の実施をすることは、患者にとって心強いが、
しかし試験所にとっては経費が掛かる。しかしながら、従来、誤って正常範囲内
になった高血小板数を有する患者に対する手動的立証の必要性を試験所に警告す
る方法はなかった。したがって、自動血小板計数は、血小板の計数が低い場合に
は限定値を示し、計数が正常である場合には不確定値を示し、そして計数が高く
なる（血小板増加症）と、完全に確かであるというわけではなくなる。
【０００４】 以下で考察するように、本出願人は、既存の自動血球分析機により検出されず
且つ適正に区別されないその他の小粒子、細胞断片が存在することを発見した。
細胞脆砕性または細胞断片の生成の重要性は、従来認識されていなかった。 発明の要約 本発明の一局面によれば、血小板を含有する細胞懸濁液中の血小板数の測定値
の確定方法であって、懸濁液中の小粒子の数を計数し、気体の存在下で懸濁液を
攪拌し、攪拌後に懸濁液中の小粒子の数を計数し、そして血小板の数の測定値を
得るために２つの計数を比較する工程を含む方法が提供される。
且つ適正に区別されないその他の小粒子、細胞断片が存在することを発見した。
細胞脆砕性または細胞断片の生成の重要性は、従来認識されていなかった。 発明の要約 本発明の一局面によれば、血小板を含有する細胞懸濁液中の血小板数の測定値
の確定方法であって、懸濁液中の小粒子の数を計数し、気体の存在下で懸濁液を
攪拌し、攪拌後に懸濁液中の小粒子の数を計数し、そして血小板の数の測定値を
得るために２つの計数を比較する工程を含む方法が提供される。
【０００５】 本発明の方法は、単純な生理学的特性を利用してその他の小粒子から血小板を
弁別し、擬似に低い自動血小板数を除去する。血小板の数および機能の正確な測
定は、患者の健康に多大な重要性を有する。血小板減少症（不十分な血小板）か
ら死に至る出血の他に、血小板は卒中、心臓発作および炎症の危険構成成分であ
り、そして上皮悪性疾患および転移の増殖における重要な要素である。
弁別し、擬似に低い自動血小板数を除去する。血小板の数および機能の正確な測
定は、患者の健康に多大な重要性を有する。血小板減少症（不十分な血小板）か
ら死に至る出血の他に、血小板は卒中、心臓発作および炎症の危険構成成分であ
り、そして上皮悪性疾患および転移の増殖における重要な要素である。
【０００６】 赤血球はすべて、浸透圧ストレスに非常に感受性であり、ほとんどの細胞が機
械的ストレスに感受性である。血小板は、空気との接触に曝露された場合を除い
て、機械的および浸透圧ストレスに対して相対的に非感受性である、ということ
が判明した。血小板懸濁液は、空気、またはその構成成分気体への曝露時に、そ
れらが同時にストレスを加えられる場合にはより大きく、それらの特性を変える
。検査前および検査中に血小板の取扱いを注意深く制御することにより、空気へ
の懸濁液の曝露を排除または調節することにより、より正確な血小板の計数が得
られる。それらにストレスを受けさせながら、空気に血小板を故意に曝露するこ
とにより、血小板集団中のあらゆる誘導変化を記録し得る。既存の方法は空気の
作用を無視するという理由で、それらはその血小板計数においてエラーを誘発し
ている。
械的ストレスに感受性である。血小板は、空気との接触に曝露された場合を除い
て、機械的および浸透圧ストレスに対して相対的に非感受性である、ということ
が判明した。血小板懸濁液は、空気、またはその構成成分気体への曝露時に、そ
れらが同時にストレスを加えられる場合にはより大きく、それらの特性を変える
。検査前および検査中に血小板の取扱いを注意深く制御することにより、空気へ
の懸濁液の曝露を排除または調節することにより、より正確な血小板の計数が得
られる。それらにストレスを受けさせながら、空気に血小板を故意に曝露するこ
とにより、血小板集団中のあらゆる誘導変化を記録し得る。既存の方法は空気の
作用を無視するという理由で、それらはその血小板計数においてエラーを誘発し
ている。
【０００７】 WO97/24598号、WO97/24599号およびWO97/24601号に記載された方法は、粒子の
サイズ、形状および数を測定するための方法を提供するが、一方、粒子は同時に
種々の浸透圧勾配に同時に曝露される。しかしながら、それを本発明を組合せる
ことにより、この検査からさらなる情報が得られる。例えば、浸透圧ストレス下
で全血懸濁液を検査し、そして空気の存在下での機械的攪拌後に同一標本に対す
る結果と比較することにより、空気の存在下での機械的攪拌により変えられる標
本集団の構成成分を確定し得る。さらに、型および各型の割合を単一手法で明示
し得る。したがって、赤血球、白血球、微球細胞および細菌は空気の存在下での
機械的攪拌による影響を受けないが、一方、血小板のみは消失する。この方法の
利点は、血小板を弁別し、計数する方法を説明する他に、それは、既存の計器に
それらの計数の精度を増大する非常に簡単な方法を提供する。
サイズ、形状および数を測定するための方法を提供するが、一方、粒子は同時に
種々の浸透圧勾配に同時に曝露される。しかしながら、それを本発明を組合せる
ことにより、この検査からさらなる情報が得られる。例えば、浸透圧ストレス下
で全血懸濁液を検査し、そして空気の存在下での機械的攪拌後に同一標本に対す
る結果と比較することにより、空気の存在下での機械的攪拌により変えられる標
本集団の構成成分を確定し得る。さらに、型および各型の割合を単一手法で明示
し得る。したがって、赤血球、白血球、微球細胞および細菌は空気の存在下での
機械的攪拌による影響を受けないが、一方、血小板のみは消失する。この方法の
利点は、血小板を弁別し、計数する方法を説明する他に、それは、既存の計器に
それらの計数の精度を増大する非常に簡単な方法を提供する。
【０００８】 本出願において、機械的ストレスが細胞の断片化を誘発するために、細胞脆砕
性の測定方法も我々は開示する。細胞計数器で細胞を計数する場合、溶解も、断
片化もゴーストも誘発されない。細胞に浸透圧ストレスを施すと、それらは溶解
し、ゴースト化しまたは断片化し、あるいはいずれもが生じる。機械的攪拌の付
加はその作用を増強し、攪拌懸濁液中への空気の付加は、その作用をさらに強め
る。したがって、細胞断片および血小板を分別するためには、オスモル濃度に対
して空気の存在下で攪拌の前後に小粒子の計数を比較するのが望ましい、という
ことが見出されている。これらの小粒子の性質を誘導するこの工程は、その温度
を上げることによる未知の流体の同定になぞらえ得る。それが78℃で沸騰する場
合、それはエチルアルコールであり、100 ℃で沸騰する場合にはそれは水であり
、そして357 ℃の場合は水銀である。
性の測定方法も我々は開示する。細胞計数器で細胞を計数する場合、溶解も、断
片化もゴーストも誘発されない。細胞に浸透圧ストレスを施すと、それらは溶解
し、ゴースト化しまたは断片化し、あるいはいずれもが生じる。機械的攪拌の付
加はその作用を増強し、攪拌懸濁液中への空気の付加は、その作用をさらに強め
る。したがって、細胞断片および血小板を分別するためには、オスモル濃度に対
して空気の存在下で攪拌の前後に小粒子の計数を比較するのが望ましい、という
ことが見出されている。これらの小粒子の性質を誘導するこの工程は、その温度
を上げることによる未知の流体の同定になぞらえ得る。それが78℃で沸騰する場
合、それはエチルアルコールであり、100 ℃で沸騰する場合にはそれは水であり
、そして357 ℃の場合は水銀である。
【０００９】 本発明から定量測定を提供するためには、以下の：Ａ）懸濁液との接触に際し
ての空気量、Ｂ）攪拌の強度、およびＣ）攪拌の継続時間の少なくとも１つをモ
ニタリングし、そして２つの計数間の差にこの測定値を関連させることが望まし
い。 本発明の方法で計数される小粒子としては、血小板、細菌、細胞断片および微
球細胞が挙げられ、これらは典型的には7 〜10フェントリットルの容積を有する
。
ての空気量、Ｂ）攪拌の強度、およびＣ）攪拌の継続時間の少なくとも１つをモ
ニタリングし、そして２つの計数間の差にこの測定値を関連させることが望まし
い。 本発明の方法で計数される小粒子としては、血小板、細菌、細胞断片および微
球細胞が挙げられ、これらは典型的には7 〜10フェントリットルの容積を有する
。
【００１０】 本発明の別の局面によれば、in vitroでの遊離細胞の標本の分析方法は、既知
量または同定可能量のストレスを標本に適用し、ストレスの適用前後に標本を測
定して、適用ストレスにより引き起こされる標本の細胞断片の数に関して定量的
情報を確定し得る少なくとも１つの示度を提供し、そしてこの示度をストレスの
量に関連させて細胞脆砕性の指標を提供することを包含する。
量または同定可能量のストレスを標本に適用し、ストレスの適用前後に標本を測
定して、適用ストレスにより引き起こされる標本の細胞断片の数に関して定量的
情報を確定し得る少なくとも１つの示度を提供し、そしてこの示度をストレスの
量に関連させて細胞脆砕性の指標を提供することを包含する。
【００１１】 赤血球が死ぬと、それらはその内容物を喪失するが、これは溶解と呼ばれる工
程である。次にそれらは、一部は細胞の膜特性によって、そして一部は誘発によ
って、ゴースト細胞または断片に変形される。従来、このメカニズムはほとんど
認識または理解されていなかった。 本発明は、血球、特に赤血球のような細胞がin vitroでストレスを加えられる
場合、適用ストレスと標本に対する断片化との間の関係は、正常標本および多数
の疾患に特有である、という認識に基づいている。ある細胞（血小板）は検出可
能断片を生成しないが、ある細胞（赤血球）は多数を生成するため、この方法は
ある種の細胞型間の区別方法も提供する。
程である。次にそれらは、一部は細胞の膜特性によって、そして一部は誘発によ
って、ゴースト細胞または断片に変形される。従来、このメカニズムはほとんど
認識または理解されていなかった。 本発明は、血球、特に赤血球のような細胞がin vitroでストレスを加えられる
場合、適用ストレスと標本に対する断片化との間の関係は、正常標本および多数
の疾患に特有である、という認識に基づいている。ある細胞（血小板）は検出可
能断片を生成しないが、ある細胞（赤血球）は多数を生成するため、この方法は
ある種の細胞型間の区別方法も提供する。
【００１２】 既存の自動粒子分析機は、食作用増大によりin vivo で除去された断片化を同
定できないので、断片の検出に際して用途が限定され、そして断片が食作用され
なかった場合、それは、血小板、アポトーシス体、微球細胞、寄生虫およびノイ
ズからそれらを容易に弁別できない。身体の生理学的清掃メカニズムはそれらが
生成されるのと同じくらい速く断片を除去するため、その細胞が断片化しつつあ
り、しかも、既存の方法により断片が検出されない多数の患者が存在する。
定できないので、断片の検出に際して用途が限定され、そして断片が食作用され
なかった場合、それは、血小板、アポトーシス体、微球細胞、寄生虫およびノイ
ズからそれらを容易に弁別できない。身体の生理学的清掃メカニズムはそれらが
生成されるのと同じくらい速く断片を除去するため、その細胞が断片化しつつあ
り、しかも、既存の方法により断片が検出されない多数の患者が存在する。
【００１３】 本発明の方法は、ストレスがかかった場合にその細胞が断片化する患者を検出
するため、ある種の血液異常を同定するのに顕著に良好である、ということが見
出された。適用ストレスは赤血球断片および血小板に異なるように影響を及ぼす
ため、２つを区別することができる。血小板および赤血球断片は通常は個別に測
定されないため、これは、従来技術の粒子計数機ではできなかった。さらに、標
本はストレス適用の前、最中および後に検査することができるので、誘導作用は
生理学的断片化能力および生理学的除去率の指標を提供する。
するため、ある種の血液異常を同定するのに顕著に良好である、ということが見
出された。適用ストレスは赤血球断片および血小板に異なるように影響を及ぼす
ため、２つを区別することができる。血小板および赤血球断片は通常は個別に測
定されないため、これは、従来技術の粒子計数機ではできなかった。さらに、標
本はストレス適用の前、最中および後に検査することができるので、誘導作用は
生理学的断片化能力および生理学的除去率の指標を提供する。
【００１４】 古い細胞は容易に断片化するが、一方新しい細胞は容易には断片化しないため
、本発明は、細胞集団の年齢を同定するために用い得る。これは、例えば、特定
範囲のストレスを用いて特定の細胞集団を選択的に破壊し、それにより古い細胞
を捨ててユニットの寿命を延長させるために、血液貯蔵に有用であり得る。 適用ストレスは、機械的、化学的、熱、音波、光、電気的、電磁的または膜ス
トレスを誘発するあらゆるその他の手段、例えば細胞標本のin vitro加齢であり
得る。好ましくは、細胞は、浸透圧勾配を施される。それらを、攪拌棒により、
激しく振盪することにより、またはあらゆるその他の種類のストレスによっても
攪拌し得る。１つより多いストレスメカニズムを、必要な場合には同時に用い得
る。実際、これはある種の異常の同定に有用であり得る。
、本発明は、細胞集団の年齢を同定するために用い得る。これは、例えば、特定
範囲のストレスを用いて特定の細胞集団を選択的に破壊し、それにより古い細胞
を捨ててユニットの寿命を延長させるために、血液貯蔵に有用であり得る。 適用ストレスは、機械的、化学的、熱、音波、光、電気的、電磁的または膜ス
トレスを誘発するあらゆるその他の手段、例えば細胞標本のin vitro加齢であり
得る。好ましくは、細胞は、浸透圧勾配を施される。それらを、攪拌棒により、
激しく振盪することにより、またはあらゆるその他の種類のストレスによっても
攪拌し得る。１つより多いストレスメカニズムを、必要な場合には同時に用い得
る。実際、これはある種の異常の同定に有用であり得る。
【００１５】 しかしながら、既知のストレスを適用するのが好ましく、低減しつつあるかま
たは偶然であり得るが、しかし、赤血球断片の数と適用ストレスとの間の関係の
プロットを得るために、好ましくは増大しつつある一連のストレスを適用するの
がより望ましい。この範囲のストレスは、種々の期間および／または強度で、例
えば標本を徐々に激しく機械的に攪拌することにより、定速で長時間標本を機械
的に攪拌することにより、溶液で標本を稀釈してオスモル濃度を徐々に低減する
ことにより、またはこれらのメカニズムのあらゆる組合せにより、適用し得る。
後者のアプローチは、WO97/24529号に開示された、オスモル濃度勾配を生じる装
置を用いて実行し得る。
たは偶然であり得るが、しかし、赤血球断片の数と適用ストレスとの間の関係の
プロットを得るために、好ましくは増大しつつある一連のストレスを適用するの
がより望ましい。この範囲のストレスは、種々の期間および／または強度で、例
えば標本を徐々に激しく機械的に攪拌することにより、定速で長時間標本を機械
的に攪拌することにより、溶液で標本を稀釈してオスモル濃度を徐々に低減する
ことにより、またはこれらのメカニズムのあらゆる組合せにより、適用し得る。
後者のアプローチは、WO97/24529号に開示された、オスモル濃度勾配を生じる装
置を用いて実行し得る。
【００１６】 細胞断片の数に関連して定量的情報を提供する特徴には、断片それ自体の検出
、多数細胞集団の頻度分布の変化、総粒子計数の増大、無傷細胞濃度の変化、膜
またはサイトゾル部分の濃度の変化、例えばヘモグロビン放出、あるいは誘発性
細胞断片化に関連したその他のこのような現象が含まれる。 小粒子数の計数工程は、好ましくは、慣用の市販粒子計数機を用いて、または
WO97/24600号に開示された装置を用いてなされる。両方の場合に、血液標本は、
センサー、典型的にはそのサイズが光学的に、音響的に、熱的に、電子的に、ま
たはその他の手段により検出される開口部を通して流される。インピーダンスセ
ンサーでは、細胞の通過に対する電場の応答が一連の電圧パルスとして記録され
、各パルスの振幅は細胞断片サイズおよび頻度の関数である。
、多数細胞集団の頻度分布の変化、総粒子計数の増大、無傷細胞濃度の変化、膜
またはサイトゾル部分の濃度の変化、例えばヘモグロビン放出、あるいは誘発性
細胞断片化に関連したその他のこのような現象が含まれる。 小粒子数の計数工程は、好ましくは、慣用の市販粒子計数機を用いて、または
WO97/24600号に開示された装置を用いてなされる。両方の場合に、血液標本は、
センサー、典型的にはそのサイズが光学的に、音響的に、熱的に、電子的に、ま
たはその他の手段により検出される開口部を通して流される。インピーダンスセ
ンサーでは、細胞の通過に対する電場の応答が一連の電圧パルスとして記録され
、各パルスの振幅は細胞断片サイズおよび頻度の関数である。
【００１７】 適用ストレスの不存在下では、既存の計器は血小板と、例えば赤血球断片とを
区別できない。異なる種類の細胞は各々、それ自体の生化学的個性および断片化
に対するそれ自体の感受性を有するので、細胞の種類、感受性および病状を同定
する同定特性として、その応答を用いることができる。例えば、断片とサイズが
似ている血小板は、それらがストレスを加えられると異なって応答するので、断
片から弁別される。断片、血小板、ゴースト細胞およびその他の細胞部分の弁別
および同定は、細胞株を選択的に染色するか、または特定の細胞部分、例えば細
胞膜の内側および外側に結合するか、あるいは血小板だけを染色する着色剤およ
び染料を用いることにより促進し得る。例えば、WO97/24598号、WO97/54599号お
よびWO97/24601号におけるようにストレスが血液標本に適用された場合、それは
細胞を強いて既知の形状にさせることにより正確な容積およびその他の細胞測定
値を得るために実施された。本明細書中に開示した方法は、細胞を断片化させて
、断片化の結果を測定する。これは、例えば、断片のサイズ範囲に上下閾値電圧
を設定することにより、標本の化学的調製にヘパリンまたはその他の適切な化学
物質を適用することにより断片化を促すことにより、および／または断片化に十
分な時間進行させることにより注目の断片以外のすべての粒子を除去することに
より、増強し得る。断片の誘導、検出および定量は、WO97/24598号、WO97/54599
号およびWO97/24601号により示された測定値ならびに誘導されたまたは既存の断
片により変えることができるその他の測定値を増強し得る。
区別できない。異なる種類の細胞は各々、それ自体の生化学的個性および断片化
に対するそれ自体の感受性を有するので、細胞の種類、感受性および病状を同定
する同定特性として、その応答を用いることができる。例えば、断片とサイズが
似ている血小板は、それらがストレスを加えられると異なって応答するので、断
片から弁別される。断片、血小板、ゴースト細胞およびその他の細胞部分の弁別
および同定は、細胞株を選択的に染色するか、または特定の細胞部分、例えば細
胞膜の内側および外側に結合するか、あるいは血小板だけを染色する着色剤およ
び染料を用いることにより促進し得る。例えば、WO97/24598号、WO97/54599号お
よびWO97/24601号におけるようにストレスが血液標本に適用された場合、それは
細胞を強いて既知の形状にさせることにより正確な容積およびその他の細胞測定
値を得るために実施された。本明細書中に開示した方法は、細胞を断片化させて
、断片化の結果を測定する。これは、例えば、断片のサイズ範囲に上下閾値電圧
を設定することにより、標本の化学的調製にヘパリンまたはその他の適切な化学
物質を適用することにより断片化を促すことにより、および／または断片化に十
分な時間進行させることにより注目の断片以外のすべての粒子を除去することに
より、増強し得る。断片の誘導、検出および定量は、WO97/24598号、WO97/54599
号およびWO97/24601号により示された測定値ならびに誘導されたまたは既存の断
片により変えることができるその他の測定値を増強し得る。
【００１８】 電気粒子計数機を用いる場合、閾値は細胞を検出するのに十分低いほぼ０フェ
ントリットルの容積に設定するべきである。0.08mVの閾値容積は、既存の装置で
十分に作用することが判明している。その他の粒子集団は、電子的に、デジタル
に、機械的に、またはその他の手段により排除し得る。 市販粒子計数機およびWO97/24600号に開示された装置は、本発明に適切な示度
を提供するために用い得る。しかしながら、開口の横断面対赤血球断片または血
小板の平均横断面の比が実質的に4:1 であるように、いずれかの装置中の開口の
サイズが低減される場合に、さらに正確な示度が得られる。
ントリットルの容積に設定するべきである。0.08mVの閾値容積は、既存の装置で
十分に作用することが判明している。その他の粒子集団は、電子的に、デジタル
に、機械的に、またはその他の手段により排除し得る。 市販粒子計数機およびWO97/24600号に開示された装置は、本発明に適切な示度
を提供するために用い得る。しかしながら、開口の横断面対赤血球断片または血
小板の平均横断面の比が実質的に4:1 であるように、いずれかの装置中の開口の
サイズが低減される場合に、さらに正確な示度が得られる。
【００１９】 慣用の血球分析技術では、分析前に標本を抗凝固薬、例えばＥＤＴＡで処理す
るのが普通である。しかしながら、それは断片化を抑制する傾向がある。したが
って、抗凝固薬で標本を処理しないか、または断片化を抑制しないかまたは促す
抗凝固薬、例えばヘパリンを用いるのが望ましいことが判明した。 本発明の実施例を、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。
るのが普通である。しかしながら、それは断片化を抑制する傾向がある。したが
って、抗凝固薬で標本を処理しないか、または断片化を抑制しないかまたは促す
抗凝固薬、例えばヘパリンを用いるのが望ましいことが判明した。 本発明の実施例を、添付の図面を参照しながら詳細に説明する。
【００２０】 詳細な説明 本発明の方法を用いて得られた結果の例を、WO97/24529号に開示された装置お
よびWO97/24600号に開示された電極を用いて検査した細胞の標本に関する漸増ス
トレスに対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である、添付の
図面の図１〜５を参照しながら、ここで説明する。
よびWO97/24600号に開示された電極を用いて検査した細胞の標本に関する漸増ス
トレスに対する細胞サイズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である、添付の
図面の図１〜５を参照しながら、ここで説明する。
【００２１】 このような頻度分布は、例えば正常な非断片化赤血球のそれぞれ細胞透過性、
オスモル濃度および細胞形状の指標を提供するために、例えば、WO97/24598号、
WO97/24599号およびWO97/24601号において従来用いられてきた。 検査した標本は、ヘパリンで処理し、空気中での攪拌または振盪により機械的
に攪拌し、次にWO97/24529号に開示された装置を用いて浸透圧勾配処理を施した
。
オスモル濃度および細胞形状の指標を提供するために、例えば、WO97/24598号、
WO97/24599号およびWO97/24601号において従来用いられてきた。 検査した標本は、ヘパリンで処理し、空気中での攪拌または振盪により機械的
に攪拌し、次にWO97/24529号に開示された装置を用いて浸透圧勾配処理を施した
。
【００２２】 図１は、健常人からの血液標本である。ストレスが点Ａから前方に増大される
と、細胞は膨潤し始めて、平均細胞サイズの漸増を生じる。あるオスモル濃度で
、細胞はそれ以上増大し得ず、ストレスがさらに増大すると、細胞はその内容物
を排出して、領域Ｂに示したような「ゴースト細胞」になる。細胞のこれらの特
徴は、本発明の技術と並んで有用な診断情報を生じる。しかしながら、本発明は
これらの特徴には無関心で、且つそれらとは無関係であるが、しかし、代わりに
、図１のグラフのベースラインに沿って現れる細胞に関係する。これらのベース
ライン細胞の性質を、浸透圧ストレスに対するそれらの分布、機械的ストレスに
対するそれらの分布および／または空気との接触に対するそれらの応答により弁
別し得る。
と、細胞は膨潤し始めて、平均細胞サイズの漸増を生じる。あるオスモル濃度で
、細胞はそれ以上増大し得ず、ストレスがさらに増大すると、細胞はその内容物
を排出して、領域Ｂに示したような「ゴースト細胞」になる。細胞のこれらの特
徴は、本発明の技術と並んで有用な診断情報を生じる。しかしながら、本発明は
これらの特徴には無関心で、且つそれらとは無関係であるが、しかし、代わりに
、図１のグラフのベースラインに沿って現れる細胞に関係する。これらのベース
ライン細胞の性質を、浸透圧ストレスに対するそれらの分布、機械的ストレスに
対するそれらの分布および／または空気との接触に対するそれらの応答により弁
別し得る。
【００２３】 血小板は、検査した範囲内（300 〜100mOsm/Kg）の浸透圧ストレスによる影響
を受けない。しかしながら、断片は、浸透圧ストレスの影響を強く受ける。それ
らは溶解の誘発を伴わずに出現することは稀で、溶解が増大するとより多くなる
。したがって、断片はオスモル濃度とは逆に変化する。機械的ストレスは血小板
と断片に反対の作用を及ぼし、その影響は空気への同時曝露により強められる。
それは断片の出現を起こさせるが、しかしそれは血小板の溶解を誘導して、それ
らを目に見えなくする。
を受けない。しかしながら、断片は、浸透圧ストレスの影響を強く受ける。それ
らは溶解の誘発を伴わずに出現することは稀で、溶解が増大するとより多くなる
。したがって、断片はオスモル濃度とは逆に変化する。機械的ストレスは血小板
と断片に反対の作用を及ぼし、その影響は空気への同時曝露により強められる。
それは断片の出現を起こさせるが、しかしそれは血小板の溶解を誘導して、それ
らを目に見えなくする。
【００２４】 図２Ａ〜Ｆは、空気中での漸進的攪拌（それぞれの攪拌期間は0 、1 、2 、6
、10および15秒）により血小板が目に見えなくされる、ということを実証する。
図２Ａのベースラインに沿った信号は、それらの頻度が全オスモル濃度でほぼ同
一で、そして空気中での２秒間の攪拌でもほぼ完全な消失を誘導し得る（図２Ｃ
参照）ため、血小板の存在に帰し得る。その現象は、図３Ａ〜Ｆが、他の種類の
細胞が存在しない場合に純血小板懸濁液中で同一現象を示しているため、赤血球
または白血球との血小板結合（付随性）には帰し得ない。
、10および15秒）により血小板が目に見えなくされる、ということを実証する。
図２Ａのベースラインに沿った信号は、それらの頻度が全オスモル濃度でほぼ同
一で、そして空気中での２秒間の攪拌でもほぼ完全な消失を誘導し得る（図２Ｃ
参照）ため、血小板の存在に帰し得る。その現象は、図３Ａ〜Ｆが、他の種類の
細胞が存在しない場合に純血小板懸濁液中で同一現象を示しているため、赤血球
または白血球との血小板結合（付随性）には帰し得ない。
【００２５】 図４Ａ〜Ｅは、時間に伴う空気中での機械的攪拌の作用を実証する。攪拌期間
が４Ａから下って４Ｅに進行すると、生成される断片の数が増大する。同時に、
血小板は急速に目に見えなくされる（しかし、これらの特定の図でこれを観察す
るのは難しい）。図５Ａ〜Ｄは、空気を伴う振盪時の全血標本中の血小板低減を
実証する。このような頻度分布は、例えばWO97/24598号、WO97/24599号およびWO
97/24601号において従来用いられてきた。
が４Ａから下って４Ｅに進行すると、生成される断片の数が増大する。同時に、
血小板は急速に目に見えなくされる（しかし、これらの特定の図でこれを観察す
るのは難しい）。図５Ａ〜Ｄは、空気を伴う振盪時の全血標本中の血小板低減を
実証する。このような頻度分布は、例えばWO97/24598号、WO97/24599号およびWO
97/24601号において従来用いられてきた。
【００２６】 好ましい方法は、既存の自動血小板計数機を用いて、空気の不存在下で標本を
混合し、検査して血小板を測定する工程を包含する。やむおえず多少の空気が存
在する場合には、標本に及ぼす影響を限定するために標本メニスカスの表面積を
最小にすべきであり、あるいは血小板に影響を及ぼさない気体を用いるべきであ
る。この１回の測定は、血小板と類似のサイズの粒子を含有しない全標本に関す
る正確な計数を提供する。反復測定は、血小板を自動分析機に対して非可視的に
させるために、空気との制御攪拌後におこなわれる。２回の測定からの集団間の
差は、血小板の数、それらの年齢および生理学的特性の測定を提供する。全血標
本中では、血小板のみが消失する。例えば、空気との攪拌前後の細胞計数が異な
らない場合には、懸濁中に血小板は認められない。
混合し、検査して血小板を測定する工程を包含する。やむおえず多少の空気が存
在する場合には、標本に及ぼす影響を限定するために標本メニスカスの表面積を
最小にすべきであり、あるいは血小板に影響を及ぼさない気体を用いるべきであ
る。この１回の測定は、血小板と類似のサイズの粒子を含有しない全標本に関す
る正確な計数を提供する。反復測定は、血小板を自動分析機に対して非可視的に
させるために、空気との制御攪拌後におこなわれる。２回の測定からの集団間の
差は、血小板の数、それらの年齢および生理学的特性の測定を提供する。全血標
本中では、血小板のみが消失する。例えば、空気との攪拌前後の細胞計数が異な
らない場合には、懸濁中に血小板は認められない。
【００２７】 種々の実験条件下で、即ち、純血小板懸濁液中で、他のすべての血球要素の存
在下で、ガラス、ポリスチレンおよびポリエチレンの容器中で、薄膜の種々の表
面積への曝露後、そして種々の量のガラスビーズとともに振盪することにより、
種々の浸透圧、機械的、熱および音波ストレスへの曝露後、ならびに空気および
窒素との機械的攪拌後に、我々は血小板を測定した。
在下で、ガラス、ポリスチレンおよびポリエチレンの容器中で、薄膜の種々の表
面積への曝露後、そして種々の量のガラスビーズとともに振盪することにより、
種々の浸透圧、機械的、熱および音波ストレスへの曝露後、ならびに空気および
窒素との機械的攪拌後に、我々は血小板を測定した。
【００２８】 これらすべてのストレスに対する血小板数を測定することにより、血小板を電
子的に非可視的にさせるが、一方他の種類の細胞は変えられないかまたは変形さ
れず、しかし自動分析機に対して依然として可視的である条件を我々は見出した
。さらに、消失の速度および特徴は、血小板の健康および機能の指標である。 全試験所において、あらゆる血液標本に関する分析の前に、標本を先ず振盪さ
せて、互いに、そして血漿に関して無作為に細胞型を混合する。攪拌は、自動計
器での分析工程中継続し、細胞を、可変量の空気の存在下で、故意にそして偶発
的にの両方で、攪拌に曝露する。実際、血液の各ボーラスを分離するための、ま
たは試験管および計器導管を清浄にするための一方法として、多くの計器が空気
気泡を使用する。
子的に非可視的にさせるが、一方他の種類の細胞は変えられないかまたは変形さ
れず、しかし自動分析機に対して依然として可視的である条件を我々は見出した
。さらに、消失の速度および特徴は、血小板の健康および機能の指標である。 全試験所において、あらゆる血液標本に関する分析の前に、標本を先ず振盪さ
せて、互いに、そして血漿に関して無作為に細胞型を混合する。攪拌は、自動計
器での分析工程中継続し、細胞を、可変量の空気の存在下で、故意にそして偶発
的にの両方で、攪拌に曝露する。実際、血液の各ボーラスを分離するための、ま
たは試験管および計器導管を清浄にするための一方法として、多くの計器が空気
気泡を使用する。
【００２９】 ガラスビーズを用いての振盪は、血小板計数に小さい作用を及ぼし、したがっ
て、目的が血小板消失を回避することである場合、初期標本混合のためには、空
気または他の何かの気体を用いた振盪より望ましい。それが空気を含有しなかっ
た（血液懸濁液で満たされている）場合、ただ空気だけを含有して空になるまで
、円錐形フラスコからアリコートを連続的に抜き出すことにより、振盪の機械的
作用を、空気混合の作用とさらに弁別した。その間中、血液懸濁液を連続的に攪
拌棒で攪拌した。フラスコがいっぱいに満たされている限り、血小板数は一定の
ままであったが、しかし標本／空気の比が半分以下に下がると、血小板は消失し
始め、フラスコ中の空気の容積に直接比例して消失した。空気の不存在下では、
血小板は、空気の存在下でのように２秒以内に評価可能なほどには消失しない。
したがって、空気（またはその構成成分）を用いた攪拌の継続期間および強度に
対する血小板の計数は、それらを減少させるか完全に消失させるが、しかし細菌
、断片、血中に見出され得るその他のあらゆる要素は減少も消失も伴わない。
て、目的が血小板消失を回避することである場合、初期標本混合のためには、空
気または他の何かの気体を用いた振盪より望ましい。それが空気を含有しなかっ
た（血液懸濁液で満たされている）場合、ただ空気だけを含有して空になるまで
、円錐形フラスコからアリコートを連続的に抜き出すことにより、振盪の機械的
作用を、空気混合の作用とさらに弁別した。その間中、血液懸濁液を連続的に攪
拌棒で攪拌した。フラスコがいっぱいに満たされている限り、血小板数は一定の
ままであったが、しかし標本／空気の比が半分以下に下がると、血小板は消失し
始め、フラスコ中の空気の容積に直接比例して消失した。空気の不存在下では、
血小板は、空気の存在下でのように２秒以内に評価可能なほどには消失しない。
したがって、空気（またはその構成成分）を用いた攪拌の継続期間および強度に
対する血小板の計数は、それらを減少させるか完全に消失させるが、しかし細菌
、断片、血中に見出され得るその他のあらゆる要素は減少も消失も伴わない。
【００３０】 本方法は、以下において有用である： １．疾患診断の改良。より正確な血小板計数は良好な疾患診断および予後をも
たらす。 ２．血液検査の既存方法。不活性気体を用いることにより、または混合から空
気を排除することにより、自動計器は血小板計数および大きさによる分類の精度
および反復可能性を改良する。
たらす。 ２．血液検査の既存方法。不活性気体を用いることにより、または混合から空
気を排除することにより、自動計器は血小板計数および大きさによる分類の精度
および反復可能性を改良する。
【００３１】 ３．血小板の健康の新規の測定法。この方法を用いることにより、空気に対す
るそれらの感受性ならびにそれらの消失および再出現速度から、血小板の健康に
ついての新しい情報が得られる。 ４．血液採取。Currently Vacutainers （カレントリーバキュテイナー、商標
）（部分的真空ガラス試験管）は空気を含有し、さらに、標本が必要とされるよ
りも小さい場合に、時として入れられる。
るそれらの感受性ならびにそれらの消失および再出現速度から、血小板の健康に
ついての新しい情報が得られる。 ４．血液採取。Currently Vacutainers （カレントリーバキュテイナー、商標
）（部分的真空ガラス試験管）は空気を含有し、さらに、標本が必要とされるよ
りも小さい場合に、時として入れられる。
【図１】 多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイ
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図２】 多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイ
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図３】 多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイ
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図４】 多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイ
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
【図５】 多数の細胞標本に関する浸透圧的および機械的ストレス増大に対する細胞サイ
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
ズ測定値のプロフィールを示す頻度分布である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９９１０２６７．５ (32)優先日 平成11年５月４日(1999．5．4) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シャイン，トーマス アダム アメリカ合衆国，コネチカット 06511， ニュー ヘイブン，ローレンス ストリー ト 220，アパートメント ＃３ Ｆターム(参考） 2G045 AA04 BA11 BB60 CA25 GA04
Claims (13)
- 【請求項１】 血小板を含有する細胞懸濁液中の血小板の数の測定値の確定
方法であって、以下の： 懸濁液中の小粒子の数を計数し、 気体の存在下で懸濁液を攪拌し、 攪拌後に懸濁液中の小粒子の数を計数し、そして 血小板の数の測定値を得るために２つの計数を比較する 工程を含む方法。 - 【請求項２】 前記気体が空気、あるいは１以上のその構成気体である請求
項１に記載の方法。 - 【請求項３】 小粒子の数の最初計数を得るために前記懸濁液が攪拌される
前に前記懸濁液の１以上のアリコートを粒子計数機に通し、その後、標本中の小
粒子の数の二回目の計数を得るために攪拌後に前記懸濁液の１以上のその他のア
リコートを粒子計数機に通す請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記細胞懸濁液が等張である請求項１〜３のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項５】 少なくとも７フェントリットルの容積を有する小粒子を前記
懸濁液中の小粒子の数の計測値を得るために検出する請求項１〜４のいずれかに
記載の方法。 - 【請求項６】 前記懸濁液にオスモル濃度における一連の変更を施し、多数
の異なるオスモル濃度で懸濁液中の小粒子の計数を得る請求項１〜５のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項７】 前記懸濁液との接触における空気の量、攪拌強度および攪拌
継続時間のうちの少なくとも１つを測定する請求項１〜６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項８】 in vitroの遊離細胞標本の分析方法であって、以下の： 既知のまたは同定可能量のストレスを標本に適用し、 ストレス適用の前後に標本を測定して、適用ストレスにより生じた標本中の
細胞断片の数に関する定量的情報を確定し得る少なくとも１つの示度を提供し、
そして この示度をストレスの量に関連させて細胞脆砕性の指標を提供する 工程を包含する方法。 - 【請求項９】 前記適用ストレスが機械的、化学的、熱、音波、光、電気的
、電磁的およびオスモル濃度の変化から成る群のうちの少なくとも１つである請
求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 細胞断片の数と適用ストレスとの間の関係のプロットを得
るために一連のストレスを適用する請求項８または９に記載の方法。 - 【請求項１１】 標本が浸透圧勾配処理を施す請求項８または９に記載の方
法。 - 【請求項１２】 細胞断片の数と適用ストレスとの間の関係を説明するデー
タを得るために多数の異なるオスモル濃度で測定を成す請求項１０または１１に
記載の方法。 - 【請求項１３】 粒子の数を計数するために用いられる検出閾値を細胞を検
出するのに十分低い実質的に０フェントリットルの容積に設定する請求項８〜１
２のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9828765.9 | 1998-12-29 | ||
| GBGB9828765.9A GB9828765D0 (en) | 1998-12-29 | 1998-12-29 | A method of testing a cell sample |
| GB9910266.7 | 1999-05-04 | ||
| GBGB9910267.5A GB9910267D0 (en) | 1999-05-04 | 1999-05-04 | A method of determining the number of platelets in a cell suspension containing platelets |
| GBGB9910266.7A GB9910266D0 (en) | 1999-05-04 | 1999-05-04 | A method of analysing a sample of free cells |
| GB9910267.5 | 1999-05-04 | ||
| PCT/GB1999/004428 WO2000039559A2 (en) | 1998-12-29 | 1999-12-24 | A method of analysing a sample of free cells |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002533712A true JP2002533712A (ja) | 2002-10-08 |
| JP2002533712A5 JP2002533712A5 (ja) | 2007-02-22 |
| JP4402301B2 JP4402301B2 (ja) | 2010-01-20 |
Family
ID=27269605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000591409A Expired - Lifetime JP4402301B2 (ja) | 1998-12-29 | 1999-12-24 | 遊離細胞標本の分析方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6699680B1 (ja) |
| EP (2) | EP2322910B1 (ja) |
| JP (1) | JP4402301B2 (ja) |
| AU (1) | AU732426B2 (ja) |
| NZ (1) | NZ506590A (ja) |
| WO (1) | WO2000039559A2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4402301B2 (ja) * | 1998-12-29 | 2010-01-20 | バジル シャイン，イアン | 遊離細胞標本の分析方法 |
| CA2838007A1 (en) | 2004-11-15 | 2006-05-26 | University Of North Dakota | A method for single oxygen atom incorporation into digested peptides using peptidases |
| US7822276B2 (en) * | 2005-02-17 | 2010-10-26 | Iris International, Inc. | Method and apparatus for analyzing body fluids |
| JP5058320B2 (ja) * | 2010-09-16 | 2012-10-24 | シスメックス株式会社 | 血液撮像装置および血液撮像方法 |
| CN111033256B (zh) * | 2017-09-05 | 2022-07-12 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 血小板聚集样本的报警方法、血细胞分析仪及存储介质 |
| CN111656161B (zh) | 2018-04-28 | 2024-02-20 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 样本分析仪异常的报警方法、系统及存储介质 |
Family Cites Families (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3502412A (en) * | 1967-10-16 | 1970-03-24 | Abbott Lab | Method and apparatus for measuring osmotic fragility of red blood cells by constantly reducing the concentration of the saline solution suspending the cells |
| US3606539A (en) * | 1968-11-13 | 1971-09-20 | American Optical Corp | Apparatus and method for measuring osmotic fragility of red blood cells |
| CA988319A (en) | 1973-10-11 | 1976-05-04 | Tomas Hirschfeld | System for differentiating particles |
| US3851246A (en) | 1973-11-26 | 1974-11-26 | Us Navy | Method of predicting the post transfusion viability of preserved erythrocytes and other similar cells |
| GB1481480A (en) * | 1974-02-02 | 1977-07-27 | Kernforschungsanlage Juelich | Process and apparatus for increasing the permeability of the membrane of cells of organisms |
| US4271001A (en) * | 1978-03-23 | 1981-06-02 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Apparatus for measuring membrane characteristics of vesicles |
| US4240027A (en) * | 1978-08-31 | 1980-12-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Electromagnetic method for the noninvasive analysis of cell membrane physiology and pharmacology |
| IT1105662B (it) * | 1978-09-07 | 1985-11-04 | Salus Istituto Diagnostico Di | Apparecchiatura per studiare e fenomeni della emocoagulazione e dell'aggregazione delle piastrine |
| US4375615A (en) * | 1979-04-20 | 1983-03-01 | Becton Dickinson And Company | Apparatus for counting particles in a liquid suspension |
| US4298836A (en) | 1979-11-23 | 1981-11-03 | Coulter Electronics, Inc. | Particle shape determination |
| US4374644A (en) * | 1981-04-06 | 1983-02-22 | Coulter Electronics, Inc. | Blood cell volume monitoring |
| US4535284A (en) * | 1981-07-10 | 1985-08-13 | Coulter Electronics, Inc. | High and low frequency analysis of osmotic stress of cells |
| DE3215719C2 (de) | 1982-04-28 | 1984-01-26 | Holger Dr. 5100 Aachen Kiesewetter | Meßeinrichtung zur Messung des Verformungsvermögens von roten Blutkörperchen |
| GB8408529D0 (en) | 1984-04-03 | 1984-05-16 | Health Lab Service Board | Concentration of biological particles |
| US4664796A (en) * | 1985-09-16 | 1987-05-12 | Coulter Electronics, Inc. | Flux diverting flow chamber for high gradient magnetic separation of particles from a liquid medium |
| US4791355A (en) | 1986-10-21 | 1988-12-13 | Coulter Electronics Inc. | Particle analyzer for measuring the resistance and reactance of a particle |
| US5223398A (en) | 1987-03-13 | 1993-06-29 | Coulter Corporation | Method for screening cells or formed bodies for enumeration of populations expressing selected characteristics |
| US5006460A (en) | 1988-05-26 | 1991-04-09 | Pantox Corporation | Method for measuring DNA damage in single cells |
| JP2966904B2 (ja) * | 1990-08-08 | 1999-10-25 | 株式会社日立製作所 | 細胞の処理方法、および処理装置 |
| US5548661A (en) | 1991-07-12 | 1996-08-20 | Price; Jeffrey H. | Operator independent image cytometer |
| WO1993016384A1 (en) * | 1992-02-07 | 1993-08-19 | Abbott Laboratories | Method for accurately enumerating and sensitively qualifying heterogeneous cell populations in cytolytic processing conditions |
| US5532139A (en) * | 1992-10-30 | 1996-07-02 | Micro-Med, Inc. | Micro lysis-analysis process to measure cell characteristics and diagnose diseases |
| US5595866A (en) | 1994-05-27 | 1997-01-21 | Methodist Hospital Of Indiana, Inc. | Step-wise method to remove cryoprotectant from sperm |
| GB9526653D0 (en) | 1995-12-29 | 1996-02-28 | Shine Thomas A | Fluid delivery device |
| GB9526652D0 (en) | 1995-12-29 | 1996-02-28 | Shine Thomas A | Electrode assembly |
| GB9526676D0 (en) * | 1995-12-29 | 1996-02-28 | Shine Thomas A | Method for testing a cell suspension |
| DE69635391T2 (de) * | 1995-12-29 | 2006-08-03 | Basil Ian Shine | Verfahren zur Untersuchung einer Zellprobe |
| GB9526684D0 (en) | 1995-12-29 | 1996-02-28 | Shine Thomas A | Method for testing a cell sample |
| JP4402301B2 (ja) * | 1998-12-29 | 2010-01-20 | バジル シャイン，イアン | 遊離細胞標本の分析方法 |
-
1999
- 1999-12-24 JP JP2000591409A patent/JP4402301B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 WO PCT/GB1999/004428 patent/WO2000039559A2/en active Application Filing
- 1999-12-24 EP EP10183397.8A patent/EP2322910B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 US US09/623,186 patent/US6699680B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-24 AU AU18817/00A patent/AU732426B2/en not_active Expired
- 1999-12-24 NZ NZ506590A patent/NZ506590A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-12-24 EP EP99962461A patent/EP1058830B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-12-26 US US10/329,608 patent/US20030138871A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU732426B2 (en) | 2001-04-26 |
| JP4402301B2 (ja) | 2010-01-20 |
| EP1058830A1 (en) | 2000-12-13 |
| EP1058830B1 (en) | 2012-07-11 |
| EP2322910A2 (en) | 2011-05-18 |
| EP2322910B1 (en) | 2019-03-13 |
| AU1881700A (en) | 2000-07-31 |
| US6699680B1 (en) | 2004-03-02 |
| NZ506590A (en) | 2002-10-25 |
| EP2322910A3 (en) | 2012-02-01 |
| WO2000039559A2 (en) | 2000-07-06 |
| US20030138871A1 (en) | 2003-07-24 |
| WO2000039559A3 (en) | 2000-11-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bain et al. | Basic haematological techniques | |
| US6423270B1 (en) | Flow cytometric characterization of amyloid fibrils | |
| Chabot-Richards et al. | White blood cell counts: reference methodology | |
| JP2565844B2 (ja) | 細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し，感受性に関する格付けを行う方法 | |
| US3558522A (en) | Hematology control standard comprising washed red blood cells and synthetic latex particles | |
| Bayliss et al. | Detecting fetomaternal hemorrhage: a comparison of five methods | |
| JP2002506208A (ja) | 白血球百分率及び網状赤血球計数の決定 | |
| JP2003526082A (ja) | 血球の計数を行う方法 | |
| JP5762523B2 (ja) | 血液サンプルを分析するための方法およびシステム | |
| WO1985005179A1 (en) | Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes | |
| SE442347B (sv) | Komposition for provning av biologiska vevnader eller vetskor innehallande ett dna-interaktivt fergemne och ett avexciterande emne, samt ett sett att anvenda kompositionen | |
| US4535284A (en) | High and low frequency analysis of osmotic stress of cells | |
| JP4402301B2 (ja) | 遊離細胞標本の分析方法 | |
| JP2002005925A (ja) | 破砕赤血球の測定方法 | |
| JP4160117B2 (ja) | 細胞サンプルを試験するための方法 | |
| Chiron et al. | The GEN. S: a fortuitous finding of a routine screening test for hereditary spherocytosis | |
| US4788155A (en) | Method and apparatus for measuring the degree of reaction between a foreign entity and a subject's blood cells | |
| JP2778745B2 (ja) | 血液中の白血球弁別測定用試薬 | |
| Saunders | Development of automation of differential leukocyte counts by use of cytochemistry | |
| JP2004513369A (ja) | 血小板活性の測定方法 | |
| Cantinieaux et al. | Accurate flow cytometric measurement of bacteria concentrations | |
| US3476514A (en) | Cancer cytoscreening | |
| Gunawardena et al. | Comparison of Automated and Manual Reticulocyte Count in a cohort of patient’s samples in Haematology Laboratory of Colombo South Teaching Hospital, Sri Lanka | |
| CA2358920C (en) | A method of testing a cell sample | |
| Huisman et al. | Mathematical correction of the invitro storage-related increase in erythrocyte mean cell volume of an automated hematology analyzer-the Cell-Dyn 4000 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061225 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20061225 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080724 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090526 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090824 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090929 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20091029 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4402301 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121106 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121106 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131106 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |