JP5762523B2 - 血液サンプルを分析するための方法およびシステム - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、粒子分析器を使用して血液サンプルを分析するための方法およびシステムに関し、より具体的には、網状赤血球およびゴースト化され難い（ｈａｒｄ−ｔｏ−ｇｈｏｓｔ）細胞を決定することに関する。

毎年、何百人ものアメリカ人が血液疾患に罹患している。血液病理の例は、白血病およびリンパ腫等の種々の血液悪性疾患、サラセミア、クーリー病、および鎌状赤血球貧血（ＨｂＳ病）等の、いくつかの遺伝的原因の貧血を包含する異常血色素症、ならびに種々の凝血および出血性障害を含む。血液異常はまた、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、悪性腫瘍、および自己免疫障害等の他の状態と関連付けられる二次的な結果でもあり得る。これらの状態のほとんどは、有意な罹患率および死亡率を有し、一般的に罹患した患者で重度の苦痛を引き起こす。疾患を有する患者が適正な処置および疾患管理を受容することができるように、これらの障害の早期診断が重要である。

血液は、栄養素および酸素等の必要な物質を身体の細胞に送達し、これらの同じ細胞から老廃物を輸送する、特殊な体液である。血液中の主要細胞は、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、すなわち、ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌまたはｒｅｄ ｃｅｌｌ）である。末梢血スメアにおいて、赤血球は、タンパク質ヘモグロビン由来の赤みがかかった色を導出し、通常、赤血球は、淡染性の中心領域を伴う円形または長円形に見える。それらの両凹形態は、細胞の表面積を増加させ、細胞からの酸素および二酸化炭素の拡散を促進する。典型的な赤血球は、約１２０日の寿命を有する。

赤血球は、骨髄中の有核前駆細胞から発生する。未熟な赤血球、すなわち、網状赤血球は、増加したヘモグロビン数およびガス運搬能力に貢献する細胞小器官を有する。網状赤血球は、それらのポリリボソームまたはリボ核酸（ＲＮＡ）を染色するために、特別な染色が使用されるときに、末梢血スメアで認識することができる。典型的な条件下で、網状赤血球は、サンプルの中の赤血球の約１〜２％を占める。しかしながら、身体的に必要な一定期間中に、網状赤血球数は増加する場合がある。

疾患、ミネラル含有量、薬物有効性、および臓器機能等の生理学的および生化学的状態を決定するために、血液検査を使用することができる。例えば、種々の形態の貧血または急性内出血等の疾患の診断を確認する際、または確認を助ける際に、網状赤血球の決定が非常に重要となり得る。

自動網状赤血球分析は、フローサイトメータまたは血液学的分析器等の粒子分析器を使用して行うことができる。粒子分析器の例は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＵｎｉＣｅｌ（登録商標） ＤｘＨ ８００ ＳｙｓｔｅｍおよびＳｙｓｍｅｘ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＸＴ−２０００を含む。サイトメトリフローおよび血液学的分析用の血液サンプルの調製は、概して、全血サンプルを採取することと、Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ（ＮＭＢ）等の生体染色液を用いて血液のサンプルをインキュベートするステップ、およびヘモグロビンを取り除く低張の酸で血液サンプルを希釈するステップのうちの一方または両方を行うこととを伴う。染色は、赤血球内のＲＮＡを沈殿させる。低張の酸で希釈することにより、ヘモグロビンを取り除き、細胞内の染色したＲＮＡを残す。ヘモグロビンを除去する過程は、一般的に「ゴースト化」と呼ばれる。次いで、血液サンプルまたはその一部分は、粒子分析器のフローセルの中での分析に供される。典型的には、シース液の中の細胞は、１つずつフローセルの中の１点を通り、ここで、１つまたは複数の光ビームによって調査される。いくつかの測定値が、各通過細胞について生成される。単一の細胞の調査は、細胞事象と呼ばれる。細胞事象あたりの一般的に記録される測定値は、前方光散乱、軸方向光損失、および蛍光を含む。いくつかの粒子分析器はまた、どれだけ多くのインピーダンスが細胞によってもたらされるかということの尺度である、直流インピーダンス（ＤＣ）測定値も収集する。細胞膜を透過せず、電流が細胞を通って流れないような、最大電流を印加することにより得られるＤＣ測定値はまた、コールター容積または容積としても知られている。

本願は、粒子分析器データの分析を対象としている。一実施形態では、血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を列挙する自動化された方法は、血球サンプルを、核酸染色液および赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合し、それにより、ゴースト化した血球サンプルを生成するステップと、ゴースト化した血球サンプルをサイトメトリのフローセルに通すステップと、２つの異なる光学的測定値を使用して、サイトメトリのフローセルにおいてゴースト化した血球サンプルを分析するステップと、２つの異なる光学的測定値を検出することによって、ゴースト化され難い細胞を区別するステップと、ゴースト化され難い細胞を列挙するステップとを含むことができる。

別の実施形態では、血液サンプルを分析する方法は、事象データを生成するように、軸方向光損失測定値を含む検出によって、フローセルの中の血液サンプルを測定するステップと、軸方向光損失測定値に基づき、事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞の集団を同定するステップと、事象データからゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除く（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ−ｏｕｔ）ステップと、血球分布パターンを同定するように事象データを分析するステップとを含むことができる。網状赤血球分析を含む分析は、ゴースト化され難い細胞をフィルタリングして取り除いた後に行うことができる。

いくつかの実施形態では、血液サンプルを分析する方法は、軸方向光損失測定によって生成された事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞の集団を列挙するステップを含むことができる。報告される実施形態の実施例は、全赤血球集団のうちのゴースト化され難い細胞の％となり得る。該値は、研究専用（ＲＵＯ）パラメータとして使用することができ、またはインビトロ診断（ＩＶＤ）パラメータに発展させることができる。

さらに別の実施形態では、血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を列挙する自動化された方法は、血球サンプルを、核酸を含有する血球を染色する核酸染色蛍光色素および血球サンプルの中の赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合し、それにより、ゴースト化した血球サンプルを生成するステップと、ゴースト化した血球サンプルをサイトメトリのフローセルに通すステップと、光散乱および蛍光測定値を使用することによって、サイトメトリのフローセルにおいてゴースト化した血球サンプルを分析するステップと、蛍光および光散乱測定値を検出することによって、ゴースト化され難い細胞を、核酸を含有する蛍光染色した細胞およびゴースト化した細胞から区別するステップと、ゴースト化され難い細胞を列挙するステップとを含むことができる。

本発明のさらなる特徴および利点、ならびにその種々の実施形態の構造および実施を、添付の図面を参照して下記で詳細に説明する。本発明は、本明細書で説明される具体的実施形態に限定されないことに留意されたい。そのような実施形態は、例証目的のみで本明細書に提示される。付加的な実施形態が、本明細書に含まれる教示に基づいて当業者に明白となるであろう。

図１は、２次元における、フローサイトメータを使用した血液サンプルの分析からの事象データの図である。 図２は、本発明の一実施形態による、血液サンプルの中の未熟な網状赤血球を分析する際のステップを図示する。 図３は、本発明の一実施形態による、図２に示された予備処理ステップのさらなる詳細を示す。 図４は、本発明の一実施形態による、図２に示された測定ステップのさらなる詳細を示す。 図５（Ａ）および５（Ｂ）は、血液サンプルの分析からの事象データの２次元図である。図５（Ｂ）は、ゴースト化され難い細胞の集団が除去された、図５（Ａ）に示された事象データの図である。 図６は、図５（Ａ）に示されたもの同じ事象集団を示すが、従来のＤＣおよびＵＭＡＬＳの代わりに、軸方向光損失（ＡＬＬ）およびＵＭＡＬＳを使用している。 図７（Ａ〜Ｃ）は、ゴースト化され難い細胞の集団を同定する様々な能力によって事象データを図示する、いくつかの２次元図を示す。 図８は、本発明の別の実施形態による、図２に示された測定ステップのさらなる詳細を示す。 図９は、本発明の一実施形態による、未熟な網状赤血球を評価するためのシステムである。 図１０（Ａ）は、健康な個人からの血液サンプルの分析からの事象データの３次元図を示す。ゴースト化され難い細胞１０１０、成熟赤血球１０２０、および網状赤血球１０３０は、図中で明確に区別されている。図１０（Ｂ）は、鎌状赤血球貧血と診断された患者からの血液サンプルの分析からの事象データの３次元図を示す。ゴースト化され難い細胞１０１０、成熟赤血球１０２０、および網状赤血球１０３０は、図中で明確に区別されている。図１０（Ｃ）は、サラセミアと診断された患者からの血液サンプルの分析からの事象データの３次元図を示す。ゴースト化され難い細胞１０１０、成熟赤血球１０２０、および網状赤血球１０３０は、図中で明確に区別されている。 図１１は、健康な個人から得られた血液サンプルの中の「ゴースト化され難い」細胞の平均％を図示する。 図１２は、種々の疾患に罹患した患者から得られた血液サンプルの中の「ゴースト化され難い」細胞の平均％を図示する。

本発明の特徴および利点は、図面と共に用いられるときに、下記に記載される詳細な説明から、より明白となるであろう。図面中、類似の参照番号は、概して、同一、機能的に同様、および／または構造的に同様の要素を示す。概して、要素が最初に出現する図面は、対応する参照番号の最左の数字によって示される。

（詳細な説明）
本発明は、粒子分析データ処理に関する。本発明は、特定の用途に対する例証的実施形態を参照して本明細書で説明されているが、本発明は、それらに限定されないことを理解されたい。本明細書の教示にアクセスできる当業者であれば、その範囲内の付加的な修正、用途、および実施形態、ならびに本発明が非常に有用である付加的な分野を認識するであろう。

（概観）
上記の背景の節で説明されるように、血液サンプルの中の赤血球の分布を決定する自動化された能力は、いくつかの用途にとって重要な能力である。本明細書で開示される方法およびシステムは、血液サンプルの中の細胞の集団の改良型の自動化された測定をもたらす。一実施形態では、ゴースト化され難い細胞は、本明細書で提供される方法を使用して、区別され、列挙される。

本発明が実施されてもよい例示的環境は、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒのＵｎｉＣｅｌ（登録商標） ＤｘＨ ８００ Ｓｙｓｔｅｍ等の粒子分析器を含む。ＵｎｉＣｅｌ（登録商標） ＤｘＨ ８００ Ｓｙｓｔｅｍは、例えば、フローセル内の流体力学的に集中した細胞を評価するために、Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）容積、伝導度、および光散乱（ＶＣＳ）技術を使用する。ＶＣＳは、容量を測定する低周波数直流電源、伝導度を測定する高周波数電源、および散乱を測定するレーザ光源といった、細胞測定のために相互に協調して稼働する３つの独立エネルギー源を使用する。容積測定は、細胞全体が等張性希釈剤において置換する容積を物理的に測定する、電気インピーダンスのコールター原理を使用して行われる。この方法は、光路におけるそれらの配向にかかわらず、全ての細胞種類を正確にサイズ決定する。無線周波数（ＲＦ）範囲内の交流電流は、細胞の膜の双極脂質層を短絡させ、エネルギーが細胞に進入することを可能にする。この強力な方法は、化学成分および核容積を含む、細胞のサイズおよび内部構造に関する情報を収集するために使用される。レーザおよび多角光散乱検出器は、細胞の内部構造、粒度、および表面形態に関する情報を提供する。加えて、ＶＣＳデバイスは、伝導度および散乱からの細胞のサイズで調整される他の測定値を取得するために、高度に正確なＤＣ容積測定を使用する。しかしながら、本開示の教示は、ＶＣＳ技術を使用するデバイスに限定されないことに留意されたい。

図１は、粒子分析器を使用した血液の測定から生成された事象データに基づいて、血液サンプルの２次元散布図を示す。散布図中に出現する各データ点は、１つの細胞事象から取得される選択された測定、すなわち、フローセルの中の電流およびレーザビームによる個々の細胞の調査に基づく。血液サンプルの中で一般的に見出される異なる細胞種類の事象データ集団が、散布図に示されている。一般に、十分な分離が、全体としての赤血球の集団（すなわち、赤血球１０２および網状赤血球１０４）と、血小板１０８と、および白血球１０６との間に存在し、この既知の技法は、例えば、線１２２および１２４によって画定される領域に基づいた、全体としての赤血球の集団のゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）を可能にする。ゲーティングとは、多重パラメータデータから選択された測定値をフィルタリングする、例えば、上記で説明されるように、既知の閾値に対して各細胞事象について生成された測定値を試験することによって、赤血球（赤血球および網状赤血球）、血小板、および白血球を分離する過程を指す。例えば、線１２４は、閾値容積値となり得、線１２２は、閾値光散乱値となり得、線１２４より上側の容積測定値および線１２２未満の光散乱値（しばしば光散乱の対数の形態で使用される）を伴う細胞事象は、赤血球または網状赤血球のいずれか一方に対応する。既存のシステムでは、網状赤血球集団はまた、例えば、線１３０等の線によってゲーティングすることができる。線１３０の右側の事象が、網状赤血球である一方で、線１３０の左側の事象は、成熟赤血球である。

（網状赤血球を分析する）
一側面では、血液サンプルの中の網状赤血球を分析するための方法が提示される。図２は、本発明の一実施形態による、網状赤血球を評価する際のステップのフローチャートである。ステップ２０２では、血液サンプルが、粒子分析器内の分析のために調製される。調製は、血液サンプルをゴースト化すること、および／または好適な色素もしくは染色液でサンプルを染色することを含むことができる。図３は、一実施形態による、調製ステップ２０２をさらに詳細に示す。ステップ３０２では、網状赤血球をさらに示すように、血液サンプルを生体染色と組み合わせることができる。例えば、網状赤血球の細胞内リボ核酸（ＲＮＡ）を沈殿させる非蛍光色素を使用することができる。好適な染色の例は、Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｂｌｕｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒｅｔｉｃ Ｐａｋ^ＴＭの試薬Ａとして知られている）、Ｏｘａｚｉｎｅ ７５０、およびＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｒｅｓｙｌ Ｂｌｕｅを含むが、それらに限定されない。沈殿させられたＲＮＡは、より高い密度を有し、このことは、各細胞中のＲＮＡ含有量の表示（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）を増強する。網状赤血球を測定するために非蛍光色素を使用することには、所望であれば蛍光色素を利用することによって、血液サンプルが他の構成物質についてさらに分析されることを可能にする追加利点がある。好適な蛍光色素の実施例は、チアゾールオレンジおよびポリメチンを含むが、それらに限定されない。付加的な予備ステップが、本発明の種々の実施形態で可能である。例えば、いくつかの実施形態では、蛍光測定を使用して、サンプルの付加的な特性を測定するように、蛍光色素を血液サンプルと組み合わせることができる。

血液サンプルの組成の検査をさらに遂行するために、血液サンプルは、例えば、チオシアン酸カリウムおよび硫酸を有する、網状赤血球ゴースト化溶液等の試薬と組み合わせることができる（ステップ３０４）。この種類のゴースト化試薬は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｒｅｔｉｃ Ｐａｋ^ＴＭの試薬Ｂとして知られている商品として入手することができる。当業者に公知である他のゴースト化試薬を使用することができる。ゴースト化過程は、赤血球の中のヘモグロビンを放出させ、ゴースト化した細胞をもたらす。本明細書で使用されるような「ゴースト化した細胞」という用語は、そのヘモグロビン含有量の約７０％超が除去されている赤血球を指す。好ましくは、細胞は、ヘモグロビンの９０％超、さらに好ましくは９５％超が除去されている。言い換えれば、ゴースト化した細胞は、もともとのヘモグロビンの３０％未満を保持する。ヘモグロビン含有量の低減は、網状質の画定を増強して、網状赤血球のサイトメトリフロー決定を可能にする。より具体的には、赤血球中のヘモグロビン含有量の低減は、光散乱およびＤＣを含む非蛍光方法によって測定するときに、成熟ＲＢＣからの網状赤血球の区別を可能にする。

ヘモグロビンの放出を促進することに加えて、ゴースト化過程はまた、赤血球を球形化して、細胞により規則正しい形状を与え、それにより、より予測可能な光散乱測定を可能にすることができる。天然網状赤血球は、光ビームに供されたときに予測不可能な光散乱情報を生じる、不規則な形状を有する。赤血球の球形化は、サンプルの中の網状赤血球を決定するための基礎を形成する、再現可能な光散乱情報を提供する。いくつかの実施形態では、血液サンプルを球形化剤と組み合わせることが有利となる場合がある。球形化剤は、網状赤血球および赤血球を等積的に（ｉｓｏｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）球形化させて、網状赤血球の分析における配向アーチファクトを排除するために有効な量で使用される。いくつかの実施形態では、球形化剤は、赤血球を等積的に球形化する両性イオン界面活性剤である。本発明に好適な球形化剤の実施例は、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン（ｃｏｃｏａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌｂｅｔａｉｎｅ）、およびコカミドスルホベタイン（ｃｏｃｏａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔａｉｎｅ）を含むが、それらに限定されない。

ゴースト化過程は温度の影響を受けることが以前に発見されている。５５°Ｆを下回る温度はゴースト化過程を遅延させると考えられ、ゴースト化過程が起こることを可能にするために、より長い期間が必要である。いくつかの実施形態では、血液サンプルは、約３０秒間、少なくとも５５°の温度のゴースト化溶液と混合される。一実施形態では、血液サンプルのゴースト化は、１０６°Ｆ（４１℃）で行われる。

いくつかの実施形態では、ゴースト化溶液のｐＨは、３．０より高くなるべきではない。一実施形態では、ゴースト化溶液のｐＨは、約１．０から２．０である。加えて、酸性ゴースト化溶液は、ヘモグロビンを可溶化し、血球からのそれの除去を促進すると思われる。チオシアン酸カリウムを利用するときに、硫酸が組み合わせて利用されるのに好ましい酸であることが留意されている。チオシアン酸カリウムの好ましい濃度は、１リットルあたり約１．０から６．０グラムであり、硫酸については１リットルあたり約０．７から３．０グラムである。

ゴースト化溶液の浸透圧は、血球の急速であるが制御された膨張がおこるように制御されるべきである。ゴースト化溶液の浸透圧は、少なくとも約７５ミリオスモルとなるべきである。浸透圧は、ゴースト化溶液との混合の３０秒以内に血球を膨張させ、ヘモグロビンを放出させる。浸透圧が約７５ミリオスモル未満である場合、血球は、無傷の細胞膜を保持せず、溶解する。より具体的には、より低い浸透圧は、網状赤血球の列挙が信頼できるものではないように損傷された赤血球をもたらす。浸透圧が十分でない場合、血球は、ヘモグロビンを保持し、このことは、網状赤血球の区別を曖昧にする。いくつかの実施形態では、ゴースト化溶液の浸透圧は、約７５から約１１０ミリオスモルに及ぶ。他の実施形態では、ゴースト化溶液の浸透圧は、約８２から約１０５ミリオスモルの範囲内となる。

図２に戻って、ステップ２０４では、粒子分析器を使用して、血液サンプルが分析される。一実施形態では、粒子分析器は、血液学的分析器である。例えば、血液サンプル、またはそれの一部分が、粒子分析器に導入される。流体力学的圧力下で、血液サンプルは、フローセルを通って細胞ごとに流れる。フローセル内で、個々の細胞のいくつかのパラメータが測定される。例えば、ＶＣＳ技術を使用する粒子分析器は、各細胞について同時に、細胞の容積サイズ決定、細胞の伝導度、および光散乱を行うことができる。図４は、本発明の実施形態による、さらに詳細なステップ２０４のフローチャートである。

ステップ４０２では、ステップ２０２で調製された血液サンプルが、分析のためにフローセルに導入される。ステップ４０４では、一実施形態では、サンプルがフローセルの中の調査点を通って細胞ごとに流れる際に、３つの独立供給源からのエネルギーによって調査される。ステップ４０６では、光散乱測定値が、各細胞事象について記録される。ＲＮＡ含有量が網状赤血球の成熟とともに減少するにつれて、光散乱測定値が減少すると期待することができる。光散乱のいくつかの測定が利用可能であり、例えば、前方光散乱測定を含むことができるが、これに限定されない。前方散乱は、調査されている細胞を通って、光ビームの軸から逸らされた光を測定する。前方光散乱の例は、下中央角光散乱（ｌｏｗｅｒ ｍｅｄｉａｎ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ（ＬＭＡＬＳ））、上中央角光散乱（ｕｐｐｅｒ ｍｅｄｉａｎ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ（ＵＭＡＬＳ））、および低角光散乱（ｌｏｗ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ（ＬＡＬＳ））を含むが、それらに限定されない。ＬＭＡＬＳとは、ビーム軸から９°〜１９°の角度で散乱させられた光を指し、ＵＭＡＬＳは、ビーム軸から２０°〜４３°の角度で散乱させられた光を指し、ＬＡＬＳは、ビーム軸から約５．１°の角度で散乱させられた光を指す。別の光散乱測定である、側角光散乱（ｓｉｄｅ ａｎｇｌｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＡＬＳ））は、９０°の角度で散乱させられた光を測定することができる。いくつかの実施形態では、血液サンプルの分析は、軸方向光損失（ＡＬＬ）の測定を含む。ＡＬＬは、ビーム軸に対して約０°〜０．５°の角度で失われる光の量である。

ステップ４０８では、網状赤血球の成熟を示す別の測定値が収集される。例えば、本発明の一実施形態では、細胞のサイズを測定することができる。細胞のサイズは、一般に、ＲＮＡ含有量が減少するにつれて、網状赤血球の成熟とともに減少することが知られている。例として、ＤＣ測定を使用して、細胞のサイズ、または細胞容積を測定することができる。ＤＣパルスのピーク振幅は、細胞容積の関数である。細胞の容積を測定する直接または間接的な方法を含む、網状赤血球の成熟を示す他の測定を、このステップで使用することができる。例えば、細胞中のＲＮＡの量を示す蛍光測定、または細胞容積を測定する他の様態を使用することができる。別の実施例として、前方散乱もまた、細胞のサイズを示すために使用することができる。

図２に戻って、ステップ２０６では、網状赤血球集団が、細胞事象集団全体から同定される。種々の軸を使用する事象データの散布図は、血球分布パターンを同定するのに役立つ。例として、事象データは、例えば、図１等の散布図において視覚化することができ、ここで、光散乱はｘ軸上にあり、容積（ＤＣ）はｙ軸上にある。図１に関して以前に示されているように、網状赤血球集団１０４は、赤血球１０２、血小板１０８、および白血球１０６とは別個に同定することができる。網状赤血球集団の精度は、特に、赤血球から網状赤血球を分離する線１３０をどれだけ確実に決定できるかに依存している。例えば、一実施形態では、以前の測定の集合から実験的に導出された閾値光散乱値および閾値容積測定値に基づいて、線１３０を散布図１００に重ね合わせることができるが、線１３０は、特に、散布図１００中の線１３０にごく接近して位置する細胞事象に関して、網状赤血球（１０４）から赤血球１０２を正しく分離できない場合がある。

さらにもう一度図２に戻って、ステップ２０７では、１つ以上の網状赤血球測定値を報告することができる。一実施形態では、網状赤血球画分が、赤血球集団全体に対するマッピング機能上で画定された所定数の領域の比として報告される。別の実施形態では、網状赤血球は、割合または絶対数として報告することができる。報告することは、コンピュータファイル等のディスプレイまたは他の出力デバイスに１つ以上の測定値を出力することを伴う。

（ゴースト化され難い細胞を検出する）
一側面では、本発明の方法は、網状赤血球情報を計算することに基づいて、より正確なサンプルデータを有することで、報告される網状赤血球検出の精度の向上を可能にする。いくつかの血液サンプルでは、初期ゴースト化過程後に、ゴースト化されなかった、または部分的にしかゴースト化されなかったいくつかの細胞、すなわち、「ゴースト化され難い」細胞が残ることが観察されている。本発明の目的で、「ゴースト化され難い細胞」という用語は、そのもともとのヘモグロビン含有量の少なくとも約３０％より多くを保持した細胞を指す。言い換えれば、ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの７０％未満が除去されている。好ましくは、細胞は、もともとのヘモグロビン含有量の５０％より多くを有し、さらに好ましくは、７０％より多くを有する。例えば、低張の酸溶液を血液サンプルと組み合わせることによる、ゴースト化過程は、細胞からヘモグロビンを取り除くことを目的としている。ゴースト化されていないか、または非効率的にゴースト化がされていると（すなわち、細胞がそれらのヘモグロビン含有量の約３０％未満を放出するとき）、赤血球は、網状赤血球と明確に区別されない場合がある。ゴースト化され難い細胞と比較した、ゴースト化した細胞からの差異の別の図は、図６で見ることができ、この図は、軸方向光損失対ＵＭＡＬＳの散布図の上部分に位置付けられているゴースト化され難い細胞の集団６１０を示す。ゴースト化され難い細胞が血液サンプルに存在し、光散乱および軸方向光損失を使用して血液サンプルが分析されるときに、ゴースト化され難い細胞の集団は密集し、概して、網状赤血球領域内に位置付けられるために、成熟赤血球からの網状赤血球の区別は失敗する場合がある。本発明のいくつかの実施形態は、血球の全集団の中でゴースト化され難い細胞を検出することを伴う。

図５（Ａ）および５（Ｂ）は、従来の光散乱または上中央角光散乱（ＵＭＡＬＳ）、およびＤＣ軸を使用した、ゴースト化され難い細胞事象を伴う、および伴わない、同じ事象データの散布図に提示された対比を示す。図５（Ａ）では、散布図は、ゴースト化され難い細胞事象を含む。境界５１０は、ゴースト化され難い細胞事象集団の場所を示す。図５（Ｂ）は、境界５１０によって画定される集団を含む、ゴースト化され難い細胞事象が除去された後の同じ事象集団を示す。図５（Ａ）および５（Ｂ）の両方では、境界５３０より下側の事象は、血小板に対応し、境界５２０の右側の事象は、白血球に対応する。境界５１０の場所によって分かるように、ゴースト化され難い細胞事象集団は、成熟赤血球集団と網状赤血球集団の分離線にまたがり、それにより、成熟赤血球と網状赤血球とを明確に区別することを困難にする。対照的に、図５（Ｂ）に示されるように、ゴースト化され難い細胞事象集団が除去されると、明確な境界５１１を成熟赤血球と網状赤血球との間で画定することができる。図５（Ａ）および５（Ｂ）の視覚的比較は、ゴースト化され難い細胞が存在するときに、網状赤血球から成熟赤血球を同定および分離することの困難さを図示する。

この実施形態では、軸方向光損失測定は、サンプルの残りからのゴースト化され難い集団の区別を可能にする。従来使用されている光散乱測定に基づいてゴースト化され難い集団を同定することができない同じ事象集団が、軸方向光損失測定を使用することによって、その集団を現在は区別できることが、本発明の発明者らによって予想外に見出されている。例えば、図６は、図５（Ａ）に示されたものと同じ事象集団を示すが、従来のＤＣおよびＵＭＡＬＳの代わりに、軸方向光損失（ＡＬＬ）およびＵＭＡＬＳを使用している。ＡＬＬを使用して、境界６１０内の領域によって示されるように、ゴースト化され難い細胞事象を明確に同定することができる。

図７（Ａ〜Ｃ）は、本発明の一実施形態による、ＡＬＬを使用した別の血液サンプルのゴースト化され難い細胞事象除去を図示する。散布図７１０は、一般的に使用されているＵＭＡＬおよびＤＣを示す。散布図７１０では、ゴースト化され難い細胞が（境界７１１内で示されるように）存在するが、他の赤血球から明確に区別することはできない。しかしながら、同じデータは、軸として軸方向光損失（ＡＬＬ）およびＵＭＡＬＳを有する散布図７２０に示されるときに、ゴースト化され難い細胞を検出する能力が多いに向上する。ＡＬＬに基づいて、ゴースト化され難い集団７２１は、他の事象集団から明確に見分けられる。

本発明の一実施形態では、ゴースト化され難い集団に対応する細胞事象をフィルタリングして取り除くことができ、ＵＭＡＬＳ軸およびＤＣ軸を使用した、例えば、７３０等の散布図に、残りの細胞事象を表示することができる。ゴースト化され難い集団に対応する細胞事象をフィルタリングして取り除くことは、例えば、実験的に決定される閾値ＡＬＬおよびＵＭＡＬＳ値に基づいて自動的に、または手動操作者支援を用いて、ゴースト化され難い集団をゲーティングすることによって達成することができる。散布図７３０および７１０の視覚的比較は、境界７３１の左側の成熟赤血球集団と境界７３１の右側の網状赤血球集団との間のより明確な区別を図示する。

図６（具体的には境界６１０内の領域）および図７（Ａ〜Ｃ）（具体的には境界７２１内の領域）に示されるように、ＡＬＬを使用するときに、ゴースト化され難い細胞は、成熟赤血球、網状赤血球、血小板、および白血球等の他の集団から明確に異なる集団として同定することができる。ゴースト化され難い細胞は、概して、白血球を除く他の血球種類よりも高いＡＬＬを表示する。白血球は、他の血球種類に対するそれらの高い光散乱測定値により、区別することができる。ゴースト化され難い細胞の集団の高いＡＬＬは、ヘモグロビンの比較的高い光吸収に起因し得る。４８８ｎｍのレーザ波長（図５（Ａ）、５（Ｂ）、６および７（Ａ〜Ｃ）に示される結果をもたらした粒子分析器で使用される波長）において、ヘモグロビンは、高レベルのＡＬＬにつながる、非常に高い光吸収を示す。一般に、ヘモグロビンは、光が４００〜５００ｎｍの波長であるときに、増加した光の吸収を示す。

分析されている血液サンプル中のゴースト化され難い細胞の検出は、図８に示される本発明の実施形態によって達成することができる。図８では、図２のステップ２０２が、ゴースト化され難い細胞を検出するステップを含むようにさらに細かく分けられている。ステップ８０２では、調製された血液サンプル、すなわち、ゴースト化および染色されたサンプルを、分析のためにフローセルに導入することができる。ステップ８０４では、上記の図２に関して説明されるように、光ビームを含む測定を使用して、細胞ごとにサンプルが調査される。ステップ８０６では、ＡＬＬ測定値が収集され、加えて、ステップ８１０において１つ以上の光散乱測定値が収集される。光散乱測定の説明は、図２に関して上記で見出すことができる。

一実施形態では、いったんゴースト化され難い細胞が検出されると、網状赤血球をより正確に分析するために、この事象データを使用することができる。例えば、ステップ８１２のように、網状赤血球事象のＡＬＬ値を使用して、ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除くことができる。この実施形態では、この事象データは、ステップ８１４のように、網状赤血球情報または任意の他の赤血球情報を決定するためのさらなる分析に利用可能となる。一般に、ゴースト化され難い細胞事象集団の除去は、赤血球および／または網状赤血球に関して報告されるほとんどのパラメータの精度を増加させる。網状赤血球情報の計算および報告は、図２に関して上記で説明される。

（ゴースト化され難い細胞を列挙する）
本発明の一側面は、血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を列挙することに関する。血液サンプル中のゴースト化され難い細胞の集団と血液病理との間に相関が存在することが、本発明の発明者らによって予想外に発見されている。具体的には、ゴースト化され難い細胞の数は、種々の疾患に罹患している患者から収集された分析血液サンプルの中で増加させられることが分かっており、疾患の例は、異常血色素症（例えば、鎌状赤血球貧血およびサラセミア）、血液悪性疾患（例えば、白血病およびリンパ腫）、凝血および出血性障害、ならびにＨＩＶ／ＡＩＤＳ、悪性腫瘍、および自己免疫障害を含むが、それらに限定されない。加えて、散布図中のゴースト化され難い細胞の位置を正常サンプルと比較するときに、これらの疾患に関するさらなる情報を取得することができる。図８に戻って、検出後、ステップ８１３のように、ゴースト化され難い細胞を列挙することができる。細胞の計数または列挙は、ここで画定されているゴースト化され難い細胞等、境界が明瞭な細胞の集団のための十分に確立された技法である。一実施形態では、ゴースト化され難い画分は、赤血球集団全体に対するゴースト化され難い細胞の比として報告される。別の実施形態では、ゴースト化され難い細胞は、割合または絶対数として報告することができる。該値は、研究専用（ＲＵＯ）パラメータとして使用することができ、またはインビトロ診断（ＩＶＤ）パラメータに発展させることができる。図１０（Ａ〜Ｃ）は、健康な個人（図１０（Ａ））から、ならびに鎌状赤血球貧血（図１０（Ｂ））およびサラセミア（図１０（Ｃ））に罹患した患者からの、血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞の集団１０１０のサイズの差異を図示する。図１０（Ａ）および１１によって図示されるように、全ＲＢＣ集団のうちのゴースト化され難い細胞の％は、ごくわずかであり、すなわち、健康な個人から提供された血液サンプル中の約０．０１％未満である。また、いくつかのある病理に罹患した患者からの血液サンプルは、増加したゴースト化され難い細胞の集団を含有することも決定されている（図１２に図示されている）。そのような病理は、腎不全、肝臓がん、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、およびサラセミアを含む。ある診断された疾患状態を有する患者の血液サンプル中の全ＲＢＣ集団のうちのゴースト化され難い細胞の％は、健康な個人のゴースト化され難い細胞の集団のサイズから少なくとも１０倍増加させられる。いくつかの血液サンプルでは、疾患または障害に罹患した患者のゴースト化され難い細胞の集団は、健康な個人のものより少なくとも１００倍大きい。本発明の発明者らによる、この傾向の発見は、ある病理の存在にさらに関係してもよい、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するのに有用となり得る。

ゴースト化され難い細胞を列挙するために代替的方法を採用することができる。より具体的には、当業者は、サンプルをゴースト化し、当業者に公知であるような光散乱測定を使用して血球サンプルのヘモグロビンを細胞ごとに測定することによって、血液サンプルを分析することができる。もともとのヘモグロビンの３０％より多くを有する細胞は、ゴースト化され難い細胞と見なされる。言い換えれば、ゴースト化され難い細胞は、散布図中のゴースト化した細胞よりも大きな光散乱を有する。この代替的方法では、当業者はまた、網状赤血球をゴースト化され難い細胞から区別するために蛍光色素を採用することもできる。

フローサイトメータおよび血液学的分析器等の、本発明を実施することができる環境は、ゴースト化され難い細胞の集団の数値を報告するようにプログラムされ得ることが、当業者によって理解されるであろう。この数値は、個人の生化学的および／または生理学的状態に相関させることができる。例えば、閾値は、血液サンプル中の全赤血球のうちのゴースト化され難い細胞の％について設定することができ、これは、健康な個人に存在するゴースト化され難い細胞の数に対応する。患者に由来する血液サンプル中の多数のゴースト化され難い細胞が、そのような閾値を超えるときに、疾患状態を疑うことができ、血液サンプルを報告することができ、患者のさらなる診断評価の十分な理由となる。血球数結果を評価する医師は、患者の症状、全般的な健康状態、疾患または障害、性別、および年齢に基づいて、適切なさらなる検査を決定する。一実施形態では、血液サンプル中のゴースト化され難い細胞の％が、閾値を少なくとも１０倍超える場合に、さらなる評価のために血液サンプルを報告することができる。別の実施形態では、血液サンプル中のゴースト化され難い細胞の％が、閾値を少なくとも１００倍超える場合に、さらなる評価のために血液サンプルを報告することができる。

（血球情報を決定するシステム）
図９は、本発明の一実施形態による、血液サンプルを分析するシステムを示す。粒子分析器９１０は、リンク９４０を使用してコンピュータ９０１に連結される。コンピュータ９０１は、随意で、リンク９５０を使用してディスプレイ９２０および／または外部記憶デバイス９２１に連結される。コンピュータ９０１は、プロセッサ９０２と、メモリ９０３と、内部記憶装置９０４と、入力モジュール９０５と、出力モジュール９０６と、網状赤血球モジュール９０７を含むことができる。網状赤血球モジュール９０７は、検出器モジュール９６１と、分析器モジュール９６３と、微分器モジュール９６５と、レポータモジュール９６７とを含むことができる。

粒子分析器９１０は、光ビームを用いて血液サンプルを調査することが可能である、血液学的分析器、フローサイトメータ、または同様のデバイスを含むことができる。血液サンプルが調製され、分析のために粒子分析器９１０に入力される。粒子分析器９１０によって生成された事象データは、リンク９４０を通してコンピュータ９０１に伝達される。リンク９４０は、周辺装置相互接続（ＰＣＩ）バス等のデバイス内部接続、またはネットワーク接続となり得る。粒子分析器９１０の中で血液サンプルの分析によって生成された事象は、リアルタイムで、またはバッチモードでコンピュータ９０１に伝達することができる。

次いで、事象データは、コンピュータ９０１内での任意の処理後に、ディスプレイ９２０上でユーザに提示されるか、または外部記憶デバイス９２１に記憶される。例えば、コンピュータ９０１内で処理することによって生成される散布図は、ディスプレイ９２０を使用してユーザに提示することができる。処理された事象データもまた、以降の分析および表示のために記憶することができる。外部記憶デバイス９２１は、ハードドライブ、または他の種類のポータブル記憶装置を含むことができる。

プロセッサ９０２は、モジュール９０５、９０６、および９０７の処理を可能にする命令を実行することができる。内部メモリ９０３は、そのような処理に必要とされる一時メモリを提供し、内部記憶装置９０４は、そのような処理に関連付けられるデータおよび結果の一時または中間記憶装置を提供することができる。内部記憶装置９０４はまた、コンピュータ可読プログラムコードを含む形態で、網状赤血球モジュール９０７の構成要素モジュールを含むモジュールの命令および／またはプログラムコードに基づいて、制御論理を記憶することができる。

入力モジュール９０５は、粒子分析器９１０によって生成された事象データを受信する。入力モジュール９０５は、粒子分析器９１０からの入力事象データを網状赤血球モジュール９０７によって理解される形式に変換するために必要とされる、任意の処理を含むことができる。出力モジュール９０６は、網状赤血球モジュール９０７によって処理された事象データを収集し、必要な任意の変換を行い、リンク９５０を使用してディスプレイ９２０または記憶装置９２０に出力する。リンク９５０は、ＰＣＩ等のデバイス内部接続、またはネットワーク接続となり得る。ディスプレイ９２０は、粒子分析器データの視認のためにカスタマイズされる表示デバイス、一般的なディスプレイ、または粒子分析の結果を出力することが可能な任意の他の手段となり得る。

検出器モジュール９６１は、ＵＭＡＬＳを含む側方散乱、前方散乱、軸方向光損失、およびＤＣに関連する際に、細胞事象の測定値またはパラメータを決定するための命令を含むことができる。本発明の全実施形態が、上記の測定値の全てにアクセスできなくてもよいことに留意されたい。上記の測定値の全ての収集を可能にするために粒子分析器９１０上で必要とされる、何らかの構成があってもよい。

分析器モジュール９６３は、網状赤血球集団および／またはゴースト化され難い細胞の集団を同定し、他の種類の血球からその集団を単離するための命令を含む。別の実施形態では、分析器モジュール９６３は、上記で説明されるように、ゴースト化され難い細胞に対応する細胞事象をフィルタリングして取り除く命令を含むことができる。さらに別の実施形態では、分析器モジュール９６３は、ゴースト化され難い細胞の集団を列挙するための命令を含むことができる。

微分器モジュール９６５は、コンピュータに、分析されているサンプルの未熟網状赤血球情報を決定させる、命令を含むことができる。例えば、モジュール９６３を使用して同定された網状赤血球事象集団は、成熟赤血球を未熟網状赤血球から区別するように、光散乱測定ならびに容積等の第２の網状赤血球成熟度測定の両方を使用して、その後調査されてもよい。

レポータモジュール９６７は、コンピュータ９０１が散布図をディスプレイ９２０に表示すること、さらに、血液サンプル中の網状赤血球の有用な定量化を報告することも可能にする、命令を含む。網状赤血球画分または網状赤血球の割合は、レポータモジュール９６７によって報告することができる、いくつかの定量化である。レポータモジュール９６７はまた、ゴースト化され難い細胞の集団に関する情報を報告する命令を含むこともできる。

本開示では、網状赤血球画分およびゴースト化され難い細胞等の測定を通して血液サンプル分析の精度を向上させることができる方法が開示された。開示された方法は、現在の方法を超える大幅な改良をもたらし、いくつかの血液病理の検出および処置の有意な改良につながり得る。当業者であれば、本明細書で開示される技法は、本明細書で説明されるような赤血球以外の細胞種類に適用可能となり得ることを理解するであろう。

本発明の先述の説明は、図示および説明目的で提示されている。それは、包括的であること、または本発明を開示されたまさにその形態に限定することを目的としておらず、他の修正および変化例が、上記の教示を考慮して可能であってもよい。実施形態は、本発明の原則およびその実施的適用を最も良く説明し、それによって、当業者が、検討される特定の用途に適するような種々の実施形態および種々の修正において本発明を最も良く利用することを可能にするように、選択および説明された。添付の請求項は、従来技術によって限定される範囲を除く、本発明の他の代替実施形態を含むと解釈されることが意図される。

Claims (27)

1. 血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を計数する自動化された方法であって、
   （ａ）血球サンプルを、核酸を染色する核酸染色液および該血球サンプルの中の赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血球サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血球サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
   （ｂ）該ゴースト化した血球サンプルをサイトメトリのフローセルに通すステップと、
   （ｃ）２つの異なる光学的測定値を使用して、該サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血球サンプルを分析するステップと、
   （ｄ）軸方向光損失測定値および光散乱測定値を使用して、該ゴースト化した血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞を他の細胞から区別するステップと、
   （ｅ）該ゴースト化され難い細胞を計数するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記血液サンプルと前記核酸染色色素との混合と、前記ゴースト化試薬との混合とは、別々に行われる、請求項１に記載の方法。
3. 前記染色は、蛍光性または非蛍光性である、請求項１に記載の方法。
4. 前記光散乱測定値は、上中央角光散乱（ＵＭＡＬＳ）、下中央角光散乱（ＬＭＡＬＳ）、および低角光散乱（ＬＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記血球サンプルの中のゴースト化され難い細胞の数を閾値と比較し、該閾値を超えるゴースト化され難い細胞の数を報告することによって、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を検出する方法であって、
   （ａ）該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
   （ｂ）軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
   （ｃ）該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
   を含む、方法。
7. 前記軸方向光損失測定値を使用した、前記ゴースト化され難い細胞の前記同定は、該軸方向光損失測定値を第１の閾値に対して比較し、光散乱測定値を第２の閾値に対して比較するステップを含み、該ゴースト化され難い細胞は、該第１の閾値を上回る軸方向光損失測定値、および該第２の閾値より低い光散乱測定値を有するものとして同定される、請求項６に記載の方法。
8. 前記光散乱測定値は、上中央角光散乱（ＵＭＡＬＳ）、下中央角光散乱（ＬＭＡＬＳ）、および低角光散乱（ＬＡＬＳ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記光散乱測定値は、ＵＭＡＬＳである、請求項８に記載の方法。
10. 直流インピーダンス測定値を収集するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
11. 血液サンプルの中のゴースト化され難い細胞を計数する方法であって、
    （ａ）該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
    （ｂ）軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
    （ｃ）該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
    （ｄ）該軸方向光損失測定値を使用して、該ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
    （ｅ）該血液サンプルの中の該ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップと、を含む、方法。
12. 前記ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップは、全赤血球に対する該ゴースト化され難い細胞の集団の比を報告するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップは、全赤血球集団のうちのゴースト化され難い細胞の％を報告するステップを含む、請求項１１に記載の方法。
14. 患者サンプルの中のゴースト化され難い細胞の異常集団を検出する方法であって、
    （ａ）該患者由来の血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
    （ｂ）軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを評価して、事象データを生成するステップと、
    （ｃ）該事象データの軸方向光損失測定値を使用して、ゴースト化され難い細胞を同定するステップと、
    （ｄ）該軸方向光損失測定値を使用して、該ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
    （ｅ）ゴースト化され難い細胞の数が閾値を超えるときに、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップと、
    を含む、方法。
15. ゴースト化され難い細胞の前記異常集団は、異常血色素症と関連付けられる、請求項１４に記載の方法。
16. 異常血色素症は、鎌状赤血球貧血またはサラセミアを含む、請求項１５に記載の方法。
17. 血液サンプルを分析する方法であって、
    （ａ）該血液サンプルを、赤血球からヘモグロビンを除去するゴースト化試薬と混合して、ゴースト化した血液サンプルを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
    （ｂ）軸方向光損失測定値を含む検出によって、サイトメトリのフローセルにおいて該ゴースト化した血液サンプルを測定し、事象データを生成するステップと、
    （ｃ）該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞集団を同定するステップと、
    （ｄ）該事象データから該ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除くステップと、
    （ｅ）該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定するステップと、
    を含む、方法。
18. 命令を記憶するコンピュータ可読媒体であって、該命令は、実行される場合、
    （ａ）サイトメトリのフローセルにおけるゴースト化した血液サンプルの軸方向光損失測定値を含む検出に基づいて、事象データを生成するステップであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、ステップと、
    （ｂ）該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞集団を同定するステップと、
    を含む方法を使用して、少なくとも１つのプロセッサに血液サンプルを分析させる、コンピュータ可読媒体。
19. 前記方法はさらに、
    （ｃ）前記事象データから前記ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除くステップと、
    （ｄ）該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定するステップと、
    を含む、請求項１８に記載のコンピュータ可読媒体。
20. 前記方法はさらに、
    （ｃ）前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
    （ｄ）ゴースト化され難い細胞の数が閾値を超えるときに、ゴースト化され難い細胞の異常集団の存在を決定するステップと、
    を含む、請求項１８に記載のコンピュータ可読媒体。
21. 前記方法はさらに、
    （ｃ）前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するステップと、
    （ｄ）前記血液サンプルの中の該ゴースト化され難い細胞の集団を報告するステップと、
    を含む、請求項１８に記載のコンピュータ可読媒体。
22. 少なくとも１つのプロセッサと、
    該少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつサイトメトリのフローセルを備える、粒子分析器と、
    該少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつ該フローセルにおけるゴースト化した血液サンプルの軸方向光損失測定値を含む検出に基づいて、事象データを生成するように構成される、検出器モジュールであって、ここで、該ゴースト化した血液サンプルは、残留するヘモグロビンを含むゴースト化され難い細胞を含む、検出器モジュールと、
    該少なくとも１つのプロセッサに連結され、かつ該軸方向光損失測定値に基づき、該事象データを使用して、ゴースト化され難い細胞の集団を同定するように構成される、分析器モジュールと、
    を備える、血液サンプルを分析するためのシステム。
23. 前記分析器モジュールはさらに、前記軸方向光損失測定値を使用して、前記ゴースト化され難い細胞の集団を計数するように構成される、請求項２２に記載のシステム。
24. 前記分析器モジュールはさらに、
    前記事象データから前記ゴースト化され難い細胞の集団をフィルタリングして取り除き、
    該ゴースト化され難い細胞の集団を伴わない該事象データを分析して、血球分布パターンを同定する
    ように構成される、請求項２２に記載のシステム。
25. 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも３０％を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも３０％を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のコンピュータ可読媒体。
27. 前記ゴースト化され難い細胞は、そのもともとのヘモグロビンの少なくとも３０％を含む、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のシステム。