ES2641015T3 - Método y sistema para analizar una muestra de sangre - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar células difíciles de acromizar, que se definen como células que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original tras la mezcla con un reactivo acromizante, en una muestra de sangre que comprende: (a) mezclar la muestra de sangre con un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los glóbulos rojos, generando de esta forma una muestra de sangre acrómica; (b) evaluar la muestra de sangre acrómica en una celda de flujo citométrico mediante una detección que comprende una medición de la pérdida de luz axial y una medición de la dispersión de luz, generando de esta forma datos de eventos que comprenden una pérdida de luz axial y una medición de la dispersión de la luz para cada célula; e (c) identificar las células difíciles de acromizar utilizando los datos de eventos que comprenden una medición de la pérdida de luz axial y una medición de la dispersión de la luz para cada célula.

Description

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DESCRIPCION
Metodo y sistema para analizar una muestra de sangre Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere en general a los metodos y sistemas para analizar las muestras de sangre utilizando un analizador de pardculas, y mas concretamente, para determinar reticulocitos y celulas diffciles de acromizar.
Antecedentes
Cada ano, millones de americanos se ven afectados por enfermedades de la sangre. Los ejemplos de patologfas de la sangre incluyen diversas neoplasias hematologicas malignas, tales como leucemias y linfomas, hemoglobinopatias, que abarcan numerosas anemias de origen genetico, tales como talasemia, enfermedad de Cooley, y anemia drepanodtica (enfermedad HbS), asf como diversos trastornos de coagulacion y hemorragias. Las anomalfas sangumeas pueden ser tambien una consecuencia secundaria asociada con otras dolencias, tales como VIH/SIDA, tumores malignos, y trastornos autoinmunitarios. La mayona de estas dolencias tienen una morbilidad y mortalidad significativas y pueden producir normalmente dolor severo en el paciente afectado. El diagnostico temprano de estos trastornos es cntico para que los pacientes que tengan la enfermedad puedan recibir el tratamiento y la gestion de la enfermedad adecuados.
La sangre es un fluido corporal especializado que suministra sustancias necesarias, tales como nutrientes y oxfgeno, a las celulas del cuerpo y transporta productos residuales desde estas mismas celulas. La celula predominante en sangre es el eritrocito, es decir, los globulos rojos sangumeos o globulos rojos. En un frotis de sangre periferica, los eritrocitos derivan su color rojizo de la protema hemoglobina, y suelen tener un aspecto redondeado u ovalado, con una region central tenida de color palido. Su morfologfa biconcava aumenta el area superficial celular y facilita la difusion del oxfgeno y el dioxido de carbono desde la celula. Un eritrocito tfpico tiene una duracion de aproximadamente 120 dfas.
Los eritrocitos se desarrollan a partir de celulas precursoras nucleadas en la medula osea. Los eritrocitos inmaduros, es decir, los reticulocitos, tienen organulos que contribuyen a aumentar el contenido de hemoglobina y la capacidad de transporte de gases. Los reticulocitos pueden reconocerse en frotis de sangre periferica cuando se usa una tincion especial para tenir su polirribosoma o su acido ribonucleico (ARN). En condiciones tfpicas, los reticulocitos representan aproximadamente 1 %-2 % de los globulos rojos en una muestra. Sin embargo, en determinados periodos de necesidad ffsica, el recuento de reticulocitos puede aumentar.
Se pueden utilizar analisis de sangre para determinar los estados fisiologicos y bioqmmicos, tales como enfermedad, contenido de minerales, eficacia del farmaco, y funciones de los organos. Para confirmar o ayudar a confirmar el diagnostico de enfermedades tales como, por ejemplo, diversas formas de anemia o hemorragia interna aguda, la determinacion de reticulocitos puede ser de importancia fundamental.
El analisis de reticulocitos automatizado se puede llevar a cabo utilizando un analizador de partfculas tal como un citometro de flujo o un analizador hematologico. Los analizadores de partfculas ilustrativos incluyen el sistema UniCel® DxH 800 de Beckman Coulter y el XT-2000 de Sysmex Corporation. La preparacion de una muestra de sangre para citometrfa de flujo o analisis hematologico implica generalmente tomar una muestra de sangre completa y llevar a cabo uno o ambas etapas de incubar la muestra de sangre con una tincion vital tal como New Methylene Blue (NMB) y diluir la muestra de sangre con un acido hipotonico que aclara la hemoglobina. La tincion hace precipitar el ARN en el interior de los eritrocitos. La dilucion con un acido hipotonico aclara la hemoglobina, quedando el ARN tenido en el interior de las celulas. El proceso de eliminar hemoglobina se denomina comunmente “creacion de imagenes acromicas”. La muestra de sangre, o una parte de esta, se somete a continuacion a analisis en una celda de flujo de un analizador de partfculas. Normalmente, las celulas en un fluido envolvente atraviesan un punto en la celda de flujo, una por una, donde son examinadas por uno o mas haces de luz. Se generan varias mediciones para cada celula que pasa. El examen de una unica celula se denomina un evento celular. Las mediciones normalmente registradas por evento celular incluyen, dispersion de luz directa, perdida de luz axial, y fluorescencia. Algunos analizadores de partfculas recogen tambien una medicion de la impedancia de la corriente continua (CC) que es una medida de cuantas impedancias ejerce una celula. La medicion de la CC, que se obtiene a partir de la aplicacion de la corriente maxima de tal manera que la membrana celular deje de estar permeada y no haya flujo de corriente a traves de la celula, se denomina tambien como volumen Coulter o volumen.
Sumario de la invencion
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La presente solicitud se dirige al analisis de datos de un analizador de parffculas. La presente invencion se define en las reivindicaciones. En una realizacion, un metodo automatizado de enumerar celulas diffciles de acromizar, que se definen como celulas que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original despues del mezclado con un reactivo acromizante en una muestra de celulas sangumeas que comprende: mezclar una muestra de celulas sangumeas con un acido nucleico de tincion y un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los globulos rojos, generando de esta forma una muestra de celulas sangumeas acromicas; pasar la muestra de celulas sangumeas acromicas a traves de una celda de flujo citometrico; analizar la muestra de celulas sangumeas acromicas en la celda de flujo citometrico utilizando las mediciones de dispersion de la luz y de la perdida de luz axial, generando de esta forma datos del evento que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y la medicion de la dispersion de la luz para cada celula; diferenciar las celulas diffciles de acromizar en la muestra de celulas sangumeas acromicas de otras celulas usando el analisis de los datos del evento que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula; y enumerar las celulas diffciles de acromizar.
Se describen en detalle a continuacion caractensticas y ventajas adicionales de la presente invencion, asf como la estructura y el funcionamiento de diversas realizaciones de la misma, con referencia a los dibujos acompanantes. Se senala que la invencion no se limita a las realizaciones espedficas descritas en la presente memoria. Dichas realizaciones se presentan en la presente memoria solo a fines ilustrativos. Las realizaciones adicionales seran evidentes para las personas expertas en la(s) tecnica(s) relevante(s) basandose en las ensenanzas contenidas en la presente memoria.
Breve descripcion de los dibujos
La Fig. 1 es una vista de los datos de eventos procedentes del analisis de una muestra de sangre utilizando un citometro de flujo, en dos dimensiones.
La Fig. 2 ilustra las etapas del analisis de reticulocitos inmaduros en una muestra de sangre segun una realizacion de la presente invencion.
La Fig. 3 muestra detalles adicionales de la etapa de preprocesamiento que se muestra en la Fig. 2, segun una realizacion de la presente invencion.
La Fig. 4 muestra detalles adicionales de la etapa de medicion que se muestra en la Fig. 2, segun una realizacion de la presente invencion.
Las Figs. 5(A) y 5(B) son vistas bidimensionales de datos de eventos procedentes del analisis de una muestra de sangre. La Fig. 5(B) es una vista de los datos de eventos que se muestran en la Fig. 5(A) de la que se ha eliminado la poblacion de celulas diffciles de acromizar.
La Fig. 6 muestra la misma poblacion del evento que se muestra en la Fig. 5(A), pero utilizando la perdida de luz axial (ALL) y UMALS en vez de los convencionales CC y UMALS.
Las Figs. 7 (A-C) muestran varias vistas bidimensionales que ilustran datos de eventos con diferente capacidad para identificar la poblacion de celulas diffciles de acromizar.
La Fig. 8 muestra detalles adicionales de la etapa de medicion que se muestra en la Fig. 2, segun otra realizacion de la presente invencion.
La Fig. 9 es un sistema para evaluar reticulocitos inmaduros segun una realizacion de la presente invencion.
La Fig. 10(A) muestra una vista tridimensional de datos de eventos procedentes del analisis de una muestra de sangre procedente de un individuo sano. En la vista, las celulas 1010 diffciles de acromizar, los globulos rojos 1020 maduros, y los reticulocitos 1030 se diferencian de forma distintiva.
La Fig. 10(B) muestra una vista tridimensional de datos de eventos procedentes de la muestra de sangre de un paciente al que se ha diagnosticado anemia drepanodtica. En la vista, las celulas 1010 diffciles de acromizar, los globulos rojos 1020 maduros, y los reticulocitos 1030 se diferencian de forma distintiva.
La Fig. 10(C) muestra una vista tridimensional de datos de eventos procedentes del analisis de una muestra de sangre de un paciente al que se ha diagnosticado talasemia. En la vista, las celulas 1010 diffciles de acromizar, los globulos rojos 1020 maduros, y los reticulocitos 1030 se diferencian de forma distintiva.
La Fig. 11 ilustra un % promedio de celulas “diffciles de acromizar” en muestras de sangre extrafdas de individuos sanos.
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La Fig. 12 ilustra un % promedio de celulas “difmiles de acromizar” en muestras de sangre ex^das de pacientes que padecen diversas enfermedades.
Las caractensticas y ventajas de la presente invencion seran mas evidentes a partir de la descripcion detallada que se define a continuacion cuando se toma junto con los dibujos. En los dibujos, numeros de referencia similares indican generalmente elementos identicos, funcionalmente similares, y/o estructuralmente similares. Generalmente, el dibujo donde un primer elemento aparece en primer lugar se indica por el(los) dfgito(s) mas a la izquierda en el numero de referencia correspondiente.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere al procesamiento de datos de analisis de partmulas. Aunque la presente invencion se describe en la presente memoria con referencia a realizaciones ilustrativas para aplicaciones concretas, debe entenderse que la invencion no esta limitada a lo anterior. Los expertos en la tecnica con acceso a las ensenanzas de la presente memoria reconoceran modificaciones, aplicaciones, y realizaciones adicionales comprendidas en el alcance de la anterior y campos adicionales en los que la invencion sena de significativa utilidad.
Panorama general
Como se describe en la seccion de antecedentes anterior, la capacidad automatizada para determinar la distribucion de globulos rojos en una muestra de sangre es una cualidad vital en varias aplicaciones. Los metodos y sistemas descritos en la presente memoria dan como resultado una medida automatizada mejorada de las poblaciones de celulas en una muestra de sangre. En una realizacion, las celulas diffciles de acromizar se diferencian y enumeran utilizando los metodos proporcionados en la presente memoria.
Los entornos ilustrativos en los que la presente invencion puede llevarse a la practica incluyen analizadores de partmulas tales como el Sistema Beckman Coulter's UniCel® DxH 800. El Sistema Uni Cel® DxH 800, por ejemplo, utiliza la tecnologfa patentada Coulter de volumen, conductividad, y dispersion de luz (VCS) para evaluar las celulas centradas hidrodinamicamente dentro de una celda de flujo. La tecnologfa VCS utiliza tres fuentes de energfa independientes que trabajan de forma concertada entre sf para la medicion de celulas: una fuente de alimentacion de corriente continua de baja frecuencia para medir el volumen; una fuente de alimentacion de alta frecuencia para medir la conductividad, y una fuente de luz laser para medir la dispersion. La medicion del volumen se lleva a cabo utilizando el principio Coulter de la impedancia electrica para medir ffsicamente el volumen que desplaza la celula completa en un diluyente isotonico. Este metodo dimensiona con precision todos los tipos de celulas independientemente de su orientacion en la trayectoria de la luz. La corriente alterna en el intervalo de radiofrecuencia (RF) cortocircuita la capa lipfdica bipolar de la membrana de una celula, permitiendo que la energfa penetre en la celula. Este potente metodo se utiliza para recoger informacion acerca del tamano y la estructura interna de la celula, incluidos la composicion qrnmica y el volumen nuclear. Un laser y detectores de dispersion de luz de angulo multiple proporcionan informacion acerca de la estructura interna, granularidad y morfologfa superficial de una celula. Ademas, los dispositivos VCS utilizan la medicion de alta precision mediante CC del volumen para obtener otras mediciones que se ajustan segun el tamano de la celula derivado de la conductividad y la dispersion. Debe senalarse, sin embargo, que las ensenanzas de esta descripcion no se limitan a los dispositivos que utilizan la tecnologfa VCS.
La Fig. 1 muestra una grafica de dispersion bidimensional de una muestra de sangre basada en datos de eventos generados a partir de mediciones de sangre con un analizador de partmulas. Cada punto de datos que aparece en la grafica de dispersion se basa en mediciones seleccionadas obtenidas de un evento celular, es decir, el examen de una celula individual mediante una corriente electrica y un haz laser en la celda de flujo. En la grafica de dispersion se muestran poblaciones de datos de eventos para diferentes tipos de celulas que se encuentran normalmente en una muestra de sangre. En general, existe separacion suficiente entre las poblaciones de globulos rojos en su conjunto (es decir, los eritrocitos l02 y los reticulocitos 104), plaquetas 108, y globulos blancos 106, que las tecnicas conocidas permiten para clasificar la poblacion de globulos rojos en su conjunto, por ejemplo, basandose en el area definida por las lmeas 122 y 124. Clasificacion se refiere al proceso de filtrar mediciones seleccionadas a partir de datos multiparametricos, por ejemplo como se ha descrito anteriormente, separando los globulos rojos (eritrocitos y reticulocitos), las plaquetas y los globulos blancos, analizando las mediciones generadas para cada evento celular comparados con valores umbral conocidos. Por ejemplo, la lmea 124 puede ser un valor umbral del volumen y la lmea 122 puede ser un valor umbral de dispersion de luz, donde los eventos celulares con mediciones de volumen por encima de la lmea 124 y un valor de dispersion de luz (utilizado a menudo en la forma de un log de la dispersion de luz) inferior a la lmea 122 corresponden tanto a eritrocitos como a reticulocitos. En los sistemas existentes, la poblacion de reticulocitos puede clasificarse tambien, por ejemplo, por una lmea tal como la lmea 130. Los eventos a la derecha de la lmea 130 son reticulocitos, mientras que los eventos a la izquierda de la lmea 130 son globulos rojos maduros.
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Analisis de reticulocitos
En un aspecto, se presentan metodos para analizar reticulocitos en una muestra de sangre. La Fig. 2 es un diagrama de flujo de las etapas para evaluar reticulocitos segun una realizacion de la presente invencion. En la etapa 202, una muestra de sangre se prepara para analisis en un analizador de partfculas. La preparacion puede incluir la acromatizacion de la muestra de sangre y/o la tincion de la muestra con un tinte o tinte adecuado. La Fig. 3 ilustra la etapa de preparacion 202 con mas detalle, segun una realizacion. En la etapa 302, la muestra de sangre se puede combinar con una tincion vital para delinear adicionalmente los reticulocitos. Por ejemplo, se puede usar un tinte sin fluorocromos que precipita el acido ribonucleico intracelular (ARN) del reticulocito. Los ejemplos de tinciones adecuadas incluyen, aunque no de forma limitativa, New Methylene Blue (conocido como Reactivo A del Coulter Retie Pak™), Oxazine 750, y Brilliant Cresyl Blue. El aRn, que ha precipitado, tendra mayor densidad, lo que potenciara la delineacion del contenido de ARN en cada celula. El uso de un tinte no fluorescente para medir los reticulocitos tiene la ventaja anadida de permitir analizar adicionalmente la muestra de sangre para determinar otros componentes utilizando, si se desea, un tinte fluorescente. Los ejemplos de tintes fluorescentes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, naranja de tiazol y polimetina. Son posibles etapas preparatorias adicionales en diversas realizaciones de la presente invencion. Por ejemplo, en algunas realizaciones se puede combinar un tinte fluorescente con la muestra de sangre para medir propiedades adicionales de la muestra utilizando una medida de fluorescencia.
Para efectuar ademas el examen de la composicion de una muestra de sangre, la muestra de sangre puede combinarse con un reactivo tal como, por ejemplo, una solucion acromizante de reticulocitos que tiene tiocianato de potasio y acido sulfurico (etapa 304). Este tipo de reactivo acromizante puede obtenerse como un producto comercial conocido como Reactivo B del Coulter Retie Pak™. Se pueden utilizar otros reactivos acromicos conocidos por los expertos en la tecnica. El proceso de acromizacion libera la hemoglobina de los globulos rojos dando como resultado una celula acromica. El termino “celula acromica”, como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un globulo rojo del que se ha eliminado mas de 70 % de su contenido de hemoglobina. Preferiblemente, se ha eliminado mas de 90 % e incluso de forma mas preferida se ha eliminado mas de 95 % de la hemoglobina. En otras palabras, la celula detectada retiene menos de 30 % de su hemoglobina original. La reduccion del contenido de hemoglobina potencia la definicion del retfculo para permitir la determinacion de los reticulocitos mediante citometna de flujo. Mas espedficamente, la reduccion en el contenido de hemoglobina de los globulos rojos permite diferenciar entre reticulocitos y RBC maduros cuando se miden mediante un metodo no fluorescente que comprende dispersion de luz y CC.
Ademas de facilitar la liberacion de la hemoglobina, el proceso de acromatizacion tambien puede esferar los globulos rojos, proporcionando a las celulas una forma mas regular, y permitiendo de este modo mediciones de dispersion de luz mas previsibles. Los reticulocitos nativos tienen una forma irregular que produce informacion de dispersion de luz imprevisible cuando se somete a un haz de luz. La esferacion del globulo rojo proporciona tambien informacion reproducible de la dispersion de la luz que constituye la base para determinar los reticulocitos en la muestra. En algunas realizaciones, sena ventajoso combinar la muestra de sangre con un agente de esferacion. El agente de esferacion se usa en una cantidad eficaz para convertir los eritrocitos reticulados y los globulos rojos en esferas isovolumetricas para eliminar artefactos de orientacion durante el analisis de los reticulocitos. En algunas realizaciones, el reactivo de esferacion es un tensioactivo de ion hfbrido que esfera isovolumetricamente los globulos rojos. Los ejemplos de agentes de esferacion adecuados en la presente invencion incluyen, aunque no de forma limitativa, lauroamidopropilbetarna, cocoamidopropilbetarna y cocoamidosulfobetama.
Se habfa descubierto anteriormente que el proceso de acromizacion se ve afectado por la temperatura. Las temperaturas por debajo de 12,8 °C (55 °F) parecen retardar el proceso de acromizacion y son necesarios periodos de tiempo mas largos para permitir que se produzca el proceso de acromizacion. En algunas realizaciones, la muestra de sangre se mezclara con la solucion acromizante a una temperatura de al menos 12,8° (55°) durante aproximadamente 30 segundos. En una realizacion, la acromizacion de la muestra de sangre se llevara a cabo a 41 °C (106 °F).
En algunas realizaciones, el pH de la solucion acromizante no debe ser mayor de 3,0. En una realizacion, el pH de la solucion acromizante es aproximadamente de 1,0 a 2,0. Ademas, parece que la solucion acromizante acida solubiliza la hemoglobina y facilita su eliminacion del globulo rojo. Se ha indicado que, cuando se utiliza tiocianato potasico, el acido sulfurico es el acido preferido que se va a utilizar en la combinacion. La concentracion preferida de tiocianato potasico es aproximadamente de 1,0 a 6,0 gramos por litro, y de acido sulfurico es aproximadamente de 0,7 a 3,0 gramos por litros.
La presion osmotica de la solucion acromizante debe controlarse para que se produzca un hinchamiento rapido, pero controlado, del globulo rojo. La presion osmotica de la solucion acromizante debe ser al menos de aproximadamente 75 miliosmoles. La presion osmotica hace que el globulo rojo se hinche y libere la hemoglobina en un lapso de tiempo de treinta (30) segundos desde su mezcla con la solucion acromizante. Si la presion osmotica es inferior a aproximadamente 75 miliosmoles, entonces el globulo rojo no retendra
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una membrana celular intacta y se lisara. Mas espedficamente, una presion osmotica menor da como resultado globulos rojos que estan danados, de tal manera que la enumeracion de reticulocitos no es fiable. Si la presion osmotica no es suficiente, los globulos rojos retendran la hemoglobina, lo que obstaculizara la diferenciacion de los reticulocitos. En algunas realizaciones, la presion osmotica de la solucion acromizante variara de aproximadamente 75 a aproximadamente 110 miliosmoles. En otras realizaciones, la presion osmotica de la solucion acromizante estara en el intervalo de aproximadamente 82 a aproximadamente 105 miliosmoles.
Volviendo a la Fig. 2 en la etapa 204, la muestra de sangre se analiza utilizando un analizador de partmulas. En una realizacion, el analizador de partmulas es un analizador hematologico. Por ejemplo, la muestra de sangre, o una parte de esta, se introduce en el analizador de partmulas. Bajo presion hidrodinamica, la muestra de sangre fluye, celula a celula, a traves de una celda de flujo. Dentro de la celda de flujo se miden varios parametros de las celulas individuales. Por ejemplo, los analizadores de partmulas que utilizan la tecnologfa VCS pueden llevar a cabo el dimensionamiento volumetrico de una celula, la conductividad de una celula, y la dispersion de la luz, simultaneamente para cada celula. La Fig. 4 es un diagrama de flujo de la etapa 204 con mayor detalle, segun una realizacion de la presente invencion.
En la etapa 402, la muestra de sangre preparada en la etapa 202 se introduce en una celda de flujo para el analisis. En la etapa 404, en una realizacion, la muestra se examina mediante la energfa procedente de tres fuentes independientes a medida que fluye, celula a celula a traves de un punto de examen en la celda de flujo. En la etapa 406, la medicion de la dispersion de luz se registra para cada evento celular. A medida que el contenido de ARN disminuye con la madurez del reticulocito, puede esperarse que disminuya la medicion de la dispersion de la luz. Pueden estar disponibles varias mediciones de dispersion de luz, por ejemplo, y sin limitacion, incluyen las mediciones de dispersion de luz directa. La dispersion directa mide la luz que pasa a traves de la celula que se examina y que se desvfa desde el eje del haz de luz. Los ejemplos de dispersion de luz directa incluyen, aunque no de forma limitativa, dispersion de la luz de angulo medio inferior (LMALS), dispersion de la luz de angulo medio superior (UMALS), y dispersion de la luz de angulo bajo (LALS). La LMALS se refiere a la luz dispersada en un angulo de 9°-l9° desde el eje del haz, UMALS se refiere a la luz dispersada en un angulo de 20°-43° desde el eje del haz, y LALS se refiere a la luz dispersada en un angulo de aproximadamente 5,1° desde el eje del haz. Otra medicion de la dispersion de luz, la dispersion de luz de angulo lateral (SALS), puede medir la luz dispersada en un angulo de 90°. En algunas realizaciones, los analisis de muestras de sangre incluiran una medicion de la perdida de luz axial (ALL). ALL es la cantidad de luz perdida en un angulo de aproximadamente 0° a 0,5° con respecto al eje del haz.
En la etapa 408 se recoge otra medicion que es indicativa de la madurez de los reticulocitos. Por ejemplo, en una realizacion de la presente invencion, se puede medir el tamano de la celula. Se sabe que el tamano de la celula disminuye con la madurez del reticulocito, en general, a medida que disminuye el contenido de ARN. Como ejemplo, el tamano de la celula, o el volumen de la celula, puede medirse utilizando la medicion de CC. La amplitud del pico del pulso de CC es funcion del volumen de la celula. En esta etapa se pueden usar otras mediciones indicativas de la madurez del reticulocito, que incluye medios directos o indirectos para medir el volumen de la celula. Por ejemplo, la medicion de la fluorescencia indica la cantidad de ARN en la celula, o se pueden utilizar otros modos para medir el volumen de la celula. Como otro ejemplo, se puede utilizar tambien la dispersion directa para indicar el tamano de la celula.
Volviendo a la Fig. 2, en la etapa 206 se identifico una poblacion de reticulocitos a partir de la poblacion completa de eventos de celulas. Las graficas de dispersion de datos de eventos, utilizando varios ejes, ayudan a identificar los modelos de distribucion de celulas sangumeas. Como ejemplo, se pueden visualizar los datos de eventos en una grafica de dispersion, tal como, por ejemplo, la Fig. 1 donde la dispersion de la luz esta en el eje x y el volumen (CC) esta en el eje y. Como se ha indicado anteriormente con respecto a la Fig. 1, la poblacion 104 de reticulocitos puede identificarse por separado de los eritrocitos 102, las plaquetas 108 y los globulos blancos 106. La precision de la poblacion de reticulocitos es especialmente dependiente de cuan definitivamente se puede determinar la lmea 130 que separa los reticulocitos de los globulos rojos. Por ejemplo, en una realizacion, aunque la lmea 130 puede superponerse sobre la grafica 100 de dispersion basandose en el umbral de dispersion de luz y los valores de medicion del volumen derivados empmcamente de colecciones de mediciones anteriores, la lmea 130 puede fracasar en separar correctamente los eritrocitos 102 de los reticulocitos (104), especialmente con respecto a los eventos de celulas que se encuentran muy cerca de la lmea 130 en la grafica 100 de dispersion.
Volviendo de nuevo ahora a la Fig. 2, en la etapa 207 se pueden notificar una o mas medidas de reticulocitos. En una realizacion, la fraccion de reticulocitos se notifica como la relacion de un numero predeterminado de regiones definidas sobre la funcion de cartograffa de la poblacion completa de globulos rojos. En otra realizacion, los reticulocitos se pueden notificar como un porcentaje o numero absoluto. La generacion de informes implica la salida de una o mas mediciones en una pantalla u otro dispositivo de salida tal como un archivo informatico.
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Deteccion de las celulas diffciles de acromizar
En un aspecto, el metodo de la presente invencion permite la exactitud de la deteccion de reticulocitos que se informa que ha mejorado teniendo unos datos de las muestras mas exactos basandose en los cuales calcular la informacion de los reticulocitos. Se ha observado, en algunas muestras de sangre, que tras el proceso de acromizacion inicial, quedan celulas que bien no se han acromizado o que solamente se han acromizado parcialmente, es decir, celulas “diffciles de acromizar”. Para los fines de la presente invencion, el termino “celula diffcil de acromizar” se referira a una celula que ha retenido al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original. En otras palabras, en una celula diffcil de acromizar se ha eliminado menos de 70 % de su hemoglobina original. Preferiblemente, se mantiene mas de 50 % e incluso de forma mas preferida se mantiene mas de 70 % del contenido de hemoglobina original. Se pretende que el proceso de acromizacion, por ejemplo, combinando una solucion acida hipotonica con la muestra de sangre, aclare la hemoglobina de las celulas. Sin acromizacion, o con una acromizacion poco eficaz (es decir, cuando las celulas pierden menos de 30 % de su contenido de hemoglobina), es posible que los eritrocitos no se diferencien claramente de los reticulocitos. Otra vision de la diferencia entre las celulas acromicas en comparacion con las celulas diffciles de acromizar puede observarse en la Fig. 6, que muestra que la poblacion 610 de las celulas diffciles de acromizar se coloca en la parte superior de la grafica de dispersion de la perdida de luz axial frente a UMALS. Cuando las celulas diffciles de acromizar estan presentes en la muestra de sangre, y la muestra de sangre se analiza utilizando dispersion de luz y CC, la diferenciacion entre reticulocitos y globulos rojos maduros puede fracasar porque la poblacion de celulas diffciles de acromizar es densa y se coloca generalmente dentro de la region de los reticulocitos. Algunas realizaciones de la presente invencion implican detectar las celulas diffciles de acromizar en la poblacion total de celulas sangumeas.
Las Figs. 5(A) y 5(B) muestran el contraste presentado en las graficas de dispersion para los datos del mismo evento con y sin eventos de celulas diffciles de acromizar, utilizando la dispersion de luz convencional o la dispersion de luz de angulo medio superior (UMALS), y el eje de CC. En la Fig. 5(A), la grafica de dispersion incluye eventos de celulas diffciles de acromizar. La frontera 510 muestra la localizacion de una poblacion de eventos de celulas diffciles de acromizar. La Fig. 5(B) muestra la misma poblacion de eventos una vez que se han eliminado los eventos de celulas diffciles de acromizar, incluida la poblacion definida por la frontera 510. En ambas Figs. 5(A) y 5(b), los eventos por debajo de la frontera 530 corresponden a plaquetas y los eventos a la derecha de la frontera 520 corresponden a globulos blancos. Como se puede observar por la localizacion de la frontera 510, la poblacion de eventos de celulas diffciles de acromizar abarca la separacion entre la poblacion de globulos rojos maduros y la poblacion de reticulocitos, dificultando de esta forma distinguir claramente entre globulos rojos maduros y reticulocitos. En contraste, cuando se elimina la poblacion de eventos de celulas diffciles de acromizar, como se muestra en la Fig. 5(B), se puede definir una frontera clara 511 entre los globulos rojos maduros y los reticulocitos. Una comparacion visual de las Figs. 5(A) y 5(B) ilustra la dificultad de identificar y separar los globulos rojos maduros de los reticulocitos cuando estan presentes las celulas diffciles de acromizar.
En esta realizacion, la medicion de la perdida de luz axial permite discriminar la poblacion diffcil de acromizar del resto de la muestra. Los inventores de la presente invencion han descubierto de forma inesperada que la misma poblacion de eventos que no puede identificar la poblacion diffcil de acromizar basandose en la medicion de la dispersion de la luz utilizada convencionalmente puede ahora distinguir la poblacion utilizando una medicion de la perdida de luz axial. Por ejemplo, la Fig. 6 muestra la misma poblacion del evento que se muestra en la Fig. 5(A), pero utilizando la perdida de luz axial (ALL) y UMALS en vez de los convencionales CC y UMALS. Utilizando ALL, los eventos de celulas diffciles de acromizar pueden identificarse claramente, como se muestra por la superficie comprendida por la frontera 610.
Las Figs. 7(A-C) ilustran la eliminacion del evento de celulas diffciles de acromizar de otra muestra de sangre utilizando ALL en una realizacion de la presente invencion. La grafica 710 de dispersion muestra los UMALS y la CC generalmente utilizados. En la grafica 710 de dispersion, estan presentes las celulas diffciles de acromizar (como se muestran en la frontera 711) pero no se pueden distinguir con claridad de otros globulos rojos. Sin embargo, cuando se muestran los mismos datos en la grafica 720 de dispersion, que tiene la perdida de luz axial (ALL) y UMALS como eje, la capacidad de detectar las celulas diffciles de acromizar mejora en gran medida. Basandose en ALL, la poblacion 721 diffcil de acromizar es claramente discernible de las otras poblaciones de eventos.
En una realizacion de la presente invencion, los eventos de celulas que corresponden a la poblacion diffcil de acromizar pueden eliminarse mediante filtracion, y los eventos de celulas restantes pueden presentarse en una grafica de dispersion, por ejemplo, tal como 730, utilizando el eje UMALS y el eje CC. La filtracion de los eventos que corresponden a la poblacion de celulas diffciles de acromizar puede llevarse a cabo clasificando la poblacion diffcil de acromizar bien de forma automatica, por ejemplo, los valores umbral de ALL y UMALS determinados empmcamente, o bien mediante la asistencia de un operario manual. Una comparacion visual de las graficas de dispersion 730 y 710 ilustra la distincion mas clara entre la poblacion de globulos rojos maduros a la izquierda de la frontera 731 y la poblacion de reticulocitos a la derecha de la frontera 731.
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Como se muestra en la Fig. 6 (espedficamente el area comprendida dentro de la frontera 610) y las Figs. 7(A- C) (espedficamente el area comprendida dentro de la frontera 721) cuando se utiliza ALL, las celulas diffciles de acromizar pueden identificarse como una poblacion distinta de otras poblaciones tales como globulos rojos maduros, reticulocitos, plaquetas y globulos blancos. Las celulas diffciles de acromizar presentan generalmente un ALL mayor que los otros tipos de celulas sangmneas excepto los globulos blancos. Los globulos blancos pueden distinguirse debido a sus elevadas mediciones de dispersion de luz con respecto a otros tipos de celulas sangumeas. El ALL elevado de la poblacion de celulas diffciles de acromizar puede atribuirse a la absorcion de luz relativamente elevada de la hemoglobina. A una longitud de onda laser de 488 nm (la longitud de onda utilizada en el analizador que produjo los resultados que se muestran en las Figs. 5(A), 5(B), 6 y 7(A- C)), la hemoglobina presenta una absorcion optica muy alta que conduce a un nivel elevado de ALL. En general, la hemoglobina muestra una mayor absorcion de luz cuando la luz tiene una longitud de onda entre 400-500 nm.
La deteccion de las celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre que se esta analizando puede llevarse a cabo mediante la realizacion de la presente invencion que se muestra en la Fig. 8. En la Fig. 8, la etapa 202 de la Fig. 2 se disecciona adicionalmente para incluir etapas para detectar las celulas diffciles de acromizar. En la etapa 802, una muestra de sangre preparada; es decir, una muestra que se ha acromizado y tenido, puede introducirse en una celda de flujo para el analisis. En la etapa 804, se examina la muestra, celula a celula, utilizando mediciones que incluyen un haz de luz como se explica con respecto a la Fig. 2 anterior. En la etapa 806 se recoge la medicion de ALL, junto con una o mas mediciones de la dispersion de la luz en la etapa 810. Pueden encontrarse descripciones de la medicion de la dispersion de la luz anteriormente con respecto a la Fig. 2.
En una realizacion, una vez que se detectan las celulas diffciles de acromizar, estos datos de eventos pueden utilizarse para analizar con mas precision los reticulocitos. Por ejemplo, la poblacion de celulas diffciles de acromizar puede eliminarse mediante filtracion utilizando los valores de ALL de los eventos de reticulocitos, como en la etapa 812. En esta realizacion, los datos de eventos estaran disponibles para un analisis adicional para determinar la informacion de los reticulocitos o cualquier otra informacion sobre globulos rojos, como en la etapa 814. En general, la eliminacion de la poblacion de eventos de las celulas diffciles de acromizar aumentaffa la exactitud de la mayoffa de parametros notificados que se refieren a globulos rojos y/o reticulocitos. El calculo y la notificacion de la informacion de los reticulocitos se ha descrito anteriormente con respecto a la Fig. 2.
Enumeracion de las celulas diffciles de acromizar
Un aspecto de la presente invencion se refiere a la enumeracion de las celulas diffciles de acromizar en la muestra de sangre. Los inventores de la presente invencion han descubierto de forma inesperada que existe una correlacion entre la poblacion de celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre y una patologfa de la sangre. Espedficamente, se ha descubierto que el numero de celulas diffciles de acromizar esta aumentado en las muestras de sangre analizadas recogidas de pacientes que padecen diversas enfermedades, cuyos ejemplos incluyen, aunque no de forma limitativa, enfermedades tales como hemoglobinopaffa (p. ej., anemia drepanodtica y talasemia), neoplasias hematologicas (p. ej., leucemias y linfomas), trastornos de coagulacion y hemorragias, asf como VlH/SIDA, tumores malignos, y trastornos autoinmunitarios. Ademas, puede obtenerse informacion adicional acerca de estas enfermedades cuando se compara la posicion de las celulas diffciles de acromizar en el diagrama de dispersion con las muestras normales. Volviendo a la Fig. 8, tras la deteccion pueden enumerarse las celulas diffciles de acromizar, como en la etapa 813. El recuento o la enumeracion de celulas es una tecnica bien establecida para poblaciones de celulas bien definidas, tales como las celulas diffciles de acromizar actualmente definidas. En una realizacion, la fraccion diffcil de acromizar se notifica como la relacion de celulas diffciles de acromizar respecto a la poblacion completa de globulos rojos. En otra realizacion, las celulas diffciles de acromizar se pueden notificar como un porcentaje o numero absoluto. Dicho valor se puede utilizar como un parametro solo de uso para investigacion (RUO), o puede desarrollarse para obtener un parametro de diagnostico in vitro (IVD). Las Figs. 10 (A-C) ilustran la diferencia en el tamano de poblaciones 1010 de celulas diffciles de acromizar derivadas de individuos sanos (Fig. 10(A)) y de pacientes que padecen de anemia drepanodtica (Fig. 10(B)) y talasemia (Fig. 10(C)). Como se ilustra en las Figs. 10(A) y 11 el % de celulas diffciles de acromizar en una poblacion de RBC total es poco importante; es decir, inferior a aproximadamente 0,01 % en muestras de sangre donadas por individuos sanos. Se ha determinado tambien que las muestras de sangre de pacientes que padecen numerosas patologfas determinadas contienen una poblacion aumentada de celulas diffciles de acromizar (ilustrada en la Fig. 12). Dichas patologfas incluyen insuficiencia renal, cancer de tffgado, VIH, anemia drepanodtica, y talasemia. El % de celulas diffciles de acromizar de una poblacion de RBC total en una muestra de sangre de un paciente con una determinada patologfa diagnosticada esta aumentado en al menos diez veces el tamano de una poblacion de celulas diffciles de acromizar de un individuo sano. En algunas muestras de sangre, la poblacion de celulas diffciles de acromizar de un paciente que padece una enfermedad o trastorno es al menos 100 veces mayor que la de un individuo sano. El descubrimiento de esta tendencia por los inventores de la presente invencion puede ser util para determinar la existencia
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de una poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar, que puede estar relacionada ademas con la presencia de determinadas patologfas.
Se pueden emplear metodos alternativos para enumerar las celulas diffciles de acromizar. Mas concretamente, un experto en la tecnica puede analizar una muestra de sangre detectando la muestra y midiendo la hemoglobina celula a celula de la muestra de sangre utilizando la medicion de la dispersion de la luz como saben los expertos en la tecnica. Aquellas celulas que tienen al menos 30 % de la hemoglobina original se consideran celulas diffciles de acromizar. En otras palabras, las celulas diffciles de acromizar tendran mayor dispersion de la luz que las celulas acromicas en el diagrama de dispersion. En este metodo alternativo, un experto en la tecnica podffa emplear tambien un tinte fluorescente para diferenciar los reticulocitos de las celulas diffciles de acromizar.
El tecnico experto entendera que los entornos en los que la presente invencion se puede llevar a la practica, tales como los citometros de flujo y los analizadores hematologicos, pueden programarse para notificar un valor numerico para la poblacion de celulas diffciles de acromizar. Este valor numerico puede estar correlacionado con un estado bioqmmico y/o fisiologico de un individuo. Por ejemplo, se puede ajustar un valor umbral para el % de celulas diffciles de acromizar de los globulos rojos totales en una muestra de sangre que corresponde al numero de celulas diffcil de acromizar presente en un individuo sano. Cuando el numero de celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre de un paciente supera dicho valor umbral, se puede sospechar la presencia de una patologfa, y la muestra de sangre se puede senalar, garantizando una evaluacion diagnostica adicional del paciente. Un medico que evalua el resultado del recuento de la sangre determinara el ensayo adicional adecuado basandose en los smtomas del paciente, el estado de salud general, la enfermedad o trastorno, el genero, y la edad. En una realizacion, se puede senalar una muestra de sangre para evaluacion adicional si el % de celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre excede el valor umbral en al menos 10 veces. En otra realizacion, se puede senalar una muestra de sangre para evaluacion adicional si el % de celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre excede el valor umbral en al menos 100 veces.
Sistema para determinar la informacion de celulas sangumeas
La Fig. 9 muestra un sistema para analizar muestras de sangre segun una realizacion de la presente invencion. Un analizador 910 de parffculas se acopla utilizando el vinculo 940 a un ordenador 901. El ordenador 901 se acopla opcionalmente utilizando el vinculo 950 a una pantalla 920, y/o un dispositivo 921 de almacenamiento externo. El ordenador 901 puede incluir un procesador 902, una memoria 903, un almacenamiento interno 904, un modulo 905 de entrada, un modulo 906 de salida, y un modulo 907 de reticulocitos. El modulo 907 de reticulocitos puede incluir un modulo detector 961, un modulo analizador 963, un modulo diferenciador 965, y un modulo indicador 967.
El analizador 910 de parffculas puede incluir un analizador hematologico, un citometro de flujo, o dispositivo similar que sea capaz de examinar una muestra de sangre con el uso de un haz de luz. Se preparo una muestra de sangre como entrada a un analizador 910 de parffculas para el analisis. Los datos de eventos generados por el analizador 910 de parffculas se comunican a un ordenador 901, sobre el vinculo 940. El vinculo 940 puede ser una conexion interna al dispositivo tal como un bus que interconecta un componente periferico (PCI), o una conexion de red. Los eventos generados por el analisis de muestras de sangre en el analizador 910 de parffculas pueden comunicarse al ordenador 901 en tiempo real o en modo discontinuo.
Los datos de eventos, posteriores a cualquier procesamiento en el ordenador 901, se presentan a continuacion a un usuario sobre la pantalla 920, o se almacenan en un dispositivo 921 de almacenamiento externo. Por ejemplo, las graficas de dispersion generadas por el procesamiento en el ordenador 901 pueden presentarse al usuario utilizando la pantalla 920. Los datos de eventos procesados pueden almacenarse tambien para el analisis y presentacion posteriores. El dispositivo 921 de almacenamiento externo puede incluir un disco duro, u otro tipo de almacenamiento portatil.
El procesador 902 puede ejecutar instrucciones que permiten el procesamiento de los modulos 905, 906 y 907. La memoria interna 903 proporciona la memoria temporal requerida para dicho procesamiento, y el almacenamiento interno 904 puede proporcionar el almacenamiento de datos temporal o intermedio y los resultados asociados con dicho procesamiento. El almacenamiento interno 904 puede almacenar tambien el control logico basado en las instrucciones y/o el codigo de modulos del programa incluidos los modulos del componente del modulo 907 de reticulocitos en las formas que incluyen un codigo de programa informatico legible.
El modulo 905 de entrada recibe los datos de eventos generados por el analizador 910 de parffculas. El modulo 905 de entrada puede incluir cualquier procesamiento que se requiera para transformar los datos de eventos de entrada del analizador 910 de parffculas a un formato comprensible por el modulo 907 de reticulocitos. El modulo 906 de salida recoge los datos de eventos procesados por el modulo 907 de reticulocitos, lleva a cabo cualquier conversion necesaria, y sale a cualquier pantalla 920 o
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almacenamiento 920 utilizando el vinculo 950. El vmculo 950 puede ser una conexion interna al dispositivo tal como PCI, o una conexion de red. La pantalla 920 puede ser un dispositivo de pantalla que esta personalizado para la vision de los datos de un analizador de parffculas, una pantalla generica, o cualesquiera otros medios capaces de emitir resultados del analisis de parffculas.
El modulo detector 961 puede incluir instrucciones para determinar las mediciones o parametros de los eventos de celulas que pertenecen a la dispersion lateral incluidos UMALS, dispersion directa, perdida de luz axial, y CC. Senalar que cada realizacion de la presente invencion puede no tener acceso a todas las mediciones anteriores. Pude existir alguna configuracion requerida en el analizador 910 de parffculas que permita la recogida de todas las mediciones anteriores.
El modulo analizador 963 incluye instrucciones para identificar la poblacion de reticulocitos y/o la poblacion de celulas diffciles de acromizar, y el aislamiento de esta poblacion de otros tipos de celulas sangumeas. En otra realizacion, el modulo analizador 963 puede incluir instrucciones para eliminar mediante filtracion los eventos de celulas que corresponden a celulas diffciles de acromizar, como se ha explicado anteriormente. En otra realizacion mas, el modulo analizador 963 puede incluir instrucciones para enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar.
El modulo diferenciador 965 puede incluir instrucciones que hacen que el ordenador determine la informacion de los reticulocitos inmaduros de la muestra que se esta analizando. Por ejemplo, la poblacion de eventos de reticulocitos identificada utilizando el modulo 963 puede ahora investigarse utilizando la medicion de la dispersion de la luz asf como una segunda medicion de la madurez de los reticulocitos tal como el volumen, para diferenciar los reticulocitos maduros de los inmaduros.
El modulo indicador 967 incluye instrucciones que permiten al ordenador 901 presentar graficas de dispersion a la pantalla 920 y notificar tambien cuantificaciones utiles de los reticulocitos en la muestra de sangre. La fraccion de reticulocitos o el porcentaje de reticulocitos son algunas cuantificaciones que se pueden notificar mediante el modulo indicador 967. El modulo indicador 967 puede incluir tambien instrucciones para notificar la informacion acerca de las poblaciones de celulas diffciles de acromizar.
En esta descripcion se describen metodos que pueden aumentar la exactitud del analisis de muestras de sangre mediante medidas tales como la fraccion de reticulocitos y de celulas diffciles de acromizar. Los metodos descritos dan como resultado mejoras sustanciales sobre los metodos actuales y pueden conducir a mejoras significativas en la deteccion y el tratamiento de numerosas patologfas de la sangre. Las personas expertas en la tecnica entenderan que las tecnicas descritas en la presente memoria pueden ser aplicables para tipos de celulas diferentes de los eritrocitos que se describen en la presente memoria.

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para detectar celulas diffciles de acromizar, que se definen como celulas que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original tras la mezcla con un reactivo acromizante, en una muestra de sangre que comprende:
    (a) mezclar la muestra de sangre con un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los globulos rojos, generando de esta forma una muestra de sangre acromica;
    (b) evaluar la muestra de sangre acromica en una celda de flujo citometrico mediante una deteccion que comprende una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz, generando de esta forma datos de eventos que comprenden una perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula; e
    (c) identificar las celulas diffciles de acromizar utilizando los datos de eventos que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la identificacion de las celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial comprende comparar la medicion de la perdida de luz axial frente a un primer umbral y una medicion de la dispersion de la luz frente a un segundo umbral, en donde las celulas diffciles de acromizar se identifican por tener una medicion de la perdida de luz axial superior a la del primer umbral y una medicion de la dispersion de la luz inferior a la del segundo umbral.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la medicion de la dispersion de luz comprende o se selecciona de la dispersion de luz de angulo medio superior (UMALS), la dispersion de luz de angulo medio inferior (LMALs), y la dispersion de luz de angulo bajo (LALS).
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, que ademas comprende recoger mediciones de impedancia de la corriente continua.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 utilizado para enumerar celulas diffciles de acromizar en una muestra de sangre y que ademas comprende:
    (d) enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando datos de eventos que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula; y
    (e) notificar la poblacion de celulas diffciles de acromizar en la muestra de sangre.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 5, en donde la notificacion de la poblacion de celulas diffciles de acromizar incluye notificar una relacion de la poblacion de celulas diffciles de acromizar respecto a los globulos rojos totales o notificar un % de celulas diffciles de acromizar de poblacion de globulos rojos totales.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1 utilizado para detectar una poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar en una muestra del paciente, que comprende:
    (a) mezclar la muestra de sangre de un paciente con un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los globulos rojos, generando de esta forma una muestra de sangre acromica;
    (b) evaluar la muestra de sangre acromica en una celda de flujo citometrico mediante una deteccion que comprende una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz, generando de esta forma datos de eventos que comprenden una perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula;
    (c) identificar las celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz de los datos de eventos;
    (d) enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz; y
    (e) determinar la existencia de una poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar cuando el numero de celulas diffciles de acromizar excede un valor umbral.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde la poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar se asocia con una hemoglobinopaffa, opcionalmente en donde la hemoglobonopaffa comprende anemia drepanocffica o talasemia.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 1 utilizado para analizar una muestra de sangre, que comprende:
    (a) mezclar la muestra de sangre con un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los globulos rojos, generando de esta forma una muestra de sangre acromica;
    (b) medir la muestra de sangre acromica en una celda de flujo citometrico mediante una deteccion que comprende una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz para generar datos de eventos que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula;
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    (c) identificar una poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando datos de eventos, basandose en dicha medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz;
    (d) eliminar mediante filtracion la poblacion de celulas diffciles de acromizar de dichos datos de eventos; y
    (e) analizar los datos de eventos sin la poblacion de celulas diffciles de acromizar para identificar los modelos de distribucion de las celulas sangumeas.
  10. 10. Un medio informatico legible que almacena instrucciones en donde dichas instrucciones cuando se ejecutan dan lugar al menos a un procesador para analizar una muestra de sangre utilizando un metodo que comprende:
    (a) generar datos de eventos que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz para cada celula basandose en una deteccion que comprende una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz de una muestra de sangre acromica en una celda de flujo citometrico; e
    (b) identificar una poblacion de celulas diffciles de acromizar que se definen como celulas que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original tras la mezcla con un reactivo acromizante, utilizando los datos de eventos, basandose en dicha medicion de la perdida de luz axial y una medicion de dispersion de la luz.
  11. 11. El medio informatico legible de la reivindicacion 10, en donde el metodo ademas comprende:
    (c) eliminar mediante filtracion la poblacion de celulas diffciles de acromizar de dichos datos de eventos; y
    (d) analizar los datos de eventos sin la poblacion de celulas diffciles de acromizar para identificar los modelos de distribucion de las celulas sangumeas; o en donde el metodo ademas comprende:
    (c) enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz;
    y
    (d) determinar la existencia de una poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar cuando el numero de celulas diffciles de acromizar excede un valor umbral; o en donde el metodo ademas comprende:
    (c) enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz; y
    (c) notificar la poblacion de celulas diffciles de acromizar en la muestra de sangre.
  12. 12. Un sistema para analizar una muestra de sangre, que comprende: al menos un procesador;
    un analizador de parffculas acoplado con el al menos un procesador y que comprende una celda de flujo citometrico;
    un modulo detector acoplado al al menos un procesador y configurado para generar datos de eventos que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz para cada celula basandose en una deteccion que comprende una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz de una muestra de sangre acromica en una celda de flujo; y un modulo analizador acoplado al al menos un procesador y configurado para identificar una poblacion de celulas diffciles de acromizar que se define como celulas que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original tras la mezcla con un reactivo acromizante utilizando los datos de eventos, basandose en dicha medicion de la perdida de luz axial y una medicion de dispersion de la luz.
  13. 13. El sistema de la reivindicacion 12, en donde el modulo analizador se configura ademas para enumerar la poblacion de celulas diffciles de acromizar utilizando la medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de luz; o en donde el modulo analizador se configura ademas para:
    eliminar mediante filtracion la poblacion de celulas diffciles de acromizar de dichos datos de eventos; y analizar los datos de eventos sin la poblacion de celulas diffciles de acromizar para identificar los modelos de distribucion de las celulas sangumeas.
  14. 14. Un metodo automatizado de enumerar celulas diffciles de acromizar que se definen como celulas que retienen al menos 30 % de su contenido de hemoglobina original tras la mezcla con un reactivo acromizante, en una muestra de celulas sangumeas que comprende:
    (a) mezclar la muestra de celulas sangumeas con un acido nucleico de tincion y un reactivo acromizante para eliminar hemoglobina de los globulos rojos en la muestra de celulas sangumeas, generando de esta forma una muestra de celulas sangumeas acromicas;
    (b) pasar la muestra de celulas sangumeas acromicas a traves de una celda de flujo citometrico;
    (c) analizar la muestra de celulas sangumeas acromicas en la celda de flujo citometrico utilizando las mediciones de dispersion de la luz y de la perdida de luz axial generando de esta forma datos del evento que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y la medicion de la dispersion de la luz para cada celula
    (d) diferenciar las celulas diffciles de acromizar en la muestra de celulas sangumeas acromicas de otras celulas usando el analisis de los datos del evento que comprenden una medicion de la perdida de luz axial y una medicion de la dispersion de la luz para cada celula; y
    (e) enumerar las celulas diffciles de acromizar.
    5
  15. 15.El metodo de la reivindicacion 14, en donde la mezcla de la muestra de sangre con el tinte de tincion del acido nucleico y el reactivo acromizante se lleva a cabo por separado; o en donde la tincion es fluorescente o no fluorescente, o ademas comprende determinar una existencia de una poblacion anomala de celulas diffciles de acromizar comparando el numero de celulas diffciles de acromizar en la 10 muestra de celulas sangumeas a un valor umbral y notificar el numero de celulas diffciles de acromizar que excede el valor umbral.
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