BR112013027349B1

BR112013027349B1 - método para classificação/contagem de leucócitos, kit de reagentes para classificação de leucócitos, e reagentes para classificação de leucócitos

Info

Publication number: BR112013027349B1
Application number: BR112013027349-6A
Authority: BR
Inventors: Saori OTSUKA; Kazuki HATCHO; Toshihiro Mizukami; Shinichiro Oguni
Original assignee: Sysmex Corporation
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2021-05-18
Also published as: BR112013027349A2; WO2012147578A1; EP2703812B1; US20140120530A1; US20200326332A1; CN103460041A; EP2703812A1; EP2703812A4; JP2012233754A; SG194452A1; JP5583629B2; CN103460041B

Abstract

MÉTODO PARA CLASSIFICAÇÃO/CONTAGEM DE LEUCÓCITOS, KIT DE REAGENTES PARA CLASSIFICAÇÃO DE LEUCÓCITOS. A presente invenção refere-se a um método para classificar e contar leucócitos que possibilita classificação e contagem de leucócitos normais como também discriminação entre células de blasto e linfócitos atípicos. O método para classificar e contar leucócitos compreende as etapas de: preparar uma amostra de medição misturando uma amostra biológica; um primeiro reagente para ácido nucleico corante; e um segundo reagente contendo tensoativos catônicos e não iônicos para formar lisinas de eritrólitos e danificar membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeável para um corante fluorescente e um ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM; obtendo informação de luz dispersa e informação de fluorescência gerada aplicando luz para a amostra de medição; e com base nas informações de luz dispersa e informações de fluorescência obtidas, classificar os leucócitos na amostra biológica e detectar células de blasto e lifócitos atípicos diferenciando até no meio, em que quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH (...).

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção refere-se a um método para classificação e contagem de leucócitos em amostras biológicas. A presente invenção também se refere a um kit de reagente e reagente para classificar leucócitos que são usados para classificar e contar leucócitos em amostras biológicas.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0002] Leucócitos normais são geralmente classificados em cinco tipos: linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos. O sangue periférico normal contém essas células sanguíneas em certas proporções. Entretanto, um sujeito com uma doença pode ter um número aumentado ou diminuído de certas células sanguíneas. Desta maneira, no campo de testes clínicos, classificação e conta de leucócitos podem prover informações muito úteis para diagnóstico de doenças.

[0003] Doenças tais como malignâncias hematopoiéticas e infecções por vírus causam ocorrência de células que não estão presentes no sangue periférico normal. Por exemplo, em leucemia aguda, leucócitos imaturos, isto é, "células blasto (mieloblastos, linfoblastos)" ocorrem no sangue periférico. Por outro lado, em infecções por vírus ou alergias às fármacos, linfócitos ativados por estimulação de antígenos, isto é, "linfócitos atípicos"ocorrem no sangue periférico. É muito importante detectar linfócitos atípicos e células blasto do sangue periférico pela diferenciação até no meio a fim de rastrear ou diagnosticar doenças.

[0004] Nos últimos anos, vários contadores de células do sangue automáticos estão comercialmente disponíveis aos quais o princípio de citometria de fluxo tem sido aplicado. Esses contadores possibilitam a classificação automática e contagem de células sanguíneas em amostras. Reagentes de classificação de células do sangue para medições em contadores de células do sangue automáticos estão também comercialmente disponíveis. Mediante medições de espécimens em contadores de células do sangue automáticos usando esses reagentes, sinais das respectivas células sanguíneas aparecem em certas regiões em gráficos de distribuição.

[0005] Um número de tais reagentes de classificação de células do sangue é conhecido na técnica. Por exemplo, a Literatura de Patente 1 descreve um método que possibilita a classificação e conta de ambos os leucitos normais e anormais. Neste método, um kit de reagentes é usado que é uma combinação de solução de coloração para especificamente colorir RNA e um agente hemolítico contendo tensoativos catiônicos e não iônicos. Enquanto isto, a Literatura de Patente 2 descreve um método para classificar e contar leucócitos normais e detectar leucócitos anormais. Nesse método, um reagente é usado que compreende uma solução de coloração contendo um certo corante fluorescente e um agente hemolítico contendotensoativos catiônicos e não iônicos. Lista de Citações Literatura de patente Literatura de patente 1: Patente Japonesa No. 4248017 Literatura de patente 2: Pedido de Patente U.S. No. 2009/0023129

SUMÁRIO DA INVENÇÃO Problema Técnico

[0006] Como descrito acima, espécimens obtidos de sujeitos podem conter, em adição aos leucócitos normais, leucócitos anormais tais como células de blasto e linfócitos atípicos.

[0007] Entretanto, em métodos usando os reagentes descritos na Patente Japonesa No. 4248017 e Pedido de Patente U.S. No. 2009/0023129, sinais de leucócitos anormais, isto é, células de blasto e linfócitos atípicos, podem aparecer em regiões similares em gráficos de distribuição, e desse modo é difícil detectar células de blasto e linfócitos atípicos pela diferenciação até no meio.

[0008] Desse modo, a presente invenção é para prover um método para classificar e contar leucócitos que permitem classificação e conta de leucócitos normais e detecção de células de blasto e linfócitos atípicos diferenciando até no meio. A presente invenção é também para prover um kit de reagentes para classificação de leucócitos e um reagente para classificação de leucócitos que possibilitam classificação e conta de leucócitos normais e detecção de células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciação até no meio.

Solução para Problema

[0009] Na medição de citômetros de fluxo usando reagentes de classificação de leucócitos convencional, sinais de células de blasto e linfócitos atípicos em gráficos de distribuição, aparecem os arredores da ou na região sobrepondo as regiões em que sinais de linfócitos normais e monócitos normais estão presentes. Os presentes inventores levantaram e hipótese de que separando a região em que o sinal de linfócitos normais aparece a partir da região em que o sinal de monócitos normais aparece, o sinal leucócitos anormais pode ser separado do sinal de leucócitos normais e a sensibilidade para detecção de leucócitos anormais pode ser melhorada.

[00010] Desta maneira, os presentes inventores investigaram um método para classificar leucócitos que tornam possível separar a região em que o sinal de linfócitos normais aparece a partir da região em que o sinal de monócitos normais aparece. Como um resultado, os presentes inventores surpreendentemente descobriram que certas combinações da concentração de um ácido orgânico aromático e pH no reagente pode melhorar a exatidão da detecção de leucócitos normais e possibilitar a detecção de células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciação até no meio, desse modo realizando a presente invenção.

[00011] Desse modo a presente invenção provê um método para classificar e contar leucócitos compreendendo as etapas de:

[00012] preparar uma amostra de medição misturando uma amostra biológica; um primeiro reagente para ácido nucleico corante; e um segundo reagente contendo tensoativos catiônicos e não iônicos para provocar a lise de eritrócitos e danificar membranas de células de leucócitos de maneira a serem permeáveis ao corante fluorescente e um ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM;

[00013] aplicar luz para a amostra de medição preparada e obter informações de luz dispersa e informações sobre a fluorescência gerada desse modo; e

[00014] com base na informação obtida sobre a luz dispersa e informações da fluorescência, classificar os leucócitos na amostra biológica e detectar células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciação até no meio;

[00015] em que quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,4, e quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 7,0.

[00016] A presente invenção também provê um kit de reagentes para classificar leucócitos compreendendo um primeiro reagente contendo um corante fluorescente capaz coloração do ácido nucleico e um segundo reagente contendo tensoativos catiônicos e não iônicos para criar a lise de eritrócitos e danificar as membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeáveis ao corante fluorescente e um ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM, em que quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH de não menos do que 5,5 e não mais alto do que 6,4, e quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 30 mM enão mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH de não menos do que 5,5 e não mais do que 7,0.

[00017] A presente invenção ainda provê um reagente para classificar leucócitos compreendendo um corante fluorescente capaz de tingir ácido nucleico, um tensoativo catiônico, um tensoativo não iônico e um ácido orgânico aromático, em que o reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM, e em quein quando o reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o reagente tem pH de não menos do que 5,5 e não mais do que 6,4, e quando o reagente conteém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, o reagente tem pH de não menos do que 5,5 e não mais do que 7,0.

Efeitos Vantajosos da Invenção

[00018] O método para classificar e contar leucócitos, o kit de reagentes para classificar leucócitos e o reagente para classificar leucócitos de acordo com a presente invenção permite classificação e contagem de leucócitos normais como também a detecção de células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciação até no meio.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00019] FIG. 1 mostra um gráfico de distribuição e um diagrama obtidos por uma medição de um espécime de sangue normal usando o kit de reagentes para classificar leucócitos da presente invenção;

[00020] FIG. 2 mostra gráficos de distribuição obtidos pela medição de um espécime de sangue contendo linfócitos morfologicamente anormais usando os reagentes do Exemplo 2;

[00021] FIG. 3 mostra gráficos de distribuição obtidos pelas medições de um espécime de sangue contendo leucócitos anormais usando os reagentes do Exemplo 3;

[00022] FIG. 4 mostra gráficos de distribuição obtidos pelas medições de um espécime de sangue contendo leucócitos anormais usando os reagentes do Exemplo 3;

[00023] FIG. 5 mostra gráficos de distribuição obtidos pelas medições de um espécime de sangue contendo leucócitos anormais usando os reagentes do Exemplo 4; e

[00024] FIG. 6 mostra gráficos de distribuição obtidos pelas medições de um espécime de sangue normal usando os reagentes do Exemplo 5.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES

[00025] Nas modalidades da presente invenção, a amostra biológica não está particularmente limitada até o ponto em que ela é uma amostra de fluido do corpo contendo leucócitos. A amostra biológica pode incluir, por exemplo, sangue, fluido da medula óssea, urina, amostras obtidas por aférese e similares obtidos de mamíferos, preferivelmente de seres humanos. A amostra biológica pode ser uma amostra possivelmente contendo leucócitos normais. O leucócito como usado aqui compreende um leucócito normal e um leucócito anormal. Leucócitos normais são geralmente classificados em quatro tipos: linfócitos, monócitos, eosinófilos e granulócitos em vez de eosinófilos, ou cinco tipos: linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos.

[00026] Como usado aqui leucócitos normais significa leucócitos que normalmente não estão presentes no sangue periférico. Os leucócitos normais podem incluir, por exemplo, linfócitos atípicos e células de blasto. Os linfócitos atípicos são linfócitos que são ativados pela estimulação de antígeno e foram morfologicamente modificados respondendo à estimulação. Linfócitos atípicos ocorrem no sangue periférico de pacientes com doenças tais como infecção por vírus, alerias à fármacos e similares. As células de blasto se refere aos leucócitos imaturos tais como mieloblástos, linfoblástos e similares. Mieloblástos ocorrem no sangue periférico de pacientes com leucemia mieloide aguda e linfoblástos ocorrem no sangue periférico de pacientes com leucemia linfocítica aguda.

[00027] O kit de reagentes para classificar leucócitos que são de agora em diante descritos que são usados o método para classificar e contar leucócitos da presente invenção.

[00028] O kit de reagentes para classificar leucócitos da presente invenção (de agora em diante referido também como "kit de reagentes") compreende um primeiro reagente e um segundo reagente. Esses reagentes no kit de reagentes são deagora em diante descritos.

Primeiro reagente

[00029] O primeiro reagente contido no kit de reagentes da presente invenção compreende um corante fluorescente capaz de tingir ácido nucleico. Nas modalidades da presente invenção, o primeiro reagente é um reagente para ácido nucleico corante fluorescente de células nucleadas em uma amostra biológica tratada com o segundo reagente descrito aqui abaixo. Tratamento de uma amostra biológica com o primeiro reagente permite a coloração de células sanguíneas tendo ácido nucleico tais como leucócitos normais e leucócitos anormais.

[00030] Nas modalidades da presente invenção, o corante fluorescente não está particularmente limitado até o ponto em que pode corar ácido nucleico e pode ser apropriadamente selecionado dependendo do comprimento de onda da luz emitida de uma fonte de luz. O corante fluorescente pode incluir, por exemplo, iodeto de propídio, brometo de etídio, heterodímero etídio-acridino, etídio diazida, etídio homodímero-1, etídio homodímero-2, etídio monoazida, trimetilenobi[[3-[[4-[[(3-metilbenzotiazol-3-io)-2-il]metileno]-1,4-di- hidroquinolin]-1-il]propil]dimetilaminio] tetraiodeto (TOTO-1), 4-[(3- metilbenzotiazol-2(3H)-iliden)metil]-1-[3-(trimetilaminio)propil]quinolinio di-hiodeto (TO-PRO-1), N,N,N',N'-tetrametil-N,N'-bi[3-[4-[3-[(3- metilbenzotiazol-3-io)-2-il]-2-propeniliden]-1,4-di-hidroquinolin-1- il]propil]-1,3-propanodiaminio tetraiodeto (TOTO-3), -[3-[[1-[3- (trimetilaminio)propil]-1,4-di-hidroquinolin]-4-iliden]-1-propenil]-3- metilbenzotiazol-3-io di-hiodeto (TO-PRO-3) e corantes fluorescentes representados pela seguinte fórmula geral (I). Entre esses, os corantes fluorescentes representados pela formula geral a seguir (I) são preferidos.

[00031] Na fórmula (I), R1 e R4 são os mesmos ou diferentes um do outro e respectivamente são um átomo de hidrogênio, um grupo alquila, uma cadeia de alquila tendo um grupo hidroxila, uma cadeia alquila tendo um grupo éter, uma cadeia alquila tendo um grupo éster ou um grupo benzila que pode ter um substituinte; R2 e R3 são os mesmos ou diferentes um do outro e respectivamente são um átomo de hidrogênio,um grupo hidroxila, um halogêneo, um grupo alquila, um grupo alquenila, um grupo alquinila, um grupo alcóxi, um grupo alquilsulfonila ou um grupo fenila; Z é um átomo de enxofre, um átomo de oxigênio ou um átomo de carbono tendo um grupo metila; n é 0, 1, 2 ou 3; e X- é um ânion.

[00032] Nas modalidades da presente invenção, o grupo alquila pode ser linear ou ramificado. Nas modalidades da presente invenção, é preferível que na fórmula (I), quando um de R1 e R4 é um grupo alquila tendo 6 a 18 átomos de carbono, o outro é um átomo de hidrogênio ou um grupo alquila tendo menos de 6 átomos de carbono. Entre os grupos alquila tendo 6 a 18 átomos de carbono, o grupo alquila tendo 6, 8 ou 10 átomos de carbono é preferível.

[00033] Nas modalidades da presente invenção, o substituinte do grupo benzila em R1 e R4 na fórmula (I) pode incluir, por exemplo, grupos alquila tendo 1 a 20 átomos de carbono, grupos alquenila tendo 2 a 20 átomos de carbono e grupos alquinila tendo 2 a 20 átomos de carbono. Entre esses, um grupo metila ou etila é particularmente preferível.

[00034] Nas modalidades da presente invenção, o grupo alquenila em R2 e R3 na fórmula (I) pode incluir, por exemplo, grupos alquenila tendo 2 a 20 átomos de carbono. O grupo alcóxi em R2 e R3 pode incluir grupos alcóxi tendo 1 a 20 átomos de carbono. Entre esses, um grupo metóxi ou etóxi é particularmente preferível.

[00035] Nas modalidades da presente invenção, o ânion X- na fórmula (I) pode incluir íons de halogêneo tais como F-, Cl-, Br- e I-, CF3SO3-, BF4- e similares.

[00036] Nas modalidades da presente invenção, o primeiro reagente pode conter um ou dois ou mais corantes fluorescentes.

[00037] Nas modalidades da presente invenção, a concentração do corante fluorescente no primeiro reagente pode variar dependendo do tipo do corante fluorescente e é comumente 0,01 a 100 pg/μL, preferivelmente 0,1 a 10 pg/μL. Quando o corante fluorescente no primeiro reagente é, por exemplo, o corante fluorescente representado pela fórmula (I), o primeiro reagente preferivelmente conteém o corante fluorescente em uma concentração de 0,2 a 0,6 pg/μL, mais preferivelmente 0,3 a 0,5 pg/μL.

[00038] Nas modalidades da presente invenção, o primeiro reagente pode ser obtido dissolvendo o corante fluorescente em um solvente apropriado de maneira a obter a concentração descrita acima. O solvente não está particularmente limitado até o ponto em que ele pode dissolve o corante fluorescente e pode incluir, por exemplo, água, solventes orgânicos e misturas dos mesmos.

[00039] Os solventes orgânicos podem incluir, por exemplo, alcoóis, etileno glicol, dimetil sulfoxido (DMSO) e similares. O corante fluorescente é preferivelmente dissolvido em um solvente orgânico porque o corante pode ter uma estabilidade de armazenamento diminuída em soluções aquosas.

[00040] Nas modalidades da presente invenção, o primeiro reagente pode ser um regente corante comercial para medições de leucócitos. Tal como um reagente corante pode incluir, por exemplo, Stromatolyzer 4DS (Sysmex Corporation). Stromatolyzer 4DS é um reagente corante contendo o corante fluorescente representado pela fórmula (I).

Segundo reagente

[00041] O segundo reagente contido no kit de reagentes da presente invenção compreende tensoativos, isto é, tensoativos catiônicos e não iônicos, para formação da lise de eritrócitos e danificar membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeável para o corante fluorescente. O segundo reagente ainda compreende um ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM.

[00042] Nas modalidades da presente invenção, quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e são superior a 6,4, mais preferivel não inferior a 5,5 e não supeior a 6,2. Quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, preferivemente não menos do que 40 mM e não mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 7,0. Ainda mais preferível, quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 40 mM e não mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH não nferior a 5,5 e não superior a 6,2.

[00043] Nas modalidades da presente invenção, tratamento com o segundo reagente de uma amostra biológica possibilita a formação da lise de eritrócitos na amostra biológica e lesões nas membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeável para o corante fluorescente. Quando a amostra biológica contém leucócitos normais, o segundo reagente pode também danificar membranas de células dos leucócitos normais de maneira a ser permeável para o corante fluorescente.

[00044] As células sanguíneas lesionadas nas membranas de células pelo segundo reagente são tingidas com o corante fluorescente no primeiro reagente. Quando segundo reagente tem a concentração do ácido orgânico aromático e pH dentro das faixas acima, a região em que o sinal de linfócitos normais aparece e a região em que o sinal de monócitos normais aparece detectado pelos citômetros de fluxo e similares podem ser separados a tal ponto que a exatidão da detecção de leucócitos normais é melhorada e a diferenciação de células de blasto dos linfócitos atípicos é possível.

[00045] Como usado aqui, o ácido orgânico aromático significa um ácido tendo pelo menos one anel aromático em uma molecula ou um sal da mesma. O ácido orgânico aromático pode incluir, por exemplo, ácidos carboxílicos aromáticos, ácidos sulfônicos e similares. Nas modalidades da presente invenção, o ácido orgânico aromático que é apropriadamente usado é ácido ftálico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido hipúrico, ácido p-aminobenzenossulfônico, ácido benzenossulfônico e sais dos mesmos. O segundo reagente pode conter um ou dois ou mais ácidos orgânicos aromáticos. Quando o segundo reagente contém dois ou mais ácidos orgânicos aromáticos, o segundo reagente pode conter os ácidos orgânicos aromáticos em uma concentração total do mesmo de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM.

[00046] Nas modalidades da presente invenção, o tensoativo catiônico pode ser um tensoativo de sal de amônio quaternário ou um tensoativo de sal de piridíniopiridínio. O tensoativo de sal de amônio quaternário pode incluir, por exemplo, tensoativos representados pela fórmula (II) a seguir tendo 9 a 30 átomos de carbono no total:

[00047] Na fórmula (II), R1 é um grupo alquila ou alquenila tendo 6 a 18 átomos de carbono; R2 e R3 são os mesmsos ou diferentes um do outro e são respectivemente um grupo alquila ou alquenila tendo 1 a 4 átomos de carbono; R4 é um grupo alquila ou alquenila tendo 1 a 4 átomos de carbono ou um grupo benzila; e X- é um íon de halogêneo.

[00048] Na fórmula (II), R1 é preferivelmente um grupo alquila ou alquenila tendo 6, 8, 10, 12 ou 14 átomos de carbono e é particularmente preferível um grupo alquila linear. Mais especificamente, R1 pode incluir grupos octila, decila e dodecila. R2 e R3 são preferivelmente um grupo metila, etila ou propila. R4 é preferivelmente um grupo metila, etila ou propila.

[00049] O tensoativo de sal de piridínio pode incluir, por exemplo, tensoativos representados pela fórmula (III) a seguir.

[00050] Na fórmula (III), R1 é um grupo alquila ou alquenila tendo 6 a 18 átomos de carbono; e X- é um íon de halogêneo.

[00051] Na fórmula (III), R1 é preferivelmente um grupo alquila ou alquenila tendo 6, 8, 10, 12 ou 14 átomos de carbono e é particularmente preferível um grupo alquila linear. Mais especificamente, R1 pode incluir grupos octila, decila e dodecila.

[00052] Nas modalidades da presente invenção, a concentração do tensoativo catiônico no segundo reagente pode ser apropriadamente ajustada dependendo do tipo do tensoativo e é comumente 10 a 10.000 ppm, preferivemente 100 a 1.000 ppm.

[00053] Nas modalidades da presente invenção, o tensoativo não iônico é preferivelmente um tensoativo não iônico de polioxietileno representdo pela fórmula (VI) a seguir.

[00054] Na fórmula (VI), R1 é um grupo alquila, alquenila ou alquinila tendo 8 a 25 átomos de carbono; R2 é um átomo de oxigênio, -COO- ou

; e

[00055] n é um número inteiro de 10 a 50.

[00056] Exemplos específicos de tensoativo não iônico podem incluir alquil éteres de polioxietileno, esteróis de polioxietileno, óleos de mamona de polioxietileno, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitan, alquilaminas de polioxietileno, alquil éteres de polioxietileno polioxipropileno e similares.

[00057] Nas modalidades da presente invenção, o segundo reagente pode comumente conter um tensoativo não iônico em uma concentração de 10 a 100.000 ppm, preferivelmente 100 a 10.000 ppm, mais preferivelmente 1.000 a 5.000 ppm.

[00058] Nas modalidades da presente invenção, o segundo reagente pode conter um agente de tamponamento a fim de manter um pH constante. O agente de tamponamento pode incluir, por exemplo, sais de citrato, HEPES, sais de fosfato e similares. O ácido orgânico aromático pode exibir um efeito de tamponamento em alguns casos. Quando tal ácido orgânico aromático é usado, um agente de tamponamento pode ser opcionalmente adicionado para o segundo reagente.

[00059] Nas modalidades da presente invenção, o segundo reagente preferivelmente tem a pressão osmótica de, sem limitação, 20 a 150 mOsm/kg a fim de efetivamente formar a lise de eritrócitos.

[00060] Nas modalidades da presente invenção, o segundo reagente pode ser obtido dissolvendo os tensoativos, o ácido orgânico aromático ou um sal dos mesmos e opcionalmente o agente de tamponamento para um solvente apropriado de maneira a obter a concentração do ácido orgânico aromático descrito acima e ajustando o pH do mesmo com NaOH, HCl e similares.

[00061] O solvente não é particularmente limitado até ele poder dissolver os componentes acima e poder incluir, por exemplo, água, solventes orgânicos e misturas dos mesmos. Os solventes orgânicos podem incluir, por exemplo, alcoóis, etileno glicol, DMSO e similares.

[00062] O kit de reagentes, descrito aqui acima, contém um primeiro reagente distinto e segundo reagente. Entretanto, a presente invenção não é limitada a esta modalidade e pode abranger um reagente tendo as composições do primeiro reagente e do segundo reagente sem limitação particular.

Método para classificar e contar leucócitos

[00063] Usando o kit de reagentes para classificar leucócitos ou o reagente, leucócitos em amostras biológicas podem ser classificados e contados. O método para classificar e contar leucócitos usando o kit de reagentes da presente invenção (de agora em diante simplesmente referido como o "método") é de agora em diante descrito.

[00064] No método da presente invenção, uma amostra de medição é preparada misturando uma amostra biológica, o primeiro reagente e o segundo reagente no kit de reagentes a fim de formar a lise de eritrócitos na amostra biológica e ingir o ácido nucleico de leucócitos (etapa de preparação).

[00065] Nas modalidades da presente invenção, a amostra biológica e o primeiro reagente ou o segundo reagente são misturados em uma proporção de volume da amostra biológica: o primeiro ou segundo reagente de 1 : 1 a 1 : 1.000, mais preferivelmente 1 : 10 a 1 : 100. A proporção da mistura do primeiro e segundo reagentes para a amostra biológica é de tal maneira que a proporção de volume da amostra biológica : a mistura é 1 : 5 a 1 : 1.000, mais preferivelmente 1 : 10 a 1 : 100. Misturando a amostra biológica e o primeiro e segundo reagentes na proporção acima possibilita imediata formação da lise de eritrócitos e coloração do ácido nucleico de leucócitos. Quando a amostra biológica contém leucócitos anormais, ácido nucleico de leucócitos anormais é também corado. Uma quantidade suficiente da amostra biológica usada para a medição é cerca de 5 a 500 μL.

[00066] Na etapa de preparação, a amostra biológica, o primeiro reagente e o segundo reagente podem ser misturados em qualquer ordem sem limitação. Por exemplo, o primeiro reagente e o segundo reagente podem ser misturados e depois a mistura obtida pode ser misturada com a amostra biológica. Alternativamente, o segundo reagente pode ser misturado com a amostra biológica e depois a mistura obtida pode ser misturada com o primeiro reagente. Nas modalidades da presente invenção, misturar por qualquer ordem pode prover resultados similares.

[00067] Nas modalidades da presente invenção, é preferível que a amostra biológica, o primeiro reagente e o segundo reagente sejam misturados antes da incubação a uma temperatura de 15 a 50C, preferivelmente 30 a 45 C por 5 a 120 segundos, preferivelmente 5 a 30 segundos.

[00068] No método da presente invenção, a luz é aplicada para a amostra de medição preparada na etapa anterior para obter informação da luz dispersa e informação de fluorescência (etapa de medição).

[00069] Nas modalidades da presente invenção, a etapa de medição é preferivelmente realizada em um citômetro de fluxo. Nas medições usando um citômetro de fluxo, a luz é aplicada para colorir leucócitos quando eles passam através de uma célula de fluxo e o citômetro de fluxo, de tal maneira que a informação da luz dispersas e a informação de fluorescência podem ser obtidas como signais gerados a partir dos leucócitos.

[00070] Nas modalidades da presente invenção, a informação da luz dispersa não é particularmente limitada até o ponto em que a luz que é dispersa pode ser medida em citômetros de fluxo convencionais comercialmente disponíveis. A informação da luz dispersa pode incluir, por exemplo, uma largura de pulso e uma intensidade da luz dispersa tal como a luz dispersa anterior (por exemplo, ângulo de receber luz de cerca de 0 a 20 graus), luz dispersa lateral (um ângulo recebendo luz de cerca de 90 graus) e similares.

[00071] Sabe-se a na técnica que a luz dispersa reflete informações internas de células tais como núcleos e grânulos e a luz dispersa adiante reflete informação sobre o tamanho de células. Nas modalidades da presente invenção, a informação da luz dispersa é preferivelmente uma intensidade de luz dispersa lateral.

[00072] A informação da fluorescência é informação obtida aplicando luz de excitação tendo um comprimento de onda apropriado para os leucócitos coloridos e medindo fluorescência excitada. A fluorescência é emitida a partir de ácido nucleico e similares, nas células coradas com o corante fluorescente no primeiro reagente. O comprimento de onda de recebimento pode ser apropriadamente selecionado dependendo do corante fluorescente no primeiro reagente.

[00073] Nas modalidades da presente invenção, a fonte de luz de um citômetro de fluxo não é particularmente limitada e pode ser uma fonte de luz tendo um comprimento de onda apropriado para excitação do corante fluorescente. A fonte de luz pode ser, por exemplo, um laser semicondutor vermelho, um laser semicondutor azul, um laser de argônio, um laser He-Ne, uma lâmpara de arco de mercúrio e similares. Os lasers semicondutores são particularmente apropriados por causa de ser economicamente não dispendiosa comparados aos lasers a gás.

[00074] No método da presente invenção, leucócitos na amostra biológica são classificados e contados com base nasinformações de luz dispersa e na informação de fluorescência (etapa de classificação e contagem).

[00075] Nas modalidades da presente invenção, leucócitos são preferivelmente classificados e contados preparando um gráfico de distribuição tendo dois eixos de informação de luz dispersa lateral e informação de fluorescência e analisando as formações de distribuição obtidas em u m software de análise apropriado. Por exemplo, quendo uma formação de distribuição é gerada tendo uma intensidade de luz dispersa lateral no eixo X e uma intensidade fluorescente no eixo Y, como mostrado no painel direito na FIG. 1, leucócitos são classificados em 5 grupos (aglomerados) de linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos. Um software de análise depois provê janelas que envolvem os respectivos grupos na formação do gráfico de distribuição e permite a contagem do número de células naquele lugar.

[00076] Na FIG. 1, leucócitos são classificados em 5 aglomerados. Entretanto, a presente invenção não é limitada a esta modalidade e, por exemplo, neutrófilos e basófilos podem ser classificados como um aglomerado para classificar leucócitos em 4 aglomerados.

[00077] Nas modalidades da presente invenção, a amostra biológica pode ser uma amostra possivelmente contendo leucócitos anormais. Como descrito acima, o kit de reagentes da presente invenção possibilita a separação da região em que o sinal de linfócitos normais aparece e a região em que o sinal de monócitos normais aparece nos gráficos de distribuição detectados em um citômetro de fluxo. Desse modo o método da presente invenção possibilita a detecção de células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciar até no meio entre leucócitos normais contidos em uma amostra biológica na etapa de classificar e contar leucócitos. Células de blasto e linfócitos atípicos podem ser differenciados, por exemplo, por preliminarmente definir nos gráficos de distribuição a região em que o sinal de células de blasto aparece e a região em que o sinal de linfócitos atípicos aparece. Por exemplo, quando um sinal é detectado na região preliminarmente definida em que o sinal de células de blasto aparece, é determinado que a amostra biológica contém células de blasto, e quando um sinal é detectado na região preliminarmente definida em que o sinal de linfócitos atípicos aparece, é determinado que a amostra biológica contém linfócitos atípicos, desse modo possibilitando a detecção de células de blasto e linfócitos atípicos.

[00078] Nas modalidades da presente invenção, células de blasto podem incluir, por exemplo, mieloblastos.

[00079] A presente invenção é ainda descrita em detalhes de agora em diante por meio de exemplos que não limitam a presente invenção.

Exemplos Exemplo 1

[00080] No presente Exemplo, a concentração do ácido orgânico aromático no segundo reagente e o pH do segundo reagente são estudados a fim de discriminar a posição em que o sinal de linfócitos normais aparece a partir da posição em que o sinal de monócitos normais aparece em gráficos de distribuição.

[00081] O primeiro reagente usado foi Stromatolyzer 4DS (Sysmex Corporation). O segundo reagente foi preparado misturando cloreto de dodeciltrimetilamônio (LTAC: Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), cetil éter de polioxietileno (30) (BC30TX: Nikko Chemicals Co., Ltd.), ftalato de hidrogênio de potássio (de agora em diante referido como ftalato: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e EDTA-2K (Chubu Chelest K.K.) de acordo com as composições mostradas na Tabela 1 a seguir. O pH foi ajustado com uma solução de NaOH.

[00082] LTAC é um tensoativo catiônico, BC30TX é um tensoativo não iônico e o ftalato é um ácido orgânico aromático. Tabela 1

[00083] Como mostrado na Tabela 1, somente os segundos reagentes A e B contêm HEPES (Dojindo Laboratories) como um tampão. Os segundos reagentes A e B correspondem aos agentes hemolíticos dos reagenes de classificzação de leucócito convencional.

[00084] As amostras biológicas usadas no presente Exemplo são espécimens de sangue (18 espécimens) obtidos de 18 sujeitos saudáveis. Os espécimens são respectivamente referidos como espeécimes Nos. 1 a 18.

[00085] Uma amostra de medição foi preparada misturando 20 μL de um espécime, 20 μL do primeiro reagente e 1000 μL do segundo reagente e incubando a 40°C por 20 segundos. Amostras de medição foram preparadas para espécimens Nos. 1 a 10 com o segundo reagentes A até D e G até Q e para espécimens Nos. 11 a 18 com os segundos reagentes B e E até G.

[00086] Luz foi aplicada para as amostras de medição em um citômetro de fluxo (de agora em diante referido como um FCM) e o sinal de luz lateral dispersa, o sinal de luz dispersa anterior e o sinal de fluorescência gerados das células nas amostras foram detectados. Os sinais obtidos foram analisados para medir leucócitos normais nas amostras de medição. O FCM usado tinha uma fonte de luz de um laser semiconductor vermelho tendo um comprimento de onda de excitação de 633 nm. O sinal de fluorescência detectado era fluorescência tendo um comprimento de onda de 600 nm oo acima (fluorescência vermelha).

[00087] Quando um gráfico de distribuição é preparado para cada amostra de medição tendo a intensidade de luz dispersa lateral no eixo X e a intensidade de fluorescência no eixo Y, leucócitos formam aglomerados para diferentes tipos de células. Esses aglomerados são analisados com um software de análise apropriado para identificar os leucócitos aglomerados e calcular o número of células nos respectivos aglomerados de leucócitos, a proporção das células nos respectivos aglomerados de leucócitos relativos ao número total de células e a posição do centroide dos respectivos aglomerados de leucócitos. A partir de posições do centroide dos respectivos aglomerados de leucócitos, a distância entre os centroides (de agora em diante referido como a distância centroide) é calculada.

[00088] Como uma referência para a distância centroide, a FIG. 1 é provida. O painel da esquerda na FIG. 1 é um gráfico de distribuição obtido medindo um espécime de um sujeito saudável com o primeiro reagente acima e o segundo reagente O. O painel da esquerda na FIG. 1 mostra que leucócitos normais no espécime foram classificados em 5 tipos, isto é, linfócitos, monócitos, neutrófilos, eosinófilos e basófilos. No painel da direita da FIG. 1, os respectivos aglomerados de células do sangue são identificados e os centroides (•) para os aglomerados de linfócitos e monócitos são indicados. A distância entre dois símbolos (•) corresponde à distância centroide.

[00089] A distância centróide média foi 36,4 quando 10 espécimens (espécime Nos. 1 a 10) foram medidos com o segundo reagente A (concentração de ftalato: 20 mM, pH 7,2). A distância centroide média foi 38,3 quando 18 espécimens (espécime Nos. 1 a 18) foram medidos com o segundo reagente B (concentração de ftalato: 20 mM, pH 7,0).

[00090] As distâncias centroides médias obtidas quando 10 espécimens (espécime Nos. 1 a 10) foram medidas com os segundos reagentes C, D e H até Q, e as distâncias centroides médidas obtidas quando 18 espécimens (espécime Nos. 1 a 18) foram medidos com o segundo reagente G, e a distância centróide média obtida quando 8 espécimens (espécime Nos. 11 a 18) foram medidos com os segundo reagentes E e F são mostrados na Tabela 2 a seguir. As distâncias centroides médias mostradas na Tabela 2 são classificadas de acordo com a concentração de ftalato e pH do segundo reagente e mostradas na Tabela 3 a seguir. Tabela 2

Tabela 3

[00091] A partir da Tabela 3, é descoberto que quando o segundo reagente tem certas combinações da concentração de ftalato e pH, a região em que o sinal de monócitos aparece é significantivamente discreta a partir da região em que o sinal de linfócitos aparece comparado aos casos em que os segundos reagentes convencionais A e B são usado. Tais combinações da concentração de ftalato e pH são: a concentração de ftalato de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM e pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,4; e a concentração de ftalato de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM e pH não inferior a 5,5 e não superior a 7,0.

Exemplo 2

[00092] No presente Exemplo, um espécime de sangue contendo linfócitos morfologicamente normais (de agora em diante referido como espécime anormal 1) foi medido com o primeiro reagente e o segundo reagente B, G ou O descritos no Exemplo 1. A medição por FCM e o cálculo da distância centroide foram realizados da mesma maneira que no Exemplo 1.

[00093] Os gráficos de distribuição (eito X: intensidade de luz dispersa lateral, eito Y: intensidade de fluorescência) gerados com base nas medições por FCM usando os reagentes são mostrados na FIG. 2.

[00094] A distância centroide foi 62,9 quando o espécime anormal 1 foi medido com o segundo reagente B (concentração de ftalato: 20 mM, pH 7,0). A distância centroide foi 69,7 quando o espécime anormal 1 foi medido com o segundo reagente G (concentração de ftalato: 20 mM, pH 6,.0). A distância centroide foi 80,6 quando o espécime anormal 1 foi medido com o segundo reagente O (concentração de ftalato: 40 mM, pH 6,0).

[00095] O espécime anormal 1 usado no presente Exemplo é um espécime que provê o sinal de linfócitos morfologicamente normais em uma região similar como o sinal de linfócitos normais. Desta maneira, o aglomerado de linfócitos significativamente se expande nos gráficos de distribuição. Quando o espécime anormal 1 é medido com o segundo reagente B que é um agente hemolítico convencional, o aglomerado contendo linfócitos morfologicamente normais sobrepõe- se com o aglomerado de monócitos, e desse modo é difícil detectar linfócitos morfologicamente normais com exatidão.

[00096] Por outro lado, medicões com o segundo reagente G ou O do kit de reagentes da presente invenção permitem o aglomerado de linfócitos ser significantivamente separado do aglomerado de monócitos. Desta maneira mesmo quando espécimens anormais são medidos como no presente Exemplo, o aglomerado contendo linfócitos morfologicamente normais pode ser separado do aglomerado de monócitos com exatidão. Por conseguinte, linfócitos morfologicamente normais podem ser detectados com maior exatidão do que reagentes convencionais.

Exemplo 3

[00097] No presente Exemplo, uma amostra biológica contendo linfócitos morfologicamente normais (de agora em diante referido como espécime anormal 2) e uma amostra biológica contendo mieloblástos (de agora em diante referido como espécime anormal 3) foram medidos com o primeiro reagente e o segundo reagente B, I, K, M ou O descritos no Exemplo 1.

[00098] As amostras biológicas usadas no presente Exemplo são dois espécimens de sangue que não possibilitam determinação para leucócitos normais quewr sejam linfócitos morfologicamente normais ou mieloblástos nas medições usando reagentes convencionais. Isto resulta a partir do fato de que ambos os sinais de linfócitos morfologicamente normais e de mieloblástos aparecem em torno da mesma região nos gráficos de distribuição. A medição por FCM e o cálculo da distância centroide foram realizados da mesma maneira como no Exemplo 1.

[00099] Os gráficos de distribuição (eito X: intensidade de luz dispersa lateral, eixo Y: intensidade de fluorescência) gerados com base nas medições por FCM usando os reagentes são mostrados nas FIGs. 3 e 4.

[000100] A partir da FIG. 3, descobre-se que quando o espécime anormal 2 é medido com o segundo reagente B, que é um reagente convencional, o aglomerado de linfócitos morfologicamente normais no espécime aparece a partir da região entre o aglomerado de linfócitos e o aglomerado de monócitos para uma região acima daquela região (no sentido da direção de intensidade de fluorescência maior). A partir da FIG. 4, é também descoberto que quando o espécime anormal 3 é medido com o segundo reagente B, o aglomerado de mieloblástos no espécime também aparece em uma região similar a do aglomerado de linfócitos morfologicamente normais contidos no espécime anormal 2.

[000101] Isto é, ambos os aglomerados de leucócitos normais contidos nos espécimens anormals 2 e 3 se sobrepõem parcialmente com os aglomerados de linfócitos e monócitos. Os aglomerados de leucócitos normais nos espécimens anormais 2 e 3 também mostram características similares de distribuição nos gráficos de distribuição.

[000102] Desse modo os resultados das medições usando o segundo reagente B, que é um reagente convencional, não permitem a determinação sobre quais dos linfócitos morfologicamente normais e mieloblástos os espécimens contêm. Ainda, o aglomerado de linfócitos morfologicamente normal se sobrepõem parcialmente com os aglomerados de linfócitos e monócitos, e desse modo é difícil classificar e contar linfócitos e monócitos normais com exatidão.

[000103] A partir das FIGs. 3 e 4, é descoberto que nas medições usando o segundo reagente I, K, M ou O, que é o segundo reagente do kit de reagentes, da presente invenção, o aglomerado de linfócitos e o aglomerado de monócitos aparecem separados nos gráficos de distribuição. Por conseguinte, linfócitos morfologicamente anormais contidos no espécime anormal 2 aparecem desviados na direção do aglomerado de linfócitos, resultando em separação precisa dos mesmos a partir do aglomerado de monócitos. Além do mais, mieloblastos contidos no espécime anormal 3 aparecem desviados na direção do aglomerado de monócitos, resultando em separação precisa dos mesmos do aglomerado de linfócitos.

[000104] Desse modo, as medições com o segundo reagente do kit de reagentes da presente invenção permitem diferença evidente entre a posição em que linfócitos morfologicamente anormais aparecem e a posição em que mieloblástos aparecem, e desse modo permitem determinação exata sobre o tipo de leucócitos normais contidos em espécimens. Além disso, as medições com o reagente da presente invenção possibilitam descriminação precisa do aglomerado de leucócitos normais a partir do aglomerado de linfócitos ou do aglomerado de monócitos, e desse modo possibilitam classificação e contagem mais precisas de monócitos normais ou linfócitos normais comparados com os reagentes convencionais.

Exemplo 4

[000105] No presente Exemplo, amostras biológicas contendo linfócitos morfologicamente anormais foram medidas com o primeiro reagente e o segundo reagente A ou O descritos no Exemplo 1. Os linfócitos morfologicamente anormais contidos na amostra biológica no presente exemplo foram confirmados como sendo linfócitos atípicos através de exames morfológicos.

[000106] As amostras biológicas usadas no presente exemplo são dois espécimens de sangue (de agora em diante respectivamente referidos como espécime anormal 4 e espécime anormal 5) que não permitem a determinação para leucócitos normais que eles sejam linfócitos atípicos ou células de blasto nas medições usando reagentes convencionais. Isto resulta, como descrito acima, do fato de que ambos os sinais de linfócitos atípicos e de células de blasto aparecerem em torno da mesma região nos gráficos de distribuição. A medição por FCM foi realizada da mesma maneira como no Exemplo 1.

[000107] Os gráficos de distribuição (eixo X: intensidade de luz dispersa lateral, eixo Y: intensidade de fluorescência) gerados com base nas medições por FCM usando os reagentes são mostrados na FIG. 5. Descobriu-se que quando os espécimens anormais 4 e 5 são medidos com o segundo reagente A, que é um reagente convencional, o aglomerado de linfócitos atípicos nos espécimens aparece a partir de uma região entre o aglomerado de linfócitos de o aglomerado de monócitos para uma região acima daquela região (para a direção da intensidade de fluorescência mais alta). Devido aglomerado de células de blasto também aparecer em uma região quase similar a essa (não mostrada), o aglomerado de linfócitos atípicos não pode ser detectado pela diferenciação dos mesmos do aglomerado de células de blasto.

[000108] Por outro lado, quando os espécimens anormals 4 e 5 são medidos com o segundo reagente O, o aglomerado de monócitos foi separado do aglomerado de linfócitos como também o aglomerado de linfócitos atípicos apareceu desviado em direção ao aglomerado de linfócitos. Como mostrado na FIG. 4 a respeito do Exemplo 3, quando espécimens anormais contendo células de blasto são medidos com o segundo reagente O, células de blasto aparecem desviadas para o aglomerado de monócitos. Desta maneira, o aglomerado de linfócitos atípicos pode ser detectado pela diferenciarão dos mesmos a partir do aglomerado de células de blasto.

Exemplo 5

[000109] No presente Exemplo, uma amostra biológica foi medida com o primeiro reagente e, como o segundo reagente, o segundo reagente A ou G descrito no Exemplo 1, ou um segundo reagente R ou S contendo ftalato ou ácido benzoico como o ácido orgânico aromático. Os segundos reagentes R e S foram preparados misturando LTAC, BC30TX, o ftalato, ácido benzoico e EDTA-2K de maneira a obter as composições mostradas na Tabela 4 a seguir. Tabela 4

[000110] A amostra biológica usada no presente Exemplo é um espécime de sangue obtido de um sujeito saudável. A medição por FCM e o cálculo da distância centroide foram realizados da mesma maneira como no

Exemplo 1

[000111] Os gráficos de distribuição (eixo X: intensidade de luz dispersa lateral, eixo Y: intensidade de fluorescência) gerados com base nas medições por FCM usando os reagentes mostrados na FIG. 6. A distância centroide mediante medições do espécime usando os reagentes e a concentração de ácido orgânico aromático e pH dos reagentes são mostrados na Tabela 5 a seguir. Tabela 5

[000112] A partir da Tabela 5 e FIG. 6, descobre-se que as medições com o segundo reagente ainda contendo, em adição ao ftalato, ácido benzoico como o ácido orgânico aromático, pode ainda aumentar a distância centroide entre o aglomerado de monócitos e o aglomerado de linfócitos.

Claims

1. Método para classificar e contar leucócitos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: preparar uma amostra de medição misturando uma amostra biológica; um primeiro reagente contendo um corante fluorescente capaz de marcar ácido nucleico; e um segundo reagente contendo tensoativos catiônicos e não iônicos para formar a lise de eritrócitos e danificar membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeável para o corante fluorescente e um ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM; aplicar luz para a amostra de medição preparada e obter informações da luz dispersa e informação da fluorescência gerada desse modo; e baseado nas informações da luz dispersa obtidas e informação de fluorescência, classificar os leucócitos na amostra biológica e detectar células de blasto e linfócitos atípicos por diferenciar até no meio; em que, quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,4, e quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5e5 e não superior a 7,0.

2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico aromático é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em um ácido carboxílico aromático, um ácido sulfônico aromático e um sal dos mesmos.

3. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 40 mM e não mais do que 50 mM.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,2.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a informação da luz dispersa é a informações de luz dispersa lateral.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tensoativo catiônico é um tensoativo de sal de amônio quaternário ou um tensoativo de sal de piridínio.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o tensoativo não iônico é um tensoativo não iônico de polioxietileno representado pela fórmula geral (VI) a seguir:

em que R1 é uma alquila, alquenila ou grupo alquinila tendo 8 a 25 átomos de carbono; R2 é um átomo de oxigênio, -COO- ou

; e n é um número inteiro de 10 a 50.

8. Kit de reagentes para classificar leucócitos, caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro reagente contendo um corante fluorescente capaz de colorir o ácido nucleico; e um segundo reagente contendo tensoativos catiônicos e não iônicos para formação da lise de eritrócitos e danificando membranas de células de leucócitos de maneira a ser permeável para o corante fluorescente e um ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM, em que, quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,4, e quando o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 7,0.

9. Kit de reagentes de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ácido orgânico aromático é pelo menos um selecionado a partir do grupo consistindo em ácido carboxílico aromático, um ácido sulfônico aromático e um sal dos mesmos.

10. Kit de reagentes de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o segundo reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 40 mM e não mais do que 50 mM.

11. Kit de reagentes de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o segundo reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,2.

12. Kit de reagentes de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o tensoativo catiônico é um tensoativo de sal de amônio quaternário ou um tensoativo de sal de piridínio.

13. Kit de reagentes de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o tensoativo não iônico é um tensoativo não iônico de polioxietileno representado pela fórmula geral (VI) a seguir:

em que R1 é uma alquila, alquinila ou grupo alquinila tendo 8 a 25 átomos de carbono; R2 é um átomo de oxigênio, -COO- ou

; e n é um número inteiro de 10 a 50.

14. Reagente para classificar leucócitos, caracterizado pelo fato de que compreende um corante fluorescente capaz de colorir ácido nucleico, um tensoativo catiônico, um tensoativo não iônico e um ácido orgânico aromático, em que o reagente contém o ácido orgânico aromático em uma concentração de não menos do que 20 mM e não mais do que 50 mM, e em que, quando o reagente contem o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 20 mM e menos do que 30 mM, o reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 6,4, e quando o reagente contém o ácido orgânico aromático a uma concentração de não menos do que 30 mM e não mais do que 50 mM, o reagente tem pH não inferior a 5,5 e não superior a 7,0.