CN108318408B - 白细胞分类用样本的预处理试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
一种白细胞分类用样本的预处理试剂，含有溶血剂，所述溶血剂的活性成分主要由有机酸及高分子非离子表面活性剂组成，所述有机酸选自甲酸、乙酸及丙酸中的至少一种，所述高分子非离子表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮及聚乙二醇中的至少一种。该样本预处理试剂用于处理用于白细胞分类的样本时，其红细胞裂解效率高、白细胞破坏性小且处理后样本保存时间长。
Description
技术领域
本发明涉及检测分析技术领域，特别是涉及一种白细胞分类用样本的预处理试剂及方法。
背景技术
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是七十年代发展起来的一种集光学、流体、电子、机械、计算机、免疫等多学科于一体的分析技术。目前在医学领域主要用于淋巴细胞亚群分析和白血病免疫分型等项目的检测。在白细胞分类分析时，临床血液样本或骨髓样本中往往含有大量的红细胞，检测时它们会增加细胞信号的背景，干扰白细胞的分类，因此在分析前要使用溶血剂将样本中的红细胞予以裂解，以消除红细胞对于流式细胞分析的影响。
目前已公开的一种用于流式细胞分析的单一溶血剂，主要由甲醛等短链的脂肪醛、柠檬酸钠等弱酸性的碱或碱土金属盐以及二甘醇等多羟基醇组成。由于弱酸性的碱土金属盐裂解红细胞的能力较弱，因此该溶血剂的溶血时间较长，通常要大于10分钟，溶血剂处理后样本的细胞碎片也较多，后续还需洗涤才能完全去除。此外，由于低浓度甲醛具有挥发性，因此溶血剂开瓶后的保存时间也较短，通常只有30天。为了防止低浓度甲醛挥发较快，基于该专利的商品化溶血剂被制成了10倍的浓缩液，在使用前需要用水进行稀释，才能使用。
另一用于全血白细胞分析的溶血系统，该系统包括溶血剂和终止剂两种试剂。溶血剂的主要成分包括甲酸等强酸和皂苷，终止剂的成分主要是碱土金属盐。该溶血系统可以在5-10秒内完成红细胞的裂解。但由于溶血剂的强酸对白细胞过度破坏，所以会导致细胞散射光信号的变异系数(CV％)较大。
生物学实验中的常用溶血剂的主要成分就是氯化铵。它的最主要优点是溶血力弱，对白细胞的结构和功能破坏小。但它的缺点也很明显，即溶血时间过长，通常要15～30分钟。另一单一溶血剂，主要成分包括氯化铵等非四价铵盐、甲醛等短链脂肪醛、非磷酸盐缓冲液以及皂苷等表面活性剂等。由于使用的氯化铵和皂苷的红细胞裂解能力较弱，因此在室温条件下需要更长的溶血时间，约20秒-10分钟。若要进一步缩短溶血剂时间，还需配备38±2℃的孵育设备。
已公开的另一种流式细胞分析试剂，其成分主要有脂蛋白、皂苷等红细胞裂解剂和防腐剂。由于皂苷的红细胞裂解能力较弱，因此溶血剂处理后样本的细胞碎片较多，后续还需洗涤才能完全去除。此外，脂蛋白的来源有限，价格也较高。
发明内容
基于此，有必要提供一种红细胞裂解效率高、白细胞破坏性小且处理后样本保存时间长的白细胞分类用样本的预处理试剂及方法。
一种白细胞分类用样本的预处理试剂，含有溶血剂，所述溶血剂的活性成分主要由有机酸及高分子非离子表面活性剂组成，所述有机酸选自甲酸、乙酸及丙酸中的至少一种，所述高分子非离子表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮及聚乙二醇中的至少一种。
该白细胞分类用样本的预处理试剂的溶血剂创造性地将有机酸和高分子非离子表面活性剂结合使用。采用上述有机酸裂解红细胞的效率高，可在5～10s的短时间内将红细胞完全裂解，溶血剂处理后的样本的细胞碎片很少。同时，相对于低分子非离子表面活性剂，上述高分子非离子表面活性剂不仅具有更好的成膜性，其可在白细胞表面形成薄膜，避免有机酸在裂解红细胞时对白细胞的过度破坏，有利于保持白细胞结构和功能的完整性，且还具有更好的增溶效果，促进红细胞碎片的溶解，进一步减少红细胞对流式细胞术检测的干扰，此外，上述高分子非离子表面活性剂还具有更好的稳定性，可作为稳定剂，避免有机酸受氧化，增强溶血剂组分的长期稳定性。因此，经该溶血剂处理后的样本放置24小时后，也不会出现大量白细胞破坏和裂解的现象，该处理后的样本在进行白细胞分类时细胞散射光信号的变异系数(CV％)得到改善。因此，该样本预处理试剂用于处理用于白细胞分类的样本时，其红细胞裂解效率高、白细胞破坏性小且处理后样本保存时间长。
在其中一个实施例中，在所述溶血剂中，所述有机酸的浓度为0.5～5mL/L。
在其中一个实施例中，在所述溶血剂中，所述高分子非离子表面活性剂的浓度为0.1～10g/L。
在其中一个实施例中，所述聚乙烯吡咯烷酮的K值范围为30～120。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000及聚乙二醇20000中的至少一种。
在其中一个实施例中，还包括终止剂，所述终止剂的活性成分主要由碱金属盐组成。
在其中一个实施例中，所述碱金属盐选自浓度为2～10g/L的Na2CO3、浓度为20～40g/L的Na2SO4及浓度为10～30g/L的NaCl中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述终止剂的活性成分还包括甲醛供体防腐剂。
在其中一个实施例中，所述甲醛供体防腐剂选自浓度为5～50g/L的咪唑烷基脲及浓度为2～40g/L的双咪唑烷基脲中的至少一种。
一种白细胞分类用样本的预处理方法，使用上述样本预处理试剂，包括以下步骤：
将外周血样本与所述溶血剂混匀孵育，然后加入终止剂终止反应，得到预处理后的白细胞分类用样本。
附图说明
图1为预处理后的白细胞分类用样本1立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图；
图2为预处理后的白细胞分类用样本3立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图；
图3为预处理后的白细胞分类用样本4立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图；
图4为预处理后的白细胞分类用样本5立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的CD45-SSC散点图和CD3-CD4散点图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
一实施方式的白细胞分类用样本的预处理试剂，含有溶血剂。
溶血剂的活性成分主要由有机酸及高分子非离子表面活性剂组成，有机酸选自甲酸、乙酸及丙酸中的至少一种，高分子非离子表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及聚乙二醇(PEG)中的至少一种。
有机酸是一种常用的溶血剂，特别是甲酸、乙酸和丙酸等强有机酸，即使在较低浓度的条件下，也能在短时间内将红细胞完全溶解，消除红细胞对流式细胞术检测的干扰。但有机酸作为溶血剂也有一个缺点，其溶血力过强，会造成白细胞过度破坏。此外，有机酸还具有一定的消毒、防腐作用，从而可以抑制溶血剂中微生物的生长，保持溶血剂性质的稳定。非离子表面活性剂由于其不会与抗体发生相互作用，因此可以用于流式细胞术中的溶血剂。目前常用的非离子表面活性剂为皂苷、曲拉通、吐温等。然而非离子表面活性剂的红细胞裂解能力较弱，因此其溶血时间较长。
而本申请人创造性地将有机酸和高分子非离子表面活性剂结合使用，并选择上述强有机酸作为有机酸，选择聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及聚乙二醇(PEG)作为高分子非离子表面活性剂，其不仅具有一定的溶血能力，还具有成膜、粘结、吸湿、增溶和稳定等作用。采用上述有机酸裂解红细胞的效率高，可在5～10s的短时间内将红细胞完全裂解，溶血剂处理后的样本的细胞碎片很少。同时，相对于低分子非离子表面活性剂，上述高分子非离子表面活性剂，不仅具有更好的成膜性，其可在白细胞表面形成薄膜，避免有机酸在裂解红细胞时对白细胞的过度破坏，有利于保持白细胞结构和功能的完整性，且还具有更好的增溶效果，促进红细胞碎片的溶解，进一步减少红细胞对流式细胞术检测的干扰，此外，上述高分子非离子表面活性剂还具有更好的稳定性，可作为稳定剂，避免有机酸受氧化，增强溶血剂组分的长期稳定性。因此，经该溶血剂处理后的样本放置24小时后，也不会出现大量白细胞破坏和裂解的现象，该处理后的样本在进行白细胞分类时细胞散射光信号的变异系数(CV％)得到改善。因此，该样本预处理试剂用于处理用于白细胞分类的样本时，其红细胞裂解效率高、白细胞破坏性小且处理后样本保存时间长。
进一步地，在溶血剂中有机酸的浓度通常控制在0.5～5.0mL/L，优选在0.5～3.0mL/L。值得说明的是，此处有机酸为纯酸。过低的浓度会导致溶血剂的溶血能力减弱，红细胞溶解不充分，生成的大量碎片干扰检测。过高的浓度会导致溶血剂的溶血能力过强，样本中除了红细胞被溶解外，大量白细胞也会被溶解和破坏。在该浓度范围能进一步提高红细胞裂解效率、减小白细胞破坏性且保证处理后样本保存时间。更优选地，有机酸的浓度为1.0～2.0mL/L。
进一步地，在溶血剂中，高分子非离子表面活性剂的浓度为0.1～10g/L，优选在0.5～5.0g/L。过低的浓度无法避免白细胞被破坏过度的问题，特别是处理后的样本在放置24小时后，会有大量白细胞被溶解。过高的浓度则会抑制溶血剂的溶血能力，导致红细胞溶解不完全，细胞碎片增多。在该浓度范围能进一步提高红细胞裂解效率、减小白细胞破坏性且保证处理后样本保存时间。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按其分子量大小分为多种等级，通常以K值表示，如PVP K-15、PVP K-30、PVP K-60、PVP K-90、PVP K-120等。通常K值越大，其粘度也越大，成膜性也越强。具体地，在本溶血剂中，通常选择K值30～120之间的PVP。更具体地，聚乙烯吡咯烷酮可为PVP K-15、PVP K-30、PVP K-60、PVP K-90、PVP K-120等。进一步地，聚乙烯吡咯烷酮为PVP K-60。
聚乙二醇(PEG)是数均分子量在约200～20000的乙二醇高聚物的总称，包括PEG200、PEG1000、PEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG10000、PEG20000等多个品种。通常数均分子量<700的品种为粘稠液体，700～900为半固体，1000～1500为蜡状，2000以上为固体。具体地，在本溶血剂中，聚乙二醇通常选择固态的PEG4000、PEG6000、PEG10000及PEG20000中的至少一种，这些聚乙二醇的成膜作用较好。进一步地，聚乙二醇优选为PEG-4000。
进一步地，在一实施例中，高分子非离子表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇的组合。更进一步地，高分子非离子表面活性剂为聚乙烯吡咯烷酮K60和聚乙二醇4000的组合。
在其中一个实施例中，还包括终止剂。终止剂的主要作用是终止溶血剂的溶血作用。可理解，也可将上述溶血剂与其他终止剂结合使用。具体地在本实施例中，终止剂的活性成分主要由碱金属盐组成。
进一步地，碱金属盐选自Na2CO3、Na2SO4及NaCl中的至少一种。且在终止剂中，Na2CO3的浓度为2～10g/L，Na2SO4的浓度为20～40g/L，NaCl的浓度为10～30g/L。
更进一步地，碱金属盐选自Na2CO3、Na2SO4及NaCl的组合，且在终止剂中，Na2CO3的浓度为2～10g/L，Na2SO4的浓度为20～40g/L，NaCl的浓度为10～30g/L。
在其中一个实施例中，本发明提供的终止剂的活性成分还包括甲醛供体防腐剂。甲醛供体防腐剂可通过缓慢释放极少量的游离甲醛，从而发挥抑制微生物的作用。同时，释放的甲醛也具有固定细胞的作用，抑制溶血剂对细胞的过度破坏。
进一步地，甲醛供体防腐剂选自咪唑烷基脲及双咪唑烷基脲中的至少一种。在终止剂中，咪唑烷基脲的浓度为5～50g/L，双咪唑烷基脲的浓度为2～40g/L。
本发明还提供了一实施方式的白细胞分类用样本的预处理方法，使用上述样本预处理试剂，包括以下步骤：
将外周血样本与溶血剂混匀孵育，然后加入终止剂终止反应，得到预处理后的白细胞分类用样本。
外周血样本为使用K2-EDTA或K3-EDTA抗凝静脉血。可理解，终止剂可采用上述终止剂，也可为其他终止剂。采用上述终止剂的效果更优。
该白细胞分类用样本的预处理方法，使用上述样本预处理试剂，外周血样本与溶血剂混匀孵育的时间只需5～10秒，即可将红细胞基本完全裂解，避免了红细胞对白细胞分类的干扰；且样本在预处理24h后仍然保持性能稳定，也不会出现大量白细胞破坏和裂解的现象。
该白细胞分类用样本的预处理试剂及方法提高了采用流式细胞术进行白细胞分类时的准确性。具体地，用于流式细胞术进行白细胞分类时可将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个明显的亚群，且样本在预处理24h后再进行流式细胞术检测，不会发生中性粒细胞明显下降的情况。
以下为具体实施例。
对比例1～2和实施例1～5
对比例1～2和实施例1～5分别按表1中的配方配制溶血剂和终止剂，分别得到实施例1～4的白细胞分类用样本的预处理试剂。其中，所用的甲酸和乙酸均为纯酸。
表1
然后将对比例1～2和实施例1～5的白细胞分类用样本的预处理试剂分别对样本1～7进行预处理。预处理步骤如下：
室温条件下，取50.0μL新鲜的K3-EDTA抗凝外周全血，分别与600μL对比例1～2和实施例1～5的溶血剂混匀孵育5秒后，再分别加入300μL对比例1～2和实施例1～5的终止剂终止反应，分别得到预处理后的白细胞分类用样本1～7。
将预处理后的白细胞分类用样本1～7立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测，收集淋巴细胞达到3000个后终止检测。然后，观察FSC-SSC散点图上淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞的分类和计数情况。测定后的样本2～8℃保存24小时后，重复上述检测。
如图1中A和B分别为将预处理后的白细胞分类用样本1立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图。从图1A中可以看出，使用上述预处理试剂可以将白细胞清晰地区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群。从图1B中发现，白细胞分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个明显的亚群。但是，相对于图1A，中性粒细胞数量明显下降，说明预处理后的白细胞分类用样本的稳定性差。对比例2的结果与对比例1的结果相类似。
如图2中A和B分别为将预处理后的白细胞分类用样本3立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图。从图2A中可以看出，使用上述预处理试剂可以将白细胞清晰地区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群。从图2B中发现，白细胞分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个明显的亚群；相对于图2A，未发生中性粒细胞明显下降的情况，说明PVP K-60的添加可以保护白细胞，避免其被过度破坏。
如图3中A和B分别为将预处理后的白细胞分类用样本4立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测及在2～8℃保存24小时后在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的FSC-SSC散点图。从图3A中可以看出，使用上述预处理试剂可以将白细胞清晰地区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群。从图3B中发现，白细胞分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个明显的亚群；相对于图3A，未发生中性粒细胞明显下降的情况。
如图4中A和B分别为将预处理后的白细胞分类用样本5立即在CytoFLEX流式细胞仪上检测得到的CD45-SSC散点图和CD3-CD4散点图。从图4A中可以看出，使用上述预处理试剂可以将白细胞清晰地区分为淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个亚群。从图4B中可以将淋巴细胞中的CD3+CD4+细胞区分出来。这个结果说明，本发明上述预处理试剂处理后的样本可以用于流式细胞术中抗原/抗体的检测。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种白细胞分类用样本的预处理试剂，其特征在于，含有溶血剂，所述溶血剂的活性成分主要由有机酸及高分子非离子表面活性剂组成，所述有机酸选自甲酸、乙酸及丙酸中的至少一种，所述高分子非离子表面活性剂选自聚乙烯吡咯烷酮及聚乙二醇中的至少一种。
2.如权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，在所述溶血剂中，所述有机酸的浓度为0.5～5mL/L。
3.如权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，在所述溶血剂中，所述高分子非离子表面活性剂的浓度为0.1～10g/L。
4.如权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮的K值范围为30～120。
5.如权利要求1所述的预处理试剂，其特征在于，所述聚乙二醇选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000及聚乙二醇20000中的至少一种。
6.如权利要求1～5任一项所述的预处理试剂，其特征在于，还包括终止剂，所述终止剂的活性成分主要由碱金属盐组成。
7.如权利要求6所述的预处理试剂，其特征在于，所述碱金属盐选自浓度为2～10g/L的Na2CO3、浓度为20～40g/L的Na2SO4及浓度为10～30g/L的NaCl中的至少一种。
8.如权利要求6所述的预处理试剂，其特征在于，所述终止剂的活性成分还包括甲醛供体防腐剂。
9.如权利要求8所述的预处理试剂，其特征在于，所述甲醛供体防腐剂选自浓度为5～50g/L的咪唑烷基脲及浓度为2～40g/L的双咪唑烷基脲中的至少一种。
10.一种白细胞分类用样本的预处理方法，其特征在于，使用如权利要求1～9任一项所述的预处理试剂，包括以下步骤：
将外周血样本与所述溶血剂混匀孵育，然后加入终止剂终止反应，得到预处理后的白细胞分类用样本。
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