JP2012233754A - 白血球の分類計数方法、白血球分類試薬キット及び白血球分類試薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生体試料と、核酸を染色する第1試薬と、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に前記蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための、カチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤、ならびに20mM以上50mM以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する第2試薬とを混合して測定試料を調製する工程;調製された測定試料に光を照射し、そのときに生じる散乱光情報および蛍光情報を取得する工程;並びに取得された散乱光情報および蛍光情報に基づいて、前記生体試料中の白血球を分類するとともに、芽球と異型リンパ球とを区別して検出する工程;を含む白血球の分類計数方法。
【選択図】図1
Description
しかしながら、特許文献1や特許文献2の試薬を用いた方法では、異常白血球である芽球や異型リンパ球のシグナルが、いずれもスキャッタグラム上のほぼ同じ領域に出現するので、芽球と異型リンパ球とを区別して検出することが困難な場合があった。
生体試料と、核酸を染色する第1試薬と、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に前記蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための、カチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤、ならびに20 mM以上50 mM以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する第2試薬とを混合して測定試料を調製する工程;
調製された測定試料に光を照射し、そのときに生じる散乱光情報および蛍光情報を取得する工程;および
取得された散乱光情報および蛍光情報に基づいて、前記生体試料中の白血球を分類するとともに、芽球と異型リンパ球とを区別して検出する工程;
を含み、前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上6.4以下であり、前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上7.0以下である、白血球の分類計数方法を提供する。
さらに、本発明は、核酸を染色可能な蛍光色素と、カチオン性界面活性剤と、ノニオン性界面活性剤と、芳香族の有機酸と、を含む白血球分類試薬であって、試薬中に含まれる芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上50 mM以下であり、芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合はpHが5.5以上6.4以下であり、芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合はpHが5.5以上7.0以下であることを特徴とする白血球分類試薬を提供する。
本発明の試薬キットに含まれる第1試薬は、核酸を染色可能な蛍光色素を含有する。本発明の実施形態において、第1試薬は、後述する第2試薬で処理された生体試料中の有核細胞の核酸を蛍光染色するための試薬である。生体試料を第1試薬で処理することにより、正常白血球および上記の異常白血球などの核酸を有する血球が染色される。
有機溶媒としては、例えばアルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)などが挙げられる。なお、蛍光色素は、水溶液中での保存安定性が悪い場合があるので、有機溶媒に溶解させることが好ましい。
本発明の試薬キットに含まれる第2試薬は、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に上記の蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための界面活性剤、すなわちカチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤を含有する。さらに、該第2試薬は、20 mM以上50 mM以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する。ここで、本発明の試薬キットの第2試薬は、芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合は第2試薬のpHが5.5以上6.4以下であり、第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合は該第2試薬のpHが5.5以上7.0以下であることを特徴とする。
第2試薬により細胞膜に損傷を受けた血球は、上記の第1試薬中の蛍光色素により染色される。また、第2試薬に含まれる芳香族の有機酸の濃度およびpHが上記の範囲であることにより、フローサイトメータなどにより検出した正常リンパ球のシグナルの出現領域と正常単球のシグナルの出現領域を、異常白血球の検出精度を高め且つ芽球と異型リンパ球との判別を可能にする程度に隔てることができる。
R1−R2−(CH2CH2O)n−H (VI)
溶媒としては、上記の成分を溶解させることができれば特に限定されないが、例えば水、有機溶媒およびそれらの混合物が挙げられる。有機溶媒としては、例えばアルコール、エチレングリコール、DMSOなどが挙げられる。
本発明の白血球分類試薬キットまたは試薬を用いれば、生体試料中の白血球を分類計数することができる。以下に、本発明の試薬キットを用いた場合の白血球の分類計数方法(以下、単に「方法」ともいう)について説明する。
本発明の方法では、まず、生体試料と上記の試薬キットの第1試薬および第2試薬とを混合して、該生体試料中の赤血球を溶解させるとともに白血球の核酸を染色することにより測定試料を調製する(調製工程)。
本発明の実施形態において、測定工程はフローサイトメータにより行われることが好ましい。フローサイトメータによる測定では、染色された白血球がフローサイトメータのフローセルを通過する際に該白血球に光を照射することにより、該白血球から発せられるシグナルとして散乱光情報および蛍光情報を得ることができる。
当該技術においては、側方散乱光は細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は細胞の大きさの情報を反映することが知られている。本発明の実施形態においては、散乱光情報として側方散乱光強度を用いることが好ましい。
本発明の実施形態において、白血球の分類計数は、側方散乱光情報と蛍光情報を二軸とするスキャッタグラムを作成し、得られたスキャッタグラムを適当な解析ソフトを用いて解析することにより行われることが好ましい。例えば、X軸に側方散乱光強度、Y軸に蛍光強度をとってスキャッタグラムを描いた場合、図1の右パネルに示されるように、白血球はリンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基球の5種類の集団(クラスター)に分類される。そして、解析ソフトによって、スキャッタグラム上で各集団を囲むウィンドウを設け、その中の細胞数を計数することができる。
なお、図1では、白血球を5種類の集団に分類しているが、これに限られない。例えば、好中球と好塩基球を1つの集団として分類することにより、白血球を4種類の集団に分類してもよい。
本発明の実施形態において、芽球としては、例えば骨髄芽球が挙げられる。
本実施例では、正常リンパ球と正常単球のシグナルが出現する位置をスキャッタグラム上で分離するために、第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度と第2試薬のpHを検討した。
なお、LTACはカチオン性界面活性剤であり、BC30TXはノニオン性界面活性剤であり、フタル酸は芳香族の有機酸である。
各測定用試料にフローサイトメータ(以下、FCMという)により光を照射して、該試料中の細胞から発せられる側方散乱光シグナル、前方散乱光シグナルおよび蛍光シグナルを検出した。得られたシグナルを解析して測定用試料中の正常白血球を測定した。なお、FCMの光源として、励起波長633 nmの赤色半導体レーザを用いた。また、蛍光シグナルは、600 nm以上の波長の蛍光(赤蛍光)を検出した。
本実施例では、実施例1の第1試薬と第2試薬B、GおよびOを用いて、形態が異常なリンパ球を含む血液検体(以下、異常検体1という)を測定した。なお、FCMによる測定および重心距離の算出は、実施例1と同様にして行った。
これに対して、本発明の試薬キットの第2試薬GおよびOを用いた測定では、リンパ球の集団と単球の集団とが大きく離れるので、本実施例のように異常検体を測定した場合でも、形態が異常なリンパ球を含む集団と単球の集団とを精度よく分けることができるようになる。これにより、従来試薬よりも精度よく形態が異常なリンパ球を検出することができる。
本実施例では、実施例1の第1試薬と第2試薬B、G、MおよびOを用いて、形態が異常なリンパ球を含む生体試料(以下、異常検体2という)および骨髄芽球を含む生体試料(以下、異常検体3という)を測定した。
すなわち、異常検体2および3に含まれる異常白血球の集団はいずれもリンパ球および単球の集団と一部分が重なっている。また、異常検体2および3に含まれる異常白血球の集団は、スキャッタグラム上での分布の様子が互いに類似している。
したがって、従来試薬である第2試薬Bを用いた測定の結果からは、検体中に形態が異常なリンパ球および骨髄芽球のいずれが含まれているのか判別できない。さらに、形態が異常なリンパ球の集団の一部分がリンパ球および単球の集団と重なっているので、正常なリンパ球および単球を精度よく分類計数することが困難である。
したがって、本発明の試薬キットの第2試薬を用いて測定すれば、形態が異常なリンパ球と骨髄芽球の出現位置に明確な差が現れるので、いずれの異常白血球が検体に含まれているのかを正確に判断することができる。さらに、異常白血球の集団はリンパ球または単球の集団と精度良く分けることができるようになるので、従来の試薬と比べて、正常単球または正常リンパ球をより正確に分類計数することができる。
本実施例では、実施例1の第1試薬と第2試薬AまたはOとを用いて、形態が異常なリンパ球を含む生体試料を測定した。ここで、本実施例の生体試料に含まれている形態が異常なリンパ球は、形態学検査により異型リンパ球であると確認されたリンパ球である。
本実施例で用いた生体試料は、従来の試薬による測定では異常白血球が異型リンパ球であるか芽球であるかを判別できない2つの血液検体(以下、それぞれ異常検体4および異常検体5という)である。これは、上述したように、異型リンパ球芽球の各シグナルはいずれもスキャッタグラム上のほぼ同じ領域に出現することに起因する。なお、FCMによる測定は、実施例1と同様にして行った。
これに対して、第2試薬Oを用いて異常検体4および5を測定すると、単球の集団とリンパ球の集団とが離れるとともに、異型リンパ球の集団はリンパ球の集団へ偏って出現した。上記の実施例3の図4で示したように、第2試薬Oを用いて芽球を含む異常検体を測定した場合、芽球は単球の集団へ偏って出現する。これにより、異型リンパ球の集団と芽球の集団とを区別して検出することができる。
本実施例では、実施例1の第1試薬、第2試薬AおよびG、ならびに芳香族の有機酸としてフタル酸および安息香酸を含む第2試薬RおよびSを用いて生体試料を測定した。なお、第2試薬RおよびSは、LTAC、BC30TX、フタル酸、安息香酸およびEDTA-2Kを、以下の表4に示される組成となるように混合して調製した。
Claims (14)
- 生体試料と、核酸を染色する第1試薬と、赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に前記蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための、カチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤、ならびに20 mM以上50 mM以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する第2試薬とを混合して測定試料を調製する工程;
調製された測定試料に光を照射し、そのときに生じる散乱光情報および蛍光情報を取得する工程;および
取得された散乱光情報および蛍光情報に基づいて、前記生体試料中の白血球を分類するとともに、芽球と異型リンパ球とを区別して検出する工程;
を含み、
前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上6.4以下であり、前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上7.0以下である白血球の分類計数方法。 - 前記芳香族の有機酸が、芳香族カルボン酸、芳香族スルホン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つである請求項1に記載の方法。
- 前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が、40 mM以上50 mM以下である請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2試薬中のpHが、5.5以上6.2以下である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記散乱光情報が、側方散乱光情報である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記カチオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム塩型界面活性剤、またはピリジニウム塩型界面活性剤である請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸を染色可能な蛍光色素を含有する第1試薬と、
赤血球を溶血させ、白血球の細胞膜に前記蛍光色素が透過できる程度の損傷を与えるための、カチオン性界面活性剤およびノニオン性界面活性剤、ならびに20 mM以上50 mM以下の濃度で芳香族の有機酸を含有する第2試薬とを含み、
前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上6.4以下であり、前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合は前記第2試薬のpHが5.5以上7.0以下である白血球分類試薬キット。 - 前記芳香族の有機酸が、芳香族カルボン酸、芳香族スルホン酸およびそれらの塩からなる群より選択される少なくとも1つである請求項8に記載の試薬キット。
- 前記第2試薬中の芳香族の有機酸の濃度が40 mM以上50 mM以下である、請求項8または9に記載の試薬キット。
- 前記第2試薬中のpHが、5.5以上6.2以下である請求項8〜10のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記カチオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム塩型界面活性剤、またはピリジニウム塩型界面活性剤である請求項8〜11のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 核酸を染色可能な蛍光色素と、カチオン性界面活性剤と、ノニオン性界面活性剤と、芳香族の有機酸とを含む白血球分類試薬であって、
前記試薬に含まれる芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上50 mM以下であり、
前記芳香族の有機酸の濃度が20 mM以上30 mM未満の場合はのpHが5.5以上6.4以下であり、前記芳香族の有機酸の濃度が30 mM以上50 mM以下の場合はpHが5.5以上7.0以下であることを特徴とする白血球分類試薬。
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