JP3886271B2 - 赤芽球の分類計数用試薬及び分類計数方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリによる赤芽球の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、赤芽球を計数し、さらに赤芽球を成熟度ごとに分類することは、疾患の診断、予後診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。
【０００３】
通常、赤芽球は骨髄中に存在し、末梢血中には存在しない。末梢血への赤芽球の出現は、急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血などの疾患が存在する可能性を示しており、赤芽球の分類計数を行うことは、これらの疾患の診断、予後診断を行う上で非常に有用である。
【０００４】
従来は、赤芽球の分類計数を行うには、血液の塗沫標本を作製し、適当な染色を施した後に、顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。しかし、このような方法は、時間がかかり、複雑な染色方法が必要であり、また正確な分類計数を得るためには、専門知識が必要である。
【０００５】
近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、赤芽球が出現した場合に、アブノーマルフラッグなどによって、赤芽球が存在する可能性があることを示唆するのみで、赤芽球を正確に分類計数することはできなかった。
【０００６】
また、これとは別に特開平４−２６８４５３号、米国特許第５５５９０３７号に、赤芽球を分類計数する方法が開示されている。
【０００７】
これらの方法はいずれも、適当な溶血剤で赤血球系細胞の細胞膜のみを傷害し（色素の細胞膜透過性を付与する）、白血球系細胞の細胞膜を傷害しない（色素の細胞膜透過性を付与しない）溶解剤で処理した後に（あるいは同時に）、蛍光色素で細胞膜を傷害された赤芽球のみを染色し、その蛍光強度を測定することによって、赤芽球と白血球を弁別し、赤芽球を測定する方法である。
【０００８】
これらの方法は、採血直後の新鮮血液を用いる場合は正確な測定が可能であるが、採血後時間の経過とともに、赤芽球のみならず、白血球の細胞膜が傷害されやすくなり、あるいは、溶血剤と混合する以前に細胞膜が傷害されるために、白血球の一部が蛍光色素によって染色されてしまう。特にリンパ球系細胞が傷害された場合、傷害されたリンパ球と赤芽球を明瞭に弁別することは困難であり、赤芽球を正確に分類計数することができなくなるという問題がある。また、一部のリンパ芽球出現検体、あるいは化学療法などによって、白血球系の細胞膜が溶血剤による傷害を受けやすくなった検体では、採血直後でも正確に赤芽球を分類計数することは困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、採血後時間の経過した検体、あるいはダメージを受けやすい白血球が存在する場合でも、高精度で赤芽球を分類計数する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）赤血球を測定の障害にならない程度に溶解し、白血球と赤芽球を染色に好適な状態にするための赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤、（２）染色することによって少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素、を含むことを特徴とする赤芽球分類計数試薬、ならびに該試薬を用いることを特徴とする赤芽球分類計数方法を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい赤芽球分類計数方法は、以下の工程からなる：
１）試料を、白血球並びに赤芽球を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解する工程、
２）１）で調製した試料中の白血球と赤芽球を、少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素で染色する工程、
３）２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定する工程、
４）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程、５）４）で分類計数した赤芽球数より、白血球に対する赤芽球の割合を算出する工程、
６）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数する工程、
７）４）で分類計数した赤芽球数と、６）で成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数した赤芽球数から全赤芽球に対する各成熟度ごとの赤芽球の割合を算出する工程。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明でいう血液試料は、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシス等で採取した試料など、白血球、赤芽球を含む体液試料をいう。
【００１３】
本発明ではまず、血液試料を、白血球並びに赤芽球を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解する。このために好適な赤血球溶解剤とは、赤血球を溶解するが、白血球へのダメージの少ない赤血球溶解剤であり、例えば、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、ｐＨ２．０〜５．０の水溶液である。
【００１４】
本工程の目的は、通常白血球細胞の１０００倍の濃度で存在し、白血球、赤芽球を測定する上で障害となる赤血球を溶血すること、赤芽球と白血球の間に蛍光強度の差異を生じさせることである。
【００１５】
赤血球は、若干の個体差があるが通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、測定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。本発明で使用する溶血剤では、個体差を考慮して１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧を使用する。この浸透圧を達成するためには、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類又は後述の緩衝剤濃度などにより浸透圧を調整することができる。
【００１６】
ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球にも過度の障害を与えるため、後述する蛍光強度の差異が得にくくなる。
【００１７】
溶液のｐＨは、赤血球の溶血が効率よく行われるために、酸性側にすることが好適である。特に好適には、２．０〜５．０のｐＨが使用される。さらに好適には２．５〜４．５のｐＨが選ばれる。
【００１８】
また、ｐＨを一定に保つためには、緩衝剤を使用することが好適であり、設定するｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤が使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロン酸などの緩衝剤を含むことができる。
【００１９】
さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有することにより、より効果的に（短時間に）赤血球を溶血することができる。好ましい有機酸もしくはその塩としては、例えばサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、フタル酸などが挙げられる。これらは、緩衝剤としても作用する。
【００２０】
本条件下では、赤芽球の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ溶血するが、赤芽球細胞核の性状は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。
【００２１】
一方、白血球細胞の細胞膜への傷害は明確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生細胞と顕著な差は認められない。
【００２２】
本発明では、界面活性剤を含むが、界面活性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集防止、血小板凝集防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進の目的で使用される。
【００２３】
しかし、界面活性剤の濃度が高すぎる場合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球にも過度の障害を与え、特に赤芽球の性状を変化させ、後述する赤芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくする問題がある。
【００２４】
従って、本発明に使用する界面活性剤は、赤芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくしないように濃度の調整を行った。
【００２５】
界面活性剤濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌにすることが好適である。さらに好適には、１００〜５０００ｍｇ／ｌの濃度が選ばれる。
【００２６】
この結果、予期せぬことに、従来不可能であると考えられていた、赤芽球と白血球の間の明瞭な蛍光強度の差異を生じさせ、さらに赤芽球を成熟度ごとに分類計数することが可能になった。
【００２７】
少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素とは、以下の群からなる色素のうち少なくとも１種類が使用される。
【００２８】
【化５６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、は水素原子又はアルキル基又はアルキニル基又は水酸基で置換されたアルキル基；Ｙ、Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又は低級アルキル基を有する炭素；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５７】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2およびＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭素；ｎは０，１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５８】
（式中、Ｒ1は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ2はアルキル基、Ｒ3は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５９】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2はジメチルアミノ基；Ｒ3は水素原子又はアミノ基；Ｒ4は水素原子又はアルキル基又はアミノ基；Ｒ5は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｘ-はアニオン；Ｙは硫黄又は酸素である。）
【化６０】
（式中、Ｒ1は水素原子又は水酸基；Ｒ2は水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3は水素原子又はスルホン酸基；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。）
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【化６９】
【化７０】
【化７１】
【化７２】
【化７３】
【化７４】
【化７５】
【化７６】
【００２９】
上記式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に結合するアルキル基は、炭素数１−２０、好ましくは１−１０、より好ましくは１−６のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを挙げることができる。
【００３０】
低級アルキル基又は低級アルコキシル基とは炭素数１−８の直鎖又は分岐アルキル基又はアルコキシ基であり、好ましくはメチル、エチル、メトキシ、エトキシである。アシル基としては炭素数１−３のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが好ましい。好ましいアニオンには、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-などのハロゲンイオン、及びＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、ＣｌＯ4 -などを含む。
【００３１】
上記に記載した色素のうちＮＫシリーズは、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ730、ＬＤ700はExciton社より、その他のものは市販品を購入することができる。
【００３２】
蛍光色素は、溶血剤に溶解させ、溶血剤と同時に血液に作用させても（混合させても）良いし、溶解処理（工程の）後、適当な溶媒（水、低級アルコール、エチレングリコール、DMSO、等）に溶解したものを添加しても良い。
【００３３】
色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤と色素溶液とを混合した状態での濃度である。
【００３４】
前述の溶血剤で処理した血球を上述の色素で染色した場合、白血球細胞は強く染色され、フローサイトメータで測定した場合強い蛍光を発する。一方赤芽球は弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球と赤芽球の蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく赤芽球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられる。
【００３５】
本発明で使用される界面活性剤としては、以下の群から少なくとも１種類が好適に使用される。
【化７７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1―8アルキル基又はＣ6―8のアラルキル基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；Ｘ−はアニオンである。）
【化７８】
（式中、Ｒ1はＣ8-18のアルキル基；Ｘ-はアニオンである。）
【化７９】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1―8のアルキル基又はＣ6―8のアラルキル基；Ｒ3はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ｎは１又は２である。）
【化８０】
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
【化８９】
【００３６】
Ｃ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイルなどを挙げることができる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。
【００３７】
Ｃ8-18のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基を挙げることができる。
【００３８】
また、Ｃ9-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基の例としては、ノニル、ドデシル、ヘキサデシル、オレイル等が挙げられる。
【００３９】
上記に記載した界面活性剤のうち、MEGA-8からCHAPSOまでは株式会社 同仁化学研究所より購入することができる。
【００４０】
界面活性剤の濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは１０００〜３０００ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤に含まれる界面活性剤の濃度である。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、サリチル酸などの有機酸、色素、及び界面活性剤を精製水に溶解し、ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整して得られる簡単な組成の試薬を用いることができる。試薬と試料を混合し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させる。
【００４２】
このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する。
【００４３】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好ましくは、前方低角散乱光が選ばれ、この散乱光は白血球の大きさ情報を反映する。
【００４４】
蛍光とは、前述の細胞成分と結合した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
【００４５】
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
【００４６】
次いで、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数し、赤芽球を成熟度ごとに分類計数する。「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、赤芽球（ＮＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及びゴースト化した細胞（Ｇｈｏｓｔ）の各細胞は、集団（クラスター）を形成して分布する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽球の数と割合を計算する、工程をいう。「赤芽球を成熟度に分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、赤芽球は成熟度によって集団（クラスター）を形成して分布する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽球の各成熟度での数と割合を算出する工程、をいう。
【００４７】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００４８】
【実施例】
以下の組成の試薬を調製した。
【００４９】
サリチル酸（市販品） １０ｍＭ
ＮＫ−２８２５（日本感光色素研究所（株）） ０．３ｍｇ／ｌ
ＬＴＡＣ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド）（市販品） ０．３ｇ／ｌ
精製水 １ｌ
ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧 ４０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
上記試薬１．０ｍ／ｌに抗凝固剤処理した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液３０μｌを加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。
【００５０】
図２にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャタグラムを示す。血球は、白血球、赤芽球Stage I、赤芽球Stage II、赤芽球Stage IIIの４つの集団を形成する。
【００５１】
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。赤芽球を前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較した。
【００５２】
図３にフローサイトメータと目視の結果を示す。
【００５３】
図３より、本発明と目視の結果がよく一致していることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、赤芽球を簡便に成熟度別に分類計数することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で得られる測定結果の模式図である。
【図２】実施例の試薬を用いて、赤芽球を含む検体を測定したときのスキャッタグラムである。
【図３】実施例の試薬を用いたときの測定値を従来法（目視法）で測定した場合を比較したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明はフローサイトメトリによる赤芽球の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術】
臨床検査の分野において、赤芽球を計数し、さらに赤芽球を成熟度ごとに分類することは、疾患の診断、予後診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。
【０００３】
通常、赤芽球は骨髄中に存在し、末梢血中には存在しない。末梢血への赤芽球の出現は、急性骨髄性白血病、溶血性貧血、鉄欠乏性貧血、悪性貧血などの疾患が存在する可能性を示しており、赤芽球の分類計数を行うことは、これらの疾患の診断、予後診断を行う上で非常に有用である。
【０００４】
従来は、赤芽球の分類計数を行うには、血液の塗沫標本を作製し、適当な染色を施した後に、顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。しかし、このような方法は、時間がかかり、複雑な染色方法が必要であり、また正確な分類計数を得るためには、専門知識が必要である。
【０００５】
近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動白血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、赤芽球が出現した場合に、アブノーマルフラッグなどによって、赤芽球が存在する可能性があることを示唆するのみで、赤芽球を正確に分類計数することはできなかった。
【０００６】
また、これとは別に特開平４−２６８４５３号、米国特許第５５５９０３７号に、赤芽球を分類計数する方法が開示されている。
【０００７】
これらの方法はいずれも、適当な溶血剤で赤血球系細胞の細胞膜のみを傷害し（色素の細胞膜透過性を付与する）、白血球系細胞の細胞膜を傷害しない（色素の細胞膜透過性を付与しない）溶解剤で処理した後に（あるいは同時に）、蛍光色素で細胞膜を傷害された赤芽球のみを染色し、その蛍光強度を測定することによって、赤芽球と白血球を弁別し、赤芽球を測定する方法である。
【０００８】
これらの方法は、採血直後の新鮮血液を用いる場合は正確な測定が可能であるが、採血後時間の経過とともに、赤芽球のみならず、白血球の細胞膜が傷害されやすくなり、あるいは、溶血剤と混合する以前に細胞膜が傷害されるために、白血球の一部が蛍光色素によって染色されてしまう。特にリンパ球系細胞が傷害された場合、傷害されたリンパ球と赤芽球を明瞭に弁別することは困難であり、赤芽球を正確に分類計数することができなくなるという問題がある。また、一部のリンパ芽球出現検体、あるいは化学療法などによって、白血球系の細胞膜が溶血剤による傷害を受けやすくなった検体では、採血直後でも正確に赤芽球を分類計数することは困難である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、採血後時間の経過した検体、あるいはダメージを受けやすい白血球が存在する場合でも、高精度で赤芽球を分類計数する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、（１）赤血球を測定の障害にならない程度に溶解し、白血球と赤芽球を染色に好適な状態にするための赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤、（２）染色することによって少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる少なくとも１つの蛍光色素、を含むことを特徴とする赤芽球分類計数試薬、ならびに該試薬を用いることを特徴とする赤芽球分類計数方法を提供する。
【００１１】
本発明の好ましい赤芽球分類計数方法は、以下の工程からなる：
１）試料を、白血球並びに赤芽球を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解する工程、
２）１）で調製した試料中の白血球と赤芽球を、少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素で染色する工程、
３）２）で調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定する工程、
４）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程、５）４）で分類計数した赤芽球数より、白血球に対する赤芽球の割合を算出する工程、
６）３）で測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数する工程、
７）４）で分類計数した赤芽球数と、６）で成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数した赤芽球数から全赤芽球に対する各成熟度ごとの赤芽球の割合を算出する工程。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明でいう血液試料は、末梢血液、骨髄液、尿、アフェレーシス等で採取した試料など、白血球、赤芽球を含む体液試料をいう。
【００１３】
本発明ではまず、血液試料を、白血球並びに赤芽球を染色に好適な状態にする赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤と混合し、血液試料中の赤血球を測定の障害とならない程度に溶解する。このために好適な赤血球溶解剤とは、赤血球を溶解するが、白血球へのダメージの少ない赤血球溶解剤であり、例えば、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下、ｐＨ２．０〜５．０の水溶液である。
【００１４】
本工程の目的は、通常白血球細胞の１０００倍の濃度で存在し、白血球、赤芽球を測定する上で障害となる赤血球を溶血すること、赤芽球と白血球の間に蛍光強度の差異を生じさせることである。
【００１５】
赤血球は、若干の個体差があるが通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、測定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。本発明で使用する溶血剤では、個体差を考慮して１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧を使用する。この浸透圧を達成するためには、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌなどの電解質、糖類又は後述の緩衝剤濃度などにより浸透圧を調整することができる。
【００１６】
ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球にも過度の障害を与えるため、後述する蛍光強度の差異が得にくくなる。
【００１７】
溶液のｐＨは、赤血球の溶血が効率よく行われるために、酸性側にすることが好適である。特に好適には、２．０〜５．０のｐＨが使用される。さらに好適には２．５〜４．５のｐＨが選ばれる。
【００１８】
また、ｐＨを一定に保つためには、緩衝剤を使用することが好適であり、設定するｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤が使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロン酸などの緩衝剤を含むことができる。
【００１９】
さらに、溶血剤中に少なくとも１つの、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸もしくはその塩を含有することにより、より効果的に（短時間に）赤血球を溶血することができる。好ましい有機酸もしくはその塩としては、例えばサリチル酸、サリチル酸ナトリウム、フタル酸などが挙げられる。これらは、緩衝剤としても作用する。
【００２０】
本条件下では、赤芽球の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ溶血するが、赤芽球細胞核の性状は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。
【００２１】
一方、白血球細胞の細胞膜への傷害は明確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生細胞と顕著な差は認められない。
【００２２】
本発明では、界面活性剤を含むが、界面活性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集防止、血小板凝集防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進の目的で使用される。
【００２３】
しかし、界面活性剤の濃度が高すぎる場合、赤血球のみならず、白血球、赤芽球にも過度の障害を与え、特に赤芽球の性状を変化させ、後述する赤芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくする問題がある。
【００２４】
従って、本発明に使用する界面活性剤は、赤芽球と白血球の蛍光強度の差異を小さくしないように濃度の調整を行った。
【００２５】
界面活性剤濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌにすることが好適である。さらに好適には、１００〜５０００ｍｇ／ｌの濃度が選ばれる。
【００２６】
この結果、予期せぬことに、従来不可能であると考えられていた、赤芽球と白血球の間の明瞭な蛍光強度の差異を生じさせ、さらに赤芽球を成熟度ごとに分類計数することが可能になった。
【００２７】
少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素とは、以下の群からなる色素のうち少なくとも１種類が使用される。
【００２８】
【化５６】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、は水素原子又はアルキル基又はアルキニル基又は水酸基で置換されたアルキル基；Ｙ、Ｚは硫黄又は酸素又は窒素又は低級アルキル基を有する炭素；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５７】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2およびＲ3は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又はアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは低級アルキル基を有する炭素；ｎは０，１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５８】
（式中、Ｒ1は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ2はアルキル基、Ｒ3は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）
【化５９】
（式中、Ｒ1は水素原子又はアルキル基；Ｒ2はジメチルアミノ基；Ｒ3は水素原子又はアミノ基；Ｒ4は水素原子又はアルキル基又はアミノ基；Ｒ5は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｘ-はアニオン；Ｙは硫黄又は酸素である。）
【化６０】
（式中、Ｒ1は水素原子又は水酸基；Ｒ2は水素原子又はスルホン酸基；Ｒ3は水素原子又はスルホン酸基；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。）
【化６１】
【化６２】
【化６３】
【化６４】
【化６５】
【化６６】
【化６７】
【化６８】
【化６９】
【化７０】
【化７１】
【化７２】
【化７３】
【化７４】
【化７５】
【化７６】
【００２９】
上記式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に結合するアルキル基は、炭素数１−２０、好ましくは１−１０、より好ましくは１−６のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルなどを挙げることができる。
【００３０】
低級アルキル基又は低級アルコキシル基とは炭素数１−８の直鎖又は分岐アルキル基又はアルコキシ基であり、好ましくはメチル、エチル、メトキシ、エトキシである。アシル基としては炭素数１−３のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが好ましい。好ましいアニオンには、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-などのハロゲンイオン、及びＣＦ3ＳＯ3 -、ＢＦ4 -、ＣｌＯ4 -などを含む。
【００３１】
上記に記載した色素のうちＮＫシリーズは、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ730、ＬＤ700はExciton社より、その他のものは市販品を購入することができる。
【００３２】
蛍光色素は、溶血剤に溶解させ、溶血剤と同時に血液に作用させても（混合させても）良いし、溶解処理（工程の）後、適当な溶媒（水、低級アルコール、エチレングリコール、DMSO、等）に溶解したものを添加しても良い。
【００３３】
色素の濃度は使用する色素により異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤と色素溶液とを混合した状態での濃度である。
【００３４】
前述の溶血剤で処理した血球を上述の色素で染色した場合、白血球細胞は強く染色され、フローサイトメータで測定した場合強い蛍光を発する。一方赤芽球は弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球と赤芽球の蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく赤芽球の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されていると考えられる。
【００３５】
本発明で使用される界面活性剤としては、以下の群から少なくとも１種類が好適に使用される。
【化７７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1―8アルキル基又はＣ6―8のアラルキル基；Ｒ4はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；Ｘ−はアニオンである。）
【化７８】
（式中、Ｒ1はＣ8-18のアルキル基；Ｘ-はアニオンである。）
【化７９】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は同一又は異なって、Ｈ原子、Ｃ1―8のアルキル基又はＣ6―8のアラルキル基；Ｒ3はＣ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基；ｎは１又は２である。）
【化８０】
【化８１】
【化８２】
【化８３】
【化８４】
【化８５】
【化８６】
【化８７】
【化８８】
【化８９】
【００３６】
Ｃ8-18のアルキル基、Ｃ8-18のアルケニル基又はＣ6-18のアラルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイルなどを挙げることができる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。
【００３７】
Ｃ8-18のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基を挙げることができる。
【００３８】
また、Ｃ9-25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基の例としては、ノニル、ドデシル、ヘキサデシル、オレイル等が挙げられる。
【００３９】
上記に記載した界面活性剤のうち、MEGA-8からCHAPSOまでは株式会社 同仁化学研究所より購入することができる。
【００４０】
界面活性剤の濃度は、１０〜１００００ｍｇ／ｌ、好ましくは１００〜５０００ｍｇ／ｌ、さらに好ましくは１０００〜３０００ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は溶血剤に含まれる界面活性剤の濃度である。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、サリチル酸などの有機酸、色素、及び界面活性剤を精製水に溶解し、ＮａＯＨ、ＨＣｌなどを用いてｐＨを調整して得られる簡単な組成の試薬を用いることができる。試薬と試料を混合し、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間反応させる。
【００４２】
このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータで測定し、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定する。
【００４３】
本発明でいう散乱光とは、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好ましくは、前方低角散乱光が選ばれ、この散乱光は白血球の大きさ情報を反映する。
【００４４】
蛍光とは、前述の細胞成分と結合した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
【００４５】
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
【００４６】
次いで、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数し、赤芽球を成熟度ごとに分類計数する。「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、赤芽球（ＮＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及びゴースト化した細胞（Ｇｈｏｓｔ）の各細胞は、集団（クラスター）を形成して分布する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽球の数と割合を計算する、工程をいう。「赤芽球を成熟度に分類計数する工程」とは、（１）例えばＸ軸に蛍光、Ｙ軸に前方低角散乱光をとってスキャッタグラムを描いた場合、例えば図１に示すように、赤芽球は成熟度によって集団（クラスター）を形成して分布する；そして（２）この集団を、適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析することにより、赤芽球の各成熟度での数と割合を算出する工程、をいう。
【００４７】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００４８】
【実施例】
以下の組成の試薬を調製した。
【００４９】
サリチル酸（市販品） １０ｍＭ
ＮＫ−２８２５（日本感光色素研究所（株）） ０．３ｍｇ／ｌ
ＬＴＡＣ（ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド）（市販品） ０．３ｇ／ｌ
精製水 １ｌ
ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整（浸透圧 ４０ｍＯｓｍ／ｋｇ）
上記試薬１．０ｍ／ｌに抗凝固剤処理した赤芽球が末梢血に出現した患者の血液３０μｌを加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。
【００５０】
図２にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャタグラムを示す。血球は、白血球、赤芽球Stage I、赤芽球Stage II、赤芽球Stage IIIの４つの集団を形成する。
【００５１】
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。赤芽球を前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較した。
【００５２】
図３にフローサイトメータと目視の結果を示す。
【００５３】
図３より、本発明と目視の結果がよく一致していることが判明した。
【００５４】
【発明の効果】
本発明によれば、赤芽球を簡便に成熟度別に分類計数することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で得られる測定結果の模式図である。
【図２】実施例の試薬を用いて、赤芽球を含む検体を測定したときのスキャッタグラムである。
【図３】実施例の試薬を用いたときの測定値を従来法（目視法）で測定した場合を比較したものである。
Claims (8)
- 蛍光強度及び散乱光強度に基づいて白血球と赤芽球を弁別し、弁別された赤芽球を計数するための試薬であって、
（１）赤血球を測定の障害にならない程度に溶解し、白血球と赤芽球を染色に好適な状態にするための赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤、
（２）少なくとも白血球と赤芽球とを上記弁別可能にする以下の群から選ばれる少なくとも１つの蛍光色素を含むことを特徴とする赤芽球分類計数用試薬。
- 溶血剤が、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩を含む請求項１に記載の赤芽球分類計数用試薬。
- 赤血球溶解剤が、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下のｐＨ２．０〜５．０の水溶液である請求項１記載の赤芽球分類計数用試薬。
- 界面活性剤が、以下の群から選ばれる請求項１記載の赤芽球分類計数用試薬。
- 界面活性剤濃度が１０〜１００００ｍｇ／ｌである請求項１記載の赤芽球分類計数用試薬。
- 以下の工程からなる赤芽球分類計数方法。
試料と、赤血球を測定の障害にならない程度に溶解し、白血球と赤芽球を染色に好適な 状態にするための赤血球溶解剤と界面活性剤からなる溶血剤と、少なくとも白血球と赤芽球の間に蛍光強度の差異を生じる以下の群から選ばれる少なくとも１つの蛍光色素とを混合して測定用試料を調製する工程、
測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を分類計数する工程、
を含む赤芽球分類計数方法。 - 測定する散乱光が、前方低角散乱光、前方高角散乱光及び側方散乱光から選ばれる少なくとも一つである請求項６記載の赤芽球分類計数方法。
- さらに、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて赤芽球を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数する工程を含む請求項６に記載の赤芽球分類計数方法。
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