CN101097181B - 试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法 - Google Patents

试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可以将试样中有核红细胞和嗜碱性细胞与其他白细胞更明确区分并计数的试样测定用试剂。这种试样测定用试剂包含：碳原子数为4～8的醇和由通式(I)化合物和通式(II)化合物构成的群组中的至少一种荧光色素。本发明还提供一种可以将试样中有核红细胞和嗜碱性细胞与其他白细胞更明确区分并计数的试样测定用试剂盒及试样测定方法。

Description

试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法
技术领域：
本发明涉及用于分析采自生物的试样中所含血细胞的分析试剂、分析试剂盒及其分析方法。 
背景技术：
在临床检查领域，试样中的血细胞成份分析对于诊断受检者循环器官等的各种疾病非常有用。根据疾病的不同，有时特定的血细胞数量会增加或减少、通常不存在的血细胞会出现在末梢血液中。 
近年来，应用流式细胞技术原理的各种自动血细胞计数装置面市。人们用该装置在一般检查室进行血细胞的分类和计数。使用这些自动血细胞计数装置可以自动地对试样中的血细胞进行分类和计数。 
要进行白细胞的分类和计数，首先要溶解血样中的红细胞，制备测定用试样。只要将所制备的测定用试样导入检测器、检测出电阻信号即可将白细胞分成3类。白细胞一般有淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞等5类。首先要进行红细胞溶解处理，再荧光染色，然后向经荧光染色的血细胞照射励起光，检测、分析该染色血细胞发出的荧光信号和散射光信号，即可将白细胞分成5类。嗜碱性细胞通常比较少，因此与其一次将白细胞分为5类，不如采用以下方法更能准确地将白细胞分为5类。根据该方法，利用嗜碱性细胞在酸性条件下比其他白细胞更难被破损的特性，对血样进行处理使其成为嗜碱性细胞测定专用，再测定嗜碱性细胞数 量(参照美国专利第5,518,928号)。将测定嗜碱性细胞数所得结果与其他方法得到的白细胞分类结果组合起来，即能更正确地将白细胞分为5类。 
在白细胞测定中常常成为问题的是有核红细胞(nucleated red blood cell：NRBC)的出现。由于NRBC有核，即使对红细胞进行溶解处理也会有核残留。NRBC在上述测定中会发出近似淋巴细胞的信号，从而使白细胞计数时产生加法误差。为排除此影响，而进行NRBC测定专用处理，测定NRBC数(参照美国专利第6,664,110号)，再从用其他方法获得的白细胞数中减去NRBC数，即可得到正确的白细胞数。 
但是，为了得到正确的白细胞分类而增加特定的血细胞专用处理，不仅费事，装置也会复杂化或大型化。而且，多用特定的血细胞测定专用试剂，会增加血液检查成本。出于这种观点，最好尽可能减少特定的血细胞专用处理。 
嗜碱性细胞和有核红细胞都可以通过在酸性条件下处理血样来测定，因此，如果在酸性条件下处理血样，嗜碱性细胞和有核红细胞就有可能一次同时测定。作为这种尝试之一，比如，据日本已公开专利申请公告第2002-148261号上记载，可以将含有能使白细胞和异常细胞易于染色的红细胞溶解剂和表面活性剂的水溶液与试样混合，加入含荧光色素的染色剂进行染色，用流式细胞仪测定荧光强度和散射光强度，测定嗜碱性细胞和红芽细胞(有核红细胞)。 
然而，用上述这种老方法在白细胞数量多的标本中，有时会出现嗜碱性细胞和嗜碱性细胞以外的白细胞不易分离的问题。 
发明内容：
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
本发明的目的是提供一种可以将试样中有核红细胞和嗜碱性细胞与其他白细胞更明确区分开进行计数的试样测定用试剂和试样测定方法。 
即，本发明提供一种用于测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂，其中所述试样分析用试剂的pH值为2.0～4.5，包含： 
(a)碳原子数为4～8的醇； 
(b)阳离子型表面活性剂； 
(c)选自通式(I)化合物和通式(II)化合物中至少一种的荧光色素； 
通式(I) 
Figure DEST_PATH_GSB00000028149300011
式中，R1和R2为烷基，R1和R2相同或不同； 
Figure DEST_PATH_GSB00000028149300012
R3、R4、R5和R6为氢原子或烷基，彼此相同或不同； 
X-为阴离子； 
通式(II) 
式中，R7和R8为也可含酸基的烷基，彼此相同或不同； 
为
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000043
或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000044
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000045
为或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000047
R9、R10、R11及R12为氢原子或酸性基，彼此相同或不同；但是R7～R12中至少一个含酸性基； 
R7～R12中酸性基可成盐，且R7～R12中的酸性基中至少一个基团释放质子。 
其中所述醇选自丁醇、戊醇、庚醇、异丁醇、异戊醇、2-苯基乙醇、2-苯氧基乙醇。 
其中所述酸性基是羧基或磺酸基。其中所述可成盐的酸性基的抗衡离子是碱性金属离子或烷基铵离子。 
所述的试样分析用试剂，还包含用于红细胞溶血及破坏白细胞细胞膜以透射荧光色素的表面活性剂。其中所述表面活性剂为阳离子型表面活性剂。所述阳离子型表面活性剂为季铵盐型或吡啶鎓盐型。
其中所述试剂的pH值为2.0～4.5。 
其中所述试剂中还含有芳香族有机酸。所述芳香族有机酸选自水杨酸、水杨酸盐、酞酸和酞酸盐。 
本发明进一步提供一种测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂盒，包含： 
含有溶解红细胞并破坏白细胞细胞膜以透射荧光色素的阳离子型表面活性剂和碳原子数为4~8的醇、且pH值为2.0～4.5的第一溶液； 
含有选自上述通式(I)化合物和通式(II)化合物中至少一种的荧光色素的第二溶液。 
本发明同时提供一种试样分析方法，其包括以下步骤： 
用上述试样分析用试剂或试样分析用试剂盒对试样中的血细胞染色； 
激光照射上述经染色的血细胞、获取散射光信息和荧光信息；以及 
根据上述散射光信息和上述荧光信息对上述试样中嗜碱性细胞和/或有核红细胞计数。 
附图说明：
图1为用本发明一实施方式的试样分析用试剂分析试样所得散点图的模式图。 
图2为用实施例1的试样分析用试剂分析试样所得散点图。 
图3为用实施例1的试样分析用试剂分析试样所得散点图。 
图4为用实施例2的试样分析用试剂分析试样所得散点图。 
图5为用实施例2的试样分析用试剂分析试样所得散点图。 
具体实施方式：
本申请的发明者们经过反复锐意研究发现，使用不仅含特定的荧光色素、同时还含全碳原子数4～8的醇的试样分析用试剂，可以将嗜碱性细胞明确从嗜碱性细胞之外的白细胞区分出来。 
本发明一个实施例的试样分析用试剂提供含以下成份的试样分析用试剂：(a)全碳原子数为4～8的醇；(b)由以下通式(I)化合物和通式(II)化合物构成的群组中的至少一种荧光色素。 
通式(I) 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000061
(式中，R1和R2为烷基，R1和R2相同或不同； 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000062
为或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000064
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000065
为
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000066
或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000067
R3、R4、R5和R6为氢原子或烷基，彼此相同或不同； 
X-为阴离子) 
通式(II)
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000071
(式中，R7和R8为也可含酸基的烷基，彼此相同或不同； 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000072
为
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000073
或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000074
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000075
为
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000076
或
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000077
R9、R10、R11及びR12为氢原子或酸性基，彼此相同或不同；但是R7～R12中的至少一个含酸性基； 
存在于R7～R12的酸性基也可形成盐，但是R7～R12中的酸性基中至少一个是放出了质子的基。 
通过使用此试样分析用试剂，可以明确地从其他血细胞中区分有核红细胞和嗜碱性细胞，并对其计数。这样就可以更准确地检查和诊断疾病。用此试样分析用试剂测定可以一次即对有核红细胞和嗜碱性细胞计数，但是根据检查目的不同，有时仅测定有核红细胞和嗜碱性细胞之一即可。在这种情况下，也可以通过使用试样分析用试剂只对有核红细胞和嗜碱性细胞之一进行测定。
用试样分析用试剂可以测定的嗜碱性细胞是白细胞的一种，含有被碱性色素染色的大型酸性颗粒。有核红细胞也俗称为成红细胞(erythroblast)，含前成红细胞(proerythroblast)、嗜碱性成红细胞(basophilic erythroblast)、多染性成红细胞(polychromatophilic erythroblast)和正染性成红细胞(orthochromatophilic erythroblast)。 
在本说明书中，所谓“试样”指，采自哺乳动物(优选人)的体液试样，其包括采自哺乳动物(优选人)的血液、骨髓液和尿液以及用单采血液成份技术从哺乳动物(优选人)采集的试样等。 
试样分析用试剂含有全碳原子数4～8的醇。在本说明书中所谓“碳原子数4～8的醇”指1个醇分子中的全碳原子数为4～8个的醇。上述醇最好是也可用苯基或苯氧基置换、全碳原子数4～8的脂肪族的醇。作为上述醇可以举例如下：1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇、1-辛醇、2-辛醇、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、异戊醇、异辛醇、2-苯基乙醇、2-苯氧基乙醇等。上述醇最好是选自以下成份构成的群组：1-丁醇、2-丁醇、1-戊醇、1-庚醇、异丁醇(2-甲基-1-丙醇)、异戊醇、2-苯基乙醇、2-苯氧基乙醇等。这些醇可以使用其中1种或2种以上。 
试样分析用试剂由于含有全碳原子数4～8的醇，比以往的试剂加强了区分嗜碱性细胞和嗜碱性细胞以外的白细胞的功能以及识别有核红细胞的功能。 
试样分析用试剂中的上述醇的浓度可因所用醇的种类适当选择。比如，醇的浓度可以是试样分析用试剂的0.01～10％(重量比)，最好是0.01～5％(重量比)。通过在试样分析用试剂中添加此范围量的醇，可以加强区分嗜碱性细胞和嗜碱性细胞以外的白细胞的功能以及识别有核红细胞的功能。 
试样分析用试剂中所含荧光色素为上述通式(I)和(II)所示物质。
本说明书中，通式(I)和(II)中的“烷基”可以是直链或分链。烷基的碳原子数一般为1～20，最好为1～10，但从荧光色素的水溶性考虑，碳原子数1～6更好。作为理想的烷基可以举例出甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和已基等。 
作为通式(I)中的阴离子X-，有诸如F-、Cl-、BR-及I-等卤素负离子、CF3SO3 -、BF4 -、ClO4 -等。 
在本说明书中，通式(II)的“酸性基”包括能释放质子的基和能释放质子的基释放了质子后的基两种基。能释放质子的基有羧基、磺酸基和磷酸基，其中以羧基或磺酸基为佳。 
上述酸性基也可形成盐。这种盐包括：钠盐、钾盐等碱性金属盐和铵盐、烷基铵盐等。其中比较理想的盐是碱性金属盐或烷基铵盐，更好的是钠盐或三乙铵盐。即，酸性基的较理想的抗衡离子是碱性金属离子或烷基铵离子，更好的抗衡离子是钠离子或三乙铵离子。 
上述通式(I)、(II)的荧光色素可以使用1种或2种以上。 
上述荧光色素比如可以购买株式会社林原生物化学研究所的产品。 
试样分析用试剂中色素的浓度可以根据色素种类适当选择，一般为0.01～100mg/L、比较适宜的为0.1～10mg/L、更理想的是0.3～6.0mg/L。 
用试样分析用试剂对血细胞染色时，最好让妨碍有核红细胞和白细胞(淋巴细胞、单核细胞、中性细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞)测定的红细胞溶血，破损有核红细胞和白细胞的细胞膜。通过这种破损处理，荧光色素的透射性更高，可以更有效地对血细胞染色。 
一般来说，以大约150mOSm/kg以下的渗透压即可使红细胞的细胞膜产生微孔，红细胞内部的血红蛋白通过该微孔溶出，则红细胞在光学上变为透明(溶血)。在光学上透明的红细胞实际上不会成为使用流式细胞技术进行测定的障碍。红细胞的溶血比较适用低渗透压条件和低pH条件。满足 这两个条件的渗透压是20mOSm/kg～150mOSm/kg。 
试样分析用试剂的pH值以2.0～4.5为宜，2.0～3.5更好。pH值只要在此范围内，嗜碱性细胞的颗粒就会稳定，就能够在不对白细胞和有核红细胞等产生过度影响的情况下，高效地使红细胞溶血。通过这种处理，无核的红细胞的散射光和荧光变得极其微弱，实际上不会给有核红细胞和白细胞的测定造成负面影响。 
上述试样分析用试剂的pH值也可用缓冲剂调整。比较适宜的缓冲剂为在所期望的pH值±2.0附近有pKa的缓冲剂。作为此种缓冲剂，比如可以使用柠檬酸、苹果酸、二甘醇酸、丙二酸和马来酸等。 
试样分析用试剂中的上述缓冲剂浓度只要能保持pH值在上述范围内即可，无特别限定。 
为了使试样分析用试剂的渗透压在适于红细胞溶血的范围内，可以使用NaCl、KCl等电解质和糖类等。也可根据上述缓冲剂浓度调整渗透压。 
试样分析用试剂应含有使红细胞溶血并给白细胞细胞膜以荧光色素能透射程度的破损的表面活性剂。该表面活性剂最好使用阳离子型表面活性剂。其中以季铵盐或吡啶鎓盐为宜。 
作为较适合的季铵盐，可以例举下式表示的季铵盐： 
【结构式1】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000101
式中，R7、R8和R9为氢原子、C1-8烷基或C6-8芳烷基，彼此相同或不同。R10为C8-18烷基、C8-18链烯基或C6-18芳烷基；X-为阴离子。 
作为较好的吡啶鎓盐型的表面活性剂，可例举出下式所示吡啶鎓盐：
【结构式2】 
式中，R11为C8-18烷基；X-为阴离子。 
这些表面活性剂已经公开，比如可以使用日本已公开专利申请公告第2002-148261号上发表的东西。 
作为上述表面活性剂可以举出以下具体例子：十二烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、辛基三甲基氯化铵、月桂三甲基溴化铵、月桂三甲基氯化铵、十四烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基氯化铵、氯化月桂吡啶鎓等。 
试样分析用试剂中的上述表面活性剂浓度以10～10000mg/l为宜，100～5000mg/l更好。浓度只要在此范围内，即可在不过度影响白细胞和有核红细胞的情况下高效地使红细胞溶血。 
试样分析用试剂最好至少含有一种分子内至少有一个芳香环的有机酸(以下称“芳香族有机酸”)或其盐。这样可以更有效地在短时间内使红细胞溶血。比较理想的芳香族有机酸是水杨酸或酞酸。 
试样分析用试剂中的上述芳香族有机酸或其盐的浓度，没有特别限定，只要是试样分析用试剂pH值达到上述范围的浓度即可。芳香族有机酸或其盐的浓度可以是0.1～100mM，1～50mM更好。 
将上述荧光色素和全碳原子数4～8的醇溶解于适当的水性溶媒中，使其达到上述浓度，即可得到试样分析用的试剂。也可在试样分析用试剂调制步骤中，根据需要将上述荧光色素和全碳原子数4～8的醇、上述表面活性剂和芳香族有机酸或其盐溶解于适当的水性溶媒中，使其达到上述浓度。另外，在试样分析用试剂调制步骤中，也可根据需要使用NaOH和HCl等调整pH值。
也可以将分别溶解于适当溶媒的荧光色素溶液和醇溶液混合，使这些成份的最终浓度达到上述范围来得到试样分析用试剂。还可以在获取试样分析用试剂步骤中，根据希望，将分别溶解于适当溶媒的荧光色素溶液和醇溶液与表面活性剂溶液和芳香族有机酸或其盐的溶液混合，混合至其各成份的最终浓度达到上述范围。在获取试样分析用试剂阶段，可根据需要用NaOH、HCl等调整pH值。 
关于上述适当溶媒无特别限定，只要能溶解上述成份即可。例如有水、酒精、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)以及这些混合液等。 
试样分析用试剂最好以试样分析用试剂：试样的容量比为5～1000:1、最好10～500:1的量与试样混合。以这种比例混合试样分析用试剂和试样，制备测定用试样，可以加快红细胞的溶解，更好地对血细胞成份染色。试样的量只要有数μL～100μL即能较好地进行测定。 
作为本发明一个实施例的试样分析用试剂盒含有上述表面活性剂、碳原子数4～8的醇和荧光色素。其中，最好将表面活性剂和全碳原子数4～8的醇装入同一容器作为第一试剂，以含荧光色素的试剂作为第二试剂。用于第一试剂和第二试剂的溶媒无特别限定，只要能够溶解表面活性剂或荧光色素即可。比如可以用水、酒精、有机溶媒(乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等)及其混合液等。荧光色素有时在水溶液中长期保存稳定性低，此时，最好将荧光色素溶解在上述有机溶媒中。 
第一试剂也可以包含上述芳香族有机酸或其盐。或者试样分析用试剂盒还可以除第一试剂和第二试剂外，另有含芳香族有机酸或其盐的第三试剂。 
作为本发明一个实施例的试样分析方法包括以下步骤：用上述荧光色素和全碳原子数4～8的醇对试样中的血细胞染色；激光照射经染色的血细胞，获取散射光信息和荧光信息；根据获取的散射光信息和荧光信息将试 样中的嗜碱性细胞和/或有核红细胞与其他白细胞成份区分并计数。在该染色步骤中，最好先使红细胞溶血，破坏被溶血的红细胞以外的其他细胞的细胞膜，使荧光色素能透射，再对受损的血细胞进行染色。 
在该染色步骤中，将荧光色素和全碳原子数4～8的醇与试样混合。最好在此步骤将荧光色素、全碳原子数4～8的醇、上述表面活性剂和试样全部混合。此时，此表面活性剂会给血细胞细胞膜以荧光色素能透射程度的破坏，因此，通过混合表面活性剂和试样可以有效地对待测血细胞荧光染色。 
在该染色步骤中，如果使用表面活性剂，混合表面活性剂、荧光色素、全碳原子数4～8的醇和试样的顺序无特别限定。可以先混合表面活性剂、荧光色素和全碳原子数4～8的醇，再将其混合液与试样混合。也可以先混合表面活性剂和试样，再将其混合液与荧光色素和全碳原子数4～8的醇混合。无论用哪个顺序混合都能得到同样的测定结果。 
在上述染色步骤中，也可以将试样分析用试剂与试样混合，或将上述试样分析用试剂盒的各组份与试样混合。 
在上述染色步骤中，将荧光色素、全碳原子数4～8的醇和试样混合后，最好使其在一定温度下反应一定时间。反应温度以15～50℃为宜，最好20～40℃。反应时间以5～120秒为宜，最好5～30秒。 
在上述染色步骤被染色的血细胞可以用流式细胞仪进行分析。下面就用流式细胞仪分析血细胞的过程进行说明。当染色的血细胞通过流式细胞仪的流动室时，通过激光照射血细胞，可得到散射光信息和荧光信息。作为散射光信息，只要是市面上出售的流式细胞仪能够测定的散射光即可，无特别限定。比如前向散射光(如受光角度0～20度附近)、侧向散射光(受光角度90度附近)等的散射光光幅、散射光强度等都可作为散射光信息。众所周知，侧向散射光反映细胞核和颗粒等细胞内部信息，前向散射光反 映细胞大小等信息。在试样分析方法中，最好使用前向散射光强度作为散射光信息。 
所谓荧光信息，指以适当波长的光照射测定用试样、测定励起的荧光所得到的信息。根据所用荧光色素不同，可以选择适当的受光波长。荧光从被上述荧光色素染色的细胞内的核和颗粒产生。 
所用流式细胞仪的光源无特别限定，可以选择适于荧光色素励起的波长的光源。比如可使用红色半导体激光器、蓝色半导体激光器、氩激光器、He-Ne激光器等作为流式细胞仪的光源。特别是半导体激光器比气体激光器便宜很多，作为流式细胞仪的光源更合适。 
根据上述测定的散射光和荧光，可以从其他细胞成份中区分有核红细胞和嗜碱性细胞并计数。此步骤最好包括比如(1)以荧光信息和前向散射光信息为二轴绘制散点图；(2)用适当分析软件分析所得散点图。当以荧光强度为X轴、以前向散射光强度为Y轴绘制散点图时，如图1所示，各细胞成群(聚类)分布。在这种散点图中，有核红细胞比粒细胞(中性细胞、嗜酸性细胞和嗜碱性细胞)个头小，故出现在前向散射光强度比粒细胞弱、荧光强度比白细胞弱的区域。因此而能明确区分白细胞和有核红细胞。嗜碱性细胞出现在荧光强度比嗜酸性细胞和中性细胞小的区域，因此能够明确将嗜碱性细胞与其他粒细胞明确区分开。至于散点图上的各群对应于哪个血细胞，要待用上述试剂处理了只含各血细胞的试样后，通过测定、确认各群出现位置才能划定。 
通过用适当分析软件分析散点图上的细胞群，能够计算出有核红细胞和嗜碱性细胞的数量和比例。具体而言，在散点图中，当确认细胞群出现在被认为是某一特定细胞(假设A细胞)出现的位置时，首先划定此细胞群的中心，然后将从此中心到其他细胞(假设为B细胞)群出现区域之间直至特定A细胞出现的部分止设为此A细胞群的界限。出现在所设区域内的细 胞即可作为特定A细胞计数。 
通过对嗜碱性细胞以外的白细胞计数，可以算出嗜碱性细胞对全白细胞的比率(嗜碱性细胞/全白细胞：以下称“嗜碱性细胞比率”)和有核红细胞对全白细胞的比率(有核红细胞/全白细胞：以下称“有核红细胞比率”)。有核红细胞比率通常用每100个白细胞出现的有核红细胞的百分率表示，单位记为“个/100WBC”。 
使用上述试样分析用试剂、试样分析用试剂盒及试样分析方法，可以明确将有核红细胞形成的细胞群、嗜碱性细胞形成的细胞群分别从其他血细胞形成的细胞群区分开。因此可以更准确地对有核红细胞和嗜碱性细胞进行计数。 
下面用实施例更详细地说明本发明。对于本发明可以进行各种变更和修饰，本发明的范围不受以下实施例所限。 
实施例 
在以下实施例中使用的荧光色素如下： 
NK-3383 
【结构式3】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000151
【结构式4】
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000161
【结构式5】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000162
【结构式6】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000163
【结构式7】
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000171
【结构式8】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000172
【结构式9】 
【结构式10】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000174
【结构式11】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000181
比较例1 
分别从2名受检者采集血液，用XE-2100自动血细胞计数仪(希森美康公司制：配备红色半导体激光器(633Nm))测定两血样标本中所含嗜碱性细胞，算出嗜碱性细胞比率。试剂使用的是STROMATOLYSER-FBII(希森美康公司制)。 
测定结果，确认这些试样嗜碱性细胞的含量很高(以下将此试样称为BaSO试样1和BaSO试样2)。BaSO试样1的嗜碱性细胞比率为2.3％，BaSO试样2的嗜碱性细胞比率为1.2％，将这些结果与实施例1作比较。 
接下来，以从不同于上述受检者的其他2名受检者采集的血液作为试样，用XE-2100自动血细胞计数仪测定两血样标本中所含有核红细胞，计算出有核红细胞比率。试剂使用的是STROMATOLYSER-NR(希森美康公司制)。 
测定结果，确认这些试样有有核红细胞出现(以下将此试样称为NRBC试样1和NRBC试样2)。NRBC试样1的有核红细胞比率为4.0个/100WBC，NRBC试样2的有核红细胞比率为20.2个/100WBC。将此结果与实施例1比较。 
实施例1 
将含有水杨酸10mM(pH：2.7)、1-丁醇2％和十二烷基三甲基溴化铵 (DTAB)3000ppm的水溶液1mL放入35℃恒温槽。在此水溶液分别加入图2和图3所示的各种色素(NK-3383 6ppm、NK-1840 2ppm、NK-22226ppm、NK-5056 6ppm、NK-2001 2ppm、NK-2002 2ppm、NK-20032ppm、NK-4242 2ppm和NK-3606 2ppm)溶解，使其分别达到前述浓度，得到含各种色素的各种试样分析用试剂。 
所得试样分析用试剂1mL与血样(BaSO试样1或2或者NRBC试样1或2)20μL充分混合，将所得测定用试样在恒温槽(35℃)反应20秒。反应后将测定用试样从恒温槽取出，送至有633nm励起光源的流式细胞仪检测器。检测器用励起光照射测定用试样中的血细胞，检测从该细胞发出的散射光信号和荧光信号。分析所得信号，测定测定用试样中的嗜碱性细胞、有核红细胞和全白细胞。此测定使用XE-2100自动血细胞计数仪进行。 
在BaSO试样1中分别添加含NK3383的试剂、含NK1840的试剂、含NK2929的试剂和含NK5056的试剂进行测定。 
在BaSO试样2中分别添加含NK9001的试剂、含NK9002的试剂、含NK9003的试剂、含NK4249的试剂及含NK3606的试剂进行测定。 
在NRBC试样1中分别添加含NK3383的试剂、含NK1840的试剂、含NK2929的试剂和含NK5056的试剂进行测定。 
在NRBC试样2中分别添加含NK9001的试剂、含NK9002的试剂、含NK9003的试剂、含NK4249的试剂及含NK3606的试剂进行测定。 
就各个测定用试样绘制以荧光强度和前向散射光强度为二轴的散点图。绘制的散点图如图2和图3所示。根据散点图，对全白细胞、嗜碱性细胞和有核红细胞进行计数，算出嗜碱性细胞比率和有核红细胞比率。将根据比较例1和本实施例算出的BaSO试样中的嗜碱性细胞比率显示为表1，将根据比较例1和本实施例算出的NRBC试样中的有核红细胞比率显示为表2。
【表1】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000201
【表2】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000202
从图2和3可以看出，使用本实施方式的试样分析用试剂，嗜碱性细胞被从嗜碱性细胞以外的白细胞成份明确区分开，有核红细胞也被明确区分开。如此，嗜碱性细胞和有核红细胞分别被明确区分出来。因此，如图2和3所示，在散点图上出现在一定区域内的细胞得以作为嗜碱性细胞和有核红细胞正确求出其个数和对全白细胞的比率。 
从表1和2可以看出，实施例1算出的比率和比较例1算出的比率值很近似，因此可以确认，使用本实施方式的试样分析用试剂能够以与分别 使用不同试剂测定有核红细胞和嗜碱性细胞时(比较例1)同样的精度测定有核红细胞和嗜碱性细胞。 
实施例2 
将含有水杨酸10mM(pH：3.0)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)3000ppm的水溶液1mL放入35℃的恒温槽。在此混合液中分别加入图4和图5所示的醇(1-庚醇0.05％、1-戊醇2％、1-丁醇2％、异丁醇2％、2-丁醇1％、异戊醇1％、2-苯氧基乙醇0.5％、2-苯基乙醇0.5％)，使其达到上述浓度。在各混合液中添加荧光色素NK-2929达到6ppm。在所得各试样分析用试剂1mL中添加血样20μL，充分混合。将所得测定用试样在恒温槽(35℃)反应20秒。反应后将测定用试样从恒温槽取出，与实施例1一样用流式细胞仪检测。 
就各个测定用试样绘制以荧光强度和前向散射光强度为二轴的散点图。绘制的散点图如图4和图5所示。根据散点图，对全白细胞、嗜碱性细胞和有核红细胞进行计数，算出嗜碱性细胞比率和有核红细胞比率。 
再对与上述测定中所用试样相同的试样，如比较例1所述，用XE-2100自动血细胞计数仪测定嗜碱性细胞比率或有核红细胞比率。 
这些结果如表3和4所示。表3显示关于试样中嗜碱性细胞比率的结果，表4显示试样中有核红细胞比率。 
【表3】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000211
【表4】 
Figure DEST_PATH_S071A9477320070706D000221
从图4和5以及表3和4的结果得知，使用含有全碳原子数4～8的醇的试样分析用试剂可明确将嗜碱性细胞与嗜碱性细胞以外的白细胞成份区分开，也可以将有核红细胞明确区分。

Claims (10)

1.一种用于测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂，其中所述试样分析用试剂的pH值为2.0～4.5，包含：
(a)碳原子数为4～8的醇；
(b)阳离子型表面活性剂；
(c)选自通式(I)化合物和通式(II)化合物中至少一种的荧光色素；
通式(I)
Figure FSB00000028149200011
式中，R1和R2为烷基，R1和R2相同或不同；
Figure FSB00000028149200012
R3、R4、R5和R6为氢原子或烷基，彼此相同或不同；
X-为阴离子；
通式(II)
Figure FSB00000028149200021
式中，R7和R8为也可含酸基的烷基，彼此相同或不同；
Figure FSB00000028149200022
R9、R10、R11及R12为氢原子或酸性基，彼此相同或不同；但是R7～R12中至少一个含酸性基；
R7～R12中酸性基可成盐，且R7～R12中的酸性基中至少一个基团释放质子。
2.根据权利要求1所述的试样分析用试剂，其中所述醇选自丁醇、戊醇、庚醇、异丁醇、异戊醇、2-苯基乙醇、2-苯氧基乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的试样分析用试剂，其中所述酸性基是羧基或磺酸基。
4.根据权利要求1所述的试样分析用试剂，其中所述可成盐的酸性基的抗衡离子是碱性金属离子或烷基铵离子。
5.根据权利要求1所述的试样分析用试剂，其中还包含用于红细胞溶血及破坏白细胞细胞膜以透射荧光色素的所述阳离子型表面活性剂。
6.根据权利要求1所述的试样分析用试剂，其中所述阳离子型表面活性剂为季铵盐型或吡啶鎓盐型。
7.根据权利要求1所述的试样分析用试剂，其中所述试剂中还含有芳香族有机酸。
8.根据权利要求7所述的试样分析用试剂，其中所述芳香族有机酸选自水杨酸、水杨酸盐、酞酸和酞酸盐。
9.一种测定嗜碱性细胞和/或有核红细胞的试样分析用试剂盒，包含：
含有溶解红细胞并破坏白细胞细胞膜以透射荧光色素的阳离子型表面活性剂和碳原子数为4～8的醇、且pH值为2.0～4.5的第一溶液；
含有选自下述通式(I)化合物和通式(II)化合物中至少一种的荧光色素的第二溶液：
通式(I)
Figure FSB00000028149200031
式中，R1和R2为烷基，R1和R2相同或不同；
Figure FSB00000028149200041
R3、R4、R5和R6为氢原子或烷基，彼此相同或不同；
X-为阴离子；
通式(II)
Figure FSB00000028149200042
式中，R7和R8为也可含酸基的烷基，彼此相同或不同；
Figure FSB00000028149200043
R9、R10、R11及R12为氢原子或酸性基，彼此相同或不同；但是R7～R12中至少一个含酸性基；
R7～R12中酸性基可成盐，且R7～R12中的酸性基中至少一个基团释放质子。
10.一种试样分析方法，其包括以下步骤：
用权利要求1所述的试样分析用试剂或权利要求9所述的试样分析用试剂盒对试样中的血细胞染色；
激光照射上述经染色的血细胞、获取散射光信息和荧光信息；以及
根据上述散射光信息和上述荧光信息对上述试样中嗜碱性细胞和/或有核红细胞计数。
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Richard S. Lepkowicz, et al.Femtosecond-to-nanosecond nonlinear spectroscopyof polymethine molecules.Journal of the Optical Society of American B: Optical Physics22 12.2005,22(12),2664-2685.
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US 6168844 B1,图2，第7栏第2－3段，第8栏第3－4段.

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