JPH0540097A

JPH0540097A - 蛍光標識用色素、蛍光標識用色素で標識された生物由来物質、及びそれらを含有する試薬

Info

Publication number: JPH0540097A
Application number: JP19657891A
Authority: JP
Inventors: Mitsuo Katayose; 光雄片寄; Seiji Tai; 誠司田井; Hiroo Watanabe; 博夫渡辺
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1991-08-06
Filing date: 1991-08-06
Publication date: 1993-02-19

Abstract

(57)【要約】【目的】放射線光源として６７０〜７８０ｎｍに発振波
長をもつ小型の半導体レーザを用いて測定するための、
種々の抗原、薬物の分析やあるいはＤＮＡの塩基配列の
分析等に有用な試薬又は臨床検査試薬を提供する。【構成】化１で表される蛍光標識用色素、化１で表され
る蛍光標識用色素で標識されたビタミン、アルカロイ
ド、又はヌクレオチド等の生物由来物質、又はこれらを
含有する試薬。血液中の種々の抗原・薬物の分析やＤＮ
Ａの塩基配列の分析等に利用される。【化１】〔化１中、Ａ¹及びＡ²は芳香環を示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³
及びＲ⁴はアルキル基、アリール基、アリールスルフォ
ニル基、カルボキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、スル
フォン基、これらを置換基にもつアルキル基、水素原子
等を示し、Ｘ¹及びＸ²は、硫黄原子、酸素原子、Ｃ＝Ｏ
等を示し、Ｌはポリメチレン基を示す。〕

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、蛍光標識用色素、蛍光
標識用色素で標識された生物由来物質、及びそれらを含
有する試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】フタロシアニン類は種々の免疫分析に使
用できることが種々報告されている（ＵＳ特許第４,１
６０,６４５号公報、ＵＳ特許第４,１９３,９８３号公
報、ＵＳ特許第４,２２０,４５０号公報、ＵＳ特許第
４,２３３,４０２号公報、ＵＳ特許第４,２３５,８６９
号公報、ＵＳ特許第４,２５６,８３４号公報、ＵＳ特許
第４,２７７,４３７号公報、ＵＳ特許第４,３１８,７０
７号公報、ＵＳ特許第４,４８３,９２９号公報、ＵＳ特
許第４,５４０,６６０号公報、ＵＳ特許第４,５４０,６
７０号公報、ＵＳ特許第４,５６０,５３４号公報、ＵＳ
特許第４,６５０,７７０号公報、ＵＳ特許第４,６５６,
１２９号公報、ＵＳ特許第４,６５９,６７６号公報）。

【０００３】更に、フタロシアニン類は、化学発光免疫
分析系で触媒として使用されている〔Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．第５６巻、２９６５−２９６８頁
（１９８３）、同第５６巻、２２６７−２２７１頁（１
９８３）、同第５７巻、５８７−５８８頁（１９８
４）、同第５７巻、３００９−３０１０頁（１９８
４）、同第５８巻、１２９９−１３０３頁（１９８
５）〕。原らは、ルミノールと過酸化水素とのあいだの
化学発光反応の触媒として鉄フタロシアニンを用いて、
化学発光のシグナル量から、テストサンプル中の分析対
象を定量している。彼らは鉄及びコバルトのフタロシア
ニン並びに鉄、パラジウム、白金、マンガン及びスズの
ポルフィリン錯体について検討し、鉄フタロシアニンが
最も優れた触媒作用を示し、かつ高感度であることを報
告した。

【０００４】免疫分析で着色物質のほかに螢光物質が広
く利用されているが、さらに、酵素免疫分析において
も、螢光物質は感度を上げることができるので着色物質
よりも好んで使用されるようになってきている。よく知
られた螢光物質−酵素対はアルカリホスファターゼ（al
kaline phosphatase）と４−メチルウムベリフェリルホ
スフェート（4-methylumbelliferyl phosphate）、β−
ガラクトシダーゼ（β−galactosidase）と４−メチル
ウムベリフェリル−Ｄ−ガラクトピラノシド（４-methy
lumbelliferyl-D-galactopyranoside）、西洋ワサビの
パーオキシダーゼ（horse radish peroxidase）とｐ−
ヒドロキシフェニル酢酸（p-hydroxyphenyl acetic aci
d）等があり、これらの系の検出感度は１０^-15 Ｍであ
る。しかし検出感度をさらに上げようとしても生成する
螢光体の分析特性には限界がある。

【０００５】最近、蛍光量子収率が高く、水に対して高
い溶解性を示すフタロシアニン類を用いた試薬が提案さ
れた（ＷＯ特許第８８／０４７７７号公報、ＷＯ特許第
９０／０２７４７号公報、特開平１−２３３２２２号公
報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかし、フタロシアニ
ン類は、そのＱ−バンドの吸収域及び蛍光発光域が６５
５〜７００ｎｍの領域にあって、生体内物質として存在
する血液中のヘム等の吸収域（＜７００ｎｍ）と重なっ
ているため、その妨害を受ける欠陥がある。

【０００７】また、放射線光源は今後安価で小型の半導
体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）が主流になると考えら
れるが、６７０〜６９０ｎｍの半導体レーザで励起する
場合に、フタロシアニン類は蛍光発光領域がこれと同様
の波長域にあるため、照射レーザ光からの散乱光と蛍光
発光を区別することが困難であるだけでなく、７００〜
７８０ｎｍの半導体レーザで励起する場合には、フタロ
シアニン類は光を吸収できないため励起されず、したが
って検出薬としての役目を果たさない。更に、フタロシ
アニン類は大きなπ共役系を有するために会合しやすい
性質があり、会合体が生成すると蛍光量子収率が著しく
低下する欠点がある。

【０００８】本発明は、血液中に存在するヘム等の生体
内物質に影響されず、また、将来主流になると予想され
る安価で小型の半導体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）を
用いて測定するための、血液中の種々の抗原、薬物の分
析やあるいはＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬又
は臨床検査試薬を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は下記（１）〜
（６）に関するものである。すなわち、（１）化２

【化２】（化２中、Ａ¹及びＡ²は、それぞれ独立に、炭素原子及
び水素原子から成る芳香環、又は炭素原子及び水素原子
のほかに窒素原子及び／又は酸素原子及び／又は硫黄原
子から成る芳香環を示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、そ
れぞれ独立に、アルキル基、複素環残基、アルコキシ
基、アリーロキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ
基、アリール基、アラルキル基、アルキルカルボニルオ
キシ基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル
基、アルキルオキシカルボニル基、アルキルアミド基、
アルキルスルフォンアミド基、アルコキシカルボニル
基、アリーロキシカルボニル基、アリールカルボニルオ
キシ基、アリールアミド基、アルキルアミノ基、アルキ
ルカルバモイル基、アルキルスルファモイル基、アリー
ルカルバモイル基、アリールアミノ基、アリールスルフ
ォニル基、アリールスルフォンアミド基、水酸基、カル
ボキシ基、ハロゲン原子、アリールスルファモイル基、
シアノ基、ニトロ基、スルフォン酸、スルフォン酸塩、
カルボン酸塩、これらを置換基にもつアルキル基、又は
水素原子を示し、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立に、硫黄
原子、酸素原子、セレン原子、Ｃ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ
Ｒ⁵又はＣＲ⁶Ｒ⁷を示し、Ｒ⁵〜Ｒ⁷は、それぞれ独立に
Ｃ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基、Ｃ₆〜Ｃ₁₂のアリール基、又は
Ｃ₆〜Ｃ₁₂のアラルキル基を示し、Ｌは、ポリメチレン
基を示す。）（２）上記（１）の蛍光標識用色素を含有する試薬。（３）上記（１）の蛍光標識用色素で標識された生物由
来物質。（４）上記（３）の標識された生物由来物質を含有する
試薬。（５）生物由来物質がビタミン、アルカロイド又はヌク
レオチドである上記（３）の標識された生物由来物質。（６）生物由来物質がビタミン、アルカロイド又はヌク
レオチドである上記（４）の試薬。

【００１０】本発明の化２の化合物において、Ａ¹及び
Ａ²の炭素原子及び水素原子から成る芳香環の具体例と
しては、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナ
ントレン等があり、炭素原子及び水素原子のほかに窒素
原子及び／又は酸素原子及び／又は硫黄原子から成る芳
香環の具体例としては、ピリジン、１，２−ジアジン、
１，３−ジアジン、１，４−ジアジン、キノリン、イソ
キノリン、キノキサリン、１，３−ベンゾジアジン、
２，３−ベンゾジアジン、１，８−ジアザナフタレン、
１，５−ジアザナフタレン、１，７−ジアザナフタレ
ン、１，６−ジアザナフタレン、ピロール、イミダゾー
ル、チオフェン、フラン等がある。これらの芳香環は任
意の可能な位置で縮環できる。

【００１１】本発明の化２の化合物において、Ｒ¹〜Ｒ⁴
中のアルキル基又はアルキル基を含む基のアルキル基の
具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ｓ
ｅｃ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｉｓｏ−ブチル基、
ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等があり、アリ
ール基又はアリール基を含む基のアリール基の具体例と
しては、フェニル基、ナフチル基、アントラニル基、フ
ェナントレニル基等があり、複素環残基の具体例として
はピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル
基、キノリル基、イソキノリル基、キノキサリル基、ベ
ンゾピリミジル基、ベンゾピリダジル基、ジアザナフチ
ル基、ピロリル基、イミダジル基、チエニル基、フリル
基等がある。

【００１２】Ｌで表されるポリメチレン基としては、化
３、化４、化５及び化６で表される基等がある。

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

【００１３】化３、化４、化５及び化６中、ｌ及びｍは
０〜５の整数であり、Ｙは水素原子、メチル基等の低級
アルキル基、メトキシ基等の低級アルコキシ基、ジメチ
ルアミノ基、ジフェニルアミノ基、メチルフェニルアミ
ノ基、モルフォリノ基、イミダゾリジン基及びエトキシ
カルボニルピペラジン基等のジ置換アミノ基、アセトキ
シ基等のアルキルカルボニルオキシ基、メチルチオ基等
のアルキルチオ基、シアノ基、ニトロ基、又はハロゲン
原子等であり、また、Ｚは二重結合を共役させるための
基で、具体的には、−ＣＨ−、シクロヘキサジエン、シ
クロペンタジエン、インデン、１，４−ジヒドロナフタ
レン、１，２−ジヒドロナフタレン、５，８−ジヒドロ
キノキサリン、５，６−ジヒドロキノキサリンのほか、
化７及び化８に示す基などが挙げられる。

【化７】

【化８】ただし、化７及び化８中、Ｘ³はＮ−Ｒ⁸、硫黄原子又は
酸素原子であり、Ｒ⁸はアルキル基である。

【００１４】本発明において、化２で表される化合物
は、例えば、「大有機化学、含窒素複素環化合物Ｉ、４
３２ページ（朝倉書店）等の参考書に記載された方法に
よって合成できるし、またそれらの一部については市販
品も入手できる。化２で表される化合物の例示化合物を
化９〜化１７に示す。

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【００１５】本発明において用いられる生物由来物質と
しては、動物、植物、微生物（ウイルスを含む）等の生
物から得られるタンパク質・ペプチド、ヌクレオチド、
糖類、脂質、ホルモン、ビタミン、アルカロイド、抗生
物質、それらの複合物等があり、これらは、天然から抽
出したもの、人工的に完全合成したもの、あるい人工的
に半合成したもののいずれであってもよい。

【００１６】タンパク質・ペプチドの具体例としては、
血清アルブミン、ＩｇＧ・ＩｇＡ・ＩｇＭ・ＩｇＤ・Ｉ
ｇＥ等の免疫グロブリン、種々のタンパク質や白血球の
膜抗原に対するモノクローナル抗体、パーオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ
等の酵素等が挙げられ、ヌクレオチドの具体例としては
ＤＮＡ、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、合成ポリヌ
クレオチド、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ、ＵＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴ
Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴ
Ｐ、ｄｄＵＴＰ、あるいはそれらの誘導体等が挙げら
れ、糖類の具体例としては、グリコーゲン、デンプン、
マンナン等の多糖類のほかオリゴ糖やグルコース、マン
ノース等の単糖類が挙げられ、脂質としては、ホスファ
チジルコリン、ホスファチジルエタノラミン、脂肪、脂
肪酸等が挙げられ、ホルモンとしてはインシュリン、成
長ホルモン、オキシトシン、バソプレッシン、セクレチ
ン、上皮細胞成長因子、ガストリン、グルカゴン、カル
シトニン等のペプチド性ホルモン、アンドロゲン、エス
トロゲン、ハイドロコーチゾン等のステロイドホルモ
ン、アドレナリン、ノルアドレナリン等のカテコラミン
類等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンＡ、ビタミ
ンＢ₁、Ｂ₂、Ｂ₆、Ｂ₁₂、ｐ−アミノ安息香酸（以下、
ＰＡＢＡという）、ビオチン、葉酸、ビタミンＣ、ビタ
ミンＤ、ビタミンＥ等の各種ビタミンが挙げられ、アル
カロイドとしてはモルフィン等のアヘンアルカロイド、
アトロピン、スコポラミン等のトロパンアルカロイド、
ビンブラスチン、ビンクリスチン等のインドールアルカ
ロイド、オウレン等のイソキノリンアルカロイド等が挙
げられ、抗生物質としては、ペニシリン、セファロスポ
リン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェ
ニコール等が挙げられる。

【００１７】生物由来物質に蛍光標識用色素を結合させ
るためには、生物由来物質中のアミノ基、水酸基等の官
能基と蛍光標識用色素中のカルボキシル基、スルフォン
基等の官能基を利用して直接、イオン結合的又は共有結
合的に直接結合させるか、あるいは蛍光標識用色素が反
応できるように、生物由来物質の一部に結合基（リンカ
ー）を付加する等の化学修飾を施したのち、反応させれ
ばよい。蛍光標識用色素で標識された生物由来物質はク
ロマトグラフィー、再結晶等の慣用の分離手段により精
製することができる。

【００１８】化２で表される化合物は、芳香環やポリメ
チレン基を種々変えることにより、長波長域（７００ｎ
ｍ以上）の任意の波長域に吸収又は蛍光極大を移動さ
せ、生体中の種々のスペクトル的妨害因子の影響を除く
ことができるので、血液中の種々の抗原、薬物の分析や
あるいはＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬又は臨
床検査試薬として利用できる。

【００１９】

【実施例】以下、実施例により更に具体的に本発明を説
明する。ただし、化合物Ｎｏ．は化９〜化１７に示した
化合物Ｎｏ．に対応する。実施例１化合物（３）のＰＡＢＡ付加体の合成化合物（３）２５０ｍｇのクロロホルム溶液に、２５℃
でオギザリルクロリド１．０ｍｌを滴下した。室温で６
時間撹拌したのち、溶媒を除去し、化１８で表される化
合物（３）のスルフォニルクロライド誘導体（固体）を
得た。

【化１８】別に、水１．５ｍｌに炭酸ナトリウム８６ｍｇ及びＰＡ
ＢＡ５０ｍｇを加え、８０℃に加熱して溶かした液に、
上記のスルフォニルクロライド誘導体４９ｍｇを加え、
８０℃で６時間撹拌した。反応後、溶媒を除去し、得ら
れた固体を、１０重量％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに
溶かし、再度濃縮して、化１９で表される化合物（３）
のＰＡＢＡ付加体を得た。

【化１９】

【００２０】実施例２化合物（７）のＰＡＢＡ３分子
付加体の合成化合物（７）３００ｍｇのクロロホルム溶液に、２５℃
でオギザリルクロリド１．１ｍｌを滴下した。室温で６
時間撹拌したのち、化合物（７）のスルフォニルクロラ
イド誘導体（固体）を得た。別に、水２．０ｍｌに炭酸
ナトリウム９８ｍｇ及びＰＡＢＡ１３２ｍｇを加え、８
０℃に加熱して溶かした液に、上記のスルフォニルクロ
ライド誘導体５０ｍｇを加え、８０℃で６時間撹拌し
た。反応後、溶媒を除去し、得られた固体を、１０重量
％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに溶かし、化合物（７）
のＰＡＢＡ３分子付加体を得た。

【００２１】実施例３化合物（２３）のＰＡＢＡ付加
体の合成化合物（２３）２３４ｍｇのクロロホルム溶液に、２５
℃でオギザリルクロリド１．０ｍｌを滴下した。室温で
６時間撹拌したのち、化合物（２３）のスルフォニルク
ロライド誘導体（固体）を得た。別に、水１．５ｍｌに
炭酸ナトリウム７９ｍｇ及びＰＡＢＡ５０ｍｇを加え、
８０℃に加熱して溶かした液に、上記のスルフォニルク
ロライド誘導体４８ｍｇを加え、８０℃で６時間撹拌し
た。反応後、溶媒を除去し、得られた固体を、１０重量
％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに溶かし、化合物（２
３）のＰＡＢＡ付加体を得た。

【００２２】実施例４化合物（２４）のＰＡＢＡ２分
子付加体の合成化合物（２４）１８５ｍｇのクロロホルム溶液に、２５
℃でオギザリルクロリド１．０ｍｌを滴下した。室温で
６時間撹拌したのち、化合物（２４）のフォスフォリル
クロライド誘導体（固体）を得た。別に、水１．２ｍｌ
に炭酸ナトリウム６８ｍｇ及びＰＡＢＡ４６ｍｇを加
え、８０℃に加熱して溶かした液に、上記のフォスフォ
リルクロライド誘導体４３ｍｇを加え、８０℃で６時間
撹拌した。反応後、溶媒を除去し、得られた固体を、１
０重量％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに溶かし、化合物
（２４）のＰＡＢＡ２分子付加体を得た。

【００２３】実施例５化合物（２６）のＰＡＢＡ２分
子付加体の合成化合物（２６）〔商品名：ＮＫ−１９６７、（株）日本
感光色素研究所製〕４７３ｍｇのクロロホルム溶液に、
２５℃でオギザリルクロリド２．５ｍｌを滴下した。室
温で６時間撹拌したのち、化合物（２６）のスルフォニ
ルクロライド誘導体（固体）を得た。別に、水２．４ｍ
ｌに炭酸ナトリウム１３５ｍｇ及びＰＡＢＡ９１ｍｇを
加え、８０℃に加熱して溶かした液に、上記のスルフォ
ニルクロライド誘導体８５ｍｇを加え、８０℃で６時間
撹拌した。反応後、溶媒を除去し、得られた固体を、１
０重量％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに溶かし、化合物
（２６）のＰＡＢＡ２分子付加体を得た。

【００２４】実施例６化合物（２７）のＰＡＢＡ２分
子付加体の合成化合物（２７）〔商品名：ＮＫ−２６１２、（株）日本
感光色素研究所製〕５１３ｍｇのクロロホルム溶液に、
２５℃でオギザリルクロリド２．５ｍｌを滴下した。室
温で６時間撹拌したのち、化合物（２７）のスルフォニ
ルクロライド誘導体（固体）を得た。別に、水２．４ｍ
ｌに炭酸ナトリウム１３５ｍｇ及びＰＡＢＡ９１ｍｇを
加え、８０℃に加熱して溶かした液に、上記のスルフォ
ニルクロライド誘導体９４ｍｇを加え、８０℃で６時間
撹拌した。反応後、溶媒を除去し、得られた固体を、１
０重量％ＮＨ₄ＯＨを含むメタノールに溶かし、化合物
（２７）のＰＡＢＡ２分子付加体を得た。

【００２５】実施例７化合物（３）で標識されたモル
フィンの合成実施例１で得た化合物（３）のＰＡＢＡ付加体（７８ｍ
ｇ）のトリエチルアミン（０．９ｍｌ）溶液に、０℃で
クロロギ酸エチル１０ｍｌを撹拌しながら加えた。５分
間撹拌後、３−（４−アミノブチル）モルフィン３３ｍ
ｇを加え、室温で８時間撹拌して、化合物（３）で標識
されたモルフィンを得た。

【００２６】実施例８化合物（７）で標識されたモル
フィンの合成実施例２で得た化合物（７）のＰＡＢＡ３分子付加体を
用いたほかは、実施例７と同様に操作し、化合物（７）
で標識されたモルフィンを得た。

【００２７】実施例９化合物（２３）で標識されたモ
ルフィンの合成実施例３で得た化合物（２３）のＰＡＢＡ付加体を用い
たほかは、実施例７と同様に操作し、化合物（２３）で
標識されたモルフィンを得た。

【００２８】実施例１０化合物（２４）で標識された
モルフィンの合成実施例４で得た化合物（２４）のＰＡＢＡ２分子付加体
を用いたほかは、実施例７と同様に操作し、化合物（２
４）で標識されたモルフィンを得た。

【００２９】実施例１１アンチモルフィンモノクロー
ナル抗体に対する親和性試験モルフィン、アミノモルフィン並びに化合物（３）、化
合物（７）、化合物（２３）及び化合物（２４）で標識
されたモルフィンについて、アンチモルフィンモノクロ
ーナル抗体に対する親和性（モルフィンに対する親和性
を１．０とし、相対値で表す）をトリチウムをラベルし
たモルフィンとの競争反応により測定した。測定結果を
表１に示す。

【表１】 ────────────────────────── 化合物（抗原）相対親和性 ────────────────────────── モルフィン１．０アミノモルフィン１．０化合物（３）標識化モルフィン０．９化合物（７）標識化モルフィン１．０化合物（２３）標識化モルフィン０．９化合物（２４）標識化モルフィン１．０ ────────────────────────── 表１の結果から、化合物（抗原）による親和性の違いは
ほとんどみられず、モルフィンを化２で表される化合物
で標識しても抗体との親和性はほとんど変わらないこと
が分かった。

【００３０】実施例１２化合物（３）で標識されたオ
リゴヌクレオチド・プライマーの合成とＤＮＡ塩基配列
の分析への応用（１）リンカーが結合したオリゴヌクレオチド・プライ
マーの合成固相ＣＥＤ−フォスフォラミド法を用いた自動ＤＮＡ合
成装置によりプライマー（５’−ＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＧＡＣ−３’）を合成した。合成したプライマー
のリン酸化は、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭジチオスレイトー
ル、３ｍＭＡＴＰ、Ｔ₄−ヌクレオチドカイネースを含
む１００μｌの反応液中で３７℃、１時間保温して行っ
た。リン酸化されたプライマーは、ゲル濾過用カラムを
使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分
離し、リン酸化されたプライマーのピークを集め、凍結
乾燥で溶媒を除いた。次に、これを２５０ｍＭの１，２
−ジアミノエタン（ｐＨ６．０），２００ｍＭのエチル
−３（３−ジエチルアミノプロピル）カルボジイミド及
び１００ｍＭのＮ−メチルイミダゾール（ｐＨ６．０）
を含む反応液１００μｌ中、２５℃で一晩保温して５’
末端のグアノシンのリン酸部にリンカー〔ＮＨ₂−（Ｃ
Ｈ₂)₂−ＮＨ−〕を結合させた。

【００３１】（２）化合物（３）で標識されたオリゴヌ
クレオチド・プライマーの合成実施例７で得た、化合物（３）で標識されたモルフィン
と上記（１）で合成した５’末端グアノシンのリン酸部
にリンカーが結合したオリゴヌクレオチド・プライマー
を、０．２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）中で
混合し、２５℃で一晩、暗所に保温したのち、ＨＰＬＣ
で精製することにより、リンカーを介して化合物（３）
が結合したプライマーを得た。

【００３２】（３）ＤＮＡの塩基配列の分析既知の塩基配列のＤＮＡをサンプルとし、リンカーを介
して化合物（３）が結合したプライマーを用いて、それ
ぞれ４種の塩基でサンガー反応を行ったのち、それぞれ
別々のレーンで電気泳動分離し、７８０ｎｍの発振波長
の半導体レーザーを搭載したＤＮＡシークエンサーで分
析した。その結果、ＤＮＡの３００塩基までを９９％の
精度で決定できた。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、血液中に存在するヘム等
の生体内物質に影響されず、また、将来主流になると予
想されるに小型の半導体レーザ（６７０〜７８０ｎｍ）
を用いて測定するための、種々の抗原、薬物の分析やあ
るいはＤＮＡの塩基配列の分析等に有用な試薬又は臨床
検査試薬を提供できた。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】化１【化１】（化１中、Ａ¹及びＡ²は、それぞれ独立に、炭素原子及
び水素原子から成る芳香環、又は炭素原子及び水素原子
のほかに窒素原子及び／又は酸素原子及び／又は硫黄原
子から成る芳香環を示し、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は、それぞれ独立に、アルキル
基、複素環残基、アルコキシ基、アリーロキシ基、アル
キルチオ基、アリールチオ基、アリール基、アラルキル
基、アルキルカルボニルオキシ基、アルキルカルボニル
基、アリールカルボニル基、アルキルオキシカルボニル
基、アルキルアミド基、アルキルスルフォンアミド基、
アルコキシカルボニル基、アリーロキシカルボニル基、
アリールカルボニルオキシ基、アリールアミド基、アル
キルアミノ基、アルキルカルバモイル基、アルキルスル
ファモイル基、アリールカルバモイル基、アリールアミ
ノ基、アリールスルフォニル基、アリールスルフォンア
ミド基、水酸基、カルボキシ基、ハロゲン原子、アリー
ルスルファモイル基、シアノ基、ニトロ基、スルフォン
酸、スルフォン酸塩、カルボン酸塩、これらを置換基に
もつアルキル基、又は水素原子を示し、Ｘ¹及びＸ²は、それぞれ独立に、硫黄原子、酸素原子、
セレン原子、Ｃ＝Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、ＮＲ⁵又はＣＲ⁶Ｒ⁷
を示し、Ｒ⁵〜Ｒ⁷は、それぞれ独立にＣ₁〜Ｃ₁₀のアルキル基、
Ｃ₆〜Ｃ₁₂のアリール基、又はＣ₆〜Ｃ₁₂のアラルキル基
を示し、Ｌは、ポリメチレン基を示す。）で表される蛍光標識用
色素。
【請求項２】請求項１記載の蛍光標識用色素を含有する
試薬。
【請求項３】請求項１記載の蛍光標識用色素で標識され
た生物由来物質。
【請求項４】請求項３の標識された生物由来物質を含有
する試薬。
【請求項５】生物由来物質がビタミン、アルカロイド又
はヌクレオチドである請求項３記載の標識された生物由
来物質。
【請求項６】生物由来物質がビタミン、アルカロイド又
はヌクレオチドである請求項４記載の試薬。