JPH04506403A - 標識技術を用いた複数分析物の検出または定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′　いた　の　たは 本発明は、各物質がケミルミネサンス反応に関与できる別の分子または分子類と 連結して（“標識されてｍ）いる試料中において、複数の問題物質類（“分析物 “）のそれぞれのアッセイ、検出、定量、局在または分析のための方法および試 薬類に関する。

本明細書の目的のため、ケミルミネサンス反応は、電磁放射線の放出をもたらす 化学反応を伴うようなものとして定義される。このルミネサンスは、蛍光および りん光と明確に識別される。本文でルミネサンスとは、さらに正確にはケミルミ ネサンスとは、生体反応（パイオルミネサンス反応）による光放出も同様に包含 する。

ルミネサンス反応は、通常、他の試薬類、補因子類、または触媒（Ｄ）によって またはなしで、または物理的惹起剤の存在下において、少なくとも２分子（Ｓお よびＬ）間のものである。Ｌは、ルミノールのような光を発する物質である。

Ｓは、例えば酸素または過酸化水素のようなしと反応して励起させる物質である 。（もし存在するならば）Ｄは、酵素、ルシフェラーゼまたはフェリシアン化カ リウムのような補因子、および／または触媒または惹起剤である。Ｌおよび５間 の反応はＬの励起分子Ｌ＊への変換をもたらし、およびこの励起分子の非励起状 態への復帰は光子の放出をもたらす。Ｌおよび５間の反応およびＬ＊の非励起状 態への崩壊は自然に起きるか、または、補因子または触媒Ｄ１または温度のよう な物理的惹起剤の存在を必要とする。このような反応の例として、ルミノールの ＨＯによる酸化がある。触媒および補因子類は本文におけるように無機化合物類 であることがしばしする酵素パーオキシダーゼのように、生体材料から抽出する こともできる。

上記に述べたこれらの方法および試薬類はイムノアッセイ、タンパク質結合アッ セイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、細胞レセプターアッセイおよび特 定の結合相手または試薬との問題物質の結合を伴う他の同様の技術のような広範 囲の技術において使用できる。これらの連結型は、本文で“結合またはそうでな ければ連結”として言う。

問題の物質類は、ペプチド類、タンパク質類、ポリペプチド類、核酸類および生 物学上問題の他の物質類であることもできる。

結合アッセイは、生物学上問題の分子類の定量に多年にわたり使用されてきた。

結合段階が免疫反応、タンパク賀結合反応、細胞レセプターとの反応または相補 性の核酸ハイブリダイザ−２１２反応である数多くの例が示されてきた。これら の反応に基づく感度の良いアッセイでは、結合度したがって反応の別の成分−問 題物質−の濃度または質量が測定できるように、このような反応の結合相手のひ とつに付着するかまたは取り込まれる標識の使用を必要としている。前記基本的 結合反応の多くのバリエージ碧ンが記載されてきており、かつ、放射性同意元素 類、酵素類、蛍光分子類およびケミルミネサシス分子類を含む多くの異なる標識 類が使用されてきた。

これらのさまざまな組み合わせが、ホルモン類および薬物類のような小分子類か らヌクレオチド類のような大分子類にわたる広範囲の分析物類の検出および定量 のために順次使用されてきた。

一般的に述べれば、これらの技術類はｌ試験反応における単一分析物の探索に応 用されてきたに過ぎず、単一試験操作を使用して２分析物を木賃的に決定してき た例の数は限られている。これらの内で最も公知であるのは、ビタミンＢ１２と 葉酸およびまたチロキシンおよび甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンのための同時 イムノアッセイ類および／またはタンパク質結合アッセイ類であった。これらの 場合において、前記２種の興なる反応類を、それぞれについて異なる放射性同位 元素を使用して別々にモニターする。ここでは、放射線の放出が適当なガンマカ ウンターを用いて識別可能であるコバルト−５７およびヨウ素−１２５が用いら れる。類似の手段が、ルトロピンおよびフォリトロビン同時測定のためにも使用 できる。

放射性試薬類は、３つの大きな欠点を有している。まず第１に、標識の方法が高 放射性でよって潜在的に障害性の試薬類の使用を伴う。第２に、放射性標識物質 の保存期間が、まさにその本来の性質によって、放射性同位元素が間断なく崩壊 することばかりでなく、また、放射性１謙タンパク質類がしばしば不安定である ということのために、実質的にしばしば短いことである。第３に、感度よくかつ 迅速に検出可能な試薬を提供するほど十分にタンパク質類を標識することがしば しば困難である。ルミネサンスの測定は高感度でかつ極めて迅速であり、測定時 間は、通常放射能の測定に要する数分特表平４−５０６４０３　（４） というよりもどちらかといえば秒の単位である。ルミネサンス反応に通常は関与 できない物質類にルミネサンス反応に関与可能な物質を共有結合または非共有結 合で結合することで、極めて少量で迅速に測定できる試薬を提供する。

いわゆる“二重標識”糸類において異なる蛍光分子類の使用に関する研究が記載 されてきた。しかし、蛍光標識系類は、通常、物質類のおおまかな分析しか可能 でな（、かつ、感度の良い分析には一般には適していない。また、蛍光系では、 試料はＵ、Ｖ、照射によって照射されて蛍光を測定し、および、このことは、退 色による深刻な問題を引き起こす。蛍光原類の使用に基づく複数分析物イムノア ッセイが記載されており、その中で使用した異なる標識類は、異なる波長で発光 する異なるランタナイド金属類のキレート類であった。使用したある蛍光原類が 低量子収率を有していることおよびこれらの材料類に基づく通常全てのアッセイ が高レベルの挙動を達成するために複雑な機器および化学を必要としていること のために、ここで限界が生じるが、このことは多くのケミルミネサシス系類の特 徴である（参考文献１）。

大まかに述べれば、本発明の１側面によれば、試料に含有された複数の問題物質 類のそれぞれのアッセイ、検出、定量、局在または分析のための方法が提供され 、これは、１種以上のそれぞれ識別可能なケミルミネサンス反応に関与可能な成 分類で前記物質類のそれぞれを標識することからなる。

もうひとつの側面では、本発明は、少なくとも２種の問題の物質類を含有する試 料のアッセイ、検出、定量、局在または分析のための方法を提供し、これは、（ １）前記試料を処理し少な（とも第１および第２の複合体類を形成し、前記第１ の複合体は、１次ケミルミネサンス反応に関与可能な第１試薬に結合またはそう でなければ連結した前記物質類のひとつ、またはそれぞれの関連物質であり、前 記第２の複合体は、前記１次ケミルミネサンス反応のそれとは識別可能な発光特 徴を有している２次ケミルミネサンス反応に関与可能な第２試薬に結合またはそ うでなければ連結した前記物質類のひとつ、またはそれぞれの関連物質から作製 されていること、 （２）その後前記第１および第２複合体類含有前記試料を処理し、前記１次およ び２次ケミルミネサンス反応を起こさせること、および （３）前記ケミルミネサンス反応のそれぞれの発光を観察し、検出し、測定しお よび／または記録すること−からなる。

さらにもう一つの面では、本発明は、それぞれ異なる結合相手に結合またはそう でなければ連結可能な少なくとも２つの物質類の混合物からなり、前記物質類の ひとつはそれぞれ１種のケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上の成分類で 標識されており、かつ、前記物質類のもうひとつは、発光特性が前記１種のケミ ルミネサンス反応と識別可能なそれぞれ他のケミルミネサンス反応に関与可能な １個以上の成分類で標識されている。

我々は、適切な化学操作によって速度および発光波長の観点から興なる特性を有 している興なるケミルミネサンス標識が産生できることおよびこれらの興なる標 識類は分析物結合系において有効に使用でき単−試験操作内で２個以上の興なる 分析物類を実質的に同時定量可能であることを発見した。

ケミルミネサシス分子類の構造におけるある変化が放出した光のスペクトルに変 化を引き起こすことが公知である。最近、光放出末端による従来の酵素イムノア ッセイが複数アッセイに使用できることが示唆された（参考文献２）が、但し、 これがどのようにして達成できるかは教示されていないし、または、このような アッセイがどのようにして行われるのかも自明ではない。また、この示唆を裏付 けるいかなるデータもない。ルミネサンス末端酵素イムノアッセイを使用するこ とに対して、発光分子類そのものが生物学上の問題物質類に連結する状況につい て相当するような示唆が全くなされていない。酵素修飾（モジュレーション）に 対してこのような直接標識法を使用することの利点は十分に確立されており、簡 便性、堅固性および感度の観点から利点が得られる。このような系の利点がいか にして複数分析物アッセイ用に開発されることができるのかに関する教示は全く ないし、または、このようなアッセイを行うためにどんな機器が必要であるかな どについて自明でもない。さらに最近になって、遺伝操作によるパイオルミネサ ンス反応のルシフェラーゼ成分の修飾（参考文献３）が、対応するルシフェリン の化学構造を修飾する代替えとしてこのような反応による発光の波長を修飾する 付加的手段を構成することが示された。

また別の面では、一般に、化学反応条件における変化または反応分子それ自体の 構造的変化がそれらのさまざまな可能な反応類の速度に影響を及ぼすことが公知 である。同様に、さらに詳細には、ケミルミネサンス反応のキネティックスがし ばしばケミルミネサンス分子によりて影響を受ける。例えば（参考文献４．５） 、アクリジニウム塩類のケミルミネサンス反応の速度はある構造的特徴に依存す ることが示唆されている。同様に、酵素駆動ケミルミネサシス反応類は基質類の 構造によって影響を受けるらしいことが報告されている（参考文献６）。このよ うなキネティックス上の相異にもとづく複数アッセイの開発にこれらのキネティ ックス上の効果が利用できることは教示されてもいす、また、このようなアッセ イがどのように構成されかつ利用されるのかはいかなる関連技術からも自明では ない。

本発明の非限定的実施例の検討が、アッセイ操作の特定実施例とともに以下に示 され、添付図面についての説明を行う二図１は、本発明による典型的試験操作の 発光強度対時間を示した略グラフであり；および 図２は、ヒト性腺刺激ホルモンおよびα−フェトプロティンのイムノケミルミネ サンスアッセイのための本発明による操作実施例における発光強度対時間を示し た略グラフである。

衾主五璽五 ＡおよびＢは問題の分析物でありかつそれぞれ１個を超える抗体に結合可能であ り、その結果、平行２サイトイムノアッセイが設定できる。ＡおよびＢを結合可 能な抗体類の混合物は、試験管壁土に塗布される。未知量のＡおよびＢを含有す る分析試料を、ＡおよびＢの他の部位に結合可能な可溶性相補性の抗体類の混合 物とともに試験管に添加する。ＡおよびＢに特異的な可溶性抗体類は、例えば迅 速および遅延発光のように識別可能な特徴を示すケミルミネサシス分子類で標識 されている。適切なインキュベーシミン時間後、２サイト免疫後合体が試験管側 面に形成され、この免疫複合体形成の度合いは、存在するＡおよびＢの量に依存 する。試験管の可溶性内容物のアスピレーシタンによる未結合物質類の除去後、 残存するケミルミネサンス発光が惹起され次いでルミノメータで測定される。放 出された光子の総数は、存在するＡおよびＢの総数に比例する。しかし、本実施 例では、Ａ特異的標識抗体類によるケミルミネサンス発光は１秒以内と迅速でか つ完全であり、一方、Ｂ特異的標識抗体類による発光は、はるかに遅くかつ開始 後火の１９秒間に崩壊前にピークに達する（図１参照）。したがって、総測定時 間２０秒間内におけるｌおよび１９秒の２つの別々の時間ウィンドウに放出され た光子の測定によって、系の校正後人およびＢの独立した定量が可能となる。

一セ　・ 本発明による方法は、単一分析物定量技術を用いて識別可能な生物学上問題の種 を定量できる。下記の実施例は、使用した結合反応の種類に関しての手引きとと もに示されている。

このリストは例示のためにのみ示されており、本発明を限定することを全く意味 していない： ｌ、イムノアッセイ： 薬物類、ビタミン類、ステロイド類、甲状腺ホルモン類、ペプチド類、ポリペプ チド類、タンパク質類、イムノグロブリン類、ウィルス類、細菌類、原生動物類 。

２、タンパク質結合アッセイ： ビタミン類、補因子類、酵素阻害剤ＩＩ。

３、核酸ハイブリダイゼーションアッセイａ：オリゴヌクレオチド類、ポリヌク レオチド類、ＤＮＡ、ＲＮＡ。

癌遺伝子類、微生物類。

４、レセプター結合アッセイ： プロゲステロンレセプター類、エストロゲンレセプター類、チロトロピン（甲状 腺刺激ホルモン放出ホルモン）レセプター類、甲状腺ホルモンレセプターｇ。

ある対の分析物群がしばしば測定され、生体系のより完全な像を得、または生体 系の試験の効率を向上させる。このような場合、本発明によって提供される同時 、複数分析物測定が利用可能であることは、独自の利点を有している。このよう な分析物群の例を下記に示したが、しかし、本発明の限定を意味していない。

１、ホルモンｆＩＩ： チロキシン／チロトロピン、ルトロピン／フォリトロピン、アドレノコルテコト ロビン／コルチゾール。

２、ビタミン類および補因子類： ビタミンＢ１２／葉酸、１．２５−ジヒドロキシコリカルシフェロール／２５− ヒドロキシコレカルシフェロール。

３、核酸類（ウィルス類および微生物類由来）：ナイセリア・ゴノルホエア（Ｎ ｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ）　／クラミジアートラコマティス（ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　Ｔｒａｃｂｏｍａｔｉｓ）。

４、腫瘍マーカー類： 前立腺特異的抗原／前立腺酸ホスファターゼ、α−フェトプロティン／癌胎児性 抗原／絨毛性ゴナドトロピン。

鼠１皿 ケミルミネサンス活性を適切な結合反応と連関させる好適な方法は、ケミルミネ サンス反応に関与できるケミルミネサンス分子のような成分を、特異的標識試薬 を産生ずるためにその結合反応の成分類のひとつに化学的または物理的に結合さ せることである。本発明によるこのルミネサンス試薬類は、したがって、それぞ れがキネティックス上および／または分光学的特性の観点から異なる特性の標識 を有する上記の標識試薬類を２個以上含有している。これらの標識試薬類のそれ ぞれは、一定の結合反応に関与するための特別の特異性を有しており、したがつ て、たとえ上記反応の２個以上が同時に起こっていても各一定の結合反応が別個 にモニターできる。

したがって、これらの平行結合反応類に関与する分析物を独立してかつ同時に定 量することができる。

いくつかの群のケミルミネサシス分子類の異なる構成員は、キネティックスおよ び／または分光学的特性の差異を示すことができ、したがうて、本発明に使用可 能であり、アクリジニウムおよび関連化合物類（例　フェナンスリジニウム化合 物ｌ［）、フタールヒドラジド類および関連化合物Ｗ１（例ナフタールヒドラジ ドｌＩ）、オキザレートエステル類および関連化合物類およびまた安定化ジオキ セタン類およびジオキセタン類を含む。このような群内の化合物類のバリエーシ ョン類については中等度の当技術者に周知であり、同様に、それらのケミルミネ サンス反応の量子収量、キネティックスおよび発光波長がそれらの構造によって 影響を受けることが公知である（上記および同様に参考文献７−１１参照）。し たがって、本発明における使用に適し、キネティックスまたは発光波長パラメー タ類が興なる複数の化合物類の構造は、当技術者によってそれぞれ容易に着想さ れる。

当業者は、例えば既存の文献から、これらの化合物類の検出との分解能を最大に するために、高量子収率の化合物から選択することおよび互いに対してそれらの 反応速度またはそれらの発光波長において実質的差異を有している化合物類を選 択することを知るであろう。アリルアクリジニウムエステル類は、所望のキネテ ィックスおよび分光学的パラメータ類をもたらすために作製された適切な化学修 飾を有する標識類として使用できる。このような化合物類のい（つかの例を下記 に示してあり、そして、本発明のいかなる限定も意味していない。

１、キネティックスバリエーション ａ、標準条件における光放出の継続＝０．８秒特表平４−５０６４０３　（６） ｂ、標準条件における光放出の継続＝６０秒１ａ、のアクリジニウムフェニルエ ステルにおいて、フェニル部分は電子吸引性であるＦ基によって置換でき、した がって、アクリジニウムフェニルエステルを修飾し、その結果、光の放出は、実 質的に短時間に起こる。ｌｂのアクリジニウムフェニルエステルにおいて、フェ ニル部分は電子供与性であるＣＨ３基によって置換でき、その結果、光の放出は 、実質的に長時間起こる。他の電子供与性および吸引性基も使用できる。

Ｃ９標準条件における光放出の継続（９，１０−ジフェニルアントラセン蛍光ア クセプター）＝３０分ｄ、標準条件における光放出の継続（９，１０−ジフェニ ルアントラセン蛍光）＝２分 表１は、群 ｔｌ／２（崩壊 Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５Ｒ６相半減期） ＣＨａ　ＨＨＨＨＨＯ，６ｓ ＣＨ３ＣＨ３０ＨＨＣ１３０Ｈ７ｓ Ｃ６Ｈ５Ｃ１２ＨＨＨＨＨＯ，５ｓ Ｃ１３ＣＨ３Ｂ　ＨＨＨＩｔｓ ＣＩ３Ｎｏ　ＨＨＮ０２Ｈ＜０．４ｓ ＣＨ３Ｉ　Ｃ１３ＣＨ３ＨＨＯ，７ｓ ＣＨ３Ｃ■３ＨＨＣＨ３ＣＨ３４Ｓ Ｃ１３Ｂｒ　ＨＨＢｒ　Ｈ＜０．４ｓ の例をさらに示している。

２、分光学的バリエーション ａ１発光λｗａｘ　〜４３０ｎｍ ｂ１発光λｌ１ａｘ〜５１０ｎｍ Ｒ 仁発光λ■ａｘ〜４３０ｎ瓢 ｄ８発光λｗａｘ　〜５２０ｎｌＩ ｅ０発光λｗａｘ　〜４３０ｎｍ ｆ、発光λｒａａｘ　〜５１２ｎｍ ２ｂにおいて、核の電子的結合が増加して、その結果、放出された放射線が実質 的に長波長である。

上記に例示したアクリジニウム化合物類のそれぞれにおいて、Ｒは、適切な結合 反応の成分に対する共有結合を可能とするために選択される。適切な結合基につ いてはよく記載されているが、本実施例においては分子のキネティックス上およ び／または分光学的特性の所望の特性が維持されるようにおよびまた最終標識試 薬がその結合反応への関与能力という観点からしてまだ活性であるように、選択 される。このような基には、Ｎ−ヒドロキシサクシイミドエステル類、イミデー トエステル類、イソチオシアナート類および他の確定された活性基類または生物 学上問題の分子類への結合を促進する活性基類を産生可能な基類である。好適に は、これらの基類が、適切な長さの脂肪族鎖によってケミルミネサンス部分に連 イされる。

さらに別の面では、蛍光アクセプター分子へのエネルギー移行を伴うケミルミネ サンス反応を使用することも同様に可能である。この１例として、フルオロセイ ンにひとつの特二性を有する抗体およびローダミンに別の特異性を有する抗イを 標識することが可能である。これらの抗体類は同時２サートアツセイにおいて使 用でき、そして、その末端は、バー；キシオキザレートケミルミネサンス系（過 酸化水素／ビス２．４−ジニトロフェニルオキザレート）の導入によって２定さ れる。放射線を伴わないエネルギー変換が起こり、２シの異なる波長（フルオロ セインによる緑−黄色／ローグミによる赤色）の光の放出をもたらし、この発光 の強度は、５疫化学反応において結合した関連標識抗体の量に直接比例でいる。

−　ム　雫　ム 下記の体系は、現在使用されている単一分析物濃度決定ｌために使用可能な結合 相手または結合反応の例を示したち・である： 鍵： ◇■　異なる分析物をＡおよびＢで示しであるイックスおよび／または分光学的 特性を示している。

分析物に対しである一定の特異性の抗体類は、前記ある分析物の興なる部分を認 識し、２サイト免疫後合体の形成を可能とする。分析物に対して過剰濃度の試薬 が２サイト系で使用される。

ｌｂ、競合結合イムノアッセイ（標識抗原）１ｃ、２サイト／競合結合（標識抗 原）併用１ｄ、２サイト／競合結合（標識抗体）併用競合結合系においては、限 定された試薬濃度が使用されることを明記されたい。

２　オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーシコンアツセイ類＋−一−−÷ 上記は、分析物／結合相手複合体が非複合材料から単離される不均質アッセイ系 の例の全てである。さらに、前記開示された糸類を均買アッセイに適用すること も可能である。

徽Ｉ 光子計数機器は、光強度の測定のために使用できる。検出機器は、識別可能なケ ミルミネサンス反応からの発光を識別可能であるべきである。

ＩＡ　−−ス　量 先の実施例において述べたように、本機器は、少なくとも２つの時間枠内におい て光強度の測定値（好適には、時間当たりの光子計数として）を記録可能であり 、遅速および迅速反応類から生じる強度を独立して測定できるようにするべきで ある。多くの例において２つのシグナル間に重なりがあるであろうが、時間枠の 適切な選択または前記型なりの数学的推定によって考慮に入れられる。

−Ｌ−透」Ｊすｌ歇■ ここでは、２種以上の波長強度を同時に測定することが必要である。これは、例 えば、それぞれバンドパスフィルターを設置した必要数の光電子増倍管を使用し て他を排除して１シグナルの測定を可能とすることによって、達成される。これ とは別に、単独の光電子増倍管は、前記反応によって放出された光がまず最初に 迅速スキャニングスペクトロメータまたはフィルター／チョッパー系を通過する ように使用できる。

光電子増倍管出力をスキャニングまたはチョッピング周波数とシンクロナイズさ せることで、異なる波長の独立した定量が可能となる。

艷ヱ爽凰五 １、標識抗体類の調製： ａ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈ　ＣＧ）に対する４−（２−カルボニルエチ ル）フェニル−１Ｏ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロス ルホネート標識抗体類。

アクリジニウム標識は、下記のようにして合成したニアクリジニウム−９−カル ボン酸（５ｇ）は、チオニルクロリド（１５＋ａｌ）で３時間、還流した。本溶 媒を減圧下に除去し、生成物を無水ピリジン（３５■１）中に懸濁した。４−ヒ ドロキシフェニルプロパノアートベンジル（９ｎｍｏｌ）を添加しかつ室温でこ の溶液を一晩撹拌した。本混合物を次に破砕水７１Ｍ塩酸（２５０鳳ｌ）中に注 ぎ、結果として生成した沈澱物をろ過し、水で洗浄しそして減圧下に乾燥した。

このようにして得られた４−（２−ベンジルオキシカルボニルエチル）フェニル −９−アクリジンカルボキシレートをベンゼン／シクロヘキサンから再結晶した 。０．４６　ｇのこれを臭化水素／酢酸混合物（４５１５５ｗ／ｗ、１０■ｌ） 中に溶解し、かつ、本溶液を５０−５５℃で２時間撹拌した。本溶液を水（１０ ０ｍｌ）中に注ぎ、結果として生成した黄色固体をろ過し水で洗浄しかつ減圧下 に乾燥し、それによって、アセトニトリル／クロロホルムから再結晶し、４−　 （２−カルボニルエチル）フェニル−９−メチルアクリジニンカルボキシレート を得た。Ｎ−ヒドロキシサクシイミド（６２ｍｇ）をジメチルホルムアミド（５ ０１１）中に上記アクリジンカルボキシレートとともに溶解した。本混合物を一 ２０℃まで冷却し、そして、ジシクロへキシルカルボジイミド（ｉ２３ｍｇ）を 添加し、−２０℃で２時間、次に室温で１晩撹拌した。氷酢酸１滴を次に添加し て、本混合物をさらに３０分放置した。ジシクロヘキシル尿素をろ過によって除 去し、そして、酒精の蒸発によって得られた材料をベンゼン／シクロヘキサンか ら再結晶し、４−（２−サクシイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−９ −アクリジインカルボキシレートを得た。本生成物（２３４＋１ｇ）を無水クロ ロホルム（２５ｍｌ）中に溶解して、メチルフルオロスルホネート（０，５ｍ１ ）を添加した。室温で１８時間撹拌後形成された沈澱物をろ過して、無水ベンゼ ンで洗浄し、４−（２−サクシイミジルオキシカルボニルエチル）フェニル−１ Ｏ−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートフルオロスルホネートを得た 。ヒト絨毛性ゴナドトロピンに対して作製したマウスモノクローナル抗体類（５ ０℃ｇ）を０．１５Ｍ塩化カトリウ、ム含有リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７， ４，０，１Ｍ。

２００μｌ）′中に溶解した。保存溶液を、アセトニトリル中アクリジニウムサ クシイミジルエステル（０，５ｉ＋ｇ／ｍｌ）で作製し、ｌＯμｌを混合しなが ら抗体溶液に添加した。室温で１５分間、暗所でインキュベーション後、リシン ｌ塩酸塩の上記緩衝液溶液（１００μｌ　、　１０ｍｇ／ｍｌ）を添加しこの混 合物をさらに５分間放置した。前記混合物を、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アル ブミンおよび０．０５％（Ｗ／Ｖ）アジ化ナトリウム含有リン酸緩衝食塩水（ｐ Ｈ６，３，０，ＩＭ、０．０１Ｍ　ＮａＣ１）で平衡にしかつ溶出したファルマ シアセファデックス（ＰｈａｒｍａｃｉａＳｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　２５−　Ｍ カラム（３０ｃ＋ｌＸ　０．６ｃｍ）にて精製した。

０、５ｍｌの分画を採取し、モしてボイドボリューム分画類をプールし４℃に保 存した。

ｂ、ヒトα−フェトプロティン（ＡＥＰ）に対する４−（２−イミジルエチル− ）−２，６−シメチルー１０−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレートジ クロリド標識抗体類。

アクリジニウム標識は、下記のようにして合成したニアクリジニウム−９−カル ボン酸（２，５ｇ）は、チオニルクロリド（１０ｓｉ）で３時間、還流した。本 溶媒を減圧下に除去し、生成物を無水ピリジン（２５ｓｉ）中に懸濁した。２． ６−シメチルー４−ヒドロキシフェニルプロピオニトリル（１，３ｇ）を添加し かつ室温でこの溶液を一晩撹拌した。本混合物を次に破砕水／ＩＭ塩酸（２５０ ■ｌ）中に注ぎ、かつ結果として生成した沈澱物をろ過し、水で洗浄しそして減 圧下に乾燥した。このようにして得られた４−（２−シアノエチル）−２，６− シメチルフエニルアクリジニウムカルボキシレートを無水クロロホルム（１５＋ ｓｌ）中に溶解しかつメチルトリフルオロメチルスルホネート（０，５ｍ１）を 添加した。室温で１晩撹拌しかっジエチルエーテル添加後形成された沈澱物をろ 去し、そして無水ベンゼンで洗浄し、４−　（２−シアノエチル）−２，６−ジ メチル−フェニルー１０−メチル−９−アクリジニウムカルボキシレートトリフ ルオロメチルスルホネートを得、これを次に無水メタノール中に溶解した（８９ ｍｇ、１０履１）。ＨＣＩガスを窒素下に溶液中に通気し、氷温度で２時間保存 しかつさらに１時間放置した。形成された結晶を乾燥窒素雰囲気下にろ過し、そ して無水メタノールで洗浄し、４−　（２−メチルオキシイミジルエチル）−２ ，６−シメチルフエニルーｌ〇−メチルアクリジニウム−９−カルボキシレート ジクロリドを得た。ヒトα−フェトプロティンに対して作製したマウスモノクロ ーナル抗体類（５０Ｍｇ）を０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有リン酸ナトリウム緩 衝液（ｐＨ９，５、０，１Ｍ、　２００μｍ）中に溶解した。保存溶液を、アセ トニトリル中アクリジニウムサクシイミジルエステル（０，５＋＋＋ｇ／　ｍｌ ）で作製し、１９０μｌを混合しながら抗体溶液に添加した。室温で３０分間、 暗所でインキュベーション後、リシン１塩酸塩の上記緩衝液溶液（ｔｏｏμ！　 、　１０　ｍｇ／ｍｌ）を添加し、この混合物をさらに１５分間放置した。前記 混合物を、上記のようにして精製した。

２、固相抗体類の調整 標識抗体類によって認識されたものに対するヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびα −フェトプロティン認識顕著な抗原決定基に対するモノクローナル抗体類を、公 開された方法を用いて常磁性粒子に結合させた。

３、ヒト絨毛性ゴナドトロピンおよびヒトα−プロティンの１同時”イムノケミ ルミツメトリックアッセイ固相抗体懸濁液（８００μｍ）を等量混合した。標識 抗体溶液（１０ｎｇ／ｍｌ抗ｈ　ＣＧ、　５０　ｎｇ／５ｌｔｆｔＡ　Ｆ　Ｐ　 ）を等量混合した。希釈緩衝液は抗体精製緩衝液（上記）と同一であった。校正 のための標準混合物は、公知濃度のｈＣＧおよびＡＦＰをウマ血清中に含有する 溶液で構成されていた。患者血清試料５０μＩを１２Ｘ７５ａｕｉポリスチレン 試験管にデュプリケットで（二重に）入れた。標識試験管は、上記適切な標準物 賀５０μｌを用いてデュブリケットで設定した。標識抗体混合物１００μＩを添 加し、固相抗体混合物１００Ｉｉ１を続けた。洗浄溶液１　ａｌｌ　（１，７６ ｇ　／　１オルソリン酸二水素ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．５ ％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍａｘｉｄｅ）　、０．５％ウシ血 清アルブミン、１％（Ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００）を添加 後、固相の沈澱を促進するために磁気ラックに試験管を配置した。上清をデカン トし捨て、さらに洗浄緩衝液１ｍｌを添加後、試験管内容物を混合した。さらに 沈澱／デカント操作を行い、そして、この試験管をルミノメータに配置した。

４、光強度の測定 光放出の測定は、製造業者推奨の操作を用いてチバコーニングマジックライトア ナライザー（Ｃｈｉｂａ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍａｇｉｃ　ＬｉｔｅＡｎａｌｙｚ ｅｒ）中で行った。ソフトウェアを操作して、時間に対して光強度を明確に連続 的に積分できた。それぞれｈＣＧおよびＡＦＰ抗体類による光放出に対応しそれ によって試料中のｈＣＧおよびＡＦＰ濃度に比例する０、１および１−２秒の範 囲で分離積分を行った。ＡＦＰシグナルによるｈＣＧシグナルの干渉によって一 部重なりがあうなので、補正が必要であうた。このことは、図２でわかるように 、先に測定した〇−１秒間の積分に対する２秒時の光強度の関係を用いて、０− １秒積分に対するＡＦＰ寄与を推定することによって、達成された。

［ｈＣＧ］　光子　［ＡＦＰ］　光子　重なり　補正ｈＣＧ［ｈＣＧ］）［ＡＦ Ｐ］であるとき、第二時間ウィンドウにおける残留ｈＣＧシグナルは有意に寄与 し、したがって、Ｘの測定を変動させた。このことは実際には問題ではなく、例 えば、標識抗体類の特異活性の操作によって相対的アッセイ最適化によって最小 とすることができた。

相対濃度が極端である場合でさえも正確さが必要である状況においては、繰り返 しまたは同時等式計算が可能なより複雑なソフトウェアを使用することによって 、相互の重なりを考慮する。

重なりが重大な問題である場合、それらの相対的キネティックスにおける特性に 大きな差異を生じる代替え標識類を検索しなければならない。

Ｌ１又ぷ１ １、１．Ｈｅｌｌｍ１１ｓｉ、Ｓ、Ｈｏ１ｔｔｉｎｅｎ、に、Ｐｅｔｔｅｒｓｓ ｏｎ、Ｔ、Ｌｃｉｏｖｇｒｅｎ、クリニカルケミストリ（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ）３３（１９８７）２２８１２　、　Ｂ、　Ｅｄｗａｒｄｓ、 　Ａ、　５ｐａｒｋｓ、　Ｊ、　Ｃ，Ｖｏｙｔａ、　１．　Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ 　ジャーナル・オブ・パイオルミネサンス・アンド・ケミルミネサンス（Ｊｏｕ ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍ ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）ｊ４（１９９０）ｌ ３　、　Ｋ、　Ｖ、　Ｗｏｏｄ、　Ｙ、　Ａ、　ＬａＩＩ、　Ｗ、　Ｄ、　Ｍｃ Ｅｌｒｏｙ、　Ｈ，Ｈ，Ｓｅｌｉｇｅｒ　ジャーナル・オブ・パイオルミネサン ス・アンド・ケミルミネサンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓ ｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉ１ｕ＋＊１ｎｅｓｃｅｎｃｅ）４ｉ１９８９） ４、　Ｆ、ＭｃＣａｐｒａ、アヵウンッ・オブ・ケミカルリサーチ（Ａｃｃｏｕ ｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）ｊ（１９７６）２０１５ 、　Ｆ、ＭｃＣａｐｒａら、　ジャーナル・オブ・パイオルミネサンス・アンド ・ケミルミネサンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕ＋５ｉｎｅｓｃｅｎｃ ｅａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）４（１９８９）５１６　、　 Ｂ、　Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ａ、　５ｐａｒｋｓ、　Ｊ、　Ｃ，Ｖｏｙｔａ、　１ ．　Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎ　ジャーナル・オブ・パイオルミネサンス・アンド・ケ ミルミネサンス（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａ ｎｄ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）互（１９９０）　１ ７　、　Ｍ、　Ｍ、　Ｒａｕｈｕｔ、　Ｌ、　Ｊ、　Ｂａ１ｌｙｋｙ、　Ｂ、　 Ｇ、　Ｒｏｂｅｒｔｓら、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカンケミカルソサイア ティ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ ｏｃｉｅｔｙ）８９（１９６７）６５１５゜８、に、Ｄ、Ｇｕｎｄｅｒｍａｎｎ 、　トピックス・イン・カラントケミストリ（Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｃｕｒｒｅ ｎｔ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）４６（１９７４）６１９、　米国特許第３６８９３ ９１号（Ｕｌｌｍａｎ）。

１０、米国特許第４２７７４３７号（ｌｌａｇｇｉｏ）。

１１、米国特許第３８１７８３７号（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ）。

上記に述べた対象は、本文で参考として引用している。

開始 見かけのｈｃａシグナルｚ　ｌａすｂノ真のｈＣＧシグナル　＝　ｌａφｂノー ｘ／ｒ国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　９０００９５７ Ｓ＾　３７９２６ ０発　明　者　ウッドヘッド、ジェームス、ス　イギリス国　カーデイフ　シー エフ３９デイジエイ　ペニーランヴエンスコート　クロース　１３

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中に含有される複数の問題物質類のそれぞれのアッセイ、検出、定量、 局在または分析のための方法で、前記物質類のそれぞれを、それぞれ識別可能な ケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上の成分で標識することからなる方法 。
2. ２．少なくとも２個の問題物質類を含有する試料のアッセイ、検出、定量、局在 または分析のための方法で、前記試料を処理し前記少なくとも２個の物質類のひ とつまたはそれぞれの関連物質を１次ケミルミネサンス反応に関与可能な１個以 上の成分類で標識することおよび前記少なくとも２個の物質類のもうひとつまた はそれぞれの関連物質を２次ケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上の成分 類で標識し、前記１次および２次ケミルミネサンス反応の発光特徴が互いに識別 可能であること、その後前記ケミルミネサンス反応類を起こさせること、および 前記ケミルミネサンス反応類のそれぞれの発光を観察し、検出し、測定しおよび ／または記縁することからなる方法。
3. ３．少なくとも２個の問題物質類を含有する試料のアッセイ、検出、定量、局在 または分析のための方法で、（ｉ）前記試料を処理し少なくとも第１および第２ の複合体類を形成し、前記第１の複合体は、１次ケミルミネサンス反応に関与可 能な第１試薬に結合またはそうでなければ連結した前記物質類のひとつ、または それぞれの関連物質であり、前記第２の複合体は、前記１次ケミルミネサンス反 応のそれとは識別可能な発光特徴を有している２次ケミルミネサンス反応に関与 可能な第２試薬に結合またはそうでなければ連結した前記物質類のひとつ、また はそれぞれの関連物質であること； （ｉｉ）その後前記第１および第２複合体類含有前記試料を処理し、前記１次お よび２次ケミルミネサンス反応を起こさせること、および （ｉｉｉ）前記ケミルミネサンス反応のそれぞれの発光を観察し、検出し、測定 しおよび／または記縁することからなる方法。
4. ４．第１および第２複合体類の形成のための処理段階が前記試料を前記第１およ び第２試薬類を含有する混合物と反応させることを含むことを特徴とする請求の 範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記１次および２次ケミルミネサンス反応が、前記ケミルミネサンス反応の 実質的に同時惹起を起こさせることによって起きることになることを特徴とする 請求の範囲第３項または第４項に記載の方法。
6. ６．前記ケミルミネサンス反応のそれぞれの発光特徴が発光時間による光放出ま たは放射線強度の変化の観点から識別可能であることを特徴とする請求の範囲の いずれかの先行請求項に記載の方法。
7. ７．前記試料から放出された放射線強度が重なることもある２つの異なる時間区 間で観察され、検出され、測定されおよび／または記縁されることを特徴とする 請求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．前記ケミルミネサンス反応のそれぞれが、それぞれ異なるスペクトル範囲に おいて放射線を放出することを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項のいずれ かに記載の方法。
9. ９．少なくとも３種のケミルミネサンス反応を伴い、そのうち少なくとも２種が スペクトル発光特徴の観点から識別可能であり少なくとも２種が時間による光ま たは放射線強度の変化の観点から識別可能であることを特徴とする請求の範囲第 １項乃至第５項のいずれかに記載の方法。
10. １０．前記発光が前記異なるスペクトル範囲における放射線に応答性のそれぞれ のフィルター手段によってろ過されることおよび前記ろ過された発光の強度が観 察され、検出され、測定されおよび／または記録されることを特徴とする請求の 範囲第８項または第９項に記載の方法。
11. １１．前記第１および第２の複合体類の少なくとも１個がイムノアッセイ結合反 応、タンパク質結合反応、核酸ハイブリダイゼーションおよびレセプター結合反 応のひとつによって物質に結合した反応試薬によって作製されていることを特徴 とする請求の範囲第３項またはそれに依存するいずれかの請求項に記載の方法。
12. １２．前記ケミルミネサンス反応のそれぞれが他のまたはそれぞれ他のケミルミ ネサンス反応に関連する成分または試薬またはそれぞれの構造的修飾であるそれ ぞれの成分または試薬を含むことを特徴とする請求の範囲のいずれかの先行請求 項に記載の方法。
13. １３．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが アクリジニウム化合物類またはその構造的修飾に基づくことを特徴とする請求の 範囲のいずれかの先行請求項に記載の方法。
14. １４．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが 環窒素においてアルキル化されたアクリジニウム塩であることを特徴とする請求 の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが アクリジニウムフェニルエステルであり、前記エステルが前記アクリジン核の９ 位において形成されていることを特徴とする請求の範囲第１２４項に記載の方法 。
16. １６．前記ケミルミネサンス反応のひとつが、フェニル部分が電子吸引性の基で 置換されており光の放出が実質的に短時間に起こるケミルミネサンス反応を呈す るアクリジニウムフェニルエステルを含み、かつ、前記ケミルミネサンス反応の もうひとつが、フェニル部分が電子供与性の基で置換されており光の放出が実質 的に長時間起こるケミルミネサンス反応を呈するアクリジニウムフェニルエステ ルを含むことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の方法。
17. １７．前記ケミルミネサンス反応のひとつがアクリジニウム塩を含み、これが、 前記反応の惹起によって、実質的に短波長で放射線を放出し、かつ前記ケミルミ ネサンス反応のもうひとつが、アクリジン核の電子的結合が増加しそれによって 前記もうひとつの反応の惹起によって前記アクリジニウム塩が実質的に長波長で 発光することを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の方法。
18. １８．前記ひとつのケミルミネサンス反応が４００ないし５００ｎｍの範囲の波 長の放射線を放出しおよび前記ひとつのケミルミネサンス反応が５００ないし７ ００ｎｍの範囲の波長の放射線を放出することを特徴とする請求の範囲第１７項 に記載の方法。
19. １９．前記アクリジニウム化合物が修飾されるかまたは誘導体化され生物学上問 題の分子に共有結合することを特徴とする請求の範囲第１３項またはそれに従属 するいずれかの請求項に記載の方法。
20. ２０．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが 下記の化合物類： （ｉ）フタールヒドラジド類および関連化合物類（ｉｉ）ジオキセタン類、ジオ キセタン類▽および関連化合物類（ｉｉｉ）ビスオキザレートエステル類、関連 化合物類および必要な場合には関連アクセプター相手類 のひとつに基づくことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１２項のいずれかに 記載の方法。
21. ２１．試料中に含有される複数の異なる問題物質類のそれぞれのアッセイ、検出 、定量、局在または分析のための方法で、前記試料が前記異なる物質類のそれぞ れのものと結合または連結するための適切な結合相手の混合物と反応させられ、 前記結合相手が、それぞれ、他の結合相手と会合しているケミルミネサンス標識 系と識別可能なそれぞれのケミルミネサンス標識系と会合していることを特徴と する方法。
22. ２２．それぞれ異なる結合相手に結合またはそうでなければ連結可能な少なくと も２つの物質類の混合物からなり、前記物質類のひとつはそれぞれ１種のケミル ミネサンス反応に関与可能な１個以上の成分類で標識されており、かつ前記物質 類のもうひとつは、発光特性が前記ひとつのケミルミネサンス反応と識別可能な それぞれ他のケミルミネサンス反応に関与可能な１個以上の成分類で標識されて いることを特徴とするルミネサンス試薬。
23. ２３．前記ケミルミネサンス反応のそれぞれが、発光の時間による光強度の変化 の観点から互いに識別可能であることを特徴とする請求の範囲第２２項に記載の ルミネサンス試薬。
24. ２４．前記ケミルミネサンス反応のそれぞれが異なるスペクトル範囲において放 射線を放出することを特徴とする請求の範囲第２２項に記載のルミネサンス試薬 。
25. ２５．前記物質類の少なくともひとつが、イムノアッセイ結合反応、タンパク質 結合反応、核酸ハイブリダイゼーションおよびレセプター結合反応のひとつにお いて結合またはそうでなければ連結可能であることを特徴とする請求の範囲第２ ２項に記載のルミネサンス試薬。
26. ２６．前記標識成分類は他のまたはそれぞれ他の標識成分の構造的修飾であるこ とを特徴とする請求の範囲第２２項乃至第２５項のいずれか１項に記載のルミネ サンス試薬。
27. ２７．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが アクリジニウム化合物類またはその構造的修飾類に基づくことを特徴とする請求 の範囲第２２項乃至第２５項のいずれかに記載のルミネサンス試薬。
28. ２８．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが 環窒素においてアルキル化されたアクリジニウム塩であることを特徴とする請求 の範囲第２７項に記載のルミネサンス試薬。
29. ２９．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが アクリジニウムフェニルエステルであり、前記エステルが前記アクリジン核の９ 位において形成されていることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載のルミネ サンス試薬。
30. ３０．前記ケミルミネサンス反応のひとつがフェニル部分が電子吸引性の基で置 換されており光の放出が実質的に短時間に起こるケミルミネサンス反応を呈する アクリジニウムフェニルエステルを含み、かつ、前記ケミルミネサンス反応のも うひとつがフェニル部分が電子供与性の基で置換されており光の放出が実質的に 長時間起こるケミルミネサンス反応を呈するアクリジニウムフェニルエステルを 含むことを特徴とする請求の範囲第２８項に記載のルミネサンス試薬。
31. ３１．前記ケミルミネサンス反応のひとつがアクリジニウム塩を含み、これが、 前記反応の惹起によって、実質的に短波長で放射線を放出し、かつ前記ケミルミ ネサンス反応のもうひとつが、アクリジン核の電子的結合が増加しそれによって 前記もうひとつの反応の惹起によって前記アクリジニウム塩が実質的に長波長で 発光することを特徴とする請求の範囲第２７項に記載のルミネサンス試薬。
32. ３２．前記ひとつのケミルミネサンス反応が４００ないし５００ｎｍの範囲の波 長の放射線を放出し、および、前記ひとつのケミルミネサンス反応が５００ない し７００ｎｍの範囲の波長の放射線を放出することを特徴とする請求の範囲第３ １項に記載のルミネサンス試薬。
33. ３３．前記アクリジニウム化合物が修飾されるかまたは誘導体化され生物学上問 題の分子に共有結合できることを特徴とする請求の範囲第２７項に記載のルミネ サンス試薬。
34. ３４．前記ケミルミネサンス反応の少なくともひとつにおける成分類のひとつが 下記の化合物類： （ｉ）フタールヒドラジド類および関連化合物類（ｉｉ）ジオキセタン類、ジオ キセタン類▽および関連化合物類（ｉｉｉ）ビスオキザレートエステル類、関連 化合物類および必要な場合には関連アクセプター相手類 のひとつに基づくことを特徴とする請求の範囲第２２項乃至第２５項のいずれか １項に記載のルミネサンス試薬。