JPH0210382B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、液性媒体中のリガンド又はリガンド
結合容量（キヤパシテイ）を定性的又は定量的に
測定するための均一系及び不均一系特異的結合型
の分析方法及びそれに用いる試薬組成物に関する
ものである。本発明は特に、改良した螢光発生体
標識による特異的結合分析法に関するものであ
る。 従来の特異的結合分析法に於いては、分析対象
の液性媒体試料は、各種の組成物である試薬組成
物と一緒にされる。それらの組成物は、標識が組
み入れられている結合成分を含有する標識複合体
を含むものであり、その標識複合体は、試薬組成
物の他の構成分が存在する場合にはその構成分、
そして分析対象のリガンド又はリガンドの結合容
量、と関係を生じて、標識複合体の二つの種もし
くは形態、即ち、結合種及び遊離種とを生成させ
る結合反応系を形成するものである。遊離種と結
合種とをもたらす標識複合体の相対量又は相対比
は、試験試料中での検出対象のリガンド又はリガ
ンドの結合容量の存在（又は量）の関数となる。 従来の特異性なリガンドの検出のための競合結
合分析方法の例を以下に示す。この方法では、試
薬組成物には、(1)検出対象のリガンド（例、抗原
又はハプテン）が標識に化学的に結びつけられた
形態をとつている標識複合体、及び(2)そのリガン
ドの特異的結合の相手（例、抗体）が含まれる。
試薬試料と試薬組成物とを一緒にすると、検出対
象のリガンドと標識複合体のリガンド部分（例、
結合成分）が、特異的結合の相手との非共有的結
合を目指して実質的に差のない状態で競合する。
その結果、特異的結合の相手と結合した標識複合
体（即ち、これが結合種である）の量、或いは遊
離したままでいる標識複合体（即ち、特異的結合
の相手に結合していず、遊離種となるもの）の量
は、存在する競合的関係のリガンドの量の関数と
して測定される。両者の種として得られる標識複
合体の量は、その中の標識を計測、即ち検知する
ことにより測定する。 結合種中の標識複合体が、遊離種の存在下で
は、用いられた標識検知手段によつては本質的に
識別不能である場合には、結合種と遊離種とを物
理的に分離することによつて分析を遂行しなけれ
ばならない。この型の分析法は本技術分野では
「不均一系（ヘテロジエナス）」と呼ばれる。標識
複合体の結合種及び遊離種がそれぞれ、他方の存
在下でも識別可能である場合には、「均一系（ホ
モジエナス）」の方法が用いられ、分離工程は不
要となる。 次に先行技術の説明を行なう。 高度に鋭敏な特異的結合分析法として最初に発
見された方法は、放射性同位体を標識として用い
るラジオイムノアツセイ（放射免疫測定法）であ
つた。この方法では、標識の検知可能な特性が、
遊離種と結合種との間でその性質として変化がな
いため、必然的に不均一系の方法を用いる必要が
ある。放射性物質を取り扱う点の面倒さと困難さ
が理由で、標識成分として放射性同位体以外の物
質を用いる多くの新しい分析法（測定法）が案出
されている。その例としては、酵素、バクテリオ
フアージ、金属及び有機金属の錯体、補酵素、酵
素基質、酵素阻害物質、循環反応体、有機補欠分
子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等の物質
が挙げられる。 これまでに開発された螢光標識を用いる特異的
結合分析法は、螢光発生体（発螢光体）を光で励
起する、即ち光を照射して螢光発生体を励起する
ことにより、発光を起こすエネルギー状態にする
方法によつている。そして螢光発生体を、発光の
全体量もしくはピーク、又は発生する光の他の検
知可能な特性、例えば、その偏光、等により測定
を行なう。この螢光発生体の測定を始めるために
付帯的な光が必要であるということが、これまで
の螢光結合分析法の大きな不利益な点となつてい
る。発生する光放射に対して邪魔となる背景光線
の問題に対処するための測定装置は、機械的に
も、電気的にも複雑なものとなる。 化学発光体、即ち化学反応により光を発生する
物質、を標識として用いる特異的結合分析法も発
展してきている。この分析法では検知反応を始め
るために付帯的な照射を必要とすることはない。
しかし、これまでの技術では、標識として用いる
物質は発光反応に於いて常に消費される反応体で
あるため、現在までに知られているこれらの化学
発光結合分析法の感度には理論上、限界がある。
更に、これまでに刊行された化学発光に基礎を置
いた特異的結合分析法は、一般には発光に対する
たん白質による消光を受けやすいということもあ
る。 上記の螢光結合分析法及び化学発光結合分析法
の技術の状況については、以下に、先行技術を記
載した刊行物を引用しながら簡単に概観する。 特異的結合分析法に於いて標識として螢光発生
体を用いることに関する基本的な考えは米国特許
第3720760号に記載されており、それには標識の
候補としてフルオレセインの誘導体、特にフルオ
レセイン・イソチオシアネート、が提案されてい
る。この分析法では標識を検知するのに従来の螢
光測定技術を用いている。適当な波長の光を螢光
発生体に照射することにより励起させ、別の波長
に出現する螢光を測定する方法である。この基本
的な螢光結合分析技術の改善及び改良は数多く為
されてきており、その例は、米国特許第3992631
号、第3999948号、第4020151号、第4025310号、
第4036946号及び第4058732号に記載されている。
これらの螢光分析法は不均一系型の方法に依つて
いる。即ち標識は、結合種と遊離種とを分離した
後に測定される。 一般には不利である分離工程が不要な均一系型
の螢光結合分析法がいくつか考えられている。そ
の内の一つの技術である螢光偏光法は米国特許第
4115699号に記載されており、この方法は、ある
種の螢光発生体とリガンドとの複合体が特異的結
合の相手（例、抗体）に結合した場合、これに偏
光を照射すると、異なつた偏光を有する光が発生
するという観察に基礎を置くものである。こうし
て、標識複合体の結合種と遊離種とは検知反応に
於いて効果的に識別され得るものである。 他の均一系螢光結合分析法として、螢光発生体
とリガンドとの複合体が特異的結合の相手と結合
した際に螢光の消滅もしくは増大が起こるという
点に基礎を置くものもある。この方法の例は、ベ
ルギー国特許第858722号そして西独国公開公報第
2716276号及び第2716515号に記載されている。こ
の分析法の一つの変法として米国特許第3996345
号に記載されている方法があり、これは螢光標識
に対応するものとして特異的な消光物質を用いる
ものである。 化学発光結合分析法は米国特許第4104029号そ
して米国特許出願第894836号及び第894838号
（1978年４月10日出願で、これらの出願は本願出
願人に譲渡されている）の主題である。既述のよ
うに、特に記した化学発光を基礎にした分析法
は、標識として消費される反応体を用いており、
このため理論的に感度に制約があり、そして更に
重大なことは、たん白質による消光を起こしやす
い点にある。 本発明に附随的に関係する他の刊行物として
は、米国特許第3689391号、ラウフト（Rauhut）
他の「J.Am.Chem.Soc.88：3604（1966）」、ラウ
フト他の「Accounts of Chem.Res.2：80
（1969）」、及びマウルデイング（Maulding）他の
「J.Org.Chem.33：250（1968）」があり、これらは
外部からの光の不存在下で、化学発光物質の化学
的、熱的又は電気的な励起による光化学反応を誘
起させることに関するものである。これらの現象
を分析方法に応用することについては、それらの
文献に示唆されておらず、また、それらの文献は
螢光イムノアツセイに関して前述した参照文献、
又は、それ以降の先行技術の記載箇所に於いて触
れた文献の以前に刊行されたものである。 さて、本発明により、光による励起によらずに
化学的手段を用いて螢光発生体標識を励起するこ
とにより螢光発生体標識を用いた特異的結合分析
法に於ける検知が有利に行なわれることが見いだ
された。従つて本発明は、螢光標識が組み入れら
れた結合成分を含む標識複合体を含有する試薬組
成物と液性媒体とを、該標識複合体の結合種と遊
離種とを含む結合反応系を生成させるように結合
させ、かつ該結合種もしくは該遊離種のいずれか
の螢光標識の量が液性媒体中のリガンドもしくは
リガンドの結合容量の存在もしくは量の関数とな
るようにされていて、その標識複合体の一方もし
くは双方の種について螢光標識を計測することか
ら成る液性媒体中のリガンドもしくはリガンドの
結合容量を測定するための特異的結合分析法を提
供するものである。この改良は、螢光標識を化学
的に励起せしめて該標識の発光を生起させ、次い
でその励起した螢光発生体より発する光を計測す
ることにより計測工程を遂行することを含むもの
である。螢光発生体標識は、上述のような励起及
び発光を起こさせることのできる物質に対して露
出せしめる方法、例えば、過酸化水素と塩化オキ
サリル、オキサミドもしくはビス・シユウ酸エス
テルとを、上記標識の存在下で反応させて得られ
る高エネルギー中間反応生成物に対して露出させ
る方法等、により励起させるのが好ましい。本分
析方法は、従来の均一系もしくは不均一系の分析
方法に従つて行なうことができる。 改良された試薬組成物は、用いられる結合反応
系に適した試薬、そして、それと一緒にされてい
る螢光発生体標識を励起させることのできる高エ
ネルギー物質を生成することのできる化学的手
段、即ち、反応して高エネルギー反応中間生成物
を生成することのできる複数個の試薬、を含有す
るものである。好ましくは態様としては(i)過酸化
水素又は過酸化水素を発生するための通常の化学
系、そして(ii)塩化オキサリル、オキサミド、もし
くはビス・シユウ酸エステルを含むものを挙げる
ことができる。 本発明によれば、化学的に反応して、螢光発生
体標識にエネルギーを移して、その標識を励起状
態に上げることのできる高エネルギー反応生成物
を生成することのできる複数の試薬を加えること
により、結合反応系の所望の種（即ち、不均一系
の方法によつて分離した結合種もしくは遊離種、
又は均一系の方法に於けるそれらの種が一緒とな
つた形の種）について検知反応が行なわれる。螢
光発生体の励起が、エネルギーの基底状態へと低
下するにつれて、エネルギーは光の形で発せられ
る。例を挙げると、過酸化水素と各種の反応性ビ
ス・シユウ酸エステルとは反応して、１，２―ジ
オキシエタンジオンもしくは活性二酸化炭素のい
ずれかであると考えられる高エネルギー中間体を
生成する。この中間体はエネルギーを螢光発生体
に移転させ、この螢光発生体は次いで、正常な螢
光スペクトルに基本的に類似する光を発する。こ
の例の全体の反応は、次の式で表わされると考え
られる。 上記の式で、Ｒは有機基、通常はアリール、そ
してhυは赤外部、可視部もしくは紫外部での電
磁気的な放射を表わすものである。反応式に見ら
れるように、螢光発生体標識は、消費される反応
体ではなく、また反応中にいかなる過程でも化学
的に変化することはない。 本発明は、従来の螢光及び化学発光を利用する
結合分析法に比べて種々の利点を有している。一
つの利点としては、比較的簡単な検知装置が用い
られる点があり、従つて、光源及び帯フイルタ
ー、そして光検出器に対して散乱する光の幅を考
慮すること又はその補正等を必要としなくなる点
である。標準的な螢光測定検知法に比べての他の
利点としては、光の発生を開始させるために補助
的な光を必要としないために、波長の制限を受け
ることなく全ての光を計測できる点がある。従来
の化学発光による結合分析法に比べての理論的な
利点としては、標識が消費性の反応体として働く
ものでないという事実に起因する感度の改良を挙
げることができる。更に、各々異なつた発光の極
大を持つ多数の螢光発生体標識を各種のリガンド
の分析に用いることにより、同時に多数の分析を
行なう方法が可能となる点も挙げることができ
る。更にまた、本発明の分析法は、従来の化学発
光分析法に於いて見られる問題の多いたん白質に
よる消光とは一般的には無縁である。 本明細書の開示に於いて、次に記す用語は、他
に意味付けられない限り、以下のように定義され
る。「リガンド」とは、液性媒体中でその存在も
しくは量が分析（測定）対象となつている物質又
は関連する物質群である。「リガンドの特異性結
合の相手」とは、リガンドに対して、他の物質を
排除するような特異的な結合親和力を有する物質
又は物質群である。「リガンドの特異的結合の類
似体」とは、リガンドに対する特異的結合の相手
の結合親和力に関して基本的にリガンドと同様な
挙動を示す物質又は物質群である。「試薬組成物」
とは、本発明の分析法を実施するのに用いられる
試薬を含有する組成物、装置、用具もしくは試験
キツトである。 次にリガンドについて説明を行なう。 本発明は、特異的結合の相手が存在するいかな
るリガンドの検知にも利用することができる。逆
に言えば、リガンドに結合する液性媒体の結合容
量（通常は、その媒体中のリガンドに対する結合
の相手の存在に起因するものである）の検知に利
用することもできる。リガンドは一般には、ペプ
チド、たん白質、炭水化物、糖たん白質、ステロ
イド、又は、特異的結合の相手が生物系に存在す
るか、もしくはそれを合成し得るものである他の
有機分子である。機能的な用語を用いれば、リガ
ンドは一般には、抗原及びその抗体；ハプテン及
びその抗体；そしてホルモン、ビタミン、代謝物
質、医薬製剤、及びそれらの受容体と結合物質か
ら成る群より選択される。リガンドの例として
は、分子量が1000から4000000の間の免疫的に活
性なポリペプチド及びたん白質、例えば、抗体及
び抗原性のポリペプチドとたん白質、そしてま
た、分子量が100から1500の間のハプテンを挙げ
ることができる。これらの抗原性ポリペプチドの
代表例としては、アンギオテンシン及び、Ｃ
―ペプチド、オキシトシン、バソプレシン、ニユ
ーロフイシン、ガストリン、セクレチン及びグル
カゴンがある。抗原性たん白質の代表例として
は、インシユリン、じゆう毛性ゴナドトロピン
（例、HCG）、ガン胎児性抗原（CEA）、ミオグロ
ビン、ヘモグロビン、卵胞刺激ホルモン、ヒト生
長ホルモン、甲状線刺激ホルモン（TSH）、ヒト
胎盤性ラクトゲン、チロキシン結合グロブリン、
（TBG）、内性因子、トランスコバラミン、アル
カリ性ホスフアターゼ及び乳酸デヒドロゲナーゼ
のような酵素、Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）、Ｂ
型肝炎ｅ抗原（HBeAg）及びＢ型肝炎コア抗原
（HBcAg）のような肝炎に関連する抗原がある。
抗体系リガンドの代表例としては、本明細書に記
載する抗原及び抗体に特異性を有するIgG，IgE，
IgM及びIgAの群の抗体がある。ハプテン系リガ
ンドの例としては、チロキシン；リオチロニン；
エストリオール、及びプロスタグランジンのよう
なエストロゲン；ビオチン、ビタミンB₁₂、葉
酸、ビタミンＥ、ビタミンＡ及びアスコルビン酸
（ビタミンＣ）；そして、カルバムアゼピン、キニ
ジン、ジゴキシン、ジギトキシン、テオフイリ
ン、フエノバルビタール、プリミドン、ジフエニ
ルヒダントイン、モルフイン、ニコチン等のよう
な薬剤がある。 分析対象の液性媒体はリガンド又はリガンドの
結合容量があると想定される天然に存在するか又
は人工的につくられた液体で、一般には生物学的
流動体であるか、又はそれを希釈もしくは他の処
理をすることにより得られた液体である。本発明
の方法により分析され得る生物学的流動体の例と
しては、血清、血しよう、尿、だ液、羊水及び脳
せきずい液がある。固体物質（例、細胞）のよう
な他の物質も、例えばその固体を液体に溶解させ
るか、その固体を液体により抽出する等により液
体の形態にすることにより分析することができ
る。 次に螢光発生体について説明する。 本発明に於いて用いられる螢光発生体として
は、螢光性の物質、即ち、例えば光照射、又は本
発明による高エネルギー反応中間生成物に対して
露出させることにより高エネルギー状態に励起し
て、次いで光放射又は発光を生じる物質のいかな
るものをも用いることができる。良く知られてい
るように螢光現象は、螢光発生体の電子配置につ
いての電子のエネルギー状態の変化の結果起るも
のである。ある特定のエネルギー（即ち、特定の
波長領域内）の光を当てて励起させた場合、電子
は高エネルギー状態に励起し、次いでそのエネル
ギー状態が、更に安定した低エネルギー水準に落
ちると同時に、エネルギーは光の形態で発せられ
ることになる。螢光発生中の光以外の形での付随
するエネルギー減少のために、発せられる光のエ
ネルギーは一般的に低くなり、従つて、照射した
光より長波長のものとなる。 従来の螢光発生体の内で特に好ましい例として
は、用いられる特定の結合反応系の結合成分に合
成的に結合するのに適した有機構造を持つものを
挙げることができる。そのような好ましい螢光発
生体の例としては、リスアミン（lissamine）・ロ
ーダミンＢ、ローダミンＢ、フルオレセイン、
９，10―ジフエニルアントラセン、ペリレン、ル
ブレン、ピレン、又はそれらの螢光発生性誘導
体、例えば、そのイソシアン化物、イソチオシア
ン化物、酸クロリドもしくはスルホニル・クロリ
ド誘導体を挙げることができる。螢光発生体は、
選択された分析用の結合成分（これらの成分は後
に詳細に述べるように、通常は、リガンド、リガ
ンドの特異的結合の類似体、もしくはリガンドの
特異的結合の相手である）に、直接又は更に一般
には橋かけ基を介して、所望の螢光発生体標識の
螢光特性が標識複合体内に保持されるように結合
される。当該技術に於いて良く知られているよう
に、そのような橋かけ基は、その鎖の内に一般に
は１から50、更に一般には１から15の炭素原子も
しくはヘテロ原子（例えば、窒素、酸素、硫黄及
びりん）を含むものである。化学基として、この
橋かけ基は一般には分子量1000以下で、通常は
200以下である。橋かけ基の厳密な化学構造、螢
光発生体標識と結合成分との間の結合、そして橋
かけ基の各末端基は、用いられる螢光発生体と結
合成分の精密な性質に依存するものである。螢光
発生体で標識した結合成分（即ち、標識複合体）
を形成させる合成結合の方法は当該技術分野に於
いて良く知られた技術である。 次に螢光発生体の励起用の試薬について述べ
る。 螢光発生体標識を励起することのできる高エネ
ルギー反応中間生成物の製造については当該技術
に関する文献に記載がある。その例としては、過
酸化水素と塩化オキサリル；オキサミド、例え
ば、１，1′―オキサリル―ビス―（ベンヅイミダ
ゾール）、Ｎ，N′―ジメチル―Ｎ，N′―ジニトロ
オキサミド、及びＮ，N′―ビス―（フエニルス
ルホニル）・パラバメート；又はビス・シユウ酸
エステル、例えば、ビス―（２，４―ジニトロフ
エニル）・オキサレート、ビス―（ペンタクロロ
フエニル）・オキサレート、ビス―（４―ニトロ
―３―トリフルオロメチルフエニル）・オキサレ
ート、ビス―（４―ニトロ―２―ホルミルフエニ
ル）・オキサレート及びビス―（ペンタフルオロ
フエニル）・オキサレート、との反応により得ら
れる中間体を挙げることができる。化学反応生成
物による螢光発生体の励起に関する先行技術文献
の例としては、次のものがある。米国特許第
3689491号；ラウフト（Rauhut）他の「ア・スタ
デイ・オブ・オクサリツク・エステル・ケミルミ
ネツセント・リアクシヨンズ」米国商務局ナシヨ
ナル・テクニカル・インホメイシヨン・サービ
ス・レポートAD―755，882；マウルデイング
（Maul―ding）他の「J.Org.Chem.33：250
（1968）；ラウフト他の「J.Am.Chem.Soc.88：
3604（1966）」；及びラウフト他の「Accounts of
Chem.Res.2：80（1969）」。 前述のように、本発明の分析法は従来の均一系
又は不均一系の分析方法に従つて行なうことがで
きる。実施可能な種々の型の均一系及び不均一系
の分析方法について以下に簡単にまとめる。 まず、均一系の分析方法について述べる。 均一系分析方法、即ち結合種と遊離種の物理的
な分離を必要としない分析方法は、標識複合体中
の結合成分と、これに対応する結合の相手との間
の反応が、本明細書中に述べる化学的励起により
螢光発生体標識から発する光に、正負いずれの意
味であつても、測定可能な変化をもたらす場合に
利用できるものである。この場合、結合種と遊離
種との間の螢光発生体の配分は、この一緒になつ
た二つの種に直接に、高エネルギー中間体を生成
するのに必要な試薬を加え、そして発する光（通
常は、得られる光の全体量又はピーク強度）を計
測することにより測定することができる。均一系
の分析法を実施するための操作方法は種々ある
が、最も一般的なものは直接結合法及び競合結合
法である。 直接結合法では、検知対象のリガンドが含有さ
れていると想定される液性媒体を、リガンドの特
異的結合の相手と結合した螢光発生体標識を含有
する複合体に接触させて、螢光発生体標識から発
する光の何らかの変化を評価する。競合結合法で
は、液性媒体を、リガンドの特異的結合の相手、
及びリガンドもしくはその特異的結合の類似体に
結合した螢光発生体標識を含む標識した複合体に
接触させ、次いで螢光発生体標識から発する光の
何らかの変化を評価する。両者の方法に於て、螢
光発生体標識は、その標識を励起することのでき
る高エネルギー中間体を反応により生成すること
のできる試薬に液性媒体を接触させることにより
測定するものである。液性媒体中のリガンドの定
量的測定は、液性媒体の分析での発光と、既知量
のリガンドを含有する液性媒体での発光とを比較
して行なう。 一般に、均一系分析法により行なう場合は、特
異的結合反応の成分、即ち、リガンドを含有して
いると想定される液性媒体、標識複合体、及び／
又はリガンドの特異的結合の相手は、いかなる
量、方法及び順序によつて一緒にしても良い。但
し、螢光体標識の光の発生が、液性媒体にリガン
ドが分析目的に対して有意である量もしくは濃度
で含まれている場合に、計測可能な変化を起こす
ことができるという条件がある。特異的結合反応
の全ての成分が液性媒体に可溶であることが好ま
しい。 直接結合均一系方法を用いる場合は、結合反応
の成分は、リガンドを含有していると想定される
液性媒体、及びリガンドの特異的結合の相手に結
合した螢光発生体標識を含有する複合体の或る量
である。複合体に組み入れられた螢光発生体の発
光は液性媒体に接触した場合は、液性媒体中のリ
ガンドと標識複合体中の特異的結合の相手との間
の結合の程度に応じて（通常は逆の方向に）変化
する。このように液性媒体中のリガンドの量が増
加するに従つて、複合体に組み入れられた螢光発
生体からの発光は通常は低下する。 競合結合均一系方法を用いる場合は、結合反応
の成分は、リガンドを含有していると想定される
液性媒体、リガンドもしくはリガンドの特異的結
合の類似体に結合した螢光発生体標識を含有する
複合体の或る量、及びリガンドの特異的結合の相
手の或る量である。特異的結合の相手は、標識複
合体と液性媒体とに、同時にもしくは順次、接触
する。液性媒体中のいかなるリガンドも、標識複
合体中のリガンドもしくはその特異的結合の類似
体と、特異的結合の相手との結合を目指して競合
するので、複合体に組み入れられた螢光発生体の
発光は、液性媒体と接触すると、液性媒体中のリ
ガンドと特異的結合の相手との間の結合の程度に
応じて（通常同じ方向に）変化する。このように
液性媒体中のリガンドの量が増加するに従つて、
複合体に組み入れられた螢光発生体からの発光は
通常は増加する。 液性媒体のリガンド結合容量（例えば、液性媒
体中のリガンドの特異的結合の相手の存在の容
量）の測定は、均一系方法により、液性媒体を、
リガンドもしくはその特異的結合の類似体に結合
した螢光発生体標識を含有する複合体に接触させ
ることにより達成することができる。複合体に組
み入れられた螢光発生体の発光は、液性媒体と接
触すると、液性媒体の結合容量と標識複合体中の
リガンドもしくはその類似体との間の結合の程度
に応じて、前述のリガンド測定のための直接結合
方法に於ける結合の場合と同様に（通常は逆の方
向に）変化する。 次に不均一系分析方法について説明する。 また、螢光発生体標識を使用して、標識複合体
の結合種と遊離種とを分離し、次いで一方もしく
は他方の標識の量を測定するという従来の不均一
系型の分析法を行なうこともできる。そのような
不均一系分析法を実施するための試薬組成物は
様々な形態をとることができる。一般には、その
試薬組成物には二つの基本成分、即ち(1)リガンド
の特異的結合の相手、及び(2)、(a)リガンド、(b)リ
ガンドの特異的結合の類似体、もしくは(c)特異的
結合の相手、が通常は標識された形態をとつてい
る標識複合体、を含むものである。結合反応の構
成分は分析対象の液性媒体に、同時に又は連続し
て加えて一緒にさせ、適当な温置の期間を経る
と、標識複合体は結合の程度、即ち結合の相手に
結合した標識複合体（結合種）の量と結合してい
ない標識複合体（遊離種）の量との比率が、リガ
ンドの存在量の関数となるように、対応する競合
結合の相手に結合する。次に、本発明の分析方法
を実施する場合に利用される各種の不均一系結合
分析法のいくつかを簡単に述べる。 以下に示す式では、次の記号を用いてリガンド
を表わす。

【表】 結合することのできる量よりも多い量で
存在すること
１ 競合結合不均一系法の構成 (a) Ｌ＋^*＋Ｂ（lim）→ ＋Ｂ又は^*（sep）の不溶化剤 この方法は古くからの競合結合の方式である。
不溶化剤の例としては、特異性沈降抗体、特異性
不溶化抗体があり、Ｂ又は^*がたん白質性物質
である場合には、硫酸アンモニウムのようなたん
白質沈澱剤であり、Ｂ又は^*が小さな被吸着性
分子である場合はデクストランで被覆した炭末が
用いられる。同様な系についての記述は、
Biochem.J.88：137（1973）及び米国特許第
3839153号に見られる。 (b) Ｌ＋^*＋｜−Ｂ（lim）→（sep） この方法は一般には固相法と呼ばれている。
同様な放射免疫測定法及び酵素免疫測定法につ
いての記載は米国特許第3505019号；第3555143
号；第3646346号及び第3654090号に見られる。 (c) Ｌ＋B^*＋｜−Ｌ（lim）→（sep） 参考文献：米国特許第3654090号 (d)Ｌ＋｜−Ｌ＋B^*（lim）→（sep） 参考文献；米国特許第3850752号 競合結合不均一系法の構成についての更に詳細
な説明は、スケリー（Skelley）他の「Clin.
Chem.19(2)：146―186（1973）」から得ることがで
きる。 ２ 段階的飽和不均一系法の構成 (a) Ｌ＋Ｂ（exc）→＋^*（exc）→＋Ｂ又は^*
（sep）の不溶化剤 段階的飽和法では、最初の温置期間後も残存し
ているＢの結合部位の一部もしくは全部が標識を
付した構成分と結合する。 (b)Ｌ＋｜−Ｂ（exc）→＋^*（exc）→（sep） 同様な放射免疫測定法及び酵素免疫測定法の記
述は、米国特許第3720760号及びJ.
Immunol.209：129（1972）に見られる。 (c) Ｌ＋B^*（exc）→｜−Ｌ（exc）→（sep） ３ 「サンドイツチ」型不均一系法の構成 (a)Ｌ＋｜−Ｂ（exc）→＋B^*（exc）→（sep） サンドイツチ型の方法では、不溶化された結合
の相手にリガンド分子の一部もしくは全部が標識
を付された構成分に結合する。 参考文献：米国特許第3720760号及び第3867517
号、そしてハーベルマン（Haberman）の「Z.
Clin.Chem.u.Clin.Biochem.8：51―55（1970） (b)Ｌ＋B^*（exc）→｜−Ｂ（exc）→（sep） この方法は「逆サンドイツチ法」と呼ばれるも
のである。 参考文献：米国特許第4098876号 従来の不均一系分析法に於ける可変要素、例え
ば、分析操作の更に詳しい記述、分離についての
代替法等、に関する更に詳しい議論は、「競合た
ん白結合分析の原理（プリンシパル・オブ・コン
ペテイテイブ・プロテイン・バインデイング・ア
ツセイズ）」オデル（Odell）とダウデイ（Daugh
―day）編集、ジエイ・ビー・リツピンコツト社
（J.B.Lippincott Co.）（フイラデルフイア1972）、
及び「ラジオイムノアツセイ・メソーヅ」カーク
ハム（Kirkham）とハンター（Hunt―er）編
集、チヤーチル・リビングストン（Chur―chill
Livingstone）（エヂンバラ1971）に見られる。 本明細書に記した本発明の概念から外れること
なく均一系もしくは不均一系の特異的結合分析法
を実施するための他の添加順序から成る操作法及
び他の結合反応の構成が考えられるという点は本
明細書の意図に含まれるものである。 本発明の試薬組成物は、本発明に含まれる所望
の分析法を実施するのに必要な全ての基本的な化
学的要素を含むものである。この試薬組成物は、
試薬間の相溶性に問題がなければ試験用具を組み
合わせたものの内に組成物もしくは混合物を、或
は試験キツト、即ち、必要な試薬を保持する容器
を一緒に組み合わせた形を、包装した形態で市販
に供せられる。試薬組成物には、所望の結合反応
系に適した試薬が入れられている。但し、前に規
定した標識を付した複合体は常に必要である。そ
れらの結合反応用試薬には、標識を付した複合体
に加えて、リガンドの結合の相手及びその他の物
が含まれている。不均一系の結合法の方式を用い
る場合は、結合反応試薬は、結合種又は遊離種の
いずれかを不溶化するための不溶化用の試薬もし
くは化学手段を含むことができる。 例として、抗原リガンドについての均一系競合
結合分析法を実施するための結合反応試薬の典型
的なセツトを挙げると、(1)螢光発生体で標識した
形態のリガンドもしくはその結合の類似体、そし
て(2)抗原に対応する抗体である。抗原リガンドに
ついての不均一系競合結合分析法用の典型的な試
薬セツトとしては、(1)螢光発生体で標識した形態
のリガンドもしくはその結合の類似体、そして(2)
抗原に対応する不溶化された形の抗体、を挙げる
ことができる。結合反応試薬や市販される包装形
態、様式を多くの様相で変換することは、本技術
分野の通常の知識で考えられる範囲であり、本発
明に包含されるものである。 前述の結合反応試薬の他に、本試薬手段には、
螢光発生体標識の存在下で反応して高エネルギー
反応中間生成物を生成する前述の複数個の試薬の
一組が含まれている。この反応中間生成物は次い
で標識を高エネルギー状態に励起し、その発光を
生起せしめるものである。その複数個の試薬は、
(i)過酸化水素又は過酸化水素を発生させるための
従来の化学系のいずれか、そして(ii)塩化オキサリ
ル、オキサミド、もしくはビス・シユウ酸（オキ
サレート）エステル（後者の二個の化合物群には
前述の好ましい各化合物が含まれる）、含むもの
であることが好ましい。 試薬組成物には、本技術分野で知られている他
の試薬、例えば、緩衝剤、希釈剤、標準液、その
他をも含有させることが販売面及び使用面から見
て望ましい。要約すると、本発明の試薬組成物
は、標識として本発明の螢光発生体標識を用いる
技術分野で今日利用されている特異的結合分析試
薬組成物のいかなる成分をも含有できることが理
解されるべきであり、その試薬組成物は更に、高
エネルギー反応中間生成物を生成するための上述
の複数個の試薬の一組を含むものである。 本発明を以下に例により更に詳しく説明する
が、これらの例は本発明を限定するものではな
い。 物質と方法 試 薬 リスアミン・ローダミンＢはフアルツ・エン
ド・バウエル（Pfaltz and Bauer）、米国、コネ
チカツト州、スタムホード在、から、過酸化水素
（50％）はフイツシヤー・サイエンテイフイツク
（Fischer Scientific）、米国、ニユー・ジヤージ
ー州、フエアローン在、から、そしてシスオマイ
シン（sisomicin）はシエーリング社（Sche―
ring Corp）、米国、ニユージヤージー州、ブル
ームフイールド在、から各々入手したものであ
る。シユウ酸・ビス―（２，４―ジニトロフエニ
ル）はラウフト他による「J.Amer.Chem.
Soc.89：6522（1967）」の方法に従つて調製した。
シスオマイシンに対して反応性の抗体は、ウシ血
清アルブミンに結合したゲンタマイシンで免疫化
したウサギ内で調製した（Nature New
Biol.239：214（1972））。 薄層クロマトグラフイ 予め被覆されたシリカゲル板（商品名シリカゲ
ル60、西独国、ダルムシユタツトのメルク社）を
用いた。溶媒は、等量のメタノール、クロロホル
ム及び水酸化アンモニウムを一夜激しく混合し
て、得られた低層の相を取りだすことにより調製
した。 紙電気泳動 電気泳動は、28×34cmのワツトマン3MM（商品
名）の紙（米国、ニユージヤージー州、クリフ
トン、リーブ・エンジエル）を用い、ウイリアム
ス（Williams）他の「Science121：829―830
（1955）」に記載されている紙懸垂法により行な
つた。用いた緩衝液は、0.01モル（Ｍ）のピリジ
ン・酢酸塩、PH5.0、である。約17ボルト／cmの
電位を用いて５時間行なつた。 ニンヒドリン反応 アミノ残基を持つ物質は、薄層板上及び電気泳
動紙上で、ブレナー（Brenner）とニーデルバ
イザー（Niederweiser）の「Me thods in Enzy
―mology11：39―59（1967）」記載のニンヒドリ
ン吹きつけ剤を用いて検出した。 リスアミン・ローダミンＢの精製 薄層クロマトグラフイーによると、市販のリス
アミン・ローダミンＢは、Rfが0.31の主要成分の
他に15から20の赤色の成分に分離される。この未
精製混合物を500mlの沸とう無水エタノールと共
に撹拌し、得られた混合物を熱い状態で過す
る、液を無水エタノールに入れたセフアデツク
スLH―20（商品名）のゲル（米国、ニユージヤ
ージー州、ピスカタウエイのフアーマシア・フア
イン・ケミカルス（Pharmacia Fine Ch―
emicals））の５×50cmのカラム中を通過させる。
このカラムを６リツトルのエタノールで洗浄し、
25mlづつの分画を集める。赤色を含む分画を薄層
クロマトグラフイーにより調べ、リスアミン・ロ
ーダミンＢ（Rf＝0.31）を含む分画を一緒にして、
ロータリー・エバポレーターで乾燥させる。得ら
れた物質を１マイクロメートルの厚さのシリカゲ
ル（米国、ニユージヤージー州、フエアフイール
ド、クマンタム）を用いたクロマトグラフイーに
より更に精製する。約120mgの色素をメタノール
に溶かして、これを20×20cmの板に付け、前述の
溶媒で展開させる。濃赤色帯を板から、かき取
り、この色素をシリカゲルから、メタノールを用
いて溶出する。 標識を付した複合体（螢光発生体の標識を付し
たシスオマイシン）の調製 100mg（0.18ミリモル）の精製リスアミン・ロ
ーダミンＢを５mlの塩化チオニル中で45分間、還
流させる。反応混合物を室温に冷却し、そして塩
化チオニルをロータリー・エバポレーターを用い
て除去する。残渣を20―30mlのクロロホルムに溶
解させ、次いで乾燥させる。この操作を２回繰り
返す。この反応混合物は薄層クロマトグラフイー
によると15から20の成分に分離される。乾燥した
残渣を３―４mlのジメチルアセトアミドに溶解さ
せ、次にこれを、５mlのジメチルアセトアミドと
40マイクロリツトル（0.29ミリモル）のトリエチ
ルアミン中に44mg（0.1ミリモル）のシスオマイ
シン（遊離塩基）を含有する溶液に、加える。反
応混合物を室温で一夜放置し、次いでロータリ
ー・エバポレーターを用いて溶媒を除去する。残
渣を水と一緒に撹拌し、不溶性物質を過により
分離する。この水不溶性分画はメタノールに溶解
し、そして電気泳動により調べると電荷は中性で
あるとみられる。水溶性物質は中性の赤色成分
と、正に荷電した赤色成分、そして未反応のシス
オマイシンから構成されている。これを、0.5M
のギ酸アンモニウムで平衡にしたセフアデツクス
CM25（商品名）のシリカゲル（前述のフアーマ
シア・フアイン・ケミカルス）の2.5×23cmのカ
ラムを用いたクロマトグラフイーにかける。クロ
マトグラムを、500mlの0.5Mギ酸アンモニウム溶
液と500mlの2.5Mギ酸アンモニウム溶液により直
線勾配型にて展開させる。 13mlづつの分画を集め、555ナノメートル（ｎ
ｍ）の吸光度を測定する。第60―65番目の分画を
集め、そして凍結乾燥して、水とギ酸アンモニウ
ムを除去する。この残渣を２―３mlの水に溶解さ
せて紙電気泳動により更に精製する。三個の帯
が異なつた速度で陽極に向つて移動する。これら
を切り取り、この紙を水で溶出させる。電気泳
動の上で最も早く移動する生成物（シスオマイシ
ン・螢光発生体複合体）を以後の実験に用いる。 光発生反応 螢光発生体を0.1Mトリス―（ヒドロキシメチ
ル）―アミノメタン塩酸塩（トリス・HCl）緩衝
液、PH8.0、を200から500μ、７×70mmの試験管
に分配する。各試料に指定量の50％（体積比）過
酸化水素を加え、この反応管を光度計内に置き、
次いで20ｍＭのビス―（２，４―ジニトロフエニ
ル）・オキサレート2.0mlを注射器を用いて注入す
る。この注入時から開始して20秒間、光の発生を
記録する。 光の測定 光発生反応は、光電子倍増管（米国、マサチユ
ウセツツ州、ニユーベリーポートのインターナシ
ヨナル・ライトから得られるPM270D型）上に設
置した７×70mmの試験管を用いて行なう。10nｍ
の半値幅を持つバンド・パス干渉フイルター（米
国、マサチユウセツツ州、マールボロのダイトリ
ツク・オプチクス（Ditric Optics）を、反応管
と光電子倍増管の間に置く。フイルターの最大透
過の波長は579nｍである。反応管の蓋にはゴム
製の隔膜により被われている開口がある。この隔
膜に注射針を通して反応管にシユウ酸エステルの
溶液を注入する。発生する光は、読取り装置によ
り記録される。 不均一系分析方法 抗体、シスオマイシン・螢光発生体複合体、そ
してシスオマイシンと間の結合反応は、0.1Mト
リス・HCl緩衝液、PH8.0（最終的な量：400μ）
中、室温で行なう。複合体とシスオマイシンを一
緒にし、最後に抗体を加える。結合反応は20分間
行なう。0.1Mトリス・HCl緩衝液、PH8.0にポリ
エチレングリコール（商品名：Carbowax6000、
英国、プール（Poole）、BDHラボラトリース）
を500ｇ／の割合で入れた溶液150μを加え、
生成するたん白質沈澱物（結合種を含有）を遠心
分離法により沈降させる。上澄み液（遊離種）
35μを清浄な７×70mmの試験管に移し、過酸化
水素を加えて、前述のように光の測定を行なう。 試験結果 光の発生によるリスアミン・ローダミンＢの測定 リスアミン・ローダミンＢと過酸化水素を含有
する反応混合物へビス―（２，４―ジニトロフエ
ニル）・オキサレートを加える操作は２から４秒
を要する。５から10分以内に発光は最大の強度に
達し、15分間で完了する。シユウ酸エステルを、
螢光発生体を含まない過酸化水素に加えた場合に
は、光は上述と同様な時間、経過で発生する。干
渉フイルターを用いないと、最低倍増率の所以外
では光検出器にとつて過剰負荷となる。干渉フイ
ルターはバツクグラウンドの光の約99.5％を除去
する。 抗体とシスオマイシン・螢光発生体複合体との
間の結合反応 一定量のシスオマイシン・螢光発生体複合体
を、種々の量の抗血清と共に温置（インキユベー
ト）し、その結合形と未結合形の複合体とを前述
のように分離する。未結合形の複合体（遊離種）
の量は、光発生反応により測定する。光の発生
は、抗体の量が増加するに応じて、減少する。
100μの抗血清は複合体の90％を結合させるよ
うに見える。同量の抗血清をリスアミン・ローダ
ミンＢと共に温置すると、光の発生は約20％減少
する（第１表参照）。非免疫のウサギ血清もまた、
シスオマイシン・螢光発生体から生成する光を減
少させるが、その効果は同量の抗血清により観察
される程度よりかなり少ない。

【表】 競合結合反応（不均一系） 種々、量を変えたシスオマイシンと一定量のシ
スオマイシン・螢光発生体複合体とを、規定量の
抗体と反応させる。次いで、未結合の複合体の量
を、光発生反応により測定する。光の発生は、シ
スオマイシンの量が増加するに応じて増加する。
シスオマイシンの量の最大での光の発生は、抗体
の不存在下で測定した値の79％である。 シスオマイシンは1.3μM程低い含有量でも検出
可能である。次の第２表に示す結果は、シスオマ
イシン・螢光発生体複合体が特に抗体に結合して
いることを示すものである。

【表】

【表】 抗体と結合したシスオマイシン・螢光発生体複
合体と、抗体に結合していないシスオマイシ
ン・螢光発生体複合体との分離をせずに検知し
た結合反応（均一系分析） 種々の量の抗血清を、一定量のシスオマイシ
ン・螢光発生体複合体と共に温置する。次いで反
応混合物を、複合体に抗体が結合したもの及び結
合していないものの分離を行なわずに、光発生反
応に供する。 第３表の結果は、抗体の量の増加に応じて、光
の発生が減少することを示している。非免疫ウサ
ギ血清は、光の発生に対してあまり効果を示さな
い。 量を変化させたシスオマイシンと一定量のシス
オマイシン・螢光発生体複合体と一定量の抗血清
を用いて、競合結合反応を行なう。（第３表参
照）。それらの反応混合物から発生する光を、結
合形態及び未結合形態の複合体を予め分離するこ
となく、測定する。シスオマイシンの量を増加さ
せると、光の発生は増加する。但し、その光の変
化は、分離工程を取り入れた場合に観察される程
は大きくない。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 螢光標識が組み入れられた結合成分を含む標
   識複合体を含有する試薬組成物と液性媒体とを、
   該標識複合体の結合種と遊離種とを含む結合反応
   系を生成させるように接触させ、かつ該結合種も
   しくは該遊離種のいずれかの螢光標識の量が液性
   媒体中のリガンドもしくはリガンドの結合容量の
   存在もしくは量の関数となるようにされていて、
   そしてその螢光標識を計測することから成る液性
   媒体中のリガンド又はリガンドの結合容量を測定
   するための特異的結合分析法であつて、反応系溶
   液中で、該螢光標識と化学的に反応して該螢光標
   識を励起発光させることができる高エネルギー物
   質と、該螢光標識とを接触させることにより、該
   螢光標識を化学的に励起させて該螢光標識の発光
   を生起させ、次いでその励起した螢光標識から発
   せられる光を計測することを特徴とする螢光標識
   を測定する分析法。 ２ 高エネルギー物質が別の化学反応によつて溶
   液中で生成される特許請求の範囲第１項記載の分
   析法。 ３ 高エネルギー物質が、過酸化水素と、塩化オ
   キサリル、オキサミドもしくはビス・シユウ酸エ
   ステルとの反応生成物である特許請求の範囲第２
   項記載の分析法。 ４ 高エネルギー物質が、過酸化水素と、塩化オ
   キサリル；１，1′―オキサリル―ビス―（ベンヅ
   イミダゾール）、Ｎ，N′―ジメチル―Ｎ，N′―ジ
   ニトロオキサミド及びＮ，N′―ビス―（フエニ
   ルスルホニル）・パラバメートから選ばれたオキ
   サミド；又はビス―（２，４―ジニトロフエニ
   ル）・オキサレート、ビス―（ペンタクロロフエ
   ニル）・オキサレート、ビス―（４―ニトロ―３
   ―トリフルオロメチルフエニル）・オキサレート、
   ビス―（４―ニトロ―２―ホルミルフエニル）・
   オキサレート及びビス―（ペンタフルオロフエニ
   ル）・オキサレートから選ばれたビス・シユウ酸
   エステルとの反応生成物である特許請求の範囲第
   ２項記載の分析法。 ５ 螢光標識が、リスアミン・ローダミンＢ、ロ
   ーダミンＢ、フルオレセイン、９，10―ジフエニ
   ルアントラセン、ペリレン、ルブレン、ピレン、
   又はそれらの螢光性誘導体である特許請求の範囲
   第１項ないし第４項のいずれか一項に記載の分析
   法。 ６ 螢光標識がリスアミン・ローダミンＢであ
   り、かつ、過酸化水素とビス・シユウ酸エステル
   との反応により生成した高エネルギー中間体に接
   触させることにより、該螢光標識を化学的に励起
   させる特許請求の範囲第１項記載の分析法。 ７ ビス・シユウ酸エステルがビス―（２，４―
   ジニトロフエニル）・オキサレートである特許請
   求の範囲第６項記載の分析法。 ８ リガンドが、抗原もしくはその抗体；ハプテ
   ンもしくはその抗体；又は、ホルモン、ビタミン
   もしくは薬剤、又はそれらの受容体もしくは結合
   物質である特許請求の範囲第１項記載の分析法。 ９ 標識複合体の結合種と遊離種とが一緒の状態
   で螢光標識を計測する均一系型である特許請求の
   範囲第１項記載の分析法。 １０ 標識複合体の結合種と遊離種とを分離し、
   分離した種の一つについて螢光標識を計測する不
   均一系型である特許請求の範囲第１項記載の分析
   法。 １１ 螢光標識が組み入れられた結合成分を含む
   標識複合体を含有し、かつ分析対象の液性媒体と
   接触させた場合に、その媒体中のリガンドもしく
   はリガンドの結合容量と、該標識複合体の結合種
   と遊離種とを含む結合反応系を生成させることが
   でき、かつ該結合種もしくは該遊離種のいずれか
   の螢光標識の量が液性媒体中のリガンドもしくは
   リガンドの結合容量の存在もしくは量の関数とな
   るようにされている、液性媒体中のリガンド又は
   リガンドの結合容量を特異的結合分析法により測
   定するために用いる試薬組成物であつて、該結合
   反応系のいかなる成分とも結合しておらず、反応
   系溶液中で該螢光標識と化学的に反応して該螢光
   標識を励起発光させることができる物質を生成す
   る反応性の試薬を含有することを特徴とする試薬
   組成物。 １２ 反応性の試薬が(i)過酸化水素又は過酸化水
   素を発生するための化学系、及び(ii)塩化オキサリ
   ル、オキサミドもしくはビス・シユウ酸エステル
   を含む特許請求の範囲第１１項記載の試薬組成
   物。 １３ オキサミドが、１，1′―オキサリル―ビス
   ―（ベンヅイミダゾール）、Ｎ，N′―ジメチル―
   Ｎ，N′―ジニトロオキサミド及びＮ，N′―ビス
   ―（フエニルスルホニル）・パラバメートから選
   ばれたもので、ビス・シユウ酸エステルが、ビス
   ―（２，４―ジニトロフエニル）・オキサレート、
   ビス―（ペンタクロロフエニル）・オキサレート、
   ビス―（４―ニトロ―３―トリフルオロメチルフ
   エニル）・オキサレート、ビス―（４―ニトロ―
   ２―ホルミルフエニル）・オキサレート及びビス
   ―（ペンタフルオロフエニル）・オキサレートか
   ら選ばれたものである特許請求の範囲第１２項記
   載の試薬組成物。 １４ 螢光標識が、リスアミン・ローダミンＢ、
   ローダミンＢ、フルオレセイン、９，10―ジフエ
   ニルアントラセン、ペリレン、ルブレン、ピレ
   ン、又はそれらの螢光性誘導体である特許請求の
   範囲第１１項ないし第１３項のいずれか一項に記
   載の試薬組成物。 １５ 螢光標識がリスアミン・ローダミンＢで、
   反応性試薬が(i)過酸化水素又は過酸化水素を発生
   するための化学系、及び(ii)ビス・シユウ酸エステ
   ルを含む特許請求の範囲第１１項記載の試薬組成
   物。 １６ ビス・シユウ酸エステルがビス―（２，４
   ―ジニトロフエニル）・オキサレートである特許
   請求の範囲第１５項記載の試薬組成物。 １７ リガンドが、抗原もしくはその抗体；ハプ
   テンもしくはその抗体；又は、ホルモン、ビタミ
   ンもしくは薬剤、又はそれらの受容体もしくは結
   合物質である特許請求の範囲第１１項記載の試薬
   組成物。