NL8401213A

NL8401213A - Chemiluminescerende verbindingen en tussenprodukten, de bereiding daarvan en hun toepassing bij het aantonen of bepalen van organische verbindingen.

Info

Publication number: NL8401213A
Application number: NL8401213A
Authority: NL
Original assignee: Rijksuniversiteit
Priority date: 1984-04-16
Filing date: 1984-04-16
Publication date: 1985-11-18
Also published as: IL74911A0; AU594306B2; NO855033L; EP0179868A1; FI854990A; AU4293585A; JPS61502681A; US4975380A; WO1985004958A1; FI854990A0; EP0179868A4

Description

^ * N.0. 31.781 -1- ~ '1 ' / ' V *

Chemiluminescerende verbindingen en tussenprodukten, de bereiding daarvan en hun toepassing bij het aantonen of bepalen van organische verbindingen.

Uit de Nederlandse octrooiaanvrage 8201492 is bekend, dat men organische verbindingen kan merken met een rest van 2,2’-epidioxy-2,21-adamantyl-adamantaan en analoga daarvan, welke rest bij verwarmen ontleedt onder uitstralen van zichtbaar licht. De hoeveelheid licht 5 is evenredig met de aanwezige hoeveelheid van de gemerkte verbinding.

Gevonden werd nu, dat men organische verbindingen nog effectiever kan merken met een of meer polycyclische aromatische groepen R , die ten minste drie lineair geannelleerde benzeenringen bevatten en tot fluorescentie gebracht kunnen worden door energie-overdracht uit 10 een in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand verkerende groep of verbinding. Dergelijke groepen R^ zijn bijvoorbeeld resten van rubreen, peryleen, 9*10-dibroomantraceen, 9,10-dichloorantraceen en vooral van 9,10-difenylantraceen.

Wanneer men de aanwezigheid of de hoeveelheid van een met een 15 of meer resten R^ gemerkte organische verbinding wil bepalen brengt men de groep R^ in de gemerkte verbinding tot fluorescentie en meet de fluorescentie. Dit tot fluorescentie brengen kan in principe op twee manieren worden uitgevoerd. Bij de eerste methode laat men bij aanwezigheid van de gemerkte verbinding een chemische reactie verlopen, 20 die singlet- en/of triplet-aangeslagen toestanden genereert. Een dergelijke reactie is bijvoorbeeld de reactie van een geschikt oxaal-zuurderivaat, in het bijzonder een oxaalzuurester, met. waterstofperoxide [zie Anal. Chern. _55, 432 (1933).], doch ook kan hiervoor de ontledings-reactie van dioxetanen worden gebruikt. Als andere chemische reacties 25 van dit type kunnen nog enzymatische reacties genoemd worden, zoals bijvoorbeeld de oxydatie van alifatische en aromatische aldehyden met peroxydase. In principe zijn alle reacties geschikt, die een ener-giedonor leveren, waarvan de emissie spectrale overlap vertoont met de absorptie van de acceptor.

30 Het verschijnsel van de energie-overdracht uit een groep of verbinding, die zich in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand bevindt naar een door energie-overdracht tot fluorescentie te brengen verbinding is op zichzelf bekend. Volgens de uitvinding wordt nu van 8401213 - 2 - .

dit verschijnsel gebruik gemaakt, door een te bepalen organische verbinding met een polycyclische aromatische rest als boven gedefinieerd, te merken en de rest R^ tot fluorescentie te brengen.

Bij de andere mogelijkheid om de groep R^ in de gemerkte 5 organische verbinding tot fluorescentie te brengen maakt men volgens de uitvinding gebruik van organische verbindingen, die niet alleen met één of meer der bovengenoemde groepen R^ doch ook met één of meer' groepen R2 gemerkt zijn, namelijk met groepen R , die door thermische energie in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand kunnen worden 10 gebracht. De aanwezigheid of hoeveelheid van de aldus gemerkte verbinding kan dan bepaald worden door verwarmen vande gemerkte verbinding, waarbij de groep of groepen R2 ontleden en daarbij groepen of verbindingen genereren die in de singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand verkeren, welke groepen of verbindingen hun energie stralingsloos over-15 dragen op de groep of groepen R^, die daardoor tot fluorescentie gebracht worden. De uitgezonden fluorescentie is evenredig met de hoeveelheid van de gemerkte verbinding.

De uitvinding betreft daarom in de eerste plaats organische verbindingen, die gemerkt zijn met een of meer polycyclische aromatische 20 groepen R^ met ten minste 3 lineair geannelleerde benzeenringen, welke groepen R^ tot fluorescentie gebracht kunnen worden door energie-overdracht uit een in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand verkerende groep of verbinding, en desgewenst tevens gemerkt zijn met een of meer groepen R2, die door thermische energie in een singlet-25 en/of triplet-aangeslagen toestand kunnen worden gebracht.

De aldus gemerkte organische verbindingen kunnen allerlei organische verbindingen zijn, waarvan men de aanwezigheid wil vaststellen of de aanwezige hoeveelheid wil bepalen. Meer in het bijzonder zijn de gemerkte organische verbindingen stoffen, die in het lichaam van 30 mens en dier voorkomen, in het bijzonder in de lichaamsvloeistoffen.

Als zodanig kunnen eiwitten, steroïden of vetzuren worden genoemd, waarvan de eiwitten wel de belangrijkste zijn.

Heel in het bijzonder wordt de onderhavige uitvinding gerealiseerd in een met een of meer groepen R^ en'eventueel bovendien met 35 een of meer groepen R2 gemerkt eiwit, dat een deel van een immunologisch paar is. Dergelijke immunologische paren bestaan bijvoorbeeld uit 8401213 , * - 3 - antigenen met bijbehorende antilichamen. Verder kan de gemerkte organische verbinding een immunologisch conjugaat of complex zijn. Wanneer in een complex zowel een of meer groepen als een of meer groepen R^ aanwezig zijn, kan R^ aanwezig zijn in het ene deel van 5 het complex, bijvoorbeeld in het antilichaam-gedeelte, en R£ in het andere deel, bijvoorbeeld in het corresponderende antigeen-gedeelte. Uiteraard kunnen ook beide groepen R^ en R^ in een enkel deel van het immunologische paar aanwezig zijn.

De polycyclische aromatische groep R^ in de gemerkte verbindingen 10 volgens de uitvinding is bij voorkeur een 9,10-difenylantracylgroep. Deze groep kan met grote efficiency energie opnemen uit een in een singlet-aangeslagen toestand verkerende verbinding met een energie-verschil met de grondtoestand van meer dan + 70 kcal per mol. Door deze energieoverdracht is de difenylantracylgroep in de singlet-15 aangeslagen toestand gekomen en kan fluoresceren door terug te vallen naar de grondtoestand. De difenylantracylgroep doet dit, vrijwel onafhankelijk van de temperatuur, met een efficiency van 0,9.

De groep Rg die eventueel aanwezig is in de gemerkte organische verbindingen volgens de uitvinding, bezit bij voorkeur de formule 1 20 van het formuleblad, waarin A en B alkyleenresten voorstellen, die via een alkyleenrest C met elkaar verbonden kunnen zijn. Voorbeelden van dergelijke resten R^ zijn de 2,2,-epidioxy-2,2'-adamantyl-adamant-4-eq.-ylrest, de 9,9' -epidioxy-9,9 ’ -bicyclo[3,3, l] -nonyl-bicyclo [3,3,1*] non-

4-eq.-ylrest, de 8,8'-epidioxy-8,8,-bicyclo[3,2, l] -octyl-bicyclo [3,2, l] -25 oct-2- of -7-ylrest, en de 10,10'-epidioxy-10,10'-bicyclo[4,3, l]-decyl-bicyclo 4,3,1 -dec-2- of -7-ylrest. In het algemeen bevat de alkyleenrest A in de groep met formule 1 2-5 koolstofatomen, alkyleenrest B

2-5 koolstofatomen en alkyleenrest C, indien aanwezig, 1-4 koolstofatomen. Bij voorkeur is de groep in de gemerkte verbindingen volgens 30 de uitvinding de 2,2,-epidioxy-2,2,-adamantyl-adamant-4-eq.-ylrest.

Zoals boven reeds vermeld, betreft de uitvinding tevens een werkwijze voor het aantonen of bepalen van een organische verbinding, die gemerkt is met een of meer der boven gedefinieerde groepen R^ en desgewenst tevens gemerkt is met een of meer der boven gedefinieerde 35 groepen R^, volgens welke werkwijze men de groep of de groepen R^ tot fluorescentie brengt en de fluorescentie meet.

Bij de werkwijze volgens de uitvinding wordt gebruik gemaakt van het principe van de energie-overdracht, zoals boven is besproken.

8401213 - 4 - * * %

In vergelijking met de methode volgens de Nederlandse octrooiaanvrage 8201492, waarbij verbindingen worden aangetoond of bepaald, die uitsluitend met van adamantyl-adamantaan-dioxet- aan afgeleide groepen zijn gemerkt, is de onderhavige werkwijze aanmerkelijk gevoeliger.

5 Deze verbetering van de gevoeligheid kan verklaard worden aan de hand van de fluorescentie van ongesubstitueerd adamantyladamantaan-dioxet'aan. Bij de thermische ontleding van deze verbinding ontstaan voor 2 % singlet- en voor 15 % triplet-aangeslagen toestanden. Terugvallen van de singlet-aangeslagen toestand naar de grond-toestand geeft 10 in 1:200 gevallen een foton licht (fluorescentie). Terugvallen van de triplet-aangeslagen toestand naar de grond-toestand geeft fosforescentie. De fluorescentie-efficiency van deze ontledingsreactie is dus 1:200 _3 (5.10 ). De energie van de singlet-aangeslagen toestand wordt nu vol gens de uitvinding bij voorbeeld op de 9*10-difenylantracylgroep over-15 gedragen, zonder dat daarbij licht wordt uitgezonden. Deze energie- overdracht geschiedt met een efficiency van bijna 100 % indien de beide moleculen zich op korte afstand van elkaar bevinden. Zoals boven reeds is vermeld, is de difenylantracylrest dan in de singlet-aangeslagen toestand gekomen en fluoresceert door terug te vallen naar de 20 grond-toestand. De efficiency van deze fluorescentie bedraagt 0,9. Dit betekent, dat de fluorescentie, die bij thermische ontleding van het dioxet'.aan uitgestraald wordt, nu via de difenylantracylgroep ongeveer 180-maal versterkt als fluorescentie tot uitdrukking komt.

De uitvinding heeft ook betrekking op verbindingen die geschikt 25 zijn voor de bereiding van de met een of meer polycyclische aromatische groepen gemerkte organische verbindingen volgens de uitvinding.

Deze verbindingen hebben de formule R^-Y-X, waarin R^ een polycyclische aromatische groep met ten minste 3 lineair geannelleerde benzeenringen voorstelt, welke groep tot fluorescentie gebracht kan worden door 30 energie-overdracht uit een in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand verkerende groep of verbinding, Y een tweewaardige organische rest betekent en X een reactieve groep voorstelt.

Het symbool Y staat voor een bruggroep, die echter ook afwezig kan zijn, wanneer van de reactieve groep X, na reactie met de te merken ver 35 organische /binding, ten minste een atoom overblijft. De rest R^ dient namelijk door ten minste een atoom van de te merken organische verbinding gescheiden te zijn. Y kan een tweewaardige koolwaterstofrest zijn, zoals een methyleen-, ethyleen-, propyleen-, butyleen- of nog langere alkyleenrest, die eventueel vertakt en/of gesubstitueerd kan zijn.

8401213 - 5 - Y kan bijvoorbeeld ook een tweewaardige koolwaterstofrest zijn, die via een zuurstof- of stikstofatoom of via een -NH-CO-groep aan R^ is gebonden.

De reactieve groep X kan een willekeurige reactieve groep zijn, 5 die in staat is met de te merken organische verbinding te reageren.

Als voorbeelden van reactieve groepen X kunnen de volgende genoemd worden: hydroxyl- en thiolgroepen, reactief veresterde hydroxyl- of thiolgroepen, waaronder halogeenatomen, zoals chloor-, broom-, en joodatomen, zuurgroepen, zoals carbonzuur- en sulfonzuurgroepen, zuur-10 halogenidegroepen, carbonzuur- en sulfonzuurestergroepen, oxogroepen, zuuranhydridegroepen, aminogroepen, cyaangroepen, isocyanaatgroepen, isothiocyanaatgroepen, thiocyanaatgroepen, amidaatgroepen of ook metaal-atomen, zoals natrium- of kaliumatomen. De reactieve groep X kan ook een magnesiumhalogenidegroep zijn.

15 Onder de reactieve carbonzuurestergroepen kan de succinylimid-N- yl-oxycarbonylgroep genoemd worden, waarmee goede ervaringen zijn opgedaan. Deze groep reageert gemakkelijk met te merken verbindingen, die een aminogroep bevatten. Een reactieve groep, die gemakkelijk met thiolgroepen reageert, is bijvoorbeeld de maleïnimid-N-yl-groep.

20 Voor het merken van eiwitten, die een of meer vrije aminogroepen bevatten, is de N-hydroxysuccinimide-ester van 4-(9,10-difenylantracen- 2-yl)-boterzuur (zie formule 15 van het formuleblad) bijzonder geschikt.

Verder betreft de uitvinding nieuwe dioxetaanverbindingen, die geschikt zijn voor het merken van organische verbindingen met een 25 groep met formule 1, dat wil zeggen een van de mogelijke groepen

In formule 2 stellen A en B alkyleenresten voor, die via een alkyleen-rest C met elkaar verbonden kunnen zijn, terwijl Y' een direkte binding of een tweewaardige organische rest voorstelt. Als tweewaardige organische resten Y’ kunnen dezelfde resten worden genoemd als boven bij 30 de beschrijving van Y zijn vermeld. Y' is bij voorkeur een via een zuurstofatoom of via de groep -NH-CO- aan de rest met formule 1 gebonden tweewaardige koolwaterstofrest.

Een groep verbindingen met formule 2, die de voorkeur verdient, bezit formule 3 van het formuleblad. In formule 3 heeft Y' de boven-35 genoemde betekenis. Verbindingen die bijzonder goed geschikt zijn voor het merken van organische verbindingen, die een of meer aminogroepen bevatten, zijn verbindingen met formule 4, waarin n een geheel getal van 0—10 voorstelt. Ook zijn goede ervaringen opgedaan met verbindingen met formule 5, waarin m een geheel getal van 0— 10 voor- 8401213 - 6 - stelt, in het bijzonder met de verbinding met formule 6.

Het is eveneens mogelijk, een organische verbinding zowel met een rest R. als met een rest Rp, als boven gedefinieerd, te merken, ^ ΘΠ door gebruik te maken van verbinding/met de formule 16, die eveneens 5 tot de uitvinding behoren. In die formule hebben en Rp de bovenvermelde betekenis, stellen p en q gehele getallen met een waarde van ten minste 1 voor en stelt X een reactieve groep voor. De reactieve groep X kan één der bovengenoemde betekenissen hebben, maar in dit geval kan X bijvoorbeeld ook een of meer bindingsplaatsen van 10 een antigeen of antilichaam voorstellen. Het symbool Y" staat voor een bruggroep, die ten minste driewaardig is en waaraan verder geen andere eis wordt gesteld dan dat daaraan de groepen R^, Rp en X gebonden kunnen worden. Een voorbeeld van een verbinding met formule 16 is een verbinding met formule 17, waarin R^, Rp en X de bovengenoemde beteke-15 nis hebben. De verbinding met formule 17 kan bereid worden door cysteïnylglycine (formule 18) te laten reageren met bijvoorbeeld Rp-CO-CHp-halogeen, dat preferent met de mercaptogroep reageert, en met R^-CO-halogeen of een ander reactief carbonzuurderivaat van R^ dat met de aminogroep van het cysteïnylglycine kan reageren. De carboxyl- 20 groep van het verkregen, met R1 en R„ gemerkte produkt kan dan in een re, 1 d gewenste reactievergroep worden omgezet.

In het algemeen kan men een belangrijke groep verbindingen met formule 16 bereiden door in een polypeptide of eiwit door reactie met een verbinding R^-Y-X en met een verbinding Rp-Y’-X één of meer 25 groepen R^ en Rp in te voeren. De daarbij verkregen verbindingen kunnen verder worden gemodificeerd om ze geschikt te maken voor reactie met andere moleculen, die daardoor tegelijkertijd zowel met R^ als met Rp worden gemerkt. Zo kan een gemerkt eiwit op bekende wijze aan een ander eiwit, een hormoon of een klein molecuul worden gehecht.

30 De bereiding van de verbindingen met de formule R^— Y-X kan op op zichzelf bekende wijze geschieden door invoering van de rest -Y-X in een polycyclische aromatische verbinding R^H. De verbinding met formule 15 kan worden verkregen door verestering van de verbinding met formule 14 met N-hydroxysuccinimide. De verbinding met formule 14 is 35 reeds beschreven in Ann. de Chimie 4_, 479-539 (1959). Volgens die publikatie wordt de verbinding met formule 14 bereid uit 9,10-difenyl-antraceen door laatstgenoemde verbinding onder Friedel-Crafts omstandigheden te laten reageren met barnsteenzuuranhydride bij aanwezigheid 8401213 - 7 - van aluminiumchloride, waardoor op plaats 2 van het difenylantraceen een succinoylgroep wordt ingevoerd. De aan plaats 2 van het difenylantraceen gebonden carbonylgroep wordt dan tot de raethyleengroep gereduceerd, bijvoorbeeld met hydrazine of zink/HCl, waarbij de verbinding 5 met formule 14 wordt gevormd.

Ook de verbindingen met formule i^-Y'-X kunnen op op zichzelf bekende wijze worden bereid, bijvoorbeeld met behulp van de methoden die in de Nederlandse octrooiaanvrage 8201492 zijn beschreven.

De nieuwe verbindingen met formule 2, in het bijzonder de nieuwe 10 verbindingen met formule 3 kunnen bijvoorbeeld worden bereid uitgaande van het bromide met formule 7. Voor de bereiding van verbindingen, waarin Y' via een zuurstofatoom aan de epidioxyadamantyl-adamantyl-rest gebonden is, kan men het bromide met formule 7 laten reageren met een a, u?-alkyleenglycol, hetgeen resulteert in een verbinding met een 15 hydroxyalkoxysubstituent met eindstandige hydroxygroep, bijvoorbeeld de verbinding met formule 8. In deze verbindingen kan dan op op zichzelf bekende wijze met behulp van zuurstof onder invloed van licht en bij aanwezigheid van methyleenblauw de epidioxygroep worden ingevoerd, waarbij bijvoorbeeld de verbinding met formule 9 wordt 20 verkregen. De eindstandige hydroxymethylgroep van deze verbinding kan dan tot de carboxylgroep worden geoxydeerd, bijvoorbeeld met kaliumpermanganaat, waarbij bijvoorbeeld de verbinding met formule 10 wordt verkregen. Laatstgenoemde verbinding wordt dan veresterd met N-hydroxysuccinimide bij aanwezigheid van dicyclohexylcarbodiimide, 25 waarbij bijvoorbeeld een ester met formule 4 wordt verkregen.

In dit verband wordt erop gewezen, dat bij de vorming van de dioxetanen uit de overeenkomstige onverzadigde verbindingen, bijvoorbeeld de adamantylideenadamantanen, steeds een mengsel van isomeren ontstaat. Elk der isomeren en mengsels daarvan zijn bruikbaar voor het 30 merken van organische verbindingen.

Verbindingen met formule 5 kunnen eveneens uitgaande van het bromide met formule 7 worden bereid, door het broomatoom eerst te vervangen door een aminogroep door reactie met ammoniak onder druk.

De aminoverbinding met formule 11 wordt dan geacyleerd met barnsteen-35 zuuranhydride en de verkregen acylverbinding met formule 12 wordt dan veresterd met N-hydroxysuccinimide. Tenslotte wordt de verkregen ester met formule 13 op bekende wijze omgezet in het dioxetaan met formule 6.

8401213 - 8 -

Een voorbeeld van de verbindingen met de formule 16 is de verbinding, die beschreven is in voorbeeld XIX. Het runderserumalbumine-dubbelconjugaat, verkregen volgens voorbeeld XIX kan met behulp van bijvoorbeeld een in water oplosbaar carbodiimide op op zichzelf bekende 5 wijze gebonden worden aan een antilichaam. Op overeenkomstige wijze werd thyroglobuline dubbelgeconjugeerd met de verbindingen met formule 6 respektievelijk formule 15 in een molaire verhouding van 1:100:100.

Van beide merkers worden ongeveer 50 moleculen aan het thyroglobuline gebonden. Dit thyroglobuline-dubbelconjugaat kan op op zichzelf bekende 10 wijze aan een ander eiwit gekoppeld worden, bijvoorbeeld met behulp van achtereenvolgens a periodaat oxydatie van de suikerresten van het thyroglobuline en Jb condensatie met één of meer aminogroepen van een eiwit en £ reductie van het condensaat met behulp van NaBH^.

Antilichamen (schaap-anti-humaan IgG en geit-anti-CEA; 2 mg/ml) 15 werden tevens gemerkt met en R2 (in 10% dioxan/100 mM boraatbuffer pH 8.5, 1 uur reactietijd) met verschillende molaire verhoudingen R^ en R2· Schaap-anti-humaan IgG immunoglobuline gaf tot maximaal een molaire merkingsverhouding (tijdens de merk-reactie) van 1:15:20 (antilichaam: R2:R^), in een dubbel diffusie techniek (Ouchterlony) een precipitatie-20 lijn met humaan IgG, die kwalitatief overeenkwam met die van het ongeconjugeerde schaap-anti-humaan IgG. Geit-anti-CEA immunoglobuline, geconjugeerd met R^ en R2 (molaire verhouding tijdens reactie 1:20:15) werd vergeleken met het zelfde geit-anti-CEA maar dan geconjugeerd met peroxidase: dit gebeurde in een competitie experiment in een enzyme-25 linked immunosorbent assay (ELISA) techniek. Uit dit experiment bleek dat het dubbelconjugaat van gaCEA met R^ en R2 geen sterke afname in immunoreactiviteit vertoonde.

Op deze wijze verkregen immunoglobuline-dubbelconjugaten (gaCEA-R^,R2 en saIgG-R^,R2) vertonen een specifieke activiteit van 30 + 500.000 photon counts per microgram (meet efficiency 1 %«). Het maximale versterkingseffect door de 9,10-difenylantraceenrest wordt niet bereikt aan immunoglobulines omdat ongeveer 25 R^-resten per immunoglobuline noodzakelijk zijn voor efficiënte energieoverdracht van het aangeslagen adamantanon naar deze acceptor. Dit komt door de 35 relatief korte zogenaamde kritische afstand (Rq 15 5 volgens de theorie van Förster; Rq is de afstand tussen donor en acceptor, waarbij de efficiency van energieoverdracht 50 % is).

In het licht van het bovenstaande is het zeer verrassend, dat runderserumalbumine en thyroglobuline (als voorbeelden van een relatief 8401213 . - 9 - klein en een relatief groot eiwit) verzadigd kunnen worden met en R2, dan nog oplosbaar zijn in waterige buffers en zeer veel licht uitzenden (de zogenaamde quantum-efficiency van beide merkers gaat niet duidelijk achteruit bij zwaargeconjugeerde eiwitten). Verder is het 5 zeer belankrijk, dat deze, met vele resten R^ en R2 gemerkte verbindingen weer als nieuwe, in water oplosbare merkers gebruikt kunnen worden.

De werkwijze voor het aantonen of bepalen van een organische verbinding, die gemerkt is met één of meer polycyclische aromatische 10 groepen R^ met ten minste drie lineair geannelleerde benzeenringen, welke groepen R^ tot fluorescentie gebracht kunnen worden door energie-overdracht uit een in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand verkerende groep of verbinding, welke organische verbinding desgewenst tevens gemerkt is met één of meer groepen R^, die door thermische 15 energie in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand kunnen worden gebracht, geschiedt volgens de uitvinding op een voor de uitvoering van kwalitatieve of kwantitatieve lichtmeting bekende wijze. Wanneer het gaat om de bepaling van een verbinding die zowel één of meer groepen R^ als één of meer groepen R^ bevat, dient de verbinding 20 te worden verhit om de groep(en) R2 in een singlet- en/of triplet- aangeslagen toestand te brengen. De groepen R2 dragen hun energie over op de groepen R^, die daardoor tot fluorescentie gebracht worden. Deze fluorescentie wordt op gebruikelijke wijze gemeten. In principe bestaat de apparatuur uit een oven, die op een vooraf ingestelde temperatuur 25 kan worden gebracht en waarin een monster, bijvoorbeeld op een plaatje van glas of een geschikte kunststof, bijvoorbeeld polytetrafluoretheen, kan worden verwarmd. Zo dicht mogelijk bij het monster, doch gescheiden door een warmtefilter, wordt een fotomultiplier geplaatst. Het uitgezonden licht kan ook via een optische glasvezelkabel naar de foto-30 multiplier worden geleid. Wanneer het monster in de oven is gebracht, brengt men de temperatuur van de oven binnen enkele seconden op ongeveer 250°C. De thermische ontleding van de 1,2-dioxetaanresten vindt dan binnen 20 seconden plaats. Het signaal van de fotomultiplier gaat via een voorversterker naar een discriminator/foton-counter. Deze 35 integreert het signaal (photocounts) steeds over een korte periode, bijvoorbeeld 2 seconden. Deze integralen worden in een computer verwerkt. De hoogste integraalwaarde (over 2 seconden) alsook de totale integraalwaarde (over ongeveer 30 seconden) zijn lineair evenredig met de hoeveelheid resten R2 over een zeer groot concentratiegebied. Om het 8401213 - 10 - achtergrondsignaal extreem laag te houden kan men uit de ruimte, waarin het monster wordt verhit, de zuurstof zo goed mogelijk verwijderen, bijvoorbeeld door spoelen met stikstof of door in vacuum te werken.

5 De volgende voorbeelden dienen ter illustratie van de uitvinding.

- Voorbeelden - 8401213 - 11 -

Voorbeeld I.

Bereiding van 4-eq.-(3-hydroxypropoxy)adamantylideenadamantaan (formule 8a).

10 g 4-eq.-broomadamantylideenadamantaan met formule 7 werd ver-5 mengd met 250 ml droge propaandiol-1,3 en het mengsel werd 2| uur onder terugvloeikoeling gekookt. Het reactiemengsel werd uitgegoten op 500 ml water. Extractie met dichloormethaan (2 x 250 ml), wassen van de samengevoegde extrakten met 250 ml water, drogen met MgSO^, filtreren en hoogvacuum verdampen gaf 10,0 g spectroscopisch zuiver 4-eq.-(3-10 hydroxypropoxy)adamantylideenadamantaan (formule 8a) in de vorm van een gele olie.

Analytisch zuiver materiaal werd verkregen na "Kugelrohr"-destillatie (250° C, 0,002 mm Hg) : 9,0 g (91 %).

Analyse: berekend voor ^3^34^ 80,63 % C; 10,02 % H.

15 Gevonden: 80,52 % C; 9,95 % H.

IR-spectrum (onvermengd): 3400 (s), 2900 (s), 1450 (s), 1100 (br) cm”^. 1H-NMR-spectrum (CCl^, TMS): 6 3,6 (t, J = 7 Hz, 2 H), 3,5 (t, J = 7Hz, 2 H); 3,2 (br, 1 H); 2,9 (br, 4 H); 2,3-1,0 (m, 25 H). 13C-NMR-spectrum (CDCLj): 6135,4; 130,5; 82,1 (d); 66,6 (t); 61,8 (t); 20 39,2; 38,8; 36,9; 36,5; 35,2; 32,8; 32,0; 31,7; 31,3; 30,8; 30,6; 28,1; 27,3.

Massa-spectrum: M+-piek bij m/e 342 (100 %); 267; 135; 79·

Voorbeeld II.

Bereiding van 4-eq.-(4-hydroxybutoxy)adamantylideenadamantaan 25 (formule 8b).

De werkwijze van voorbeeld I werd herhaald, met dit verschil, dat 250 ml droge butaandiol-1,4 in plaats van propaandiol-1,3 werd toegepast. Het produkt, 4-eq.-(4-hydroxybutoxy)adamantylideenadamantaan (formule 8b), werd in ruwe vorm verkregen als een gele olie (11,0 g), die werd 30 gezuiverd door middel van kolomchromatografie over Al^O^ niet als loopvloeistof dichloormethaan. Op deze wijze werd 9,94 g (97 %) spectroscopisch zuiver produkt verkregen in de vorm van een kleurloze olie.

IR-spectrum (onvermengd): 3.350 (s), 2900 (s), 1450 (s), 1100 (br) cm \ 35 1 H-NMR-spectrum (CDC13, TMS): 6 3,8-3,1 (m, 5 H); 2,85 (br, 4 H); 2,3-1,0 (m, 27 H).

^3C-NMR-spectrum (CDCl^): 6 135,6; 130,8, 82,3; 67,5; 62,5; 39,6; 39,4; 39,0; 37,0; 36,8; 35,4; 32,9; 32,2; 31,9; 31,5; 31,0; 30,8; 30,5; 28,3; 27,5; 27,3.

8401213 - 12 -

Massa-spectrum: M+-piek bij m/e 356 (20 %); 284; 268; 135; 79·

Exacte massa: verwacht 356,272; experimenteel: 356,273.

Voorbeeld III.

Bereiding van 4-eq.-(5-hydroxypentoxy)adamantylideenadamantaan 5 (Formule 8c).

De werkwijze van voorbeeld I werd herhaald, met dit verschil dat 250 ml droge pentaandiol-1,5 in plaats van propaandiol-1,3 werd toegepast. Het produkt, 4-eq.-(5-hydroxypentoxy)adamantylideenadamantaan (formule 8c), dat in ruwe vorm werd verkregen als een gele olie, werd ge-10 zuiverd door middel van kolomchromatografie over met als loop- vloeistof dichloormethaan. Zo werd 9,0 g (85 %) kleurloos produkt verkregen.

IR-spectrum (onvermengd): 3400 (s), 2900 (s), 1445 (s), 1100 (br) cm”"*.

1H-NMR-spectrum (CDC13, TMS): 6 3,8-3,1 (m, 5 H); 2,9 (br, 4 H); 15 2,45 (s, 1 H); 2,6-1,0 (m, 28 H).

13C-NMR-spectrum (CDC13): 6 135,2; 130,9; 81,7; 67,1; 62,1; 39,3; 38,9; 37,0; 36,7; 35,4; 32,8; 32,1; 31,8; 31,5; 30,8; 29,6; 28,2; 27,4; 22,4.

Massa-spectrum: M+-piek bij m/e 370 (55 %); 268; 135; 79.

20 Exacte massa: verwacht 370,287; experimenteel 370,288.

Voorbeeld IV.

Bereiding van 4-eq.-(3-hydroxypropoxy)-2,2l-epidioxy-2,2t-adamantyl-adamantaan (formule 9a).

De verbinding met formule 8a (4 g) werd opgelost in dichloormethaan 25 (700 ml). Daarna werd methyleenblauw (20 mg) toegevoegd. Het ontstane mengsel werd onder doorleiden van zuurstof bestraald met een natrium-lamp (Philips SON 160 W), die van een reflector was voorzien en op korte afstand van de oplossing was geplaatst. De bestraling en het doorleiden van zuurstof werd gedurende 7 uren voortgezet, waarbij het 30 oplosmiddel van tijd tot tijd werd aangevuld. De temperatuur van de oplossing steeg tot ongeveer 40° C. Na de bestraling werd het oplosmiddel verdampt en het residu gechromatografeerd over een kolom A1303 met als loopvloeistof eerst dichloormethaan en daarna ethylacetaat.

De fractie die de verbinding met formule 9a bevatte werd met ont-35 kleuringskool behandeld en ingedampt. Op deze wijze werd de verbinding met formule 9a verkregen als mengsel van twee isomeren in de vorm van een kleurloze olie (4,1 g, 94 %).

IR-spectrum (onvermengd): 3450 (s), 2900 (s), 1455 (s), 1100 (br) cm-^.

8401213 - 13 - H-NMR-spectrum (CDC13, TMS): 6 3,82 (t, J = 11 Hz, 2 H), 6 3,68 (t, J = 11 Hz, 2 H), ^3,15 (br, 1 H), 6 2,85 (br, 1 H), 6 2,65 (br, A H), 6 2,3-1,2 (m, 24 H).

13C-NMR-spectrum (CDCLj): b 96,2; 96,0; 95,4; 77,7; 76,9; 67,5; 5 67,0; 62,2; 61,9; en 22 pieken tussen 6 39 en 25,4.

Massa-spectrum: Fragmenten M = 150 en M = 224. Exacte massa grootste fragment: verwacht 224,141; gevonden 224,143. Geen M+ bij m/e 374.

Voorbeeld V.

- Bereiding van 4-eq.-(4-hydroxybutoxy)-2,2,-epidioxy-2,2,-adamantyl-10 adamantaan (formule 9b).

De verbinding met formule 8b (9,8 g) werd behandeld als in voorbeeld IV. De verbinding met formule 9b werd daarbij verkregen als een mengsel van twee isomeren in de vorm van een kleurloze olie (9,4 g; 88 %).

15 IR-spectrum (onvermengd): 3400 (s), 2900 (s), 1450 (s), 1100 (br) cm . 1H-NMR-spectrum (CDC13, TMS): & 3,75-3,2 (m, 5 H); 6 3,0-2,4 (m, 5 H); 6 2,3-1,0 (m, 26 H).

13C-NMR-spectrum (CDCLj): 6 96,1; 95,9; 95,3; 77,3; 76,5; 67,8; 67,6; 62,3; 62,2; en 25 pieken tussen <f36,9 en 25,4.

20 Massa-spectrum: Fragmenten m/e = 238 en 150 (100 %). Exacte massa grootste fragment: verwacht voor C-j^H^O^: 238,157; experimenteel: 238,158.

Voorbeeld VI.

Bereiding van 4-eq.-(5-hydroxypentoxy)-2,2,-epidioxy-2,2,-adamantyl-25 adamantaan (formule 9c).

De verbinding met formule 8c (4 g) werd behandeld als in voorbeeld IV. De verbinding met formule 9c werd daarbij verkregen als een mengsel van twee isomeren in de vorm van een kleurloze olie (3,6 g; 83 %).

_1 IR-spectrum (onvermengd): 3450 (s), 2950 (s), 1460 (s), 1100 (br) cm .

1 r 30 H-NMR-spectrum (CDCl^): o 3,8-3,2 (m, 5 H); 3,0-2,4 (m, met pieken op 6 2,80 en 2,62; 5 H); 2,3-1,0 (m, 28 H).

13C-NMR-spectrum (CDC13): if 96,3; 96,0; 95,6; 95,5; 77,2; 76,1; 67,8; 67,6; 62,6; 62,5; en pieken tussen <5*37,3 en 22,3.

Massa-spectrum: Fragmenten bij m/e = 252 en 150 (100 %), verder 121 en 35 79-

Exacte massa: fragment 252: verwacht 252,173; gevonden 252,174.

8401213 • ’ - 14 -

Voorbeeld VII.

Bereiding van 3-(2,21-epidioxy-2,21-adamantyladaman t-4-eq.-yl-oxy)-propionzuur (formule 10a).

De verbinding met formule 9a (mengsel van twee isomeren; 0,60 g; 3 5 1,60 mmol) werd opgelost in azijnzuur (1,8 cm ). Aan deze oplossing werd bij kamertemperatuur onder roeren langzaam 0,38 g KMnO^ toegevoegd. Daarna werd het mengsel nog A uur bij kamertemperatuur geroerd.

3

Vervolgens werd water (50 cm ) en een verzadigde oplossing van natrium- 3 waterstofsulfiet in water (20 cm ) toegevoegd en werd uitgeschud met 3 .

10 50 cm dichloormethaan. De organische fase werd afgescheiden, gewassen 3 met water (2 x 50 cm ), gedroogd met magnesiumsulfaat, gefiltreerd en ingedampt, waarna een kleurloze olie achterbleef. Deze werd opgelost 3 in pentaan/ether 1:2 (50 cm ), waarna NH^-gas (droog) door de oplossing werd geleid; hierdoor sloeg de verbinding met formule 10aals ammonium-15 zout in de vorm van een olie neer. De bovenstaande vloeistof werd 3 gedecanteerd en het residu werd gewassen met n-pentaan (2 x 20 cm ).

3

Daarna werd dichloormethaan (50 cm ) toegevoegd en de oplossing ge- 3 3 schud met 2 NHC1 (20 cm ) en vervolgens met water (50 cm ). Vervolgens werd gedroogd op MgSO^ en gefiltreerd. Na verdampen van het oplos-20 middel en drogen van het residu onder hoogvacuum resteerde de spectroscopisch zuivere verbinding met formule 10a als een kleurloze taaie olie (0,30 g; 48 %; mengsel van twee isomeren).

IR-spectrum (onvermengd): 3700-2400 (s); 2900 (s), 1705 (s), 1460 (m), 1100 (m) cm .

25 1 H-NMR-spectrum (CDC1 , TMS): 6 9,3 (br, 1 H), 63,75 (t, J = 6 Hz, 2 H), 6 3,6 (br, 1 H); 3,0-2,4 (m, 6 H), 2,3-1,0 (m, 22 H).

13C-NMR-spectrum (CDCLj): 6 177,2; 96,2; 96,0; 95,4; 77,6; 76,6; 62,9; 62,8; en 22 signalen tussen 36,9 en 25,4.

Massa-spectrum: Fragmenten m/e = 238 (15 %) en 150 (50 %), verder 30 222,165 en 79 (100 %). Exacte massa fragment 238: verwacht 238,120; gevonden 238,121. Geen M+-piek.

Voorbeeld VIII.

Bereiding van 4-(2,2'-epidioxy-2,2*-adamantyladamant-4-eq.-yl-oxy)-boterzuur (formule 10b).

35 De verbinding met formule 9b (mengsel van twee isomeren; 2,0 g; 3 5,15 mmol) werd geoxideerd als in voorbeeld VII (azijnzuur 5 cm ; KMnO^ 1,2 g; reactietijd 3 uur) en op overeenkomstige wijze gezuiverd.

Na verdampen van het dichloormethaan werd de verbinding met formule 10b verkregen als een kleurloze taaie olie (1,58 g; 76 %; mengsel van 8401213 - 15 - twee isomeren).

IR-spectrum (onvermengd): 3700-2400 (s), 2950 (s), 1705 (s), 1455 (m), 1105 (s) cm-1.

1H-NMR-spectrum (CDCl^, TMS): S 8,3 (br, 1 H), 3,47 (t, J = 6 Hz, 2 H), 5 3,4 (br, 1 H), 2,9-1,0 (m, met pieken bij <5 2,8; 2,6; 2,5; 2,4; 1,85; 30 H).

13C-NMR-spectrum (CDC13): ó179,3; 96,2; 96,0; 95,5; 77,3; 76,4; 66,6; 66,3; en 23 signalen tussen 37,0 en 25,0.

Massa-spectrum: Fragmenten met m/e = 252 en 150 (100 %), verder 165 10 en 79. Exacte massa fragment 252: verwacht 252,136; gevonden 252,138. Geen M+-pieken.

Voorbeeld IX.

Bereiding van 5-(2,2l-epidioxy-2,2t-adamantyladamant-4-eq.-yl-oxy)-valeriaanzuur (formule 10c) 15 De verbinding met formule 9c (mengsel van twee isomeren; 3,6 g; 3 9,0 mmol) werd geoxideerd als in voorbeeld VII (azijnzuur 10 cm ; KMnO^ 2,0 g; reactietijd 3 uur) en op overeenkomstige wijze gezuiverd. Na verdampen van het dichloormethaan werd de verbinding met formule 10c verkregen als een kleurloze taaie olie (2,4 g; 65 %; mengsel van 20 twee isomeren).

IR-spectrum (onvermengd): 3600-2500 (s); 2900 (s), 1710 (s), 1460 (m), 1100 (m) cnf\ 1H-NMR-spectrum (CDC1 , TMS):d9,0 (br, 1 H); d3,6-3,2 (m, 3 H); 6 3,0-1,0 (m, met pieken bij d 2,78; 2,60; 2,38; 2,28; 1,90 en 25 1,70; 32 H).

13C-NMR-spectrum (CDCLj): 6 179,0; 96,4; 96,1; 95,7; 95,5; 77,3; 76,4; 67,4; 67,2; 40 pieken tussen 37,2 en 21,6.

Massa-spectrum: Fragmenten met m/e = 266 en 150 (70 %), verder 121, 101, 79. Exacte massa fragment 266: verwacht 266,152; gevonden 266,154. 30 Geen M+-piek.

Voorbeeld X.

Bereiding van de N-hydroxysuccinimide-ester van S-^^’-epidioxy^^'- adamantyladamant-4-eq.-yl-oxy)propionzuur (formule 4a).

De verbinding met formule 10a(mengsel van twee isomeren; 1,85 g; 3 35 4,8 mmol) werd opgelost in droge dioxan (10 cm ). Aan het mengsel werd dicyclohexylcarbodiimide (1,1 g; 5 mmol) en gedroogd N-hydroxy-succinimide (480 mg, 4,85 mmol) toegevoegd. Het geheel werd bij kamertemperatuur onder uitsluiting van vocht gedurende 16 uur geroerd.

8401213 - 16 -

De suspensie werd gefiltreerd en het oplosmiddel verdampt onder vacuum.

3

Het residu werd gewassen met droge n-hexaan (50 cm ) en daarna opgelost 3 in droge dichloormethaan (50 cm ). Een niet opgelost gedeelte werd verwijderd door filtratie over een korte kolom zeezand. Daarna werd het 5 oplosmiddel verdampt onder hoogvacuum. De verbinding met formule 4a bleef als residu achter in de vorm van een wit schuim (mengsel van twee isomeren; 2,2 g, 95 %; spectroscopisch zuiver).

IR-spectrum (onvermengd): 2900 (s), 1810 (m), 1775 (m), 1730 (s), 1460 (m), 1200 (m) cm"1.

10 1H-NMR-spectrum (CDCL^, TMS): 6 3,83 (t, 7 = 7 Hz, 2 H); 3,7 (br, 1 H); 3,1-2,4 (m, met piek bij 6 2,85; 10 H); 2,3-1,0 (m, 22 H). 13C-NMR-spectrum (CDCL^): <f 168,9; 166,5; 95,9; 95,6; 95,1; 77,6; 76,6; 62,1; en 19 pieken tussen (f36,7 en 25,1.

Massa-spectrum: Fragmenten m/e = 335 en 150, verder 165, 149, 121 (100%). 15 Exacte massa fragment 335: verwacht 335,137; gevonden 335,138. Geen M+-piek.

Voorbeeld XI.

Bereiding van de N-hydroxysuccinimide-ester van 4-(2,2t-epidioxy-2,2,-adamantyladamant-4-eq.-yl-oxy)boterzuur (formule 4b).

20 De verbinding met formule 10b(mengsel van twee isomeren; 210 mg; 0,52 mmol) werd overeenkomstig de methode van voorbeeld X veresterd met N-hydroxysuccinimide. Na opwerken als in voorbeeld X bleef de verbinding met formule 4b als residu achter in de vorm van een kleurloze taaie olie (opbrengst 90 %, 235 mg; spectroscopisch zuiver; mengsel 25 van twee isomeren).

IR-spectrum (onvermengd): 2920 (s), 1810 (m), 1780 (m), 1735 (s), 1460 (m), 1200 (m), 1070 (s) cm"1.

1H-NMR-spectrum (CDC13, TMS): 63,50 (t, J = 6 Hz, 2 H); 3,4 (br, 1 H); 2,80 (s, 4 H); 2,65 (m, 4 H); 2,3-1,0 (m, 26 H).

30 13C-NMR-spectrum (CDCLj): <5 169,0; 168,4; 96,2; 96,0; 95,5; 77,3; 76,3; 65,7; 65,5; en pieken tussen (f37,0 en 24,5.

Massa-spectrum: Fragmenten m/e = 349 (6 %) en 150 (35 %), verder 165, 149, 121 (100 %), 79· Exacte massa fragment 349: verwacht 349,153; gevonden 349,152. Geen M+-piek.

35 Voorbeeld XII,

Bereiding van de N-hydroxysuccinimide-ester van 5-(2,2,-epidioxy-2,2t-adamantyladamant-4-eq.-yl-oxy)valeriaanzuur (formule 4c).

De verbinding met formule 10c (mengsel van twee isomeren; 2,0 g; 8401213 - 17 - A,8 mmol) werd overeenkomstig de methode van voorbeeld X veresterd met N-hydroxysuccinimide. Na opwerken als in voorbeeld X bleef de verbinding met formule 4c als residu achter in de vorm van een schuimige witte stof (95 %; 2,35 g; spectroscopisch zuiver; mengsel 5 van twee isomeren).

IR-spectrum (onvermengd): 2900 (s), 1805 (m), 1775 (m), 1730 (s), 1460 (m), 1200 (s), 1060 (s) cm"1.

1H-NMR-spectrum (CDCLj): 6 3,50 (t, J = 6 Hz, 2 H); 3,4 (br, 1 H); 2,80 (s, 4 H); 2,65 (m, 4 H); 2,3-1,0 (m, 28 H).

10 13C-NMR-spectrum (CDC13): <S168,9; 168,3; 168,2; 96,1; 95,8; 95,4; 95,3; 77,2; 76,2; 66,9; 66,8; verder pieken tussen 037,0 en 21,5. Massa-spectrum: Fragmenten ra/e 363 ( 5 %) en 150 ( 50 %), verder 165, 149, 121 (100 %), 79. Exacte massa fragment 363: verwacht 363,168; gevonden 363,169. Geen M+-piek.

15 Voorbeeld XIII.

Bereiding van 4-eq.-amino-adamantylideenadamantaan (formule 11).

De verbinding met formule 7 (7 g, 0,020 mol) werd vermengd met droge dioxan (75 ml) in een roestvrijstalen cylinder. Daarna werd vloeibare NH^ ingeleid (250 ml) tot de cylinder voor 4/5 gevuld 20 was. Na te zijn afgesloten werd de cylinder met inhoud op 70°C gebracht en gehouden in een zgn. Cariusoven. Na 3-16 uren werd de cylinder afgekoeld met behulp van vloeibare geopend en (nadat de overtollige NH^ verdampt was, uitgegoten op 1 N NaOH (100 ml).

Het produkt werd opgenomen in ether (250 ml) en de etherische op-25 lossing gescheiden en gewassen met H^O (3 x 200 ml). De organische fase werd gedroogd op MgSO^, gefiltreerd en ingedampt, waarna de verbinding met formule 11(spectroscopisch zuiver) achterbleef als witte vaste stof (5,70 g, 95 %).

Voorbeeld XIV.

• 30 Bereiding van N-(adamantylideenadamant-4-eq.-yl)barnsteenzuurmono-amide (formule 12).

Een oplossing van de verbinding met formule 11 (9 g; 32 mmol) 3 in absolute ethanol ( 75 cm ) werd toegevoegd aan een oplossing van

O

barnsteenzuuranhydride (3,2 g; 32 mmol) in absolute ethanol (150 cm ).

35 Het geheel werd geroerd gedurende 18 uur bij kamertemperatuur.

Daarna werd het mengsel gekoeld tot 0°C en het produkt werd afgefil- 3 treerd en gewassen met koude ethanol (100 cm ). Zo werd de verbinding met formule 12 verkregen als een witte vaste stof (12,2 g; 90%); smeltpunt 253-256°C).

8401213 - 18 - IR-spectrum (KBr-plaatje): 3400 (m)f 3300-2500 (s), 2900 (s), 1720 (s), 1640 (s) en 1550 (s) cm’1.

1H-NMR-spectrum (DMS0-d&): £7,5 (br, 1 H); 3,6 (m, 1 H); 2,7 (m, 4 H); 2,3 (br, s, 4 H) en resonantie tot <5 1,0 (22 H).

5 13C-NMR-spectrum (DMS0-d6): £ 174,0; 170,5; 134,4; 131,5; 53,9; 37,9; 36,7; 35,2; 32,7; 31,7; 31,5; 31,4; 30,6; 30,4; 30,2; 29,4; 27,8; 27,0. Massaspectrum: M+ bij m/e 383 (100 %), verder 365, 283, 266.

Exacte massa: verwacht 383,246; gevonden 383,244.

Voorbeeld XV.

10 Bereiding van 4-eq.-D-lsuccinirtiid-N-yl-oxycarbonyl)ethyl-carbonylamino3-2,2' -adarnantylideenadamantaan (Γormule 13) .

De verbinding met formule 12 (1,65 g; 4,3 mmol) werd onder verwarming opgelost in watervrij dimethylformamide (50 cm3). Na afkoelen tot omgevingstemperatuur werd dicyclohexylcarbodiimide (900 mg; 4,35 15 mmol) toegevoegd. Na 10 minuten roeren werd N-hydroxysuccinimide (660 mg; 5,75 mmol) toegevoegd en daarna werd het mengsel gedurende 16 uur geroerd bij kamertemperatuur onder uitsluiting van vocht. Een weinig neerslag dat was gevormd werd afgefiltreerd. Het oplosmiddel werd verdampt onder hoogvacuum. Het residu werd gewassen met n-hexaan 20 (2 x 50 cm ) en daarna opgelost in dichloormethaan (50 crn ). Een troebeling in de oplossing werd verwijderd door filtratie over een korte kolom van zeezand. Daarna werd het oplosmiddel onder hoogvacuum verwijderd en bleef de verbinding met formule 13 in de vorm van een witte vaste stof achter (2,06 g, 100 %); smeltpunt: 191-1C (etb^netaat). 25 IR-spectrum (KBr-plaatje): 3400 (m, NH), 2900 (s), 1805 (m), 1770 (m), 1720 (s), 1660 (m), 1535 (ra), 1200 (m), 1060 (m) cm"1.

*] II-NMR-spectruiii (CDC10, ïilS, 200 Huz): 6 5,95 (ei, J=7 Hz; 1 ïl) ; 3,9 (iii, 3 H); 3,02 (t, J=7,5 nz; 2 ti); 2,o/ (1,1, 4 H); 2,ii3 (s, 4 ii); 2,63 (t, J=7,5 Hz; 2 Γ1) ; 2,2-1,0 (ra, 22 II).

30 13C-MMR-spectrura (CDC13): 6 168,0; 168,3; 136,0; 130,4; 54,3; 39,4; 39,0; 37,6; 37,1; 35,2; 33,3; 33,2; 32,2; 32,0; 31,6; 31,2; 30,9; 30,6; 20,3; 23,2; 27,3; 26,8; 25,4; 24,7.

Massa-spectrura: Mh-piek bij m/e = 480, verder 365 (100 %) en 267,266. Exacte massa verwacht 430,262; gevonden 480,263.

35 Voorbeeld XVI.

Bereiding van 4-eq. - [2- (succinimid-H-yl-oxycarbonyDethyl-carbonyl-amino3-2,2'-epidioxy-2,2l-adamantyladainantaan (formule 5a).

8401215 , * -19-

De verbinding met formule 13 (800 mg, 1,67 mmol) werd opgelost in dichloormethaan (200 cm ) samen met methyleenblauw (5 mg) en op de in voorbeeld IV beschreven wijze gedurende 5 uren bestraald en met zuurstof verzadigd. Aan de oplossing werd ontkleuringskool toegevoegd 5 (200 mg); na roeren werd gefiltreerd en werd het oplosmiddel onder 3 vacuum verdampt. Na oproeren met n-pentaan (50 cm ) en verdampen van het oplosmiddel resteerde de verbinding met formule 5a, een mengsel van twee isomeren, (750 mg, 89 %) als een witte vaste stof. Het zo verkregen materiaal was spectroscopisch zuiver en werd als zodanig 10 voor koppelingsreacties gebruikt. Smeltpunt 50-95°C.

IR-spectrum (KBr-plaatje): 3400 (br, NH), 2950 (s), 1810 (m), 1780 (m), 1730 (s), 1650 (m), 1540 (m), 1200 (m), 1080 (m) cm"1.

1H-NMR-spectrurn (CDC1 , TMS; 200 MHz): 66,20 (d, J=3 Hz; l H); 6,00 (d, J=8 Hz; i H); 4,25 (ra, \ H); 4,16 (m, l H); 3,00 (t, J=8 Hz; 2II); 15 2,83 (s, 4 H); 2,65 (t, J=8 Hz); 2,78-2,5 (m, 6 H); 2,2-1,2 (m, 22 H).

13C-NMR-spectrum (CDCL^): <5 169,2; 169,1; 168,9; 168,3; 168,2; 96,0; 95,7; 95,4; 95,3; 49,5; 48,6; signalen tussen 39,4 en 24,7. Massa-spectrum: Fragmenten m/e 362 en 150; verder 247, 219, 149, 100, 79. Exacte massa fragment 362: verwacht 362,148; gevonden 362,150.

20 Voorbeeld XVII.

Bereiding van de N-hydroxysuccinimide-ester van 4-(9,10-difenylantracen-2-yl)boterzUur (formule 15). met formule 1A

4-(9,10-difenylantracen-2-yl)boterzuur./[[bereid volgens Ann. de Chimie _4, 479-539 (1959)3 werd op de in voorbeeld X beschreven wijze ver-25 esterd met N-hydroxysuccinimide. De verbinding met formule 15 werd zo verkregen als een oranjegele vaste stof (100 % opbrengst, spectroscopisch zuiver), en werd als zodanig voor koppelingsreacties gebruikt. IR-spectrum (KBr-plaatje): 2950 (w), 1805 (m), 1770 (m), 1720 (s), 1620 (m), 1200 (m), 1060 (m), 745 (m), 695 (m) cm-1.

30 13C-NMR-spectrum (CDC13): 6 168,9; 168,2; 138,9; 137,0; 136,8; 136,2; 131,1; 129,9; 129,7; 129,4; 128,6; 128,2; 127,9; 127,2; 126,7; 126,4; 125,0; 124,8; 124,6; 34,7; 29,9; 25,6; 25,3.

Massa-spectrum: M+-piek bij m/e = 513 (100 %), verder 497, 416, 399, 356, 343. Exacte massa: verwacht 513,194; gevonden 513,192.

35 Voorbeeld XVIII.

Koppeling van de verbinding met formule 4c aan een eiwit.

Aan een oplossing van runderserumalbumine (1 g) in boraatbuffer 3 (0,1 M; pH 8,5; 133 cm ) werd toegevoegd een oplossing van de verbin- 8401213 3 - 20 - ding raet formule 4c (175 mg) in dioxan (33 cm ). Na 2 uur reactietijd werd het heldere mengsel eerst gedialyseerd tegen dioxan [h?0 (1:4), (2 dm )] daarna tegen gedestilleerd water (4x2 dm'). Na vriesdrogen _ van de eiwitoplossing werd het conjugaat van verbinding met formule 4c 5 en BSA verkregen als een witte vaste stof (1 g). Dit materiaal dat ongeveer 10 labels per eiwitmolecuul bevat, hetgeen bepaald werd middels aminogroepentritatie volgens Habeeb [Anal. Biochem. 14, 328-36 (1966)] geeft in een apparaat voor thermochemiluminescentie met β een meetefficiency van ongeveer 1 %o 2.10° fotoncounts per microgram 10 eiwit. De blancowaarde van de meting bedraagt minder dan 100 fotoncounts.

Voorbeeld XIX.

Een oplossing van runderserumalbumine-conjugaat (0,2 mg) verkregen volgens voorbeeld XVIII, maar dan met een molaire verhouding van BSA tot de verbinding met formule 4c van 1 : 25 in boraatbuffer (100 m M, 3 15 pH 8,5; 0,2 cm ) werd vermengd met een oplossing van verbinding met 3 formule 15 (0,5 mg) in aceton (0,1 cm ). Na 30 min. reactietijd werd het conjugaat van BSA, verbinding met formule 4c en verbinding met formule 15 gezuiverd door middel van dialyse. Dit materiaal, opgelost in een 1-procents oplossing van BSA in gedestilleerd water, geeft over 20 het gehele gemeten concentratiegebied (100 pg/ml tot 1 ^ig/ml; daarvan voor een meting genomen 1 yjl) 40 keer zoveel fotoncounts als het bij dit voorbeeld toegepaste uitgangsmateriaal.

- conclusies - 8401213

Claims

1. Organische verbinding, die gemerkt is met een of meer polycyclische aromatische groepen R^ met ten minste drie lineair geannelleerde benzeenringen, welke groepen R1 tot fluorescentie gebracht kunnen worden door energie-overdracht uit een in een singlet- 5 en/of triplet-aangeslagen toestand verkerende groep of verbinding, en desgewenst tevens gemerkt is met een of meer groepen R2> die door thermische energie in een singlet- en/of triplet-aangeslagen toestand kunnen worden gebracht.

2. Volgens conclusie 1 gemerkt eiwit, steroid of vetzuur.

3. Volgens conclusie 1 of 2 gemerkt eiwit, dat een deel van een immunologisch paar is.

4. Verbinding volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de volgens conclusie 1 gemerkte verbinding een antilichaam of een antigeen is.

5. Verbinding volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de volgens conclusie 1 gemerkte verbinding een immunologisch complex is.

6. Verbinding volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat de polycyclische aromatische groep R^ een 9»10-difenylantracyl- 20 groep is.

7. Verbinding volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat de groep R2 de formule 1 bezit, waarin A en B alkyleenresten voorstellen, die via een alkyleenrest C met elkaar verbonden kunnen zijn.

8. Verbinding volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de groep R2 formule 1 bezit, waarin de alkyleenrest A 2-5 kool-stofatomen, alkyleenrest B 2-5 koolstofatomen en alkyleenrest C, indien aanwezig 1-4 koolstofatomen bevat.

9. Verbinding volgens conclusie 7 of 8, met het kenmerk, 30 dat de groep R2 de 2,2,-epidioxy-2,2’-adamantyl-adamant-4-eq.-yl-rest is.

10 Y' de bovengenoemde betekenis heeft.·

10. Werkwijze voor het aantonen of bepalen van een organische verbinding volgens conclusie 1,met het kenmerk, dat men de groep of groepen R^ tot fluorescentie brengt en de fluorescentie 35 meet.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, 84 0 1 Hï . ’ - 22 - dat men, indien de organische verbinding uitsluitend met een of meer groepen gemerkt is, deze groep of groepen R^ tot fluorescentie brengt door een chemische reactie, die singlet- en/of triplet-aange-slagen toestanden genereert, te laten verlopen bij aanwezigheid van 5 de verbinding volgens conclusie 1.

12. Werkwijze volgens conclusie 11,met het kenmerk, dat de chemische reactie, die singlet- en/of triplet-aangeslagen toestanden genereert, de reactie van een geschikt oxaalzuurderivaat rnet waterstofperoxide is.

13. Werkwijze volgens conclusie 10,met het kenmerk, dat men, indien de verbinding volgens conclusie 1 zowel met een of meer groepen R^ als met een of meer groepen R2 gemerkt is, de groep R^ of groepen R^ door verwarmen tot fluorescentie brengt.

14. Verbindingen met de formule R^-Y-X, waarin R^ de in conclusie 15 1 vermelde betekenis heeft, Y een direkte binding of een tweewaardige organische rest betekent en X een reactieve groep voorstelt.

15· Verbindingen volgens conclusie 14, waarin R^ de 9,10-difenyl-antracylgroep is.

16. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin X een zuurhalogenide-20 groep is.

17. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin X een succinylimid-N-yl-oxycarbonylgroep is.

18. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin X een maleinimid-N-yl-groep is. -

19. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin Y een tweewaardige koolwaterstofrest is.

20. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin Y een via een zuurstof- of stikstofatoom aan R1 gebonden tweewaardige koolwaterstofrest is.

21. Verbindingen volgens conclusie 14, waarin Y een via een -NH-CO-groep aan R^ gebonden tweewaardigpkoolwaterstofrest is.

22. N-hydroxysuccinimide-ester van 4-(9,10-difenylantracen-2-yl)-boterzuur volgens de conclusies 14, 17 en 19.

23. Verbindingen met formule 2, waarin A en B alkyleenresten 35 voorstellen, die via een alkyleenrest C met elkaar verbonden kunnen zijn, en Y*een directe binding of een tweewaardige organische rest voorstelt.

24. Verbindingen volgens conclusie 23, waarin de tweewaardige organische rest Y#een tweewaardige koolwaterstofrest is. 1401213 - 23 -

25. Verbindingen volgens conclusie 23, waarin de tweewaardige organische rest Y' een via een zuurstof- of stikstofatoom aan de rest met formule 1 gebonden tweewaardige koolwaterstofrest is.

26. Verbindingen volgens conclusie 23, waarin Y' een via een 5 -NH-CO-groep aan de rest met de formule 1 gebonden tweewaardige koolwaterstofrest is.

27. Verbindingen volgens conclusie 23, waarin Y' de formule -NH-CO-CH2-CH2- bezit.

28. Verbindingen volgens conclusies 23-27 met formule 3, waarin

29. Verbindingen volgens conclusie 28 met de formule 4, waarin n een geheel getal van 0-10 voorstelt.

30. Verbindingen volgens conclusie 29 met formule 4, waarin n het getal 2, 3 of 4 voorstelt.

31. Verbindingen volgens conclusie 28 met formule 5, waarin m een geheel getal van 1-10 voorstelt.

32. Verbindingen met formule 6.

33. Verbindingen, verkregen door reactie van een verbinding volgens conclusies 23-32 met een verbinding, die een vrije primaire 20 aminogroep bevat.

34. Verbindingen met formule 16, waarin en R2 de in conclusie 1 vermelde betekenis hebben, X een reactieve groep, p en q elk een geheel getal met een waarde van ten minste 1 en Y" een ten minste driewaardige bruggroep voorstellen.

35. Werkwijze ter bereiding van verbindingen met formule R.J-Y-X als gedefinieerd in conclusie 14, met het kenmerk, dat men deze verbindingen op voor de synthese van analoge verbindingen bekende wijze bereidt.

36. Werkwijze volgens conclusie 35,met het kenmerk, 30 dat men de verbinding met formule 15 bereidt door verestering van de verbinding met formule 14 met N-hydroxysuccinimide.

37. Werkwijze ter bereiding van verbindingen met formule 2, als gedefinieerd in conclusie 23, met het kenmerk, dat men deze verbindingen op voor de synthese van analoge verbindingen bekende 35 wijze bereidt.

38. Werkwijze volgens conclusie 37,met het kenmerk, dat men de met de verbindingen met formule 2 overeenkomende carbon-zuren verestert met N-hydroxysuccinimide.

39· Werkwijze volgens conclusie 37,met het kenmerk, 40 dat men in de met de verbindingen met formule 2 overeenkomende poly- 8401213 - 24 - cycloalkylideen-polycycloalkylverbindingen de epidioxygroep invoert.

40. Werkwijze ter bereiding van verbindingen met formule 16 als gedefinieerd in conclusie 34,met het kenmerk, dat men deze verbindingen op voor de synthese van analoge verbindingen 5 bekende wijze bereidt. 8401213