JP2572171B2 - 有機及び生物学的分子の化学ルミネセント・ラベルとしての1,2−ジオキセタン - Google Patents
有機及び生物学的分子の化学ルミネセント・ラベルとしての1,2−ジオキセタンInfo
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-
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-
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-
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、アツセイ等に使用され
る有機及び生物学的分子に結合する能力を有するトリガ
ラブルな(triggerable)安定1,2−ジオ
キセタンに関する。特に、本発明は、生物学的物質の本
質的な機能を重大に変化させることなく、生物学的物質
と反応する能力を有する1,2−ジオキセタンに関す
る。
る有機及び生物学的分子に結合する能力を有するトリガ
ラブルな(triggerable)安定1,2−ジオ
キセタンに関する。特に、本発明は、生物学的物質の本
質的な機能を重大に変化させることなく、生物学的物質
と反応する能力を有する1,2−ジオキセタンに関す
る。
【0002】
1.安定化された1,2−ジオキセタンの化学的誘発 化学的及び酵素的方法によって誘発され化学ルミネセン
スを生じることのできる熱的安定なジオキセタンが最近
発見されている(A.P.Schaap,米国特許出願
No.887,139,出願日1986年7月17日;
A.P.Schaap,R.S.Handley,an
d B.P.Giri,Tetrahedron Le
tt.,935(1987);A.P.Schaap,
T.S.Chen,R.S.Handley,R.De
Silva,and B.P.Giri,Tetrah
edron Lett.,1155(1987);an
d A.P.Schaap,M.D.Sandiso
n,and R.S.Handley,Tetrahe
dron Lett.,1159(1987))。
スを生じることのできる熱的安定なジオキセタンが最近
発見されている(A.P.Schaap,米国特許出願
No.887,139,出願日1986年7月17日;
A.P.Schaap,R.S.Handley,an
d B.P.Giri,Tetrahedron Le
tt.,935(1987);A.P.Schaap,
T.S.Chen,R.S.Handley,R.De
Silva,and B.P.Giri,Tetrah
edron Lett.,1155(1987);an
d A.P.Schaap,M.D.Sandiso
n,and R.S.Handley,Tetrahe
dron Lett.,1159(1987))。
【0003】いくつかの重要な特徴を有する、ジオキセ
タンを製造する新規合成方法が開発されている。即ち、
(1) スピロ環融合アダマンチル基(spiro−fus
edadamantyl group)の安定力(in
fluence)を利用して、周囲温度下で何年もの貯
蔵寿命(shelf lives)を有するジオキセタ
ンを得、そして(2) この安定化されたジオキセタンの化
学ルミネセント分解を誘発する新規方法が開発されてい
る。
タンを製造する新規合成方法が開発されている。即ち、
(1) スピロ環融合アダマンチル基(spiro−fus
edadamantyl group)の安定力(in
fluence)を利用して、周囲温度下で何年もの貯
蔵寿命(shelf lives)を有するジオキセタ
ンを得、そして(2) この安定化されたジオキセタンの化
学ルミネセント分解を誘発する新規方法が開発されてい
る。
【0004】必要なアルケンは、アダマンタノンをTH
F中のチタニウムトリクロリド/LAHを用いてケトン
の芳香族エステルと反応させることによって製造される
(A.P.Schaap,米国特許No.4,857,
652)。これが、これらの反応条件を用いてケトンと
エステルの分子内縮合によりビニルエーテルを形成する
最初の報告である。McMurryは、それより前に、
ケトンとエステル官能基の分子内反応を研究したが、環
状ケトンとビニルでないエーテルがこの方法により製造
されている。(J.E.McMurry and D.
D.Miller,J.Amer.Chem.So
c.,105,1660(1983)and J.E.
McMurry,Chem.Rev.,89,1513
(1989))。
F中のチタニウムトリクロリド/LAHを用いてケトン
の芳香族エステルと反応させることによって製造される
(A.P.Schaap,米国特許No.4,857,
652)。これが、これらの反応条件を用いてケトンと
エステルの分子内縮合によりビニルエーテルを形成する
最初の報告である。McMurryは、それより前に、
ケトンとエステル官能基の分子内反応を研究したが、環
状ケトンとビニルでないエーテルがこの方法により製造
されている。(J.E.McMurry and D.
D.Miller,J.Amer.Chem.So
c.,105,1660(1983)and J.E.
McMurry,Chem.Rev.,89,1513
(1989))。
【0005】
【化42】
【0006】これらのビニルエーテルの光酸素化(ph
otooxygenation)は、望ましい熱安定性
を有し容易に取扱うことができる化合物であるジオキセ
タンを与える。例えば、以下に示すジオキセタンは活性
化エネルギー28.4kcal/mol 及び25℃で3.8年
の半減期を示す。o−キシレン中のこのジオキセタンの
サンプルを実験室ベンチ上に数ヶ月間放置しても検知し
うる分解を示さなかった。
otooxygenation)は、望ましい熱安定性
を有し容易に取扱うことができる化合物であるジオキセ
タンを与える。例えば、以下に示すジオキセタンは活性
化エネルギー28.4kcal/mol 及び25℃で3.8年
の半減期を示す。o−キシレン中のこのジオキセタンの
サンプルを実験室ベンチ上に数ヶ月間放置しても検知し
うる分解を示さなかった。
【0007】
【化43】
【0008】しかしながら、このジオキセタンの化学ル
ミネセンス分解は、室温でフッ素イオンによりシリル保
護基を除去することにより好都合に誘発することがで
き、不安定でアリールオキシド型を発生し、これは開裂
(cleave)して強い青色光をもたらす。このアリ
ールオキシド置換ジオキセタンの半減期は、25℃で5
秒である。
ミネセンス分解は、室温でフッ素イオンによりシリル保
護基を除去することにより好都合に誘発することがで
き、不安定でアリールオキシド型を発生し、これは開裂
(cleave)して強い青色光をもたらす。このアリ
ールオキシド置換ジオキセタンの半減期は、25℃で5
秒である。
【0009】DMSO中のこの化学ルミネセンスのスペ
クトルは470nmで最大を示し、これは該エステル開裂
生成物(メチル3−ヒドロキシルベンゾエート)の陰イ
オンの蛍光並びにこれらの条件下消費されたジオキセタ
ン溶液の蛍光と同一であった。アダマンタノン蛍光由来
の化学ルミネセンスは、発生しなかったようである。ル
ミノール標準に対して測定されたフッ化物で誘発された
分解の化学ルミネセンス量子収率(quantum y
ield)は0.25(又は化学ルミネセンス効率25
%)と決定された。これらの条件下、このエステルの蛍
光量子収率の補正(φF=0.44)により、シングレ
ットの励起されたエステルの形成効率57%、(これ
は、実験室で製造されたジオキセタンのかって報告され
た中で最も高いシングレットの化学励起(chemie
xcitation)効率である)が得られた。
クトルは470nmで最大を示し、これは該エステル開裂
生成物(メチル3−ヒドロキシルベンゾエート)の陰イ
オンの蛍光並びにこれらの条件下消費されたジオキセタ
ン溶液の蛍光と同一であった。アダマンタノン蛍光由来
の化学ルミネセンスは、発生しなかったようである。ル
ミノール標準に対して測定されたフッ化物で誘発された
分解の化学ルミネセンス量子収率(quantum y
ield)は0.25(又は化学ルミネセンス効率25
%)と決定された。これらの条件下、このエステルの蛍
光量子収率の補正(φF=0.44)により、シングレ
ットの励起されたエステルの形成効率57%、(これ
は、実験室で製造されたジオキセタンのかって報告され
た中で最も高いシングレットの化学励起(chemie
xcitation)効率である)が得られた。
【0010】
【化44】
【0011】
【0012】
【0013】
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】3.生物学的アッセイ用化学ルミネセント
直接ラベル (a) ルミノール及びイソルミノール アミノフタルヒドラジド、ルミノール及びイソルミノー
ルはH2 O2 及びパーオキシド酵素触媒と基礎的な条件
下、光の放出を伴って反応する。この反応は、Fe(II
I) ,Cu(II)及びCr(III) を含むいくつかの金属イ
オンの少量によっても触媒される。ラベルとしてルミノ
ールを用いる最初の化学ルミネセントイムノアッセイ
は、ビオチンのアッセイでSchroederにより報
告されている。(H.R.Schroeder,P.
O.Vogelhut,R.J.Carrico,R.
C.Boguslaski,R.T.Buckler,
Anal.Chem.48,1933(1976))。
ラベルとしてのルミノール誘導体の使用したいくつかの
適用例がその後報告されている。(H.R.Schro
eder in Luminescent Immun
oassays:Perspectives in E
ndocrinology and Clinical
Chemistry,M.Serio and M.
Pazzagli,Eds.,Raven Pres
s,New York,pp 129−146(198
2);M.Pazzagli,G.Messeri,
A.L.Caldini,G.Monetti,G.M
artinazzo and M.Serio,J.S
teroid Biochem.,19,407(19
83);Bioluminescence and C
hemiluminescenceNew Persp
ectives,J.Scholmerich,等、E
ds.,J.Wiley & Sons,Chiche
ster(1987))。
直接ラベル (a) ルミノール及びイソルミノール アミノフタルヒドラジド、ルミノール及びイソルミノー
ルはH2 O2 及びパーオキシド酵素触媒と基礎的な条件
下、光の放出を伴って反応する。この反応は、Fe(II
I) ,Cu(II)及びCr(III) を含むいくつかの金属イ
オンの少量によっても触媒される。ラベルとしてルミノ
ールを用いる最初の化学ルミネセントイムノアッセイ
は、ビオチンのアッセイでSchroederにより報
告されている。(H.R.Schroeder,P.
O.Vogelhut,R.J.Carrico,R.
C.Boguslaski,R.T.Buckler,
Anal.Chem.48,1933(1976))。
ラベルとしてのルミノール誘導体の使用したいくつかの
適用例がその後報告されている。(H.R.Schro
eder in Luminescent Immun
oassays:Perspectives in E
ndocrinology and Clinical
Chemistry,M.Serio and M.
Pazzagli,Eds.,Raven Pres
s,New York,pp 129−146(198
2);M.Pazzagli,G.Messeri,
A.L.Caldini,G.Monetti,G.M
artinazzo and M.Serio,J.S
teroid Biochem.,19,407(19
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hemiluminescenceNew Persp
ectives,J.Scholmerich,等、E
ds.,J.Wiley & Sons,Chiche
ster(1987))。
【0021】種々のエンハンサーがルミノールの使用と
一緒に採用されて放出される光の強度を増加させてい
る。これらには、D−ルシフェリン(T.P.Whit
ehead,G.H.Thorpe,T.J.Cart
er,C,Groucuttand L.J.Kric
ka,Nature,305,158(1983)),
及びp−ヨードフェノール(G.H.Thorpe,
L.J.Kricka,S.B.Mosely and
T.P.Whitehead Clin.Che
m.,31,1335(1985))を含む。
一緒に採用されて放出される光の強度を増加させてい
る。これらには、D−ルシフェリン(T.P.Whit
ehead,G.H.Thorpe,T.J.Cart
er,C,Groucuttand L.J.Kric
ka,Nature,305,158(1983)),
及びp−ヨードフェノール(G.H.Thorpe,
L.J.Kricka,S.B.Mosely and
T.P.Whitehead Clin.Che
m.,31,1335(1985))を含む。
【0022】
【化47】
【0023】(b) アクリジニウム及びフェナントリジニ
ウムエステル N−メチルアクリジニウム及びカルボン酸フェナントリ
ジニウムの芳香族エステルは、H2 O2 と塩基での処理
により化学ルミネセント反応を行なう。これらのエステ
ルの安定性は、高pHで顕著に減少する。以下に示すよう
に芳香族部分(moiety)にリンカー基Rを組み込
むと、抗原、抗体又は固体サポートに化学ルミネセント
ラベルを付着することになる。
ウムエステル N−メチルアクリジニウム及びカルボン酸フェナントリ
ジニウムの芳香族エステルは、H2 O2 と塩基での処理
により化学ルミネセント反応を行なう。これらのエステ
ルの安定性は、高pHで顕著に減少する。以下に示すよう
に芳香族部分(moiety)にリンカー基Rを組み込
むと、抗原、抗体又は固体サポートに化学ルミネセント
ラベルを付着することになる。
【0024】この研究は、特許(F.McCapra,
D.E.Tutt,R.M.Topping,英国特許
第1,461,877(1977))及び以下の文献に
報告されている(I.Weeks,I.Behesht
i,F.McCapra,A.K.Campbell,
J.S.Woodhead,Clin.Chem.,2
9,1474(1983);I.Weeks,A.K.
Campbell,J.S.Woodhead,Cli
n.Chem.,29,1480(1983))。これ
らの化合物は、TSH(LumaTag(商標);Lo
ndon Diagnostics,Inc.,;Ed
en Prairie,MN)、そして遊離チロキシン
(Magic Lite System;Ciba−C
orning Diagnostics Corp.;
メドフィールド、MA)の検出用商業用イムノアッセイ
キットでラベルとして使用されている。この技術は、ラ
ベルDNAプルーブにも使用されている(L.J.Ar
nold,Jr.,P.W.Hammond,W.A.
Wiese,N.C.Nelson,Clin.Che
m.,35,1588(1989))。
D.E.Tutt,R.M.Topping,英国特許
第1,461,877(1977))及び以下の文献に
報告されている(I.Weeks,I.Behesht
i,F.McCapra,A.K.Campbell,
J.S.Woodhead,Clin.Chem.,2
9,1474(1983);I.Weeks,A.K.
Campbell,J.S.Woodhead,Cli
n.Chem.,29,1480(1983))。これ
らの化合物は、TSH(LumaTag(商標);Lo
ndon Diagnostics,Inc.,;Ed
en Prairie,MN)、そして遊離チロキシン
(Magic Lite System;Ciba−C
orning Diagnostics Corp.;
メドフィールド、MA)の検出用商業用イムノアッセイ
キットでラベルとして使用されている。この技術は、ラ
ベルDNAプルーブにも使用されている(L.J.Ar
nold,Jr.,P.W.Hammond,W.A.
Wiese,N.C.Nelson,Clin.Che
m.,35,1588(1989))。
【0025】
【化48】
【0026】(c) 熱化学ルミネセント検出用アダマンチ
リデンアダマンタンジオキセタン アダマンチリデンアダマンタンジオキセタンの誘導体
は、抗体と蛋白質の直接ラベリング用として、Wynb
erg及び共同研究者により調製されている。(J.
C.Hummelen,T.M.Luider,H.W
ynberg,Pure Appl.Chem.,5
9,639(1987);J.C.Hummelen,
T.M.Luider,H.Wynberg.“The
rmochemiluminescent Immun
oassays”,in Complementary
Immunoassays,W.P.Collin
s,Ed.,Wiley and Sons,New
York,p.191(1988);H.Wynber
g,E.W.Meijer,J.C.Hummele
n,“1,2−Dioxetanes as Chem
iluminescentProbes and La
bels”in Bioluminescencean
d Chemiluminescence,M.A.D
eLuca,W.D.McElroy,Eds.,Ac
ademic Press,New York,p.6
87(1981))。
リデンアダマンタンジオキセタン アダマンチリデンアダマンタンジオキセタンの誘導体
は、抗体と蛋白質の直接ラベリング用として、Wynb
erg及び共同研究者により調製されている。(J.
C.Hummelen,T.M.Luider,H.W
ynberg,Pure Appl.Chem.,5
9,639(1987);J.C.Hummelen,
T.M.Luider,H.Wynberg.“The
rmochemiluminescent Immun
oassays”,in Complementary
Immunoassays,W.P.Collin
s,Ed.,Wiley and Sons,New
York,p.191(1988);H.Wynber
g,E.W.Meijer,J.C.Hummele
n,“1,2−Dioxetanes as Chem
iluminescentProbes and La
bels”in Bioluminescencean
d Chemiluminescence,M.A.D
eLuca,W.D.McElroy,Eds.,Ac
ademic Press,New York,p.6
87(1981))。
【0027】化学ルミネセンスの検出では、ラベルされ
たアナライト(analyte)がプラスチックディス
ク上に固定化され、250から300℃に加熱されるこ
とが必要である。この極端な温度は、水溶液中で実施さ
れる均一イムノアッセイ系の発展とは相容れないもので
ある。アダマンチリデンアダマンタンジオキセタンの熱
分解(thermolysis)からの化学ルミネセン
ス量子収率は非常に低い(φCL=10-4)ので、高蛍光
アクセプターへのエネルギー移動のテクニックを採用し
て、より高い検出感度を達成しなければならなかった。
このことは第2のラベル、フルオレッサー(fluor
escer)、も又化学的にアナライトか又は第1のラ
ベルかに付着することを要求している(J.C.Hum
melen,T.M.Luider,H.Wynber
g,Method in Enzymology,13
3,531(1986))。ジオキセタンを蛋白質に化
学的に結合するのに使用される反応R基は以下に示すも
のを含んでいた。
たアナライト(analyte)がプラスチックディス
ク上に固定化され、250から300℃に加熱されるこ
とが必要である。この極端な温度は、水溶液中で実施さ
れる均一イムノアッセイ系の発展とは相容れないもので
ある。アダマンチリデンアダマンタンジオキセタンの熱
分解(thermolysis)からの化学ルミネセン
ス量子収率は非常に低い(φCL=10-4)ので、高蛍光
アクセプターへのエネルギー移動のテクニックを採用し
て、より高い検出感度を達成しなければならなかった。
このことは第2のラベル、フルオレッサー(fluor
escer)、も又化学的にアナライトか又は第1のラ
ベルかに付着することを要求している(J.C.Hum
melen,T.M.Luider,H.Wynber
g,Method in Enzymology,13
3,531(1986))。ジオキセタンを蛋白質に化
学的に結合するのに使用される反応R基は以下に示すも
のを含んでいた。
【0028】
【化49】
【0029】4.ラベリング手法 有機及び生物学的分子にラベルを化学的に結合するいろ
いろな方法が文献に記述されている(例えば、L.J.
Kricka,Ligand−BinderAssay
s,Marcel Dekker,Inc.,New
York,1985,pp.15−51 and M.
Z.Atassi,“Chemical Modifi
cation and Cleavage of Pr
oteins,”Chapter 1 in Immu
nochemistry ofProteins,Vo
l.1,Plenum Press,New Yor
k,1977,pp.1−161,及び、その中のレフ
ァレンスを参照)。抗体及び蛋白質は、蛋白質中に存在
するある種の求核基(−SH,−OH,−NH2 ,−C
OOH)を以下の表1に示すような化学的に反応性の基
を有するラベルと反応させることによって好都合にラベ
ルすることができる。適当に機能化された核酸及びDN
Aプルーブも又アミン又はチオール含有核酸を合成し、
これらの分子をジオキセタン上の対応する反応基と反応
させることによってラベルすることができる。
いろな方法が文献に記述されている(例えば、L.J.
Kricka,Ligand−BinderAssay
s,Marcel Dekker,Inc.,New
York,1985,pp.15−51 and M.
Z.Atassi,“Chemical Modifi
cation and Cleavage of Pr
oteins,”Chapter 1 in Immu
nochemistry ofProteins,Vo
l.1,Plenum Press,New Yor
k,1977,pp.1−161,及び、その中のレフ
ァレンスを参照)。抗体及び蛋白質は、蛋白質中に存在
するある種の求核基(−SH,−OH,−NH2 ,−C
OOH)を以下の表1に示すような化学的に反応性の基
を有するラベルと反応させることによって好都合にラベ
ルすることができる。適当に機能化された核酸及びDN
Aプルーブも又アミン又はチオール含有核酸を合成し、
これらの分子をジオキセタン上の対応する反応基と反応
させることによってラベルすることができる。
【0030】あるいは、核酸(主にオリゴヌクレオチ
ド)は、ヒドロキシルを活性化されたホスホラミジトと
反応させることによって、ジオキセタンにリンクするこ
とができる。この場合、このホスホラミジトは核酸上に
位置することができ、そしてヒドロキシルは、ジオキセ
タン上に置かれ、この逆も同様である。ラベルされ得る
分子の他の型としては、酵素、蛋白質抗原、ハプテン、
ステロイド、炭水化物、脂肪酸、プロスタグランジン、
トロンボキサン、ロイコトリエン、ヌクレオシド及びヌ
クレオチドが含まれる。
ド)は、ヒドロキシルを活性化されたホスホラミジトと
反応させることによって、ジオキセタンにリンクするこ
とができる。この場合、このホスホラミジトは核酸上に
位置することができ、そしてヒドロキシルは、ジオキセ
タン上に置かれ、この逆も同様である。ラベルされ得る
分子の他の型としては、酵素、蛋白質抗原、ハプテン、
ステロイド、炭水化物、脂肪酸、プロスタグランジン、
トロンボキサン、ロイコトリエン、ヌクレオシド及びヌ
クレオチドが含まれる。
【0031】表1.有機および生物学的分子へのラベル
の化学結合のための反応基 1) アミン(−NH2 )に対して反応性のある基
の化学結合のための反応基 1) アミン(−NH2 )に対して反応性のある基
【0032】
【化50】
【0033】2) チオール(−SH)に対して反応性
の基
の基
【0034】
【化51】
【0035】カルボン酸(−CO2 H)に対して反応性
の基 −NH2 −OH −NHNH2
の基 −NH2 −OH −NHNH2
【0036】二官能性カップリング試薬も又おだやかな
反応基を有する有機及び生物学的分子にラベルをカップ
ルするのに使用できる(L.J.Kricka,Lig
and−Binder Assays,Marcel
Dekker,Inc.,New York,198
5,pp.18−20,Table 2.2 and
T.H.Ji,“Bifunctional Reag
ents,”Methods in Enzymolo
gy,91,580−609(1983)参照)。 二
官能性試薬には、最終の構造中に取り込まれるようなも
のと、そうではなくただ2つの試薬をカップルするのに
役立つものの2つの型がある。フルオレセインは、抗フ
ルオレセインを有するコンプレックスを形成するのに使
用される。更に、プソラレン(psoralen)はD
NAに共有結合するのに使用される。
反応基を有する有機及び生物学的分子にラベルをカップ
ルするのに使用できる(L.J.Kricka,Lig
and−Binder Assays,Marcel
Dekker,Inc.,New York,198
5,pp.18−20,Table 2.2 and
T.H.Ji,“Bifunctional Reag
ents,”Methods in Enzymolo
gy,91,580−609(1983)参照)。 二
官能性試薬には、最終の構造中に取り込まれるようなも
のと、そうではなくただ2つの試薬をカップルするのに
役立つものの2つの型がある。フルオレセインは、抗フ
ルオレセインを有するコンプレックスを形成するのに使
用される。更に、プソラレン(psoralen)はD
NAに共有結合するのに使用される。
【0037】対象の分子への化学ルミネセントジオキセ
タンの物理的結合又はコンプレックス形成は、以下に示
すようにラベルをビオチン分子(ビタミンH)に化学的
に結合させ、そして対象の有機又は生物学的分子をアビ
ジン(avidin)又はストレプトアビジン(str
eptavidin)のいずれかに化学的に結合させて
行なうことができる。後者の2つの化合物は、ビオチン
に対する4つの高親和性結合部位を有するバクテリアの
蛋白である(R.M.Buckland,Natur
e,320,557−558(1986)及びそのレフ
ァレンス)。
タンの物理的結合又はコンプレックス形成は、以下に示
すようにラベルをビオチン分子(ビタミンH)に化学的
に結合させ、そして対象の有機又は生物学的分子をアビ
ジン(avidin)又はストレプトアビジン(str
eptavidin)のいずれかに化学的に結合させて
行なうことができる。後者の2つの化合物は、ビオチン
に対する4つの高親和性結合部位を有するバクテリアの
蛋白である(R.M.Buckland,Natur
e,320,557−558(1986)及びそのレフ
ァレンス)。
【0038】ラベルされたビオチン又はラベルされたア
ビジン又はストレプトアビジンによる有機又は生物学的
分子(抗原)の検出
ビジン又はストレプトアビジンによる有機又は生物学的
分子(抗原)の検出
【0039】
【化52】
【0040】Ag、抗原;Ab、抗体;B、ビオチンS
A、ストレプトアビジン;L、ラベル
A、ストレプトアビジン;L、ラベル
【0041】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、有機及び生物学的物質及び化合物を検出するのに使
用する方法及び化学ルミネセントなトリガラブルな1,
2−ジオキセタンを提供することである。更に、イムノ
アッセイ及びDNAハイブリダイゼーションアッセイで
使用できる方法及び化学ルミネセントなトリガラブルな
1,2−ジオキセタンを提供することが本発明のもうひ
とつの課題である。
は、有機及び生物学的物質及び化合物を検出するのに使
用する方法及び化学ルミネセントなトリガラブルな1,
2−ジオキセタンを提供することである。更に、イムノ
アッセイ及びDNAハイブリダイゼーションアッセイで
使用できる方法及び化学ルミネセントなトリガラブルな
1,2−ジオキセタンを提供することが本発明のもうひ
とつの課題である。
【0042】
【課題を解決するための手段】本発明は、式:
【0043】
【化53】
【0044】(式中、Arは、フェニル及びナフチルか
ら成る群から選ばれる芳香族置換基、Aは、有機又は生
物学的分子と化学的にカップルする置換基及び有機又は
生物学的分子に物理的にカップルして分子上のラベルと
してジオキセタン化合物を与える置換基から成る群から
選ばれ、R1は任意であって、もし存在するとすれば1
から30炭素原子及び任意に、炭素原子のいくつかを置
換した酸素、窒素、イオウ、及びリンから成る群から選
ばれたヘテロ原子を含むリンキング(linking)
置換基であり、Xは、酵素以外の活性化試薬により除去
され、光をジオキセタンにより作るような化学的に不安
定な置換基であり、そして
ら成る群から選ばれる芳香族置換基、Aは、有機又は生
物学的分子と化学的にカップルする置換基及び有機又は
生物学的分子に物理的にカップルして分子上のラベルと
してジオキセタン化合物を与える置換基から成る群から
選ばれ、R1は任意であって、もし存在するとすれば1
から30炭素原子及び任意に、炭素原子のいくつかを置
換した酸素、窒素、イオウ、及びリンから成る群から選
ばれたヘテロ原子を含むリンキング(linking)
置換基であり、Xは、酵素以外の活性化試薬により除去
され、光をジオキセタンにより作るような化学的に不安
定な置換基であり、そして
【0045】
【化54】
【0046】は、6から30炭素原子を含むポリサイク
リックアルキレン置換基である)のジオキセタン化合物
に関する。
リックアルキレン置換基である)のジオキセタン化合物
に関する。
【0047】本発明は又、上記1,2−ジオキセタン化
合物の製造に使用される次の式:
合物の製造に使用される次の式:
【0048】
【化55】
【0049】(式中、Aは、有機又は生物学的分子と化
学的にカップルする置換基及び有機又は生物学的分子と
物理的にカップルして分子上のラベルとしてジオキセタ
ン化合物を与える置換基から成る群から選ばれた置換基
であり、R1は任意であり、存在するとすれば1から3
0炭素原子及び任意に、炭素原子のいくつかを置換した
酸素、窒素、イオウ、リンから成る群から選ばれるヘテ
ロ原子を含む結合置換基(linking subst
ituent)であり、Xは酵素以外の活性化された試
薬により除去され、アルケン化合物及び6から30炭素
原子を含むポリサイクリックアルケン、
学的にカップルする置換基及び有機又は生物学的分子と
物理的にカップルして分子上のラベルとしてジオキセタ
ン化合物を与える置換基から成る群から選ばれた置換基
であり、R1は任意であり、存在するとすれば1から3
0炭素原子及び任意に、炭素原子のいくつかを置換した
酸素、窒素、イオウ、リンから成る群から選ばれるヘテ
ロ原子を含む結合置換基(linking subst
ituent)であり、Xは酵素以外の活性化された試
薬により除去され、アルケン化合物及び6から30炭素
原子を含むポリサイクリックアルケン、
【0050】
【化56】
【0051】から作られた1,2−ジオキセタンによ
り、光を作る化学的に不安定な基である)のアルケン化
合物に関する。
り、光を作る化学的に不安定な基である)のアルケン化
合物に関する。
【0052】この置換基
【化57】
【0053】は、好ましくはアダマンチルである。6か
ら30炭素原子を含む他のポリサイクリックアルキレン
置換基も使用できる。R1 置換基は、好ましくは、
ら30炭素原子を含む他のポリサイクリックアルキレン
置換基も使用できる。R1 置換基は、好ましくは、
【0054】
【化58】
【0055】(式中、nは1から30の間の整数であ
る)か又は、
る)か又は、
【0056】
【化59】
【0057】(式中、nは、1から30までの整数であ
る)か又は −(CH2 )n (式中、nは、1から30までである)である。
る)か又は −(CH2 )n (式中、nは、1から30までである)である。
【0058】Arは、フェニル及びナフチルから成る群
から選ばれる。フェニルが好ましい。Aは、好ましく
は、n−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボン酸基、
ヒドロキシル基、ビオチン、抗体が分子と結合又は反応
して、抗体のラベルを与える抗体反応性分子、マレイミ
ド;アミン等である。無数のこのような化学的に反応性
のある基又はカップリング基が、前述した如くAとして
機能しうる。Aがビオチンのとき、好ましい分子として
は、
から選ばれる。フェニルが好ましい。Aは、好ましく
は、n−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボン酸基、
ヒドロキシル基、ビオチン、抗体が分子と結合又は反応
して、抗体のラベルを与える抗体反応性分子、マレイミ
ド;アミン等である。無数のこのような化学的に反応性
のある基又はカップリング基が、前述した如くAとして
機能しうる。Aがビオチンのとき、好ましい分子として
は、
【0059】
【化60】
【0060】(式中、mは2から30の間の整数であ
る)である。本発明は、化学結合により、更にいくつか
の場合、物理的相互作用を通じて有機及び生物学的分子
と結合しうる化学的にトリガラブルな、安定な1,2−
ジオキセタンを含む。活性化試薬によってX基を除去す
ると自発的に分解して光を作る不安定なアリールオキシ
ドジオキセタンを発生する。得られる化学ルミネセンス
の強度は、ラベルされた有機又は生物学的分子の量の直
接的な計測を与える。ジオキセタンラベルのいくつかの
例を特異的反応性基Aと脱離基Xと一緒に示す。種々の
基R1 は、ジオキセタンに付着した酸素原子と反応性基
Aとの間のリンカーアーム(linker arm)と
して役立っている。
る)である。本発明は、化学結合により、更にいくつか
の場合、物理的相互作用を通じて有機及び生物学的分子
と結合しうる化学的にトリガラブルな、安定な1,2−
ジオキセタンを含む。活性化試薬によってX基を除去す
ると自発的に分解して光を作る不安定なアリールオキシ
ドジオキセタンを発生する。得られる化学ルミネセンス
の強度は、ラベルされた有機又は生物学的分子の量の直
接的な計測を与える。ジオキセタンラベルのいくつかの
例を特異的反応性基Aと脱離基Xと一緒に示す。種々の
基R1 は、ジオキセタンに付着した酸素原子と反応性基
Aとの間のリンカーアーム(linker arm)と
して役立っている。
【0061】
【化61】
【0062】R1は、鎖長1から30原子の炭素及び酸
素、窒素、イオウ、リンのようなヘテロ原子からなる。
更に、炭素及びヘテロ原子を含むリングは、リンカーア
ームの部分として使用される。あるいは、Aは、リンカ
ーアームなしに酸素原子に直接付着することができる。
可能な反応性基Aには、N−ヒドロキシスクシンイミ
ド、マレイミド、ヨードアセテート、ホスホラミジト
(phoshoramidite)、イソシアネート、
イソチオシアネート、ヒドロキシル、スルフヒドリル、
アミノ、カルボキシル及び表1に示された他のものを含
む。可能なX基は、反応性基Aを有機又は生物学的分子
と結合させる過程の間安定であるどのような化学的脱離
基も含む。基Xを有するラベルされた分子を適当な酵素
以外の活性化試薬とその後処置することによって化学ル
ミネセンスを生じる。ここに示す実施例及び1986年
7月17日に出願した米国特許出願No.887,13
9は化学的に除去することのできる典型的なX基を説明
している。この対応するX−オキシ基は、ヒドロキシ
ル、アルキル又はアリールカルボキシルエステル、及び
アルキル又はアリールシリルオキシを含むがこれらに限
定されない。除去されて化学ルミネセンスを誘発しうる
X基の別の例は、保護基に関する標準的論文(T.W.
Greene,Protective Groups
in Organic Synthesis,John
Wiley,New York,198,pp10−
72(1981))に見出される。このような基は、S
i(CH3)2tBu、SiPh2tBu、CH2OC
H2CH2Si(CH3)3、CH2CH2Si(CH
3)3及びSi(CH2CH3)2i−Prである。更
に、ナフチルのような他のアリール基がメタ−フェニル
の代わりに使用しうることに留意すべきである。ナフチ
ルを有する−ArOXの例は、
素、窒素、イオウ、リンのようなヘテロ原子からなる。
更に、炭素及びヘテロ原子を含むリングは、リンカーア
ームの部分として使用される。あるいは、Aは、リンカ
ーアームなしに酸素原子に直接付着することができる。
可能な反応性基Aには、N−ヒドロキシスクシンイミ
ド、マレイミド、ヨードアセテート、ホスホラミジト
(phoshoramidite)、イソシアネート、
イソチオシアネート、ヒドロキシル、スルフヒドリル、
アミノ、カルボキシル及び表1に示された他のものを含
む。可能なX基は、反応性基Aを有機又は生物学的分子
と結合させる過程の間安定であるどのような化学的脱離
基も含む。基Xを有するラベルされた分子を適当な酵素
以外の活性化試薬とその後処置することによって化学ル
ミネセンスを生じる。ここに示す実施例及び1986年
7月17日に出願した米国特許出願No.887,13
9は化学的に除去することのできる典型的なX基を説明
している。この対応するX−オキシ基は、ヒドロキシ
ル、アルキル又はアリールカルボキシルエステル、及び
アルキル又はアリールシリルオキシを含むがこれらに限
定されない。除去されて化学ルミネセンスを誘発しうる
X基の別の例は、保護基に関する標準的論文(T.W.
Greene,Protective Groups
in Organic Synthesis,John
Wiley,New York,198,pp10−
72(1981))に見出される。このような基は、S
i(CH3)2tBu、SiPh2tBu、CH2OC
H2CH2Si(CH3)3、CH2CH2Si(CH
3)3及びSi(CH2CH3)2i−Prである。更
に、ナフチルのような他のアリール基がメタ−フェニル
の代わりに使用しうることに留意すべきである。ナフチ
ルを有する−ArOXの例は、
【0063】
【化62】
【0064】を含む。1,2−ジオキセタン化合物の合成 ジオキセタンは、ここに述べる手法を用いて、対応する
アルケンの光酸素化(photooxygenatio
n)により製造する。代わりに、ジオキセタン中のひと
つの反応性基Aをジオキセタン1を対応するジオキセタ
ン2へ変換するような化学反応によって他の基Aに交換
することができる。ジオキセタン3a−cは、アルケン
14、17及び20の光酸素化により調製する。
アルケンの光酸素化(photooxygenatio
n)により製造する。代わりに、ジオキセタン中のひと
つの反応性基Aをジオキセタン1を対応するジオキセタ
ン2へ変換するような化学反応によって他の基Aに交換
することができる。ジオキセタン3a−cは、アルケン
14、17及び20の光酸素化により調製する。
【0065】
【化63】
【0066】合成されたジオキセタン
【0067】
【化64】
【0068】
【化65】
【0069】装置 核磁気共鳴(NMR)スペクトルをGeneral E
lectric QE300(商標)スペクトロメータ
ーでCDCl3 中の溶液として、他に断わらない限り内
部標準としてテトラメチルシランを用いて得た。質量ス
ペクトルはKratos MS−80(商標)又はAE
I MS−90(商標)スペクトロメーターのどちらか
で得た。重量はMettler AE 163(商標)
分析天秤で得た。化学ルミネセンス測定はTurner
か又はApple Macintosh(商標)コンピ
ューターとインターフェースさせた本実験室製の装置を
用いて実施した。
lectric QE300(商標)スペクトロメータ
ーでCDCl3 中の溶液として、他に断わらない限り内
部標準としてテトラメチルシランを用いて得た。質量ス
ペクトルはKratos MS−80(商標)又はAE
I MS−90(商標)スペクトロメーターのどちらか
で得た。重量はMettler AE 163(商標)
分析天秤で得た。化学ルミネセンス測定はTurner
か又はApple Macintosh(商標)コンピ
ューターとインターフェースさせた本実験室製の装置を
用いて実施した。
【0070】材料 種々の商業的源から得た溶媒及び試薬は入手し得る最高
級のグレードであり、特に断わらない限り更に精製する
ことなく使用した。溶媒を水酸化ナトリウム又は水酸化
カルシウムから蒸留により乾燥した。アルケンの合成 2−クロロエチル 3−ヒドロキシベンゾエート
級のグレードであり、特に断わらない限り更に精製する
ことなく使用した。溶媒を水酸化ナトリウム又は水酸化
カルシウムから蒸留により乾燥した。アルケンの合成 2−クロロエチル 3−ヒドロキシベンゾエート
【0071】
【化66】
【0072】2−クロロエタノール(70mL、1.0
モル)中の3−ヒドロキシ安息香酸(15.0g、0.
11モル)溶液と1mLの濃硫酸を一晩還流した。TL
C分析(シリカゲル/20%エチルアセテート/ヘキサ
ン)は新しい物質への明らかな変換を示した。過剰のク
ロロエタノールを蒸発により除去して茶色の溶液を得、
これをエチルアセテートに溶解し水で洗滌した。有機層
をMgSO4 で乾燥し、濃縮して21.0gの生成物を
白色固体として得た。mp50℃; 1H NMR(CD
Cl3 )δ3.81(t,2H,J=5.9Hz)、
4.57(t,2H,J=5.9Hz)、4.77
(s,1H)、7.06−7.66(m,4H)、13C
NMR(CDCl3 )δ 41.52、64.75、
116.43、120.77、121.98、129.
80、130.71、156.04、166.57;M
S m/e(rel.intensity)200(2
6)、138(59)、121(100)、93(3
1)、65(21)、39(12);MS exact
mass;理論値200.0240、実測値200.
0242。2−クロロエチル 3−(tert−ブチルジメチルシ
リルオキシ)ベンゾエート
モル)中の3−ヒドロキシ安息香酸(15.0g、0.
11モル)溶液と1mLの濃硫酸を一晩還流した。TL
C分析(シリカゲル/20%エチルアセテート/ヘキサ
ン)は新しい物質への明らかな変換を示した。過剰のク
ロロエタノールを蒸発により除去して茶色の溶液を得、
これをエチルアセテートに溶解し水で洗滌した。有機層
をMgSO4 で乾燥し、濃縮して21.0gの生成物を
白色固体として得た。mp50℃; 1H NMR(CD
Cl3 )δ3.81(t,2H,J=5.9Hz)、
4.57(t,2H,J=5.9Hz)、4.77
(s,1H)、7.06−7.66(m,4H)、13C
NMR(CDCl3 )δ 41.52、64.75、
116.43、120.77、121.98、129.
80、130.71、156.04、166.57;M
S m/e(rel.intensity)200(2
6)、138(59)、121(100)、93(3
1)、65(21)、39(12);MS exact
mass;理論値200.0240、実測値200.
0242。2−クロロエチル 3−(tert−ブチルジメチルシ
リルオキシ)ベンゾエート
【0073】
【化67】
【0074】2−クロロエチル 3−ヒドロキシベンゾ
エート(4.0g、0.02モル)とtert−ブチル
ジメチルシリルクロリド(4.5g、0.029モル)
の5mLのドライDMF中の溶液に、イミダゾール(9
2.7g、0.04モル)を徐々に添加した。それから
溶液を一晩攪拌した。TLC分析(シリカゲル、20%
エチル アセテート/ヘキサン)は、新物質への明らか
な変換を示した。この溶液を25mLの水の中に注ぎ、
エーテルで抽出した(3×25mL)。合わせたエーテ
ル溶液を無水MgSO4 上で乾燥した。溶媒を蒸発させ
て油状物質を得、これを(エチルアセテート/ヘキサ
ン、10:90)を用いてシリカ上でクロマトグラフし
て生成物を無色液体として定量的に得た。 1H NMR
(CDCl 3 )δ0.218(s,6H)、0.994
(s,9H),3.81(t,2H,J=5.7H
z)、4.56(t,2H,J=5.7Hz)、7.0
5−7.65(m,4H);13C NMR(CDC
l3 )δ −4.97、17.66、25.12、4
1.06、63.91、120.61、122.19、
124.60、128.95、130.53、155.
31、165.35;MS m/e(rel.inte
nsity)314(14)、257(9)、235
(9)、213(100)、185(6)、149
(7);135(10)、120(6)、93(1
3)、83(6)、69(9)、55(9);MS e
xact mass;理論値314.1104、実測値
314.1110。〔(3−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニ
ル)(2−クロロエトキシ)メチレン〕アダマンタン
(7)
エート(4.0g、0.02モル)とtert−ブチル
ジメチルシリルクロリド(4.5g、0.029モル)
の5mLのドライDMF中の溶液に、イミダゾール(9
2.7g、0.04モル)を徐々に添加した。それから
溶液を一晩攪拌した。TLC分析(シリカゲル、20%
エチル アセテート/ヘキサン)は、新物質への明らか
な変換を示した。この溶液を25mLの水の中に注ぎ、
エーテルで抽出した(3×25mL)。合わせたエーテ
ル溶液を無水MgSO4 上で乾燥した。溶媒を蒸発させ
て油状物質を得、これを(エチルアセテート/ヘキサ
ン、10:90)を用いてシリカ上でクロマトグラフし
て生成物を無色液体として定量的に得た。 1H NMR
(CDCl 3 )δ0.218(s,6H)、0.994
(s,9H),3.81(t,2H,J=5.7H
z)、4.56(t,2H,J=5.7Hz)、7.0
5−7.65(m,4H);13C NMR(CDC
l3 )δ −4.97、17.66、25.12、4
1.06、63.91、120.61、122.19、
124.60、128.95、130.53、155.
31、165.35;MS m/e(rel.inte
nsity)314(14)、257(9)、235
(9)、213(100)、185(6)、149
(7);135(10)、120(6)、93(1
3)、83(6)、69(9)、55(9);MS e
xact mass;理論値314.1104、実測値
314.1110。〔(3−tert−ブチルジメチルシリルオキシフェニ
ル)(2−クロロエトキシ)メチレン〕アダマンタン
(7)
【0075】
【化68】
【0076】還流コンデンサーを備えた100mL 3
首フラスコをホットエアガン及び窒素パージングにより
乾燥した。これに乾燥THF200mlを入れ、氷浴中に
冷却した。チタニウムトリクロリド(24.5g、0.
16モル);つづいてリチウムアルミニウムハイドライ
ド(3.0g、0.08モル)をはげしく攪拌しながら
小量づつ添加した。冷却浴を除去し、この黒色混合物を
温めて室温にした。トリエチルアミン(15mL)を滴
下し、反応混合物を1時間還流した。2−クロロエチル
3−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)ベンゾ
エート(5.0g、0.015モル)及びアダマンタノ
ン(7.1g、0.05モル)の溶液を、この還流中の
混合物に1時間かけて滴下した。1時間の還流後TLC
分析(エチルアセテート/ヘキサン、10:90)は、
新しい物質への変換を示した。反応混合物を冷却し、ヘ
キサンで抽出した。溶媒の蒸発後、この粗物質を(エチ
ルアセテート/ヘキサン、3:97)を用いてクロマト
グラフして5.0g(74%)のアルケン7を白色油状
物として得た。 1H NMR(CDCl3 )δ0.19
4(s,6H)、0.982(s,9H)、1.78−
1.98(m,12H)、2.65(bs,1H)、
3.34(bs,1H)、3.55(t,2H,J=
5.7Hz)、3.66(t,2H,J=5.7H
z)、6.85−7.29(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ −4.46、18.21、25.6
6、28.28、30.20、32.39、38.9
4、39.20、42.61、68.95、119.6
2、121.04、122.50、129.09、13
2.78、136.40、141.11、155.4
9;MS m/e(rel.intensity)43
2(100)、331(22)、235(13)、19
9(10)、151(19)、105(17)、73
(44)、57(14);MS exact mas
s;理論値432.2251、実測値432.224
7。〔(2−クロロエトキシ)(3−ヒドロキシフェニル)
メチレン〕アダマンタン(8)
首フラスコをホットエアガン及び窒素パージングにより
乾燥した。これに乾燥THF200mlを入れ、氷浴中に
冷却した。チタニウムトリクロリド(24.5g、0.
16モル);つづいてリチウムアルミニウムハイドライ
ド(3.0g、0.08モル)をはげしく攪拌しながら
小量づつ添加した。冷却浴を除去し、この黒色混合物を
温めて室温にした。トリエチルアミン(15mL)を滴
下し、反応混合物を1時間還流した。2−クロロエチル
3−(tert−ブチルジメチルシリルオキシ)ベンゾ
エート(5.0g、0.015モル)及びアダマンタノ
ン(7.1g、0.05モル)の溶液を、この還流中の
混合物に1時間かけて滴下した。1時間の還流後TLC
分析(エチルアセテート/ヘキサン、10:90)は、
新しい物質への変換を示した。反応混合物を冷却し、ヘ
キサンで抽出した。溶媒の蒸発後、この粗物質を(エチ
ルアセテート/ヘキサン、3:97)を用いてクロマト
グラフして5.0g(74%)のアルケン7を白色油状
物として得た。 1H NMR(CDCl3 )δ0.19
4(s,6H)、0.982(s,9H)、1.78−
1.98(m,12H)、2.65(bs,1H)、
3.34(bs,1H)、3.55(t,2H,J=
5.7Hz)、3.66(t,2H,J=5.7H
z)、6.85−7.29(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ −4.46、18.21、25.6
6、28.28、30.20、32.39、38.9
4、39.20、42.61、68.95、119.6
2、121.04、122.50、129.09、13
2.78、136.40、141.11、155.4
9;MS m/e(rel.intensity)43
2(100)、331(22)、235(13)、19
9(10)、151(19)、105(17)、73
(44)、57(14);MS exact mas
s;理論値432.2251、実測値432.224
7。〔(2−クロロエトキシ)(3−ヒドロキシフェニル)
メチレン〕アダマンタン(8)
【0077】
【化69】
【0078】5mLのTHF中の上記に示すtert−
ブチルジメチルシリル保護−アルケン7の攪拌溶液
(2.0g、0.004モル)に、テトラブチルアンモ
ニウムフルオリドトリヒドレート(TBAF,1.4
g、0.004モル)を添加した。得られた溶液を10
分間攪拌した。TLC分析(エチルアセテート/ヘキサ
ン、20:80)は、新しい物質への転換を示した。溶
媒の蒸発後、粗生成物を水で洗滌し、エーテル中に入れ
た。有機層をMgSO4 上で乾燥し、蒸発させて乾燥し
た。油状物質を(エチルアセテート/ヘキサン、20:
80)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフして1.
3g(100%)のアルケン8を得た。1 H NMR(CDCl3 )δ1.81−1.96
(m,12H)、2.67(bs,1H)、3.34
(bs,1H)、3.55(t,2H,J=5.6H
z)、3.69(t,2H,J=5.6Hz)、6.7
7−7.19(m,4H);13C NMR(CDC
l3 )δ 28.21、30.24、32.35、3
7.08、38.92、39.19、42.55、6
9.05、114.76、116.05、121.9
2、129.31,133.41、136.62、14
0.77、155.64;MS m/e(rel.in
tensity)318(100)、227(19)、
213(24)、121(92)、107(29)、9
3(37),69(21)、55(36)、41(4
0);MS exact mass;理論値318.1
386、実測値318.1383。
ブチルジメチルシリル保護−アルケン7の攪拌溶液
(2.0g、0.004モル)に、テトラブチルアンモ
ニウムフルオリドトリヒドレート(TBAF,1.4
g、0.004モル)を添加した。得られた溶液を10
分間攪拌した。TLC分析(エチルアセテート/ヘキサ
ン、20:80)は、新しい物質への転換を示した。溶
媒の蒸発後、粗生成物を水で洗滌し、エーテル中に入れ
た。有機層をMgSO4 上で乾燥し、蒸発させて乾燥し
た。油状物質を(エチルアセテート/ヘキサン、20:
80)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフして1.
3g(100%)のアルケン8を得た。1 H NMR(CDCl3 )δ1.81−1.96
(m,12H)、2.67(bs,1H)、3.34
(bs,1H)、3.55(t,2H,J=5.6H
z)、3.69(t,2H,J=5.6Hz)、6.7
7−7.19(m,4H);13C NMR(CDC
l3 )δ 28.21、30.24、32.35、3
7.08、38.92、39.19、42.55、6
9.05、114.76、116.05、121.9
2、129.31,133.41、136.62、14
0.77、155.64;MS m/e(rel.in
tensity)318(100)、227(19)、
213(24)、121(92)、107(29)、9
3(37),69(21)、55(36)、41(4
0);MS exact mass;理論値318.1
386、実測値318.1383。
【0079】〔(3−ヒドロキシフェニル)(2−ヨー
ドエトキシ)メチレン〕アダマンタン(9)
ドエトキシ)メチレン〕アダマンタン(9)
【0080】
【化70】
【0081】ヨー化ナトリウム(14.0g、0.09
モル)及び〔(2−クロロエトキシ)(3−ヒドロキシ
フェニル)メチレン〕アダマンタン8(3.0g、0.
009モル)を乾燥アセトンに溶解し、6日間還流し
た。反応をTLC分析(エチルアセテート/ヘキサン、
10:90)で追跡し、反応の完了後、溶媒を蒸発させ
て白色固体を得た。この固体をメチレンクロリドで数回
洗滌し、この合わせた有機層を再度水で洗滌した。有機
層をMgSO4 上で乾燥して、濃縮して3.8g(10
0%)のアルケン9を油状物質として得た。 1H NM
R(CDCl3 )δ1.78−1.97(m,12
H)、2.64(bs,1H)、3.19(t,2H,
J=7.1Hz)、3.35(bs,1H)、3.69
(t,2H,J=7.1Hz)、6.75−7.21
(m,4H);13C NMR(CDCl3)δ 2.4
0、28.13、30.41、32.33、36.9
9、38.86、39.09、69.74、114.8
6、116.00、121.79、129.28,13
3.37、136.42、140.51、155.6
6;MSm/e(rel intensity)410
(42)、256(19)、227(75)、155
(18)、121(100)、107(32)、93
(28)、79(14)、65(16);MS exa
ct mass:理論値410.0744、実測値41
0.0744。
モル)及び〔(2−クロロエトキシ)(3−ヒドロキシ
フェニル)メチレン〕アダマンタン8(3.0g、0.
009モル)を乾燥アセトンに溶解し、6日間還流し
た。反応をTLC分析(エチルアセテート/ヘキサン、
10:90)で追跡し、反応の完了後、溶媒を蒸発させ
て白色固体を得た。この固体をメチレンクロリドで数回
洗滌し、この合わせた有機層を再度水で洗滌した。有機
層をMgSO4 上で乾燥して、濃縮して3.8g(10
0%)のアルケン9を油状物質として得た。 1H NM
R(CDCl3 )δ1.78−1.97(m,12
H)、2.64(bs,1H)、3.19(t,2H,
J=7.1Hz)、3.35(bs,1H)、3.69
(t,2H,J=7.1Hz)、6.75−7.21
(m,4H);13C NMR(CDCl3)δ 2.4
0、28.13、30.41、32.33、36.9
9、38.86、39.09、69.74、114.8
6、116.00、121.79、129.28,13
3.37、136.42、140.51、155.6
6;MSm/e(rel intensity)410
(42)、256(19)、227(75)、155
(18)、121(100)、107(32)、93
(28)、79(14)、65(16);MS exa
ct mass:理論値410.0744、実測値41
0.0744。
【0082】〔(2−アミノエトキシ)(3−ヒドロキ
シフェニル)メチレン〕アダマンタン(10)
シフェニル)メチレン〕アダマンタン(10)
【0083】
【化71】
【0084】最小量のTHF中のアルケン9(3.0
g、0.01モル)の溶液をドライアイス中に設置した
シールされたチューブ中の10mLの液体アンモニアに
添加した。チューブを封印後、油浴中で40℃で17時
間加熱した。反応混合物を冷却し、溶媒を蒸発させて白
色固体を得た。この物質をメチレンクロリドで抽出し
た。合わせたこの有機層を水で洗滌し、MgSO4 上で
乾燥し、そして濃縮して、2.0g(90%)のアルケ
ン10を白色固体として得た。mp55℃、 1HNMR
(CDCl3 )δ1.77−1.96(m,12H)、
2.68(bs,1H)、2.85(t,2H,J=
4.8Hz)、3.23(bs,1H)、3.48
(t,2H,J=4.8Hz)、4.46(bs,2
H)、6.70−7.17(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ28.16、30.28、32.1
9、36.99、38.88、39.04、41.3
3、70.45、114.97、116.17、12
0.63、129.02、131.89、136.6
9、141.79、156.86;MS m/e(re
l intensity)299(10)、256(1
00)、239(5)、199(6)、135(1
2)、121(27)、93(12)、77(5);M
S exact mass:理論値299.1885、
実測値299.1891。
g、0.01モル)の溶液をドライアイス中に設置した
シールされたチューブ中の10mLの液体アンモニアに
添加した。チューブを封印後、油浴中で40℃で17時
間加熱した。反応混合物を冷却し、溶媒を蒸発させて白
色固体を得た。この物質をメチレンクロリドで抽出し
た。合わせたこの有機層を水で洗滌し、MgSO4 上で
乾燥し、そして濃縮して、2.0g(90%)のアルケ
ン10を白色固体として得た。mp55℃、 1HNMR
(CDCl3 )δ1.77−1.96(m,12H)、
2.68(bs,1H)、2.85(t,2H,J=
4.8Hz)、3.23(bs,1H)、3.48
(t,2H,J=4.8Hz)、4.46(bs,2
H)、6.70−7.17(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ28.16、30.28、32.1
9、36.99、38.88、39.04、41.3
3、70.45、114.97、116.17、12
0.63、129.02、131.89、136.6
9、141.79、156.86;MS m/e(re
l intensity)299(10)、256(1
00)、239(5)、199(6)、135(1
2)、121(27)、93(12)、77(5);M
S exact mass:理論値299.1885、
実測値299.1891。
【0085】3−クロロプロピル 3−ヒドロキシベン
ゾエート
ゾエート
【0086】
【化72】
【0087】3−クロロプロパノール(76g、0.8
1モル)中の3−ヒドロキシ安息香酸(16.0g、
0.115モル)溶液及び0.5mLの濃硫酸を一晩還
流した。過剰のアルコールを真空蒸留により除去した。
褐色の粘性のある残渣をエチルアセテート(60mL)
中に溶解し、水で洗滌した(2×15mL)。有機層を
無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し
た。この褐色で粘性のある残渣をカラムクロマトグラフ
ィー(エチルアセテート/ヘキサン、30:70)によ
り精製して、生成物を白色固体として得た。(23.3
g、0.108mol、93.7%): 1H NMR
(CDCl3 )δ2.19−2.28(m,2H)、
3.69(t,2H,J=6.3Hz)、4.48
(t,2H,J=6Hz)、5.92(s,1H)、
7.05−7.64(m,4H);MS exact
mass:理論値214.0396、実測値214.0
400。
1モル)中の3−ヒドロキシ安息香酸(16.0g、
0.115モル)溶液及び0.5mLの濃硫酸を一晩還
流した。過剰のアルコールを真空蒸留により除去した。
褐色の粘性のある残渣をエチルアセテート(60mL)
中に溶解し、水で洗滌した(2×15mL)。有機層を
無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し
た。この褐色で粘性のある残渣をカラムクロマトグラフ
ィー(エチルアセテート/ヘキサン、30:70)によ
り精製して、生成物を白色固体として得た。(23.3
g、0.108mol、93.7%): 1H NMR
(CDCl3 )δ2.19−2.28(m,2H)、
3.69(t,2H,J=6.3Hz)、4.48
(t,2H,J=6Hz)、5.92(s,1H)、
7.05−7.64(m,4H);MS exact
mass:理論値214.0396、実測値214.0
400。
【0088】3−クロロプロピル 3−(tert−ブ
チルジメチルシリルオキシ)ベンゾエート
チルジメチルシリルオキシ)ベンゾエート
【0089】
【化73】
【0090】無水DMF(10mL)中の3−クロロプ
ロピル 3−ヒドロキシベンゾエート(12.0g、
0.055モル)及びtert−ブチルジメチルシリル
クロリド(TBDMS−Cl、10.00g、0.06
7モル)に、イミダゾール(7.61g、0.11モ
ル)を添加した。反応混合物を1時間攪拌し、その後、
水(50mL)で稀釈し、ヘキサンで抽出した(4×2
0mL)。ヘキサン層を水で洗滌し(2×10mL)、
無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し
て所望の化合物を得た。(16.64g、0.0506
mol、90%): 1H NMR(CDCl3 )δ0.
216(s,6H)、0.994(s,9H、2.19
−2.27(m,2H)、3.69(t,2H,J=
6.3Hz)、4.46(t,2H,J=6.3H
z)、7.01−7.64(m,4H);MS exa
ct mass:理論値328.1264、実測値32
8.1257。
ロピル 3−ヒドロキシベンゾエート(12.0g、
0.055モル)及びtert−ブチルジメチルシリル
クロリド(TBDMS−Cl、10.00g、0.06
7モル)に、イミダゾール(7.61g、0.11モ
ル)を添加した。反応混合物を1時間攪拌し、その後、
水(50mL)で稀釈し、ヘキサンで抽出した(4×2
0mL)。ヘキサン層を水で洗滌し(2×10mL)、
無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮し
て所望の化合物を得た。(16.64g、0.0506
mol、90%): 1H NMR(CDCl3 )δ0.
216(s,6H)、0.994(s,9H、2.19
−2.27(m,2H)、3.69(t,2H,J=
6.3Hz)、4.46(t,2H,J=6.3H
z)、7.01−7.64(m,4H);MS exa
ct mass:理論値328.1264、実測値32
8.1257。
【0091】〔3−tert−ブチルジメチルシリルオ
キシフェニル)(3−クロロプロポキシ)メチレン〕ア
ダマンタン(11)
キシフェニル)(3−クロロプロポキシ)メチレン〕ア
ダマンタン(11)
【0092】
【化74】
【0093】還流コンデンサーを備えた1リットルの3
首フラスコをホットエアガンで乾燥し、アルゴンでパー
ジした。無水THF(200mL)を添加し氷浴中で冷
却した。チタニウムトリクロリド(33.32g、0.
216モル)を攪拌しながら添加した。水素化リチウム
アルミニウム(4.1g、0.108モル)をはげしく
攪拌しながら少量づつ添加した。冷却浴をとり除き、反
応混合物を温めて室温にした。トリエチルアミン(20
mL)を滴下し、反応混合物を1時間還流した。無水T
HF中の3−クロロプロピル 3−tert−ブチルジ
メチルシリルオキシベンゾエート(6.0g、0.01
8モル)及びアダマンタノン(8.22g、0.054
モル)の溶液をこの還流混合物に1時間かけて滴下し
た。反応混合物を1時間還流して室温まで冷却した。ヘ
キサン(500mL)を添加し、0.5時間攪拌後、溶
液を濾過し、減圧下濃縮した。淡黄色残渣をクロマトグ
ラフして(エチルアセテート/ヘキサン、3:97)ア
ルケン11を粘性油状物として得た。(4.7g、0.
010mol、58.45%): 1H NMR(CDC
l3 )δ0.19(s,6H)、0.98(s,9
H)、1.76−2.01(m,14H)、2.62
(bs,1H)、3.22(bs,1H)、3.52
(t,2H,J=5.7Hz)、3.63(t,2H,
J=6.6Hz)、6.74−7.20(m,4H);
MS exact mass:理論値446.240
7、実測値446.2414。
首フラスコをホットエアガンで乾燥し、アルゴンでパー
ジした。無水THF(200mL)を添加し氷浴中で冷
却した。チタニウムトリクロリド(33.32g、0.
216モル)を攪拌しながら添加した。水素化リチウム
アルミニウム(4.1g、0.108モル)をはげしく
攪拌しながら少量づつ添加した。冷却浴をとり除き、反
応混合物を温めて室温にした。トリエチルアミン(20
mL)を滴下し、反応混合物を1時間還流した。無水T
HF中の3−クロロプロピル 3−tert−ブチルジ
メチルシリルオキシベンゾエート(6.0g、0.01
8モル)及びアダマンタノン(8.22g、0.054
モル)の溶液をこの還流混合物に1時間かけて滴下し
た。反応混合物を1時間還流して室温まで冷却した。ヘ
キサン(500mL)を添加し、0.5時間攪拌後、溶
液を濾過し、減圧下濃縮した。淡黄色残渣をクロマトグ
ラフして(エチルアセテート/ヘキサン、3:97)ア
ルケン11を粘性油状物として得た。(4.7g、0.
010mol、58.45%): 1H NMR(CDC
l3 )δ0.19(s,6H)、0.98(s,9
H)、1.76−2.01(m,14H)、2.62
(bs,1H)、3.22(bs,1H)、3.52
(t,2H,J=5.7Hz)、3.63(t,2H,
J=6.6Hz)、6.74−7.20(m,4H);
MS exact mass:理論値446.240
7、実測値446.2414。
【0094】〔(3−クロロプロポキシ)(3−ヒドロ
キシフェニル)メチレン〕アダマンタン(12)
キシフェニル)メチレン〕アダマンタン(12)
【0095】
【化75】
【0096】無水THF(15mL)中のアルケン11
(0.5g、1ミリモル)の攪拌溶液に、TBAF
(0.32g、1.2ミリモル、1.22mLの1M溶
液)を添加し、反応混合物室温で0.5時間攪拌した。
溶媒を減圧下除去し、残渣をヘキサン(20mL)中に
溶解した。この溶液を水(10mL)で洗滌し、有機層
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮
した。淡黄色油状物質をプレパラティブTLC(エチル
アセテート/ヘキサン、20:80)により精製して純
粋な化合物12を得た(0.34g、1 mmol 、92
%): 1H NMR(CDCl3 )δ1.5−2.03
(m,14H)、2.65(bs,1H)、3.22
(bs,1H)、3.54(t,2H,J=6Hz)、
3.63(t,2H,J=6.6Hz)、5.45
(s,1H)、6.78−7.26(m,4H);MS
exact mass:理論値332.1542、実
測値332.1540。
(0.5g、1ミリモル)の攪拌溶液に、TBAF
(0.32g、1.2ミリモル、1.22mLの1M溶
液)を添加し、反応混合物室温で0.5時間攪拌した。
溶媒を減圧下除去し、残渣をヘキサン(20mL)中に
溶解した。この溶液を水(10mL)で洗滌し、有機層
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮
した。淡黄色油状物質をプレパラティブTLC(エチル
アセテート/ヘキサン、20:80)により精製して純
粋な化合物12を得た(0.34g、1 mmol 、92
%): 1H NMR(CDCl3 )δ1.5−2.03
(m,14H)、2.65(bs,1H)、3.22
(bs,1H)、3.54(t,2H,J=6Hz)、
3.63(t,2H,J=6.6Hz)、5.45
(s,1H)、6.78−7.26(m,4H);MS
exact mass:理論値332.1542、実
測値332.1540。
【0097】〔(3−シアノプロポキシ)(ヒドロキシ
フェニル)メチレン〕アダマンタン(13)
フェニル)メチレン〕アダマンタン(13)
【0098】
【化76】
【0099】シアン化ナトリウム(9mg、0.19ミリ
モル)を無水DMSO(2mL)中に溶解し、この溶液
を90℃に加熱した。アルケン12(0.026g、
0.078ミリモル)を上記溶液に添加し、反応混合物
を90℃、0.75時間攪拌した。水(15mL)を添
加し、エーテルで抽出した(3×10mL)。エーテル
層を水(10mL)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で
乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。プレパラティブTL
C(エチルアセテート/ヘキサン、20:80)によっ
て精製して純粋なニトリル13を得た。(0.021
g、0.065 mmol 、84%): 1H NMR(CD
Cl3 )δ1.6−2.03(m,14H)、2.48
(t,2H,J=7.2Hz)、2.64(bs,1
H)、3.18(bs,1H)、3.49(t,2H,
J=6Hz)、4.99(s,1H)、6.78−7.
26(m,4H);IR(CHCl3 )cm-13660−
3600、3000、2910、2840、2290、
1420、1200、1100;MS exact m
ass:理論値323.18852、実測値323.1
882。
モル)を無水DMSO(2mL)中に溶解し、この溶液
を90℃に加熱した。アルケン12(0.026g、
0.078ミリモル)を上記溶液に添加し、反応混合物
を90℃、0.75時間攪拌した。水(15mL)を添
加し、エーテルで抽出した(3×10mL)。エーテル
層を水(10mL)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で
乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。プレパラティブTL
C(エチルアセテート/ヘキサン、20:80)によっ
て精製して純粋なニトリル13を得た。(0.021
g、0.065 mmol 、84%): 1H NMR(CD
Cl3 )δ1.6−2.03(m,14H)、2.48
(t,2H,J=7.2Hz)、2.64(bs,1
H)、3.18(bs,1H)、3.49(t,2H,
J=6Hz)、4.99(s,1H)、6.78−7.
26(m,4H);IR(CHCl3 )cm-13660−
3600、3000、2910、2840、2290、
1420、1200、1100;MS exact m
ass:理論値323.18852、実測値323.1
882。
【0100】〔(3−カルボキシプロポキシ)(3−ヒ
ドロキシフェニル)メチレン〕アダマンタン(14)
ドロキシフェニル)メチレン〕アダマンタン(14)
【0101】
【化77】
【0102】水酸化ナトリウム(2mlの2N溶液)をニ
トリル13(0.018g、0.055ミリモル)に添
加し、反応混合物を1時間還流した。溶液を冷却して室
温にし、水(5mL)で稀釈した。この水溶液を稀酸
(10mL)で洗滌し、この白色で濁った溶液を直ちに
エチルアセテート(2×15mL)で抽出した。有機層
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮
した。この粗残渣をプレパラティブTLC(エチルアセ
テート/ヘキサン、30:70)によって精製して純粋
な酸14を得た。(0.012g、0.035 mmol 、
63%): 1HNMR(CDCl3 )δ1.6−2.0
3(m,16H)、2.44(t,2H,J=7.2H
z)、2.65(bs,1H)、3.21(bs,1
H)、3.45(t,2H,J=6Hz)、6.1−
7.41(m,5H);MS exact mass:
理論値342.1831、実測値342.1836。
トリル13(0.018g、0.055ミリモル)に添
加し、反応混合物を1時間還流した。溶液を冷却して室
温にし、水(5mL)で稀釈した。この水溶液を稀酸
(10mL)で洗滌し、この白色で濁った溶液を直ちに
エチルアセテート(2×15mL)で抽出した。有機層
を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮
した。この粗残渣をプレパラティブTLC(エチルアセ
テート/ヘキサン、30:70)によって精製して純粋
な酸14を得た。(0.012g、0.035 mmol 、
63%): 1HNMR(CDCl3 )δ1.6−2.0
3(m,16H)、2.44(t,2H,J=7.2H
z)、2.65(bs,1H)、3.21(bs,1
H)、3.45(t,2H,J=6Hz)、6.1−
7.41(m,5H);MS exact mass:
理論値342.1831、実測値342.1836。
【0103】〔(3−カルボキシプロピル)(3−ヒド
ロキシフェニル)メチレン〕アダマンタン N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル15
ロキシフェニル)メチレン〕アダマンタン N−ヒドロ
キシスクシンイミドエステル15
【0104】
【化78】
【0105】カルボン酸14(0.008g、0.02
ミリモル)を無水ジオキサン(1mL)中に溶解した。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、0.007
2g、0.035ミリモル)及びN−ヒドロキシスクシ
ンイミド(0.004g、0.035ミリモル)を上記
溶液に添加し、室温でアルゴン下12時間攪拌した。白
色沈殿物を濾過し、この溶液を減圧下濃縮した。残渣を
プレパラティブTLC(メタノール/ジクロロメタン、
2:98)により精製して純粋な生成物15を得た。
(0.009g、0.02 mmol 、88%): 1H N
MR(CDCl3)δ1.71−2.05(m,14
H)、2.68(bs,1H)、2.78(t,2H,
J=7.2Hz)、2.86(bs,4H)、3.21
(bs,1H)、3.47(t,2H,J=6Hz)、
5.90(bs,1H)、6.78−7.26(m,4
H);13C NMR(CDCl3 )δ24.56、2
5.47,27.44、28.14、30.23、3
2.15、37.00、38.83、39.04、6
6.90、67.23、90.64、114.52、1
15.72、121.34、128.97、132.0
7、136.75、141.54、155.98、16
8.41、169.54;MS exact mas
s:理論値439.1994、実測値439.198
8。
ミリモル)を無水ジオキサン(1mL)中に溶解した。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC、0.007
2g、0.035ミリモル)及びN−ヒドロキシスクシ
ンイミド(0.004g、0.035ミリモル)を上記
溶液に添加し、室温でアルゴン下12時間攪拌した。白
色沈殿物を濾過し、この溶液を減圧下濃縮した。残渣を
プレパラティブTLC(メタノール/ジクロロメタン、
2:98)により精製して純粋な生成物15を得た。
(0.009g、0.02 mmol 、88%): 1H N
MR(CDCl3)δ1.71−2.05(m,14
H)、2.68(bs,1H)、2.78(t,2H,
J=7.2Hz)、2.86(bs,4H)、3.21
(bs,1H)、3.47(t,2H,J=6Hz)、
5.90(bs,1H)、6.78−7.26(m,4
H);13C NMR(CDCl3 )δ24.56、2
5.47,27.44、28.14、30.23、3
2.15、37.00、38.83、39.04、6
6.90、67.23、90.64、114.52、1
15.72、121.34、128.97、132.0
7、136.75、141.54、155.98、16
8.41、169.54;MS exact mas
s:理論値439.1994、実測値439.198
8。
【0106】アルケン16
【0107】
【化79】
【0108】イミダゾール(0.015g、0.22ミ
リモル)及びTBDMSクロリド(0.033g、0.
22ミリモル)を無水DMF(2mL)中に溶解したア
ルケン14(0.025g、0.07ミリモル)の溶液
に添加し室温で2時間攪拌した。反応混合物を水(10
mL)で希釈し、エチルアセテートで抽出した(2×1
2mL)。有機層を水(7mL)で洗滌し、無水硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。プレパ
ラティブTLCによるこの残渣を精製しようとしたが、
分解してしまった。従って、粗生成物16を直接次の工
程に使用した。
リモル)及びTBDMSクロリド(0.033g、0.
22ミリモル)を無水DMF(2mL)中に溶解したア
ルケン14(0.025g、0.07ミリモル)の溶液
に添加し室温で2時間攪拌した。反応混合物を水(10
mL)で希釈し、エチルアセテートで抽出した(2×1
2mL)。有機層を水(7mL)で洗滌し、無水硫酸ナ
トリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。プレパ
ラティブTLCによるこの残渣を精製しようとしたが、
分解してしまった。従って、粗生成物16を直接次の工
程に使用した。
【0109】〔(3−tert−ブチルジメチルシリル
オキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチレ
ン〕アダマンタン(17)
オキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチレ
ン〕アダマンタン(17)
【0110】
【化80】
【0111】ビス−シリルオキシアルケン16(0.0
39g、0.068ミリモル)をメタノール(5mL)
に溶解し、そしてH2 O(2mL)中に溶解したK2 C
O3(2当量)を添加した。反応混合物を室温で10分
間攪拌した。TLCは出発物質の痕跡を示さなかった。
溶液を稀酸(7mL)で冷却(quench)し、エチ
ルアセテート(2×10mL)で抽出した。有機層をH
2 O(5mL)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥
し、濾過し、減圧下濃縮して17を得た。(0.025
g、0.043mmol、83%): 1H NMR(CDC
l3 )δ0.19(s,6H)、0.98(s,9
H)、1.77−1.97(m,14H)、2.45
(t,2H,J=7.5Hz)、2.62(bs,1
H)、3.22(bs,1H)、3.42(t,2H,
J=6.0Hz)、6.74−7.21(m,4H);
MS exact mass:理論値456.269
5、実測値456.2692。
39g、0.068ミリモル)をメタノール(5mL)
に溶解し、そしてH2 O(2mL)中に溶解したK2 C
O3(2当量)を添加した。反応混合物を室温で10分
間攪拌した。TLCは出発物質の痕跡を示さなかった。
溶液を稀酸(7mL)で冷却(quench)し、エチ
ルアセテート(2×10mL)で抽出した。有機層をH
2 O(5mL)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥
し、濾過し、減圧下濃縮して17を得た。(0.025
g、0.043mmol、83%): 1H NMR(CDC
l3 )δ0.19(s,6H)、0.98(s,9
H)、1.77−1.97(m,14H)、2.45
(t,2H,J=7.5Hz)、2.62(bs,1
H)、3.22(bs,1H)、3.42(t,2H,
J=6.0Hz)、6.74−7.21(m,4H);
MS exact mass:理論値456.269
5、実測値456.2692。
【0112】〔(3−t−ブチルジメチルシリルオキシ
フェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチレンアダ
マンタン N−ヒドロキシスクシンイミドエステル18
フェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチレンアダ
マンタン N−ヒドロキシスクシンイミドエステル18
【0113】
【化81】
【0114】カルボン酸17(0.025g、0.05
6ミリモル)を無水ジオキサン(1mL)中に溶解し
た。DCC(0.023g、0.11ミリモル)及びN
−ヒドロキシスクシンイミド(0.013g、0.11
ミリモル)を上記溶液に添加し、室温でアルゴン下8時
間攪拌した。白色沈殿物を濾過し、溶液を減圧下濃縮し
た。残渣をプレパラティブTLC(エチルアセテート/
ヘキサン、40:60)により精製してアルケン18を
得た。(0.028g、0.050mmol、90%): 1
H NMR(CDCl3 )δ0.18(s,6H)、
0.97(s,9H)、1.76−1.95(m,14
H)、2.61(bs,1H)、2.72(t,2H,
J=7.8Hz)、2.82(bs,4H)、3.21
(bs,1H)、3.45(t,2H,J=5.7H
z)、6.74−7.26(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ24.89、25.55、25.6
5、27.94、28.28、30.27、32.3
0、33.90、37.14、38.92、39.1
6、49.17、67.42、104.93、119.
41、121.02、122.43、123.84、1
29.03、131.91、136.83、141.6
6、155.35、168.47、169.04。
6ミリモル)を無水ジオキサン(1mL)中に溶解し
た。DCC(0.023g、0.11ミリモル)及びN
−ヒドロキシスクシンイミド(0.013g、0.11
ミリモル)を上記溶液に添加し、室温でアルゴン下8時
間攪拌した。白色沈殿物を濾過し、溶液を減圧下濃縮し
た。残渣をプレパラティブTLC(エチルアセテート/
ヘキサン、40:60)により精製してアルケン18を
得た。(0.028g、0.050mmol、90%): 1
H NMR(CDCl3 )δ0.18(s,6H)、
0.97(s,9H)、1.76−1.95(m,14
H)、2.61(bs,1H)、2.72(t,2H,
J=7.8Hz)、2.82(bs,4H)、3.21
(bs,1H)、3.45(t,2H,J=5.7H
z)、6.74−7.26(m,4H);13C NMR
(CDCl3 )δ24.89、25.55、25.6
5、27.94、28.28、30.27、32.3
0、33.90、37.14、38.92、39.1
6、49.17、67.42、104.93、119.
41、121.02、122.43、123.84、1
29.03、131.91、136.83、141.6
6、155.35、168.47、169.04。
【0115】アルケン19
【0116】
【化82】
【0117】イミダゾール(0.053g、0.000
78モル)及びt−ブチルジフェニルシリルクロリド
(0.216g、0.00078モル)を無水DMF
(2mL)に溶解した酸14(0.090g、0.00
026モル)の溶液に添加し、室温で2時間攪拌した。
反応混合物を水(6mL)で稀釈し、エチルアセテート
(3×10mL)で抽出した。有機層を水(7mL)で
洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮した。残渣をプレパラティブTLCにより精製し
ようとしたが、分解してしまった。従って、粗生成物1
9を次の工程に直接使用した。
78モル)及びt−ブチルジフェニルシリルクロリド
(0.216g、0.00078モル)を無水DMF
(2mL)に溶解した酸14(0.090g、0.00
026モル)の溶液に添加し、室温で2時間攪拌した。
反応混合物を水(6mL)で稀釈し、エチルアセテート
(3×10mL)で抽出した。有機層を水(7mL)で
洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮した。残渣をプレパラティブTLCにより精製し
ようとしたが、分解してしまった。従って、粗生成物1
9を次の工程に直接使用した。
【0118】〔(3−tert−ブチルジフェニルシリ
ルオキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチ
レン〕アダマンタン(20)
ルオキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチ
レン〕アダマンタン(20)
【0119】
【化83】
【0120】ビス−シリルオキシアルカン19(0.2
15g、0.00026モル)をメタノール(5mL)
中に溶解し、H2 O(2mL)中に溶解したK2 CO3
(2当量)を添加した。反応混合物を室温で20分間攪
拌した。TLCは出発物質の痕跡を示さなかった。この
溶液を稀酸(7mL)でクエンチし、エチルアセテート
で抽出した(2×20mL)。有機層をH2 O(7m
L)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過
し、減圧下濃縮して20を得た。(0.12g、0.0
002 mol、80%): 1H NMR(CDCl3 )δ
1.10(s,9H)、1.49−1.88(m,14
H)、2.31(bs,1H)、2.34(d,2
H)、3.10(bs,1H)、3.18(t,2H,
J=6Hz)、6.60−7.71(m,14H)、1
0.5(bs,1H);MS exactmass:理
論値580.3008、実測値580.3012。
15g、0.00026モル)をメタノール(5mL)
中に溶解し、H2 O(2mL)中に溶解したK2 CO3
(2当量)を添加した。反応混合物を室温で20分間攪
拌した。TLCは出発物質の痕跡を示さなかった。この
溶液を稀酸(7mL)でクエンチし、エチルアセテート
で抽出した(2×20mL)。有機層をH2 O(7m
L)で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過
し、減圧下濃縮して20を得た。(0.12g、0.0
002 mol、80%): 1H NMR(CDCl3 )δ
1.10(s,9H)、1.49−1.88(m,14
H)、2.31(bs,1H)、2.34(d,2
H)、3.10(bs,1H)、3.18(t,2H,
J=6Hz)、6.60−7.71(m,14H)、1
0.5(bs,1H);MS exactmass:理
論値580.3008、実測値580.3012。
【0121】〔(3−tert−ブチルジフェニルシリ
ルオキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチ
レン〕アダマンタン N−ヒドロキシスクシンイミド
エステル(21)
ルオキシフェニル)(3−カルボキシプロポキシ)メチ
レン〕アダマンタン N−ヒドロキシスクシンイミド
エステル(21)
【0122】
【化84】
【0123】カルボン酸20(0.070g、0.00
012モル)を無水ジオキサン(4mL)中に溶解し
た。DCC(0.075g、0.00036モル)及び
N−ヒドロキシスクシンイミド(0.041g、0.0
0036モル)を上記溶液に添加し、室温でアルゴン下
12時間攪拌した。白色沈殿物を濾過し、溶液を減圧下
濃縮した。残渣をプレパラティブTLC(メタノール/
ジクロロメタン;3:97)により精製して21(0.
071g、0.00010モル、88%)を得た。
(0.071g、 1H NMR(CDCl3 )δ1.1
0(s,9H)、1.50−1.95(m,14H)、
2.36(bs,1H)、2.58(t,2H,J=
7.2Hz)、2.82(bs,4H)3.09(b
s,1H)、3.19(t,2H,J=6Hz)、6.
58−7.71(m,14H);13C NMR(CDC
l3 )δ19.36、24.69、24.90、25.
53、26.43、27.83、28.16、30.1
0、32.07、33.91、37.07、38.7
9、38.93、67.15、119.02、120.
85、122.13、127.69、128.90、1
29.84、131.63、132.77、135.5
2、136.39、141.37、155.24、16
8.45、169.03;MS exact mas
s:理論値677.8339、実測値 M−239。
012モル)を無水ジオキサン(4mL)中に溶解し
た。DCC(0.075g、0.00036モル)及び
N−ヒドロキシスクシンイミド(0.041g、0.0
0036モル)を上記溶液に添加し、室温でアルゴン下
12時間攪拌した。白色沈殿物を濾過し、溶液を減圧下
濃縮した。残渣をプレパラティブTLC(メタノール/
ジクロロメタン;3:97)により精製して21(0.
071g、0.00010モル、88%)を得た。
(0.071g、 1H NMR(CDCl3 )δ1.1
0(s,9H)、1.50−1.95(m,14H)、
2.36(bs,1H)、2.58(t,2H,J=
7.2Hz)、2.82(bs,4H)3.09(b
s,1H)、3.19(t,2H,J=6Hz)、6.
58−7.71(m,14H);13C NMR(CDC
l3 )δ19.36、24.69、24.90、25.
53、26.43、27.83、28.16、30.1
0、32.07、33.91、37.07、38.7
9、38.93、67.15、119.02、120.
85、122.13、127.69、128.90、1
29.84、131.63、132.77、135.5
2、136.39、141.37、155.24、16
8.45、169.03;MS exact mas
s:理論値677.8339、実測値 M−239。
【0124】tert−ブチルジフェニルシロキシ 3
−(tert−ブチルジフェニルシロキシ)ベンゾエー
ト(22)
−(tert−ブチルジフェニルシロキシ)ベンゾエー
ト(22)
【0125】
【化85】
【0126】イミダゾール(1.23g、0.018モ
ル)及びDPTBSクロリド(4.97g、0.018
モル)を無水DMF(10mL)中に溶解したm−ヒド
ロキシ安息香酸(1.0g、0.0072モル)の溶液
に添加し、室温で4時間攪拌した。反応混合物を水(1
0mL)で稀釈し、エチルアセテート(2×15mL)
で抽出した。有機層を水(10mL)で洗滌し、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。ク
ロマトグラフィー(エチルアセテート/ヘキサン、1
0:90)による精製によって22を得た。(4.38
g、0.0071mol 、98%)。 1H NMR(CD
Cl3 )δ1.10(s,9H)、1.18(s,9
H)、7.01−7.79(m,24H)。MS ex
act mass:理論値614.、実測値 M−5
7,557。
ル)及びDPTBSクロリド(4.97g、0.018
モル)を無水DMF(10mL)中に溶解したm−ヒド
ロキシ安息香酸(1.0g、0.0072モル)の溶液
に添加し、室温で4時間攪拌した。反応混合物を水(1
0mL)で稀釈し、エチルアセテート(2×15mL)
で抽出した。有機層を水(10mL)で洗滌し、無水硫
酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。ク
ロマトグラフィー(エチルアセテート/ヘキサン、1
0:90)による精製によって22を得た。(4.38
g、0.0071mol 、98%)。 1H NMR(CD
Cl3 )δ1.10(s,9H)、1.18(s,9
H)、7.01−7.79(m,24H)。MS ex
act mass:理論値614.、実測値 M−5
7,557。
【0127】3−tert−ブチルジフェニルシロキシ
安息香酸(23)
安息香酸(23)
【0128】
【化86】
【0129】このビス−シロキシ 化合物22(4.0
g、0.0065モル)をメタノール(25mL)に溶
解し、H2 O(10mL)に溶解したK2 CO3 (2当
量)を添加した。反応混合物を室温で20分間攪拌し
た。TLCを出発物質の痕跡を示さなかった。溶液を稀
酸(20mL)でクエンチし、エチルアセテートで抽出
した(3×20mL)。有機層をH2 O(15mL)で
洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮して23を得た。(2.43g、0.0064mo
l 、99%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.13
(s,9H)、6.88−7.74(m,14H)、
9.7(bs,1H)。MS exactmass:理
論値376.1495、実測値 376.1500。
g、0.0065モル)をメタノール(25mL)に溶
解し、H2 O(10mL)に溶解したK2 CO3 (2当
量)を添加した。反応混合物を室温で20分間攪拌し
た。TLCを出発物質の痕跡を示さなかった。溶液を稀
酸(20mL)でクエンチし、エチルアセテートで抽出
した(3×20mL)。有機層をH2 O(15mL)で
洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧
下濃縮して23を得た。(2.43g、0.0064mo
l 、99%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.13
(s,9H)、6.88−7.74(m,14H)、
9.7(bs,1H)。MS exactmass:理
論値376.1495、実測値 376.1500。
【0130】プロパン−3−オール 3−(tert−
ブチルジフェニルシロキシ)ベンゾエート(24)
ブチルジフェニルシロキシ)ベンゾエート(24)
【0131】
【化87】
【0132】DEAD(0.14g、0.00079モ
ル)を無水THF(10mL)中に溶解した酸23
(0.3g、0.00079モル)の溶液に添加した。
THF(3mL)中のトリフェニルホスフィン(0.2
1g、0.0008モル)及び1,3−プロパンジオー
ル(0.091g、0.0011モル)の混合物を、上
記溶液中にゆっくり注入し、反応混合物を室温で24時
間攪拌した。溶液をH2 O(12mL)でクエンチし、
エチルアセテート(2×15mL)で抽出した。有機層
を無水Na2 SO4 上で乾燥し、減圧下濃縮した。プレ
パラティブTLC(エチルアセテート/ヘキサン、7
0:30)による精製により純粋なエステル(24)を
得た。(0.25g、0.00058モル、73%)。
1H NMR(CDCl3 )δ1.11(s,9H)、
1.88−1.96(m,2H)、2.49(bs,1
H)。3.67(t,2H,J=6Hz)、4.38
(t,2H,J=6Hz)、6.86−7.72(m,
14H)。MS exact mass:理論値43
4.4126、実測値 M+1、435。
ル)を無水THF(10mL)中に溶解した酸23
(0.3g、0.00079モル)の溶液に添加した。
THF(3mL)中のトリフェニルホスフィン(0.2
1g、0.0008モル)及び1,3−プロパンジオー
ル(0.091g、0.0011モル)の混合物を、上
記溶液中にゆっくり注入し、反応混合物を室温で24時
間攪拌した。溶液をH2 O(12mL)でクエンチし、
エチルアセテート(2×15mL)で抽出した。有機層
を無水Na2 SO4 上で乾燥し、減圧下濃縮した。プレ
パラティブTLC(エチルアセテート/ヘキサン、7
0:30)による精製により純粋なエステル(24)を
得た。(0.25g、0.00058モル、73%)。
1H NMR(CDCl3 )δ1.11(s,9H)、
1.88−1.96(m,2H)、2.49(bs,1
H)。3.67(t,2H,J=6Hz)、4.38
(t,2H,J=6Hz)、6.86−7.72(m,
14H)。MS exact mass:理論値43
4.4126、実測値 M+1、435。
【0133】〔(3−ヒドロキシプロポキシ)(3−t
ert−ブチルジフェニルシロキシフェニル)メチレ
ン〕アダマンタン(25)
ert−ブチルジフェニルシロキシフェニル)メチレ
ン〕アダマンタン(25)
【0134】
【化88】
【0135】還流コンデンサを備えた100mLの3首
フラスコをホットエアガンで乾燥しアルゴンでパージし
た。チタニウムトリクロリド(1.10g、0.006
8モル)を攪拌しながら無水THF(15mL)に添加
した。Znダスト(0.70g、0.010モル)を添
加し、溶液を温水浴中で15分間攪拌した。溶液を冷却
(氷浴)し、無水トリエチルアミン(1mL)をゆっく
り注入した。0℃で10分間攪拌後、溶液を温めて室温
にし、アルゴン下2時間還流した。無水THF(5m
L)中に溶解したエステル(24)(0.85g、0.
0019モル)及びアダマンタノン(0.44g、0.
0029モル)の溶液を滴下し、反応混合物を4時間還
流した。溶液を室温に冷却し、ヘキサン(20mL)を
添加した。黒色スラリーをH2 O(20mL)に溶解
し、エーテル(3×10mL)で抽出した。有機層を濾
過し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(エチルアセテート/ヘキサン、30:70)による精
製により25を得た。(0.14g、0.00025mo
l 、12%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.12
(s,9H)、1.50−2.1(m,15H)、2.
37(bs,1H)、3.11(bs,1H)、3.3
2(t,2H,J=6Hz)、3.64(t,2H,J
=6Hz)、6.64−7.73(m,14H)。13C
(CDCl3 )δ19.34、26.43、28.1
5、30.13、30.95、32.05、32.2
2、36.45、38.83、38.91、61.1
0、67.50、118.98、120.92、12
2.03、127.64、128.86、129.7
8、131.59、132.81、135.49、13
6.58、141.71、155.22。MS exa
ct mass:理論値552.3059、実測値 5
52.3066。
フラスコをホットエアガンで乾燥しアルゴンでパージし
た。チタニウムトリクロリド(1.10g、0.006
8モル)を攪拌しながら無水THF(15mL)に添加
した。Znダスト(0.70g、0.010モル)を添
加し、溶液を温水浴中で15分間攪拌した。溶液を冷却
(氷浴)し、無水トリエチルアミン(1mL)をゆっく
り注入した。0℃で10分間攪拌後、溶液を温めて室温
にし、アルゴン下2時間還流した。無水THF(5m
L)中に溶解したエステル(24)(0.85g、0.
0019モル)及びアダマンタノン(0.44g、0.
0029モル)の溶液を滴下し、反応混合物を4時間還
流した。溶液を室温に冷却し、ヘキサン(20mL)を
添加した。黒色スラリーをH2 O(20mL)に溶解
し、エーテル(3×10mL)で抽出した。有機層を濾
過し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(エチルアセテート/ヘキサン、30:70)による精
製により25を得た。(0.14g、0.00025mo
l 、12%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.12
(s,9H)、1.50−2.1(m,15H)、2.
37(bs,1H)、3.11(bs,1H)、3.3
2(t,2H,J=6Hz)、3.64(t,2H,J
=6Hz)、6.64−7.73(m,14H)。13C
(CDCl3 )δ19.34、26.43、28.1
5、30.13、30.95、32.05、32.2
2、36.45、38.83、38.91、61.1
0、67.50、118.98、120.92、12
2.03、127.64、128.86、129.7
8、131.59、132.81、135.49、13
6.58、141.71、155.22。MS exa
ct mass:理論値552.3059、実測値 5
52.3066。
【0136】ビオチンアミドアルケン(26)
【0137】
【化89】
【0138】ビオチンNHSエステル(Calビオチ
ン)(0.025g、0.073ミリモル)を無水DM
F(4mL)中に溶解したアミノアルケン10(0.0
12g、0.04ミリモル)の溶液に添加した。反応混
合物をアルゴン下48時間攪拌した。水(5mL)を添
加し、ジクロロメタン(2×12mL)で抽出した。有
機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下濃縮し
た。淡黄色残渣をプレパラティブTLC(メタノール/
ジクロロメタン、10:90)で精製して白色固体とし
て26を得た。(0.019g、0.036ミリモル、
73%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.25−
2.17(m,20H)、2.65−2.94(m,3
H)、3.12−3.59(m,6H)、4.31−
4.35(m,1H)、4.50−4.54(m,1
H)、5.26(bs,1H)、6.17(t,1H,
J=2.4Hz)、6.40(bs,1H)、6.75
−7.32(m,4H)。13C(CDCl3 )δ25.
45、27.91、28.16、30.43、32.2
5、35.84、37.02、39.11、39.5
7、40.50、55.64、60.31、61.9
5、68.73、115.03、115.79、12
0.91、129.09、133.28、136.9
0、141.70、156.90、164.49、17
3.86。MS exact mass:理論値52
5.7158、実測値FAB(M+23〔Na〕)54
8.6。
ン)(0.025g、0.073ミリモル)を無水DM
F(4mL)中に溶解したアミノアルケン10(0.0
12g、0.04ミリモル)の溶液に添加した。反応混
合物をアルゴン下48時間攪拌した。水(5mL)を添
加し、ジクロロメタン(2×12mL)で抽出した。有
機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下濃縮し
た。淡黄色残渣をプレパラティブTLC(メタノール/
ジクロロメタン、10:90)で精製して白色固体とし
て26を得た。(0.019g、0.036ミリモル、
73%)。 1H NMR(CDCl3 )δ1.25−
2.17(m,20H)、2.65−2.94(m,3
H)、3.12−3.59(m,6H)、4.31−
4.35(m,1H)、4.50−4.54(m,1
H)、5.26(bs,1H)、6.17(t,1H,
J=2.4Hz)、6.40(bs,1H)、6.75
−7.32(m,4H)。13C(CDCl3 )δ25.
45、27.91、28.16、30.43、32.2
5、35.84、37.02、39.11、39.5
7、40.50、55.64、60.31、61.9
5、68.73、115.03、115.79、12
0.91、129.09、133.28、136.9
0、141.70、156.90、164.49、17
3.86。MS exact mass:理論値52
5.7158、実測値FAB(M+23〔Na〕)54
8.6。
【0139】フルオレセインアミドアルケン(27)
【0140】
【化90】
【0141】無水ジクロロメタン/DMF(3:1,3
mL)中のアミノアルケン10(0.012g、0.0
0004モル)の溶液に、5(及び−6)カルボキシ−
フルオレセインスクシンイミジルエステル(分子プロー
ブ)(0.030g、0.00006モル)を添加し、
反応混合物をアルゴン下、室温で24時間攪拌した。溶
液を水(5mL)でクエンチし、エチルアセテート(2
×12mL)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム
上で乾燥し、減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(メタノール/ジクロロメタン、10:90)による精
製により、アルケン27(0.015g、0.0000
22モル、58%)を得た。 1H NMR(CD3 O
D)δ1.27−1.96(m,12H)、2.60
(bs,1H)、3.07(bs,1H)、3.56−
3.62(m,4H)、6.51−8.46(m,13
H)。MS exact mass:理論値657.7
268、実測値FAB(M+1)658。
mL)中のアミノアルケン10(0.012g、0.0
0004モル)の溶液に、5(及び−6)カルボキシ−
フルオレセインスクシンイミジルエステル(分子プロー
ブ)(0.030g、0.00006モル)を添加し、
反応混合物をアルゴン下、室温で24時間攪拌した。溶
液を水(5mL)でクエンチし、エチルアセテート(2
×12mL)で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム
上で乾燥し、減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(メタノール/ジクロロメタン、10:90)による精
製により、アルケン27(0.015g、0.0000
22モル、58%)を得た。 1H NMR(CD3 O
D)δ1.27−1.96(m,12H)、2.60
(bs,1H)、3.07(bs,1H)、3.56−
3.62(m,4H)、6.51−8.46(m,13
H)。MS exact mass:理論値657.7
268、実測値FAB(M+1)658。
【0142】1,2−ジオキセタンの製造 このジオキセタンを、以下に示す光酸素化法により製造
した。上記に示した各アルケンは対応するジオキセタン
に変換することができる。
した。上記に示した各アルケンは対応するジオキセタン
に変換することができる。
【0143】ジオキセタン1a
【0144】
【化91】
【0145】無水ジクロロメタン(4mL)中に溶解し
たアルケン15(0.012g、0.027ミリモル)
を−78℃で、連続的な酸素バブリングを備えたセンシ
トックス(Sensitox)の存在下、1000wナ
トリウムランプで照射した。1時間の照射後、増感剤を
濾過により除去し、溶媒を蒸発させてジオキセタン1a
(0.012g、0.027ミリモル、99%)を得
た。 1H NMR(CDCl3 )δ1.05−2.12
(m,14H)、2.18(bs,1H)、2.88
(bs,4H)、3.03(bs,1H),3.32−
3.39(m,2H)、3.45−3.57(m,2
H)、6.8−7.32(m,4H);13CNMR(C
DCl3 )δ25.59、25.83、25.97、3
1.56、31.81、32.20、32.91、3
3.05、34.68、36.36、38.92、6
7.23、95.60、111.40、116.81、
121.61、129.61、135.94、156.
12、168.36。
たアルケン15(0.012g、0.027ミリモル)
を−78℃で、連続的な酸素バブリングを備えたセンシ
トックス(Sensitox)の存在下、1000wナ
トリウムランプで照射した。1時間の照射後、増感剤を
濾過により除去し、溶媒を蒸発させてジオキセタン1a
(0.012g、0.027ミリモル、99%)を得
た。 1H NMR(CDCl3 )δ1.05−2.12
(m,14H)、2.18(bs,1H)、2.88
(bs,4H)、3.03(bs,1H),3.32−
3.39(m,2H)、3.45−3.57(m,2
H)、6.8−7.32(m,4H);13CNMR(C
DCl3 )δ25.59、25.83、25.97、3
1.56、31.81、32.20、32.91、3
3.05、34.68、36.36、38.92、6
7.23、95.60、111.40、116.81、
121.61、129.61、135.94、156.
12、168.36。
【0146】ジオキセタン1b
【0147】
【化92】
【0148】無水ジクロロメタン(15mL)中に溶解
したアルケン18(0.03g、0.054ミリモル)
を−78℃で、連続酸素バブリングを備えたセンシトッ
クスの存在下、1000wナトリウムランプで照射し
た。2時間照射後、増感剤を濾過により除去し、溶媒を
蒸発させて定量的収率のジオキセタン1bを得た。 (0.028g、0.047mmol、88%): 1H N
MR(CDCl3 )δ0.18(s,6H)、0.97
(s,9H)、1.70−2.1(m,14H)、2.
28(bs,1H)、2.68−2.74(m,2
H)、2.83(bs,4H),3.01(bs,1
H)、3.44−3.54(m,2H)、6.71−
7.40(m,4H)。
したアルケン18(0.03g、0.054ミリモル)
を−78℃で、連続酸素バブリングを備えたセンシトッ
クスの存在下、1000wナトリウムランプで照射し
た。2時間照射後、増感剤を濾過により除去し、溶媒を
蒸発させて定量的収率のジオキセタン1bを得た。 (0.028g、0.047mmol、88%): 1H N
MR(CDCl3 )δ0.18(s,6H)、0.97
(s,9H)、1.70−2.1(m,14H)、2.
28(bs,1H)、2.68−2.74(m,2
H)、2.83(bs,4H),3.01(bs,1
H)、3.44−3.54(m,2H)、6.71−
7.40(m,4H)。
【0149】ジオキセタン1c
【0150】
【化93】
【0151】無水ジクロロメタン(15mL)中に溶解
したアルケン21(0.03g、0.044ミリモル)
を−78℃で、連続的酸素バブリングとともに、センシ
トックスの存在下、1000wナトリウムランプで照射
した。2時間の照射後、増感剤を濾過により除去し、溶
媒を蒸発させて定量的収率のジオキセタン1c(0.0
31g、0.044ミリモル、99%)を得た。 1H
NMR(CD2 Cl2)δ 1.08(s,9H)、
1.36−2.0(m,15H)、2.85(m,7
H)、3.47(m,2H)、7.0−7.78(m,
14H)。
したアルケン21(0.03g、0.044ミリモル)
を−78℃で、連続的酸素バブリングとともに、センシ
トックスの存在下、1000wナトリウムランプで照射
した。2時間の照射後、増感剤を濾過により除去し、溶
媒を蒸発させて定量的収率のジオキセタン1c(0.0
31g、0.044ミリモル、99%)を得た。 1H
NMR(CD2 Cl2)δ 1.08(s,9H)、
1.36−2.0(m,15H)、2.85(m,7
H)、3.47(m,2H)、7.0−7.78(m,
14H)。
【0152】ジオキセタン2a
【0153】
【化94】
【0154】6−アミノヘキサノール(1.2mg、0.
010ミリモル)を無水ジクロロメタン(2mL)中に
溶解したジオキセタン1b(0.004g、0.006
8ミリモル)の溶液にアルゴン下添加した。反応混合物
を室温で10分間攪拌した。白色沈殿物を濾過により除
去し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(メタノール/ジクロロメタン、10:90)による精
製によって、2a(0.004g、0.0068ミリモ
ル、100%)を得た。 1H NMR(CDCl 3 )δ
0.21(s,6H)、0.98(s,9H)、1.
24−1.57(m,22H)、2.12(t,2H,
J=6.6Hz)、2.16(bs,1H)、2.30
(t,2H,J=7.2Hz)、3.26(q,2H,
J=6.3Hz)、3.60−3.66(m,3H)、
4.35(t,2H,J=6.3Hz)、5.5(b
s,1H)、7.02−7.63(m,4H)。
010ミリモル)を無水ジクロロメタン(2mL)中に
溶解したジオキセタン1b(0.004g、0.006
8ミリモル)の溶液にアルゴン下添加した。反応混合物
を室温で10分間攪拌した。白色沈殿物を濾過により除
去し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC
(メタノール/ジクロロメタン、10:90)による精
製によって、2a(0.004g、0.0068ミリモ
ル、100%)を得た。 1H NMR(CDCl 3 )δ
0.21(s,6H)、0.98(s,9H)、1.
24−1.57(m,22H)、2.12(t,2H,
J=6.6Hz)、2.16(bs,1H)、2.30
(t,2H,J=7.2Hz)、3.26(q,2H,
J=6.3Hz)、3.60−3.66(m,3H)、
4.35(t,2H,J=6.3Hz)、5.5(b
s,1H)、7.02−7.63(m,4H)。
【0155】ジオキセタン2b
【0156】
【化95】
【0157】6−アミノヘキサノール(1mg、0.00
84ミリモル)を無水ジクロロメタン(2mL)に溶解
したジオキセタン1c(2mg、0.0028ミリモル)
の溶液アルゴン下添加した。反応混合物を室温で30分
間攪拌した。白色沈殿物を濾過により除去し、溶液を減
圧下濃縮した。プレパラティブTLC(メタノール/ジ
クロロメタン、10:90)による精製によって、2b
(1.9mg、0.0026ミリモル、95%)を得た。
1H NMR(CDCl3 )δ 1.08(s,9
H)、1.25−1.66(m,22H)、3.18−
3.25(m,5H)、3.63(t,3H,J=6.
0Hz)、5.81(t,1H)、7.32−7.69
(m,14H)。
84ミリモル)を無水ジクロロメタン(2mL)に溶解
したジオキセタン1c(2mg、0.0028ミリモル)
の溶液アルゴン下添加した。反応混合物を室温で30分
間攪拌した。白色沈殿物を濾過により除去し、溶液を減
圧下濃縮した。プレパラティブTLC(メタノール/ジ
クロロメタン、10:90)による精製によって、2b
(1.9mg、0.0026ミリモル、95%)を得た。
1H NMR(CDCl3 )δ 1.08(s,9
H)、1.25−1.66(m,22H)、3.18−
3.25(m,5H)、3.63(t,3H,J=6.
0Hz)、5.81(t,1H)、7.32−7.69
(m,14H)。
【0158】ジオキセタン3a−c
【0159】
【化96】
【0160】ジオキセタン3a,3b及び3cは、各々
アルケン14、17及び20から、標準増感シングレッ
ト酸化法により得ることができる。
アルケン14、17及び20から、標準増感シングレッ
ト酸化法により得ることができる。
【0161】ジオキセタン4
【0162】
【化97】
【0163】無水ジクロロメタン(10mL)中に溶解
したアルケン25(0.12g、0.0002モル)を
−78℃で連続酸素バブリングとともにセンシトックス
の存在下、1000wナトリウムランプにより照射し
た。2.5時間照射後、増感剤を濾過により除去し、溶
液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC(エチルア
セテート/ヘキサン、30:70)による精製によっ
て、ジオキセタン4(0.11g、0.00019モ
ル、93%)を得た。 1H NMR(CDCl3 )δ
1.09(s,9H)、1.36−2.09(m,16
H)2.81−3.86(m,5H)、7.31−7.
74(m,14H)。13C NMR(CDCl3)δ
19.25、25.68、25.89、26.32、2
7.44、30.94、31.41、31.60、3
2.20、32.67、32.78、34.40、3
6.29、36.44、37.53、59.97、7
4.44、77.20、95.41、111.56、1
27.77、129.92、132.44、135.3
4、135.48、135.99、155.58。
したアルケン25(0.12g、0.0002モル)を
−78℃で連続酸素バブリングとともにセンシトックス
の存在下、1000wナトリウムランプにより照射し
た。2.5時間照射後、増感剤を濾過により除去し、溶
液を減圧下濃縮した。プレパラティブTLC(エチルア
セテート/ヘキサン、30:70)による精製によっ
て、ジオキセタン4(0.11g、0.00019モ
ル、93%)を得た。 1H NMR(CDCl3 )δ
1.09(s,9H)、1.36−2.09(m,16
H)2.81−3.86(m,5H)、7.31−7.
74(m,14H)。13C NMR(CDCl3)δ
19.25、25.68、25.89、26.32、2
7.44、30.94、31.41、31.60、3
2.20、32.67、32.78、34.40、3
6.29、36.44、37.53、59.97、7
4.44、77.20、95.41、111.56、1
27.77、129.92、132.44、135.3
4、135.48、135.99、155.58。
【0164】ジオキセタン5
【0165】
【化98】
【0166】ビオチン化(biotinylated)
ジオキセタン5をアルケン26から得た。無水K2 CO
3 (0.15g)を無水CH2 Cl2 (10ml)中に溶
解したアルケン26(0.012g、0.022ミリモ
ル)に添加し、酸素を0℃で2分間バブルした。トリス
(4−ブロモフェニル)アミニウム ヘキサクロロアン
チモネート(BAHA)(0.004g、0.0048
ミリモル)を上記溶液に添加し、O2 を0℃で30分間
この反応混合物中にバブルした。溶液を濾過し、減圧下
濃縮した。プレパラティブTLC(メタノール/CH2
Cl2 、15:85)による精製によって、ジオキセタ
ン5(0.0091g、0.0163ミリモル、72
%)を得た。 1H NMR(CD3 OD/CDCl3 、
10:90)δ 1.02−1.90(m,18H)、
2.23−2.28(m,3H)、2.72(d,1
H、J=12.9 Hz)、3.14−3.20(m,
1H)、3.39−3.56(m,6H)、4.30−
4.34(m,1H)、4.48−4.52(m,1
H)、6.87−7.28(m,4H)。
ジオキセタン5をアルケン26から得た。無水K2 CO
3 (0.15g)を無水CH2 Cl2 (10ml)中に溶
解したアルケン26(0.012g、0.022ミリモ
ル)に添加し、酸素を0℃で2分間バブルした。トリス
(4−ブロモフェニル)アミニウム ヘキサクロロアン
チモネート(BAHA)(0.004g、0.0048
ミリモル)を上記溶液に添加し、O2 を0℃で30分間
この反応混合物中にバブルした。溶液を濾過し、減圧下
濃縮した。プレパラティブTLC(メタノール/CH2
Cl2 、15:85)による精製によって、ジオキセタ
ン5(0.0091g、0.0163ミリモル、72
%)を得た。 1H NMR(CD3 OD/CDCl3 、
10:90)δ 1.02−1.90(m,18H)、
2.23−2.28(m,3H)、2.72(d,1
H、J=12.9 Hz)、3.14−3.20(m,
1H)、3.39−3.56(m,6H)、4.30−
4.34(m,1H)、4.48−4.52(m,1
H)、6.87−7.28(m,4H)。
【0167】ジオキセタン6
【0168】
【化99】
【0169】ジクロロメタン/メタノール(9:1,1
2mL)の混合物中に溶解したアルケン27(0.01
1g、0.0167ミリモル)を−78℃で連続酸素バ
ブリングとともにセンシトックスの存在下、1000w
ナトリウムランプで照射した。1時間の照射後、増感剤
を濾過により除去し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラ
ティブTLC(メタノール/ジクロロメタン、20:8
0)による精製によって、ジオキセタン6(0.005
3g、0.0076ミリモル、46%)を得た。分析T
LCスポットは加熱により黄色の化学ルミネセンスを示
した。 1H NMR(CDCl3 /CD3 OD、3:
1)δ:0.88−1.98(m,12H)2.32
(bs,1H)、3.06(bs,1H)、3.65
(m,4H)、6.53−8.34(m,13H)。
2mL)の混合物中に溶解したアルケン27(0.01
1g、0.0167ミリモル)を−78℃で連続酸素バ
ブリングとともにセンシトックスの存在下、1000w
ナトリウムランプで照射した。1時間の照射後、増感剤
を濾過により除去し、溶液を減圧下濃縮した。プレパラ
ティブTLC(メタノール/ジクロロメタン、20:8
0)による精製によって、ジオキセタン6(0.005
3g、0.0076ミリモル、46%)を得た。分析T
LCスポットは加熱により黄色の化学ルミネセンスを示
した。 1H NMR(CDCl3 /CD3 OD、3:
1)δ:0.88−1.98(m,12H)2.32
(bs,1H)、3.06(bs,1H)、3.65
(m,4H)、6.53−8.34(m,13H)。
【0170】ジオキセタンで直接ラベルしたウシ血清ア
ルブミンの化学ルミネセント検出 1. BSA−ジオキセタン共役体の調製 ジオキサン−ホウ酸バッファー(ジオキサン/H2 O、
1:9)溶液(pH7.5)(10mL)中のBSA
(0.15g)の溶液に、ジオキセタン N−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル1aを攪拌しながら添加し
た。室温で0.5時間攪拌後、TLC(メタノール/ジ
クロロメタン 10:90)は、非結合ラベルの痕跡量
を示した。溶液をウルトラフィルトレーションにより高
圧下濃縮した。反応混合物を10mL ウルトラフィル
トレーションセル(アミコン、YM30、25mm、>3
0,000MW カットオフ)中に移した。セルをキャッ
プし、N 2 インレットにつないだ。濾過を最初穏かに攪
拌しながらN2 (20 psi)を通して行なった。約5分
後、N2 圧をゆっくり50 psiに増加した。溶液(ジオ
キサン/水)をアウトレットからビーカーに集めた。濃
縮物を水性ジオキサン(ジオキサン/H2 O、5:9
5)(10mL)で洗滌し、ひきつづき水(10mL)
で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を白色の薄片
状の固体として得た。
ルブミンの化学ルミネセント検出 1. BSA−ジオキセタン共役体の調製 ジオキサン−ホウ酸バッファー(ジオキサン/H2 O、
1:9)溶液(pH7.5)(10mL)中のBSA
(0.15g)の溶液に、ジオキセタン N−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル1aを攪拌しながら添加し
た。室温で0.5時間攪拌後、TLC(メタノール/ジ
クロロメタン 10:90)は、非結合ラベルの痕跡量
を示した。溶液をウルトラフィルトレーションにより高
圧下濃縮した。反応混合物を10mL ウルトラフィル
トレーションセル(アミコン、YM30、25mm、>3
0,000MW カットオフ)中に移した。セルをキャッ
プし、N 2 インレットにつないだ。濾過を最初穏かに攪
拌しながらN2 (20 psi)を通して行なった。約5分
後、N2 圧をゆっくり50 psiに増加した。溶液(ジオ
キサン/水)をアウトレットからビーカーに集めた。濃
縮物を水性ジオキサン(ジオキサン/H2 O、5:9
5)(10mL)で洗滌し、ひきつづき水(10mL)
で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を白色の薄片
状の固体として得た。
【0171】ジオキサン−ホウ酸バッファー(ジオキサ
ン/H2 O、1:9)溶液(pH7.6)(2.7mL)
中のBSA(0.05g)の溶液に、ジオキサン(0.
3mL)中に溶解したジオキセタン N−ヒドロキシス
クシンイミドエステル1bを攪拌しながら添加した。室
温で1時間攪拌後、溶液を圧力下ウルトラフィルトレー
ションにより濃縮した。濃縮物をジオキサン水溶液(ジ
オキサン/H2 O、5:95)(5mL)及び蒸留水
(5mL)で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を
白色の薄片状の固体として得た。
ン/H2 O、1:9)溶液(pH7.6)(2.7mL)
中のBSA(0.05g)の溶液に、ジオキサン(0.
3mL)中に溶解したジオキセタン N−ヒドロキシス
クシンイミドエステル1bを攪拌しながら添加した。室
温で1時間攪拌後、溶液を圧力下ウルトラフィルトレー
ションにより濃縮した。濃縮物をジオキサン水溶液(ジ
オキサン/H2 O、5:95)(5mL)及び蒸留水
(5mL)で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を
白色の薄片状の固体として得た。
【0172】ジオキサン−ホウ酸バッファー(ジオキサ
ン/H2 O、1:9)溶液(pH7.6)(2.7mL)
中のBSA(0.05g)の溶液に、ジオキサン(0.
3mL)中に溶解したジオキセタン N−ヒドロキシス
クシンイミドエステル1cを攪拌しながら添加した。室
温で1時間攪拌後、溶液を圧力下ウルトラフィルトレー
ションにより濃縮した。濃縮物をジオキサン水溶液(ジ
オキサン/H2 O、5:95)(5mL)及び蒸留水
(5mL)で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を
白色薄片状固体として得た。
ン/H2 O、1:9)溶液(pH7.6)(2.7mL)
中のBSA(0.05g)の溶液に、ジオキサン(0.
3mL)中に溶解したジオキセタン N−ヒドロキシス
クシンイミドエステル1cを攪拌しながら添加した。室
温で1時間攪拌後、溶液を圧力下ウルトラフィルトレー
ションにより濃縮した。濃縮物をジオキサン水溶液(ジ
オキサン/H2 O、5:95)(5mL)及び蒸留水
(5mL)で洗滌した。濃縮物を凍結乾燥して共役体を
白色薄片状固体として得た。
【0173】2. BSA−ジオキセタン共役体の化学
ルミネセント検出 化学ルミネセンス測定を光−密封のホルダー中に置いた
シングルダイナテックイムロンウェル(single
Dynatech Immulon wells)中で
実施した。ルミネセンスをオルテックスフォトン−カウ
ンター(Ortex photon−counter)
に連結したファィバーオプチック(fiber opt
ic)を用いてウェルの底で検出した。光強度を−78
℃に冷却したRCA A−31034Aガリウム−ヒ素
PMTで測定した。上記したBSAとジオキセタン1
aとの共役体2.4mgをマイクロ−タイターウェル中に
置き、90μL中性 CTAB(0.00125M)を
この白色薄片状固体を溶かすように添加した。10M
NaOH溶液(10μL)を上記溶液に約25°で注入
し、発生した化学ルミネセンスをルミノメーターにより
記録した。図1に示すようにルミネセンスの強度は、ラ
ベルした蛋白質の直接的測定となる。有機媒体中での誘
発として、BSAとジオキセタン1aとの共役体1.2
mgをマイクロ−タイターウェルに置き、DMSO(90
μL)をそれに添加した。DMSO(10μL)中の
0.1Mテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBA
F)溶液を上記溶液に約25℃で注入し、ルミネセンス
の強度を図2に示すように記録した。
ルミネセント検出 化学ルミネセンス測定を光−密封のホルダー中に置いた
シングルダイナテックイムロンウェル(single
Dynatech Immulon wells)中で
実施した。ルミネセンスをオルテックスフォトン−カウ
ンター(Ortex photon−counter)
に連結したファィバーオプチック(fiber opt
ic)を用いてウェルの底で検出した。光強度を−78
℃に冷却したRCA A−31034Aガリウム−ヒ素
PMTで測定した。上記したBSAとジオキセタン1
aとの共役体2.4mgをマイクロ−タイターウェル中に
置き、90μL中性 CTAB(0.00125M)を
この白色薄片状固体を溶かすように添加した。10M
NaOH溶液(10μL)を上記溶液に約25°で注入
し、発生した化学ルミネセンスをルミノメーターにより
記録した。図1に示すようにルミネセンスの強度は、ラ
ベルした蛋白質の直接的測定となる。有機媒体中での誘
発として、BSAとジオキセタン1aとの共役体1.2
mgをマイクロ−タイターウェルに置き、DMSO(90
μL)をそれに添加した。DMSO(10μL)中の
0.1Mテトラブチルアンモニウムフルオリド(TBA
F)溶液を上記溶液に約25℃で注入し、ルミネセンス
の強度を図2に示すように記録した。
【0174】ジオキセタンで直接ラベルされた抗体の化
学ルミネセント検出 1. ジオキセタン−結合抗体の調製 125μLのDMF中のジオキセタン1c(100μ
g)を、25mM Tris−HCl(pH7.5)、
1.4mM CTAB、ヤギ 抗マウス(goatan
timouse)IgG(Cappel,Cat.n
o.0611−0231、Lot32614)100μ
gを含む1.4mM CTABのはげしく渦まいた溶液
(2ml)にゆっくり(10秒にわたって)添加した。溶
液を室温で24時間インキュベートし、それから4℃で
貯蔵した。シリカプレート(メタノール/CH2 Cl
8:92)上の生成物のTLC分析は、出発ジオキセタ
ンの大部分が抗体に共有結合的にリンクしたか又はNH
S官能性が加水分解されたかどちらかを示した。図3に
は、得られたTLCプレートのX−線フィルムへの暴
露、その後の無水DMSO(20%w/v)中のテトラ
ブチルアンモニウムフルオリドの溶液での誘発を示す。
このTLC分析では、出発ジオキセタン1cはプレート
のトップに昇り、ジオキセタン−結合抗体は、はじめの
ままとどまっている。
学ルミネセント検出 1. ジオキセタン−結合抗体の調製 125μLのDMF中のジオキセタン1c(100μ
g)を、25mM Tris−HCl(pH7.5)、
1.4mM CTAB、ヤギ 抗マウス(goatan
timouse)IgG(Cappel,Cat.n
o.0611−0231、Lot32614)100μ
gを含む1.4mM CTABのはげしく渦まいた溶液
(2ml)にゆっくり(10秒にわたって)添加した。溶
液を室温で24時間インキュベートし、それから4℃で
貯蔵した。シリカプレート(メタノール/CH2 Cl
8:92)上の生成物のTLC分析は、出発ジオキセタ
ンの大部分が抗体に共有結合的にリンクしたか又はNH
S官能性が加水分解されたかどちらかを示した。図3に
は、得られたTLCプレートのX−線フィルムへの暴
露、その後の無水DMSO(20%w/v)中のテトラ
ブチルアンモニウムフルオリドの溶液での誘発を示す。
このTLC分析では、出発ジオキセタン1cはプレート
のトップに昇り、ジオキセタン−結合抗体は、はじめの
ままとどまっている。
【0175】2. ジオキセタン−結合抗体の精製 ラベルした抗体を30cm Pharmacia Sup
erose 12カラムを用いてFPLCにより非結合
ジオキセタン化合物から分離した。粗反応物のアリコー
ト(850μL)を10分間10,000rpm でEpp
indorfマイクロ遠心分離器中で遠心分離した。次
いで、これを、20mM Tris−HCl pH7.
5、0.15M NaCl、1mM CTABの溶液で
平衡化したカラム上に注入した。ジオキセタン修飾抗体
をこの同じバッファーで流速0.12mL/分で溶出し
た。フラクションをシリカプレート(メタノール/CH
2 CH2 8:92)上でTLCによりチェックしてジオ
キサン−結合抗体を含んでいるものを決定した。ジオキ
セタン−結合抗体を含んだフラクションのTLC分析
(図3に示すTLCで述べたと同じトリガー法を用い
た)は、はっきりとこれらのフラクションがこの生成物
だけを含んでおり、出発物質および加水分解生成物を含
んでいないことを示す(図4)。
erose 12カラムを用いてFPLCにより非結合
ジオキセタン化合物から分離した。粗反応物のアリコー
ト(850μL)を10分間10,000rpm でEpp
indorfマイクロ遠心分離器中で遠心分離した。次
いで、これを、20mM Tris−HCl pH7.
5、0.15M NaCl、1mM CTABの溶液で
平衡化したカラム上に注入した。ジオキセタン修飾抗体
をこの同じバッファーで流速0.12mL/分で溶出し
た。フラクションをシリカプレート(メタノール/CH
2 CH2 8:92)上でTLCによりチェックしてジオ
キサン−結合抗体を含んでいるものを決定した。ジオキ
セタン−結合抗体を含んだフラクションのTLC分析
(図3に示すTLCで述べたと同じトリガー法を用い
た)は、はっきりとこれらのフラクションがこの生成物
だけを含んでおり、出発物質および加水分解生成物を含
んでいないことを示す(図4)。
【0176】3. ジオキセタン−結合抗体を用いたウ
ェスタンブロット マウスIgG(Cappel)をMSIナイロン膜(2
0cm×80cm)上にスポットし、真空下30分間乾燥し
た。膜をハイブリダイゼーションバッグ中に置き、0.
1M Tris−HCl pH7.5、0.15M Na
Cl、0.05% Tween 20を含む溶液10ml
を添加し、バッグを封印し、その後25℃1時間おだや
かに攪拌しながらインキュベートした。バッグを開き、
ブロッキング溶液を流し、0.1M Tris−HCl
pH7.5、0.15M NaCl、0.05%Twe
en20、1%スキムミルク、及び上記ジオキセタン−
ラベル抗体(約5μgの修飾IgG)のFPLC精製か
らのプールしたフラクション200μLを含む溶液10
mlで置き換えた。バッグを封印し、膜を一晩室温でイン
キュベートした。それから膜をバッグから取り除き、1
分間脱イオン水の流れの下でリンスし、0.1M Tr
is−HCl pH7.5、0.15M NaCl、0.
05%Tween 20、0.1%SDSを含む溶液2
0mlを含む浅い皿の中に置いた。皿を15分間ゆっくり
ロックし、溶液をドレーンし、洗滌を2回繰り返した。
膜を脱イオン水の流水下で1分間リンスし、それから真
空下で乾燥した。膜をKodak XAR5 X−線フ
ィルム上の薄いガラスの上に置きそして無水DMSO中
の20%(w/v)テトラブチルアンモニウムフルオリドを
添加して誘発することにより暴露した。修飾した抗体の
ハイブリダイゼーションを100ngの蛋白質を含むスポ
ットされたサンプルについて観察した(図5)。これら
の結果は、化学ルミネセンスによるジオキセタン−ラベ
ルバイオモレキュールの検出が得られたことを説明して
いる。
ェスタンブロット マウスIgG(Cappel)をMSIナイロン膜(2
0cm×80cm)上にスポットし、真空下30分間乾燥し
た。膜をハイブリダイゼーションバッグ中に置き、0.
1M Tris−HCl pH7.5、0.15M Na
Cl、0.05% Tween 20を含む溶液10ml
を添加し、バッグを封印し、その後25℃1時間おだや
かに攪拌しながらインキュベートした。バッグを開き、
ブロッキング溶液を流し、0.1M Tris−HCl
pH7.5、0.15M NaCl、0.05%Twe
en20、1%スキムミルク、及び上記ジオキセタン−
ラベル抗体(約5μgの修飾IgG)のFPLC精製か
らのプールしたフラクション200μLを含む溶液10
mlで置き換えた。バッグを封印し、膜を一晩室温でイン
キュベートした。それから膜をバッグから取り除き、1
分間脱イオン水の流れの下でリンスし、0.1M Tr
is−HCl pH7.5、0.15M NaCl、0.
05%Tween 20、0.1%SDSを含む溶液2
0mlを含む浅い皿の中に置いた。皿を15分間ゆっくり
ロックし、溶液をドレーンし、洗滌を2回繰り返した。
膜を脱イオン水の流水下で1分間リンスし、それから真
空下で乾燥した。膜をKodak XAR5 X−線フ
ィルム上の薄いガラスの上に置きそして無水DMSO中
の20%(w/v)テトラブチルアンモニウムフルオリドを
添加して誘発することにより暴露した。修飾した抗体の
ハイブリダイゼーションを100ngの蛋白質を含むスポ
ットされたサンプルについて観察した(図5)。これら
の結果は、化学ルミネセンスによるジオキセタン−ラベ
ルバイオモレキュールの検出が得られたことを説明して
いる。
【図1】水酸化ナトリウムで誘発したときのジオキセタ
ン1aでラベルしたウシ血清アルブミン(BSA)につ
いての強度対時間のグラフ。
ン1aでラベルしたウシ血清アルブミン(BSA)につ
いての強度対時間のグラフ。
【図2】テトラブチルアンモニウムフルオリド(TBA
F)で誘発したときのDMSO中のジオキセタン1aで
ラベルしたBSAについての強度対時間のグラフ。
F)で誘発したときのDMSO中のジオキセタン1aで
ラベルしたBSAについての強度対時間のグラフ。
【図3】TLC分析の結果を表わす写真であり、TLC
シリカプレート上で、ジオキセタン1cでラベルしたヤ
ギ抗マウスIgGをクロマトグラフして、非ラベルの成
分を分離し、その後誘発させたTLCシリカプレートに
暴露したX−線フィルムの写真。
シリカプレート上で、ジオキセタン1cでラベルしたヤ
ギ抗マウスIgGをクロマトグラフして、非ラベルの成
分を分離し、その後誘発させたTLCシリカプレートに
暴露したX−線フィルムの写真。
【図4】TLC分析の結果を表わす写真であり、トリガ
ーされた抗マウスIgGを含む液体クロマトグラフィー
により分離された物質(フラクション20は、精製され
ラベルされた抗マウスIgGを含む)にさらされたX−
線フィルムの写真。
ーされた抗マウスIgGを含む液体クロマトグラフィー
により分離された物質(フラクション20は、精製され
ラベルされた抗マウスIgGを含む)にさらされたX−
線フィルムの写真。
【図5】ナイロン膜上の異なる濃度のマウスIgGをジ
オキセタンラベル抗マウスIgGに接触させた化学ルミ
ネセント ウエスタン ドットブロツトの写真。セ
オキセタンラベル抗マウスIgGに接触させた化学ルミ
ネセント ウエスタン ドットブロツトの写真。セ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07F 7/18 C07F 7/18 A C09K 11/07 9280−4H C09K 11/07 // G01N 33/533 G01N 33/533
Claims (35)
- 【請求項1】 式: 【化1】 (式中、Arはフェニル及びナフチルから成る群から選
ばれる芳香族置換基であり、Aは、有機又は生物学的分
子とカップルして分子上にラベルとしてジオキセタン化
合物を与える置換基であり且つヒドロキシル、アミノ、
カルボン酸、NH(CH2)mOH(mは2から20の
数)、スクシンイミドオキシ及びビオチン置換基から成
る群から選ばれ、R1は−(CH2)n−,−(C
H2)nNH−及び−(CH2)nCO−(nは1から
30の整数)から成る群から選ばれるリンキング置換基
であり、OXはヒドロキシル、アルキルエステル、アリ
ールエステル、アルキルシリルオキシ及びアリールシリ
ルオキシから成る群から選ばれ、Xは酵素以外の活性化
剤によって除去されるものであり、 【化2】 はアダマンチルである)のジオキセタン化合物。 - 【請求項2】 式: 【化4】 (式中、Aは有機又は生物学的分子とカップルしてその
分子上にラベルとしてジオキセタン化合物を与える置換
基であり且つヒドロキシル、アミノ、カルボン酸、NH
(CH2)mOH(mは2から20の数)、スクシンイ
ミドオキシ及びビオチン置換基から成る群から選ばれ、
R1は−(CH2)n−,−(CH2)nNH−及び−
(CH2)nCO−(nは1から30の整数)から成る
群から選ばれるリンキング置換基であり、OXはヒドロ
キシル、アルキルエステル、アリールエステル、アルキ
ルシリルオキシ及びアリールシリルオキシから成る群か
ら選ばれ、Xは酵素以外の活性化剤により除去されるも
のである)のジオキセタン化合物。 - 【請求項3】 Aは、アミン、チオール及びカルボン酸
置換基から成る群から選ばれる有機又は生物学的分子中
で、置換基とカップルする請求項2の化合物。 - 【請求項4】 式: 【化7】 (式中、R1は 【化8】 ,nは1から30の整数、Aは有機又は生物学的分子と
カップルして分子上でラベルとしてジオキセタン化合物
を与える置換基であり、且つヒドロキシル、アミノ、カ
ルボン酸、NH(CH2)mOH(mは2から20の
数)、スクシンイミドオキシ及びビオチン置換基から成
る群から選ばれ、OXはヒドロキシル、アルキルエステ
ル、アリールエステル、アルキルシリルオキシ及びアリ
ールシリルオキシ基から成る群から選ばれ、Xは酵素以
外の活性化剤によって除去されるものである)のジオキ
セタン化合物。 - 【請求項5】 式: 【化10】 (式中、R1は 【化11】 ,nは1から30までの整数、Aはスクシンイミドオキ
シ及びビオチン置換基から成る群から選ばれ、OXはヒ
ドロキシル、アルキルエステル、アリールエステル、ア
ルキルシリルオキシ及びアリールシリルオキシ基から成
る群から選ばれ、Xは酵素以外の活性化剤によって除去
されるものである)のジオキセタン化合物。 - 【請求項6】 Aがスクシンイミドオキシ置換基であり
且つ式: 【化12】 を有する請求項5のジオキセタン化合物。 - 【請求項7】 nが3であり、XがHであり且つ式: 【化13】 を有する請求項6のジオキセタン化合物。
- 【請求項8】 nが3であり、OXがシリルオキシであ
り且つ式: 【化14】 (式中、シリルオキシはtert−ブチルジメチルシリ
ルオキシ及びtert−ブチルジフェニルシリルオキシ
から成る群から選ばれる)を有する請求項6のジオキセ
タン化合物。 - 【請求項9】 Aが、−NH(CH2)mOH(ここ
で、mは2から20までの整数である)であり且つジオ
キセタンは式: 【化15】 を有する請求項1のジオキセタン化合物。 - 【請求項10】 nが3であり、mが6である請求項9
のジオキセタン化合物。 - 【請求項11】 OXがtert−ブチルジメチルシリ
ルオキシ及びtert−ブチルジフェニルシリルオキシ
から成る群から選ばれる請求項10のジオキセタン化合
物。 - 【請求項12】 Aが−CO2H置換基であり、且つジ
オキセタンが式: 【化17】 (式中、nは1から30までの整数である)を有する請
求項2の化合物。 - 【請求項13】 nが3である請求項12の化合物。
- 【請求項14】 OXがヒドロキシル、tert−ブチ
ルジメチルシリルオキシ及びtert−ブチルジフェニ
ルシリルオキシ置換基から成る群から選ばれる請求項1
2の化合物。 - 【請求項15】 AがOHである請求項2の化合物。
- 【請求項16】 OXがtert−ブチルジメチルシロ
キシ及びtert−ブチルジフェニルシロキシから成る
群から選ばれる請求項15の化合物。 - 【請求項17】 式: 【化20】 (式中、nは2から30までの整数であり、mは4であ
る)を有する請求項2の化合物。 - 【請求項18】 nが2であり、mが4でありそしてO
Xがヒドロキシルである請求項17の化合物。 - 【請求項19】 1,2−ジオキセタン化合物を製造す
るのに使用される次式: 【化21】 (式中、Arはフェニル及びナフチルから成る群から選
ばれる芳香族置換基であり、Aは有機又は生物学的分子
とカップルしてジオキセタン化合物を分子上にラベルと
して与える置換基であり且つヒドロキシル、カルボン
酸、NH(CH2)mOH(mは2から20の数)、ス
クシンイミドオキシ及びビオチン置換基から成る群から
選ばれ、R1は−(CH2)n−,−(CH2)nNH
−及び−(CH2)nCO−(nは1から30の整数)
から成る群から選ばれるリンキング置換基であり、OX
はヒドロキシル、アルキルエステル、アリールエステ
ル、アルキルシリルオキシ及びアリールシリルオキシか
ら成る群から選ばれ、1,2−ジオキセタン中のXは酵
素以外の活性化剤により除去されるものであり、そして 【化22】 がアダマンチルである)のアルケン化合物。 - 【請求項20】 1,2−ジオキセタン化合物を製造す
るのに使用される次式: 【化24】 (式中、Aは有機又は生物学的分子とカップルしてジオ
キセタン化合物を分子上にラベルとして与える置換基で
あり且つヒドロキシル、カルボン酸、NH(CH2)m
OH(mは2から20の数)、スクシンイミドオキシ及
びビオチン置換基から成る群から選ばれ、R1は−(C
H2)n−,−(CH2)nNH−及び−(CH2)n
CO−(nは1から30の整数)から成る群から選ばれ
るリンキング置換基であり、OXはヒドロキシル、アル
キルエステル、アリールエステル、アルキルシリルオキ
シ及びアリールシリルオキシから成る群から選ばれ、X
は酵素以外の活性化剤によって1,2−ジオキセタンに
おいて除去され、 【化25】 がアダマンチルである)のアルケン化合物。 - 【請求項21】 Aが、アミン、チオール及びカルボン
酸置換基から成る群から選ばれる有機又は生物学的分子
中で置換基とカップルする請求項20の化合物。 - 【請求項22】 1,2−ジオキセタン化合物を製造す
るのに使用される次式: 【化27】 (式中、R1は、 【化28】 であり、nは1から30の整数であり、Aは有機又は生
物学的分子とカップルして分子上にラベルとしてジオキ
セタン化合物を与える置換基であり且つヒドロキシル、
カルボン酸、NH(CH2)mOH(mは2から20の
数)、スクシンイミドオキシ及びビオチン置換基から成
る群から選ばれ、OXはヒドロキシル、アルキルエステ
ル、アリールエステル、アルキルシリルオキシ及びアリ
ールシリルオキシから成る群から選ばれ、Xは酵素以外
の活性化剤によって1,2−ジオキシセタンにおいて除
去される)のアルケン化合物。 - 【請求項23】 Aがスクシンイミドオキシ及びビオチ
ン置換基から成る群から選ばれる請求項22のアルケン
化合物。 - 【請求項24】 Aがスクシンイミドオキシであり、
式: 【化31】 を有する請求項22のアルケン化合物。 - 【請求項25】 nが3であり、XがHであり、そして
式: 【化32】 を有する請求項24のアルケン化合物。 - 【請求項26】 nが3であり、OXがシリルオキシで
ある式: 【化33】 (式中、シリルオキシはtert−ブチルジメチルシリ
ルオキシ及びtert−ブチルジフェニルシリルオキシ
基から成る群から選ばれる)の請求項24のアルケン化
合物。 - 【請求項27】 nが2であり、 Aがビオチン置換基でありそして式: 【化35】 を有する請求項22のアルケン化合物。
- 【請求項28】 AがNH(CH2)mOHである請求
項22のアルケン。 - 【請求項29】 nが3であり、mが6であり、OXが
tert−ブチルジメチルシリルオキシ及びtert−
ブチルジフェニルシリルオキシから成る群から選ばれる
請求項28のアルケン。 - 【請求項30】 R1が(CH2)nであり(ここでn
は1から30の整数)であり、OXがヒドロキシ、te
rt−ブチルジメチルシリルオキシ及びtert−ブチ
ルジフェニルシリルオキシから選ばれる請求項20のア
ルケン。 - 【請求項31】 Aがカルボン酸及びヒドロキシル基か
ら成る群から選ばれる請求項30のアルケン。 - 【請求項32】 nが2である請求項31のアルケン。
- 【請求項33】 nが3である請求項31のアルケン。
- 【請求項34】 有機分子にカップルしたAを有する、
アッセイに使用される請求項1のジオキセタン。 - 【請求項35】 有機分子にカップルしたAを有する、
アッセイに使用される請求項2のジオキセタン。
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