KR940009534B1 - 유기분자와 생물학적 분자를 위한 화학발광성 표시체인 1,2-디옥세탄 화합물 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

유기분자와 생물학적 분자를 위한 화학발광성 표시체인 1, 2-디옥세탄 화합물
제 1 도는 수산화나트륨으로 제동된후 디옥세탄(1a)으로 표시한 소혈청(BSA) 알부민에 대한 농도 대 시간의 그래프를 보여준다.
제 2 도는 불화 테트라부틸암모늄(TBAF)로 제동된 후 DMSO에서 디옥세탄(1a)으로 표시한 BSA에 대한 농도 대 시간의 그래프를 보여준다.
제 3 도는 디옥세탄(1a)로 표시된 염소 항마우스 IgG를 크로마토 분리하고 비-표시된 성분을 분리한후 제동시키기 위한 TLC 실리카판에 주입하여 얻은 X-선 필름을 보여준다.
제 4 도는 제동될 항마우스 IgG가 들어있는 액체 크로마토그래피 분리된 물질에 노출된 X-선 필름을 보여주며 성분(20)에 정제된 표시 항마우스 IgG가 들어있다.
제 5 도는 나일론막 위에 있는 마우스 IgG의 상이한 농도에서 디옥세탄 표시 항마우스 IgG과 접촉하는 것을 보여주는 화학발광 웨스턴 도트 블롯을 나타낸다.
본 발명은 유기분자 및 생물학적 분자에 대한 결합능력을 갖추어서 분석등의 용도에 이용할 수 있는 제동성 있는 안정형 1, 2-디옥세탄에 관계한다. 특히 본 발명은 기본적인 기능성은 크게 변하지 않으면서 생물학적 물질과 반응할 수 있는 능력의 1, 2-디옥세탄에 관계한다.
(2) 선행기술
1. 안정화된 1, 2-디옥세탄의 화학적 제동.
화학발광성을 일으키는 화학적 및 효소공정에 의해 제어될 수 있는 열안정성 디옥세탄이 현재 발표되었다(A. P. Schaaap, patent application serial No. 887, 139, filed July 17, 1986 ; A. P. Schaap, R. S. Handley, and B. P. Girl, Tetrahedron Lett., 935(1987) ; A. P. Schaap, T. S. Chen, R. S. Handley, R. DeSilva, and B. P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155(1987) ; and A. P. Schaap, M. D. Sendison, and R. S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159(1987), 여러 가지 중요한 특징을 가진 디옥세탄을 생산하는 새로운 합성방법이 개발되었다 : (1) 스피로-용융 아다만틸기의 안정화 효과를 활용하여 실온에서 수년간의 "반감기"를 가진 디옥세탄을 제공하고 (2) 안정화된 디옥세탄의 화학발광 분해반응을 멈추게하는 새로운 방법이 개발되었다.
필요한 알켄류는 THF 속의 삼염화티타늄/LAH를 이용하여 아다만타논과 케톤의 방향족 에스테르의 반응에 따라 제조한다(A. P. Schaap, U. S. Patent No. 4, 857, 652). 이것은 케톤과 에스테르의 상호분자 축합반응으로 이 반응조건에서 비닐에테르를 형성하는 것이 그 첫번째 기록이다. McMurry는 초기에 케톤과 에스테르작용기, 고리형 케톤과의 분자내 반응을 연구하였으며 그럼에도 불구하고 비닐에테르는 이 방법으로 제조하지 않았다(J.E. McMurry and D.D. Miller, J.Amer.Chem.Soc., 105, 1660(1983) and J. E. McMurry, Chem. Rev., 89, 1513(1989)).
이 비닐에테르의 광산반응으로 디옥산을 제공하며 이것은 바람직한 열안정성을 갖춘 화합물이다. 예컨대 다음에서 보는 바와 같은 디옥세탄은 25℃에서 3 : 8년의 반감기와 또한 28.4kcal/mol의 활성화 에너지를 갖는다. 0-크실렌속의 디옥세탄 시료는 연구실에서 여러달동안 분해현상을 보이지 않는다.
그러나 이 디옥세탄의 화학발광 분해작용은 불화용 이온으로 실릴 보호기를 제거해서 짙은 청빛을 내면서 분할하는 불안정한 아릴산화물을 형성하여 실온에서 제동시키는 것이 편리하다. 산화아릴-치환 디옥세탄의 반김기는 25℃에서 5초이다. DMSO에서의 화학발광 스펙트럼은 에스테르 분해산물(methyl 3-히드록시벤조에이트)의 음이온의 형광성과 또한 이 조건하에서 소모된 디옥세탄의 형광성과 동일하게 470nm에서 최대치를 보여준다. 아다만타논형광에서 유도된 화학발광은 생기지 않는다. 루미놀 표준치에 대하여 측정된 불소-제동 분해반응에서의 화학발광량은 0.25로 나타났다(또는 화학발광 효율 25%). 이 조건하에서 에스테르의 형광량 보정은(øF=0.44) 만일 들뜬상태 에스테르의 57% 형성 효율을 하고 이것은 연구실에서 제조한 디옥세탄에 관한 기록에서 최대 단일 화학적 들뜬상태 효율에 해당한다.
2. 안정화된 1, 2-디옥세탄의 효소적 제동.
면역분석과 DNA 교잡같은 효소를 수반하는 생물학적 분석법은 색채를 형성하거나(염색유전형) 또는 효소반응중에 형광성으로 변하는(형광유전형) 광범위한 기질을 이용한다. 제동법 연구에서 화학발광 효소 기질 역할을 하는 제 1 디옥세탄이 발표되었다(A. P. Schaap, U. S. patent application Serial No. 887, 139 ; A. P. Schaap, R. S. Handley, and B. P. Giri, Tetrahedron Lett., 935(1987) ; A. P. Schaap, T. S. Chen. R. S. Handley, R. DeSilva, and B. P. Giri , Tetrahedron Lett., 1155(1987) ; A. P. Schaap, M. D. Sandison, and R. S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159(1987) and A. P. Schaap, Photochem. Photobiol., 47S, 50S(1988). 이 과산화물을 생물학적 시스템에 사용하려면 효소반응온도에서 열적 안정성이 있고 또한 수성완충액에서 신속히 자발적으로 분해되지 않는 디옥세탄이 필요하다. 앞의 소단락에서 언급한 스피로-용융 아다만틸 디옥세탄은 이러한 요구를 해결하여야 한다. 효소적 변형이 가능하여 산화아릴형을 만들 수 있는 디옥세탄을 제조한다. 이 불안정한 중간물의 분해에 따라 발광현상이 일어난다. 아릴 에스테르 가수분해 효소, 아세틸콜린 에스테르 가수분해 효소, 알칼리성 탈인산, 가수분해 효소와 베타-젖당 가수분해 효소등을 포함하는 각종 효소에 의해 제동될 수 있는 디옥세탄을 합성한다.
예컨대, 알칼리성 탈인산 가수분해 효소에 의한 효소적 제동작용은 상기와 같이 3-히드록시-9H-크산텐-9-온과 또한 아다만타논에서 유도된 인산-치환 디옥세탄에서 관측된다. 디옥세탄은 30.7kcal/mol의 활성화 에너지 및 25℃에서 12년의 반감기를 갖고 있는 열적으로 안정한 물질이다. 디옥세탄은 유기용매에서 안정할뿐 아니라 수성 완충액속에서 매우 천천히 자발적으로 분해한다. 제동실험은 소의 내장점막에서 나온 알칼리성 탈일산 가수분해 효소와 또한 0.75M 2-아미노-2-메틸-1-프로판을 완충액에 들어있는 pH10.3의 인산-보호 디옥세탄을 사용하여 실행한다. 총 빛 방출은 디옥세탄 농도에 따라 비례하는 것을 밝혀졌다. 방출 감소율은 효소농도에 따른 함수이지만 총 빛 방출량은 효소농도와는 무관하다. 탈인산 가수분해 효소-촉매화 분해현상의 화학발광 스펙트럼은 완충액속에서 또한 실온에서 얻는다. 소모된 반응 혼합물의 형광스펙트럼과 완충액속에 있는 히드록시-크산톤 분해산물의 형광스펙트럼에 대해 상기의 화학발광 스펙트럼을 비교한 결과 디옥세탄으로부터 인산기가 효소분할되어 불안정한 산화아릴 디옥세탄이 나오고 이것이 단일 들뜬상태의 히도록시크산톤 음이온을 형성함으로써 빛방출이 개시됨을 알수 있다.
탈인산 가수분해 효소 제동실험은 또한 메틸 3-히드록시 벤조에이트에서 유도된 상기의 인산-보호 디옥세탄과 아다만타논올 0.75M 2-아미노-2-메틸-1-프로판을 완충액속의 pH9.6의 알칼리성 탈인산 가수분해 효소와 함께 사용하여 실행한다. 10-4M 디옥세탄용액에 효소를 첨가하면 수분후 화학발광하여 빛이 방출한다. 완충액속에서 디옥세탄의 느린 가수분해에 의한 매우 낮은 발광현상 때문에 10-18몰(lattomol)의 알칼리성 탈인산 가수분해 효소는 강화제의 존재하에서 검출할 수 있다(A. P. Schaap, H. Akhavan and L. J. Romano, Clin. Chem., 35, 1863(1989) and A. P. Schaap, U. S. patent applications Serial Nos. 07/224, 681 and 07/317, 585).
3. 생물학적 분석을 위한 화학발광형 라벨.
(a) 루미놀과 이소루미놀, 아미노프랄히드라지드, 투미놀과 이소루미놀은 염기성 조건하에서 빛방출과 함께 H2O2및 페록시다제 효소촉매와 함께 반응한다. 반응은 또한 Fe(III), Cu(II) 또한 Cr(Ⅲ)을 포함한 소량의 여러금속이온에 의해 촉매반응화 한다. 라벨로서 루미놀을 사용하는 제 1 화학발광 면역분석 결과가 기록되었다(H. R. Schroeder, P. O. Vogelhut, R. J. Carrico, R. C. Boguslaski, R. T. Buckler, Anal. Chem. 48, 1933(1976). 라벨(표시체)인 루미놀 유도체의 여러 가지 이용방법도 공지되었다(H. R. Schroeder in Luminescent Immunoassays : Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry, M. Serio and M. Pazzagli, Eds., Raven Press, New York, pp 129-146(1982) ; M. Pazzagli, G. Messeri, A. L. Caldini, G. Monetti, G. Martinazzo and M. Serio. J. Steroid Biochem., 19,407(1983) ; Bioluminescence and Chemiluminescence New Perspectiver, J. Scholmerich, et al., Eds., J. Wiley ＆ Sons, Chichester(1987), 빛방출 강도를 증가시키기 위해 루미놀과 함께 각종 강화제도 함께 사용할 수 있다. 이중에는 D-투시페린(T. P. Whitehead, G. H. Thorpe, T. J. Carter, C. Groucutt and L. J. Kricka, Nature, 305, 158(1983)과 또한 p-이오도페놀(G. H. Thorpe, L. J. Kricka. S. B. Mosely and T. P. Whitehead Clin. Chem., 31, 1335(1985)).
(b) 아크리디늄과 페난트리디늄 에스테르, N-메틸 아크리디늄과 페난트리디늄 유기산의 방향족 에스테르를 H2O2및 염기와 함께 처리하여 화학발광 반응시킨다. 이 에스테르의 안정성을 고 pH값에서 현저히 감소한다. 다음과 같이 방향족 성분이 있는 곳에서 연결기 R의 첨가로 항원, 항체 또는 지지물에 대한 화학발광 표시체를 부착시킬 수 있다. 이 방법은 특허로 공지되었다(F. McCapra, D. E. Tutt, R. M. Topping, British, patent No. 1, 461, 877(1977) 또한 다음의 논문에서도 나와 있다(I. Weeks, I. Beheshti, F. McCapra, A. E. Campell, J. S. Woodhead, Clin. Chem., 29, 1474(1983) ; L. Weeks, A. K. Campbell, J. S. Woodhead, Clin. Chem., 29, 1480(1983)). 이 화합물은 시중에 나와있는 TSH 검출용 면역-분석기구(LumaTag ; London Diagnostics, Inc ; Eden Prairie, MN)와 유리티록신(Magic Lite System ; Ciba-Corning Diagnostics Corp ; Medfield, MA)에서 표시체로 사용된다. 이 기술은 또한 DNA 검출자를 표시하는데 사용하기도 한다(L. J. Arnold, Jr., P. W. Hammond, W. A. Wiese, N. C. Nelson, Clin. Che., 35, 1588(1989)).
(c) 열화학 발광 검출용 아다만틸리덴 아다만단 디옥세탄, 아다만릴리멘아다만란 디옥세탄 유도체를 Wynberg가 항체 및 단백질 직접 표시를 위해 제조하였다(J. C. Hummelen, T. M. Luider, H. Wynberg, pure Appl. Chem., 59, 639(1987) ; J. C. Hummelen, T. M. Luider, H. Wynberg, "Thermochemiluminescent Immunoassays", in Complementary Immunoassays, W. P. Collins, Ed., Wiley and Sone, New York, p, 191(1988) ; H. Wynberg, E. W. Meijer, J. C. Hummelen, "1, 2-Dioxetanes as Chemiluminescent Probes and Labels" in Bioluminescence and Chemiluminescence, M. A. DeLuca, W. D. McEiroy, Eds., Academic Press, New York, p. 687(1981)). 화학발광 현상의 탐지에는 표시된 분석물을 플라스틱 원판위에서 움직이지 않도록 하고 250 내지 300℃로 가열할 필요가 있다. 이 높은 온도는 수용액에서 실행할 균일한 면역분석 시스템 개발에 부적절하다. 아다만틸리덴아다만탄 디옥세탄의 열리(thermolysis) 작용으로 얻은 화학반응의 양이 낮기 때문에(øCL=10-4) 고도의 형광수체에 대한 에너지 전달기술을 사용하여 검출감도를 높여야 한다. 이것은 분석물이나 제 1 표시체에 화학적으로 부착될 제 2 표시체인 형광물을 필요로 한다(J. C. Hummelen, T. M. Luider, H. Wynberg, Methods in Enzymology, 133, 531(1986)). 단백질에 디옥세탄을 화학증로 결합시키는데 사용한 반응 R그룹은 다음과 같은 것이 있다.
4. 표시방법
유기분자 및 생물학적 분자에 화학적으로 결합하는 표시체를 위한 다양한 방법이 문헌상에 기술되어 있다(참조 : L. J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 15-51 and M. Z. Atassi, "Chemical Modification and Cleavage of Proteins," Chapter lin Tmmunochemistry of Proteins, Vol. 1, Plenum Press, New York, 1977, pp. 1-161). 항체와 단백질은 표 1에서 보는 바와 같이 화학적 반응기가 있는 표시체 함께 단백질(-SH, -OH, -NH2, -COOH)에 들어있는 친핵성기의 반응에 의하여 표시되는 것이 바람직하다. 아민이나, 티올-함유 헥산을 합성하고 이 분자들을 이에 상응하는 반응기와 함께 디옥세탄상에서 반응시켜 이상적으로 기능화된 헥산 및 DNA 검출자를 표시할 수 있다. 별도로, 헥산(초기 올리고뉴클레오티드)은 히드록실과 활성 포스포라미드산염의 반응으로 디옥세탄에 결합시킬 수 있다. 이 경우 포스포라이드산염을 헥산위에 놓고 히드록실은 디옥세탄 위에 위치하며 그반대의 경우도 있다. 표시될 수 있는 다른종류의 분자로서 효소, 단백질항원, 합텐, 스테로이드, 탄수화물, 지방산, 프로스타글란딘, 트롬복산, 튜코트리엔, 뉴클레오시드와 뉴클레이티드등이 포함된다.
[표 1] 유기분자와 생물학적 분자에 대한 표시체의 화학적 결합을 위한 반응그룹
1) 아민(-NH2)과 반응하는 그룹
2) 티올(-SH)과 반응하는 그룹
3) 카르복실산(-CO2H)과 반응하는 그룹
-NH2-OH-NHNH2
이 작용성 결합시약을 사용하여 유기분자의 또한 반응기를 갖춘 생물학적 분자에 대해 표시체를 결합시킬 수도 있다(참조, L. J. Kricka, Ligand-Binder Assays, Marcel Dekker, Inc., New York, 1985, pp. 18-20, Table 2.2 and T. H. Ji. "Bifunctional Reagents," Methods in Enzymology, 91, 580-609(1983)).
두종류의 이작용성 시약이 있으며 하나는 최종구조에 삽입된 것과 또다른 하나는 삽입되지 않고 투시약을 결합시키는데 도움을 주는 것이다. 형광물을 사용하여 항-형광물과 함께 결합한 복합물을 형성할 수도 있다. 또한 소라렌을 사용하여 DNA에 이중결합할 수 있다.
문제의 분자에 화학반응 디옥세탄을 물리적으로 결합시키거나 복합물 형성하는 것은 다음에서 보는 바와 같이 표시체를 비오틴분자(비타민A)에 화학결합시키고 또한 문제의 유기분자나 생물학적 분자를 아비딘이나 스트렙타비딘에 화학결합시켜서 달성할 수 있다. 아래의 두 화합물은 비오틴에 대한 고-친화성 결합부위 4개가 있는 박테리아성 단백질이다(R. M. Buckland, Nature, 320, 557-558(1986) 참조).
표시된 비오틴이나 아비딘 또는 스트렙타비딘을 통한 유기분자 또는 생물학적 분자(항원)의 검출
Ag, 항원 ; Ab, 항체 ; B, 비오틴 ; SA, 스트렙타비딘 ; L, 표시체
따라서 본 발명의 목적은 유기물질과 생물학적 물질 또한 그 화합물을 검출하는 방법과 이에 이용할 화학발광성 제동형 1, 2-디옥세탄을 제공하는 것이다. 더우기, 본 발명의 한목적은 면역 분선과 DNA 교잡분석에 사용할 수 있는 화학발광성 제동형 1, 2-디옥세탄과 그 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 다음의 일반식으로 표현되는 디옥세탄 화합물에 관한 것이다.
예컨대, Ar은 페닐과 나트틸기중에서 선택한 방향족 치환물이고, A는 유기분자나 생물학적 분자와 화학적으로 결합하는 치환물과 또한 유생분자와 물리적으로 결합하는 치환물중에서 선택한 것으로서 분자상에서 표시체로 디옥세탄 화합물을 제공하고, R은 산소, 질소, 황과 또한 탄소원자 대신 치환된 인중에서 선택한 헤테로원자와 또한 1 내지 30탄소원자가 함유된 결합 치환물이고, S는 활성화 작용제에 의한 분리되어 디옥세탄에 의해 빛이 발생하도록하는 화학적으로 불안정한 치환물이고 또한 R2C-는 6 내지 30탄소원자가 들어있는 다중고리 알켄 치환물이다.
본 발명은 또한 상기의 1, 2-디옥세탄 화합물을 제조할 때 사용한 다음 일반식의 알켄 화합물에 관계한다 :
A는 유기분자나 생물학적 분자와 화학적으로 결합하는 치환물과 또한 유생분자와 물리적으로 결합하는 치환물중에서 선택한 치환물로서 분자상에 표시체인 디옥세탄을 공급하고, R1은 산소, 질소, 황 또한 탄소원자 대신 치환된 인중에서 선택한 헤테로원자와 또한 1 내지 30탄소원자가 함유된 결합치환물이고, X는 활성화 작용제에 의해 분리되어 알켄화합물로부터 생성된 1, 2-디옥세탄에 의해 빛이 발생하도록하는 화학적으로 불안정한 치환물이고 또한 R2C-는 6 내지 30탄소원자가 들어있는 다중고리 알켄치환물이다.
R2C는 치환물은 바람직하게는 아다만틸이다. 6 내지 30탄소원자가 들어있는 다중고리 알켄화합물을 사용할 수 있다.
R1치환물은 다음의 것이 바람직하다.
여기서 n은 1 내지 30의 정수이다. 또는 다음의 것이 바람직하다.
여기서 n은 30의 정수이다. 또는 -(CH2)n이 바람직하다. 여기서 n은 1 내지 30의 정수이다.
Ar은 페닐과 나프틸기중에서 선택하며 패널이 바람직하다.
A는 n-히드록시숙신이미드기, 카르복시기, 히드록시기, 비오틴 또한 항체가 분자와 결합하거나 반응하여 항체, 말레이미드, 아민류에 대한 표시체를 제공하는 항체 반응분자등이 바람직하다. 화학적인 반응기나 결합기는 A와 유사한 작용을 한다. A가 비오틴이면 다음으로 표시되는 분자가 바람직하다.
여기서 m은 2 내지 30의 정수이다.
본 발명은 화학결합에 의해 또한 어떤 경우 물리적 상호작용을 통해 유기분자의 생물학적 분자에 결합될 수 있는 화학적으로 제동가능하고 안정한 1, 2-디옥세탄을 포함한다. 활성제로 X기를 분리하면 자발적으로 분해하여 빛을 생성할 불안정한 산화아릴 디옥세탄이 형성된다. 그 결과로 생기는 화학발광의 강도 때문에 표시된 유기 또는 생물학적 분자의 양을 직접 측정할 수 있다. 디옥세탄 표시체의 여러예가 특수반응에 A와 이탈기 X와 함께 보기에 나와있다. 각종기 R1은 디옥세탄에 부착된 산소원자가 반응기 A사이에서 연결가지 역할을 한다.
여기서 R1은 탄소의 또한 1 내지 30원자의 사슬길이로된 산소, 질소, 황 및 인 같은 헤테로원자로 구성된다. 특히 탄소와 헤테로원자가 들어있는 고리는 연결가지 일부로 사용할 수 있다. 그렇지 않으면, A를 연결가지 없이 산소원자에 직접 결합시킬 수 있다. 반응성 있는 A로서 N-히드록시숙신이미드, 말레이미드, 이오도아세테이트, 포스포라미디트, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 히드록실, 설프히드릴, 아미노, 카르복실등이 있고 표 1에 나타난 바와 같다. X기로서 반응기A와 유기 또는 생물학적 분자의 결합과 정중에 안정한 화학적 이탈기가 있다. X기를 적절한 활성제로 지지할 표시된 분자의 후속처리로 화학발광을 일으킨다. 본 발명의 실시예 및 특허출원 제 887,139 호(1986년 7월 17일)에서 화학적으로 또한 효소적으로 분리가능한 정규의 X기를 보여준다. 상응하는 X-옥시기로서 제한적인 것은 아니지만 히드록실, 알킬 또는 아릴, 카르복실 에스테르, 무기옥시산염, 알킬 또는 아릴, 실릴옥시 및 산소-피라노시드등이 있다. 또다른 X기로서 분리되어 화학발광성을 제동할 수 있는 보호기에 관한 논문상에 공지되었다(T. W. Greene, Protective Groupe in Organic Synthesis, John Wiley, New York, 198, pp 10-72)(1981)). 이러한 기는 Si(CH3)2tBu, SiPh2tBu, CH2OCH2CH2Si(CH3)3,CU2CH2Si(CH3)3과 SiCH2(CH3)2i-Pr등이다. 덧붙여서, 나프틸같은 다른 아릴기를 메타-페닐기 대신 사용할 수 있음에 유의한다. 나프틸기가 있는 -ArOX의 예를 들면 다음과 같다.
1, 2-디옥세탄 화합물 합성
기술한 방법을 사용하여 상응한 알켄의 광산화반응에 따라 디옥세탄을 제조한다. 별도로, 디옥세탄의 한 반응기 A는 디옥세탄 1에서 디옥세탄 2으로의 전환에서처럼 화학반응에 의해 또다른 기 A로 교환할 수 있다. 디옥세탄(3a-c)은 알켄 14, 17 및 20의 광산화반응에 따라 제조할 수 있다.
합성 디옥세탄
[방법]
별도의 규정이 없는한 내부기준에 따라 테트라메틸실란이 있는 CDCl3의 용액으로써 General Electric QE300 분광계상에서 핵자기공명(NMR) 스펙트럼을 얻는다. 질량 스펙트럼은 Eratos MS-80TM이나 AET MS-90T분광계에서 얻는다. 무게량은 Metter AE 163TM분석용 천칭(거울)에서 측정한다. 선반 또는 연구소 부설장치를 이용하여 화학 발광성을 측정하고 이것을 에플 메킨토쉬TM컴퓨터에 입력시킨다.
[재료]
각종 시판원료에서 염은 용매와 시약중 최고급품의 것을 사용하고 별도의 지시가 없으면 정제작업없이 사용한다. 나트륨 또는 칼슘 수화물로부터 증류하여 용매를 건조시킨다.
[알켄합성]
2-클로로에틸 3-히드록시벤조에이트
2-클로로에탄올(70ml, 1.0몰)에 들어있는 3-히드록시벤조산(15.0g, 0.11몰) 용액과 1ml 농축황산을 하룻밤동안 재환류시킨다. TLC분석(실리카겔/20% 에틸아세테이트/헥산) 결과 신물질로 전환되었음을 알 수 있다. 과잉의 클로로에탄올은 증발분리하여 갈색용액을 수득하고 에틸아세테이트에 이것을 용해하고 물로 세척한다. MgSO4로 유기층을 건조 및 농축하여 백색고체인 21.0g의 생성물을 수득한다 : mp 50℃ ;
1H NMR(CDCl3)δ : 3.81(t, 2H, J=5.9Hz), 4.57(t, 2H, J=5.9Hz), 4.77(s, 1H), 7.06-7.66(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 41, 52, 64.75, 116.43, 120.77, 121.98, 129.80, 130.71, 156.04, 166.57 ;
MS m/e(상대강도) : 200(26), 138(59), 121(100), 93(31), 65(21), 39(12) ;
MS 질량 ;
계산치 : 200.0240
실측치 : 200.0242
2-클로로에틸 3-(tert-부틸디메틸실릴옥시)벤조에이트
5ml건조 DMF 이미다졸(92.7g, 0.04몰)속에 들어있는 tert-염화 부틸디메틸실릴(4.5g, 0.029몰)과 2-클로로에틸 3-히드록시 벤조에이트용액(4.0g, 0.02몰)을 점차로 혼합한다. 그후 하룻밤동안 용액을 교반한다. TLC분석(실리카켈, 20% 에틸아세테이트/헥산) 결과 신물질로 전환되었음을 알 수 있다. 용액을 25ml 물속에 붓고 에테르로 추출한다(3×25ml). 혼합된 에테르용액을 무수 MgSO4로 건조한다. 용매 증발결과 오일이 생기며 이것을 에틸아세테이트/헥산, (10 : 90)을 사용하여 실리카상에서 크로마토그래피 분리하면 무색의 액체로서 생성물이 얻어진다 ;
1H NMR(CDCl3)δ : 0.218(s, 6H), 0.994(s, 9H), 3.81(t, 2H, J=5.7Hz), 4.56(t, 2H, J=5.7Hz), 7.05-7.65(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : -4.97, 17.66, 25.12, 41.06, 63.91, 120.61, 122.19, 124.60, 128.95, 130.53, 155.31, 165.35 ;
MS m/e(상대강도) ; 314(14), 257(9), 235(9), 213(100), 185(6), 149(7), 135(10), 120(6), 93(13), 83(6), 69(9), 55(9) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 314.1104
실측치 ; 314.1110
[(3-tert-(부틸디메틸실릴옥시페닐)(2-클로로에톡시)메틸렌]아다만탄(7).
환류응축기가 구비된 100ml 3-목 플라스크를 고온 공기층과 질소 정화법으로 건조한다. 여기에 건조 THF 200ml를 충전하고 얼음-용기속에서 냉각시킨다. 3염화티타늄(24.5g, 1.16몰)과 다시 수화 알루미늄리툼(3.0g, 0.08몰)을 소량씩 교반하면서 첨가한다. 냉각용기를 제거하고 흑액혼합물을 실온까지 가온한다. 트리에틸아민(15ml)을 점적 첨가하고 그 반응혼합물을 1시간동안 환류시킨다. 2-클로로에틸 3-(tert-부틸디메틸실릴옥시) 벤조에이트(5.0g, 0.015몰)와 아다만톤(7.1g, 0.05몰) 용액을 환류혼합물에 대해 1시간동안 점적 첨가한다. 1시간동안의 환류후 TLC분석(에틸아세테이트/헥산, 10 : 90)결과 신물질로 전환되었음을 보여주었다. 반응 혼합물을 냉각하고 헥산으로 추출한다. 용매증발후 (에틸아세테이트/헥산, 3 : 97)를 사용하여 원료를 크로마토그래피 분리하면 백색오일형의 5.0g(74%) 알켄(7)이 나온다 :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.194(s, 6H), 0.962(s, 9H), 1.78-1.96(m, 12H), 2.65(bs, 1H), 3.34(bs, 1H), 3.55(t, 2H, J=5.7Hz), 3.66(t, 2H, J=6.7Hz), 6.85-7.29(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : -4.46, 18.21, 25.66, 28.28, 30.20, 32.39, 38.94, 39.20, 42.61, 68.95, 119.62, 121.04, 122.50, 129.09, 132.78, 136.40, 141.11, 155.49 ;
MS m/e(상대강도) ; 432(100), 321(22), 235(13), 199(10), 151(19), 105(17), 73(44), 57(14) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 432.2251
실측치 ; 432.2247
[(2-클로로에톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄(8).
5ml THF속에 있는, 상기와 같은 tert-부틸디메틸실릴 보호-알켄(7) 교반용액에 대해 불화 테트라부틸 암모늄 트리히드레이트를(THAF, 1.4g, 0.004몰) 첨가한다. 그 결과로 나온 용액을 10분간 교반한다. TLC 분석결과(에틸아세테이트/헥산, 20 : 80) 신물질로의 전환을 보여주다. 용매증발후 원료 생성물을 물로 세척하고 다시 에테르로 세척한다. 유기층은 MgSO4로 건조하고 증발 건조시킨다. 오일형 물질을(에틸아세테이트/헥산, 20 : 80)으로 실리카겔 상에서 크로마토그래피 분리하여 1.3g(100%)의 알켄(8)을 수득한다 ;
1H NMR(CDCl3)δ : 1.81-1.96(m, 12H), 2.67(bs, 1H), 3.34(bs, 1H), 3.55(t, 2H, J=5.6Hz), 3.69(t, 2H, J=5.6Hz), 6.77-7.19(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 28.21, 30.24, 32.35, 37.08, 38.92, 39.19, 42.55, 69.05, 114.76, 116.06, 121.92, 129.31, 133.41, 136.62, 140.77, 155.64 ;
MS m/e(상대강도) ; 318(100), 227(19), 213(24), 121(92), 407(29), 93(37), 69(21), 55(36), 41(40) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 318.1386
실측치 ; 318.1383
[3-(히드록시페닐)(2-이오드에톡시)메틸렌아다만탄(9).
요오드화 나트륨(14.0g, 0.09몰)과 [(2-클로로에톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄(8)을 건조 아세톤에 용해하고 6일간 환류시킨다. 반응후 TLC분석(에틸 아세테이트/헥산, 10 : 90)하고 다시 반응완료후 용매를 증발시켜서 백색고체를 수득한다. 이 고체를 염화메틸렌으로 여러번 세척하고 혼합된 유기층은 다시 물로 세척한다. 유기층을 MaSO4로 건조시켜서 농축하면 오일형 물질인 3.8g(100%)의 알켄(9)을 얻게된다 :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.78-1.97(m, 12H), 2.64(b, 1H), 3.19(t, 2H, J=7.1Hz), 3.35(bs, 1H), 3.69(t, 2H, J=7.1Hz), 6.75-7.21(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 2.40, 28.13, 30.41, 32.33, 36.99, 38.86, 39.09, 69.74, 114.86, 116.00, 121.79, 129.28, 133.37, 136.42, 140.51, 455.66 ;
MS m/e(상대강도) ; 410(42), 256(19), 227(75), 155(18), 121(100), 107(32), 93(28), 79(14), 65(16) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 410.0744
실측치 ; 410.0744
[(2-아미노에톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다판탄(10).
극소량의 THF속에 있는 알켄(9)(3.0g, 0.01몰) 용액을 드라이아이스속에 놓아둔 밀봉관속에 있는 10ml 액체 암모니아에 첨가한다. 관을 밀봉한 후에 40℃에서 17시간동안 오일용기속에 넣어 가열한다. 반응혼합물을 냉각하고 용매 증발시킨 후 백색고체를 수득한다. 이 물질을 염화메틸렌으로 추출한다. 혼합된 유기층을 물로 세척하고 MgSO4로 건조한후 농축시키면 백색고체인 2.0g(90%)의 알켄(10)이 나온다 : mp 55℃ ;
1H NMR(CDCl3)δ : 1.77-1.96(m, 12H), 2.68(bs, 1H), 2.85(t, 2H, J=4.8Hz), 3.23(bs, 1H), 3.48(t, 2H, J=4.8Hz), 4.46(bs, 2H), 6.70-7.17(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 28.16, 30.28, 36.99, 38.88, 39.04, 41.33, 70.46, 114.97, 116.17, 120.63, 129.02, 131.89, 136.69, 141.79, 156.86 ;
MS m/e(상대강도) ; 299(10), 256(100), 239(5), 199(6), 135(12), 121(27), 93(12), 77(5) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 299.1885
실측치 ; 299.1891
3-클로로프로필 3-히드록시벤조에이트
3-클로로프로판올(76g, 0.81몰)속에 있는 3-히드록시벤조산용액(16.0g, 0.115몰)과 0.5ml 농축황산을 하룻밤동안 환류한다. 과잉 알코올을 감압증류로 제거한다. 갈색의 점성 잔유물을 에틸아세테이트(60ml)에 용해시키고 물로(2×15ml) 세척한다. 유기층은 무수 황산나트륨으로 건조 시키고 여과후 감압하에 농축한다. 갈색 점성 잔유물은 컬럼 크로마토그래피법으로(에틸아세테이트/헥산, 30 : 70) 정제하여 백색고체인 생성물을 수득한다(23.3g, 0.108몰, 93.7%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 2.19-2.28(m, 2H), 3.69(t, 2H, J=6.3Hz), 4.48(t, 2H, J=6Hz), 5.92(s, 1H), 7.05-7.64(m, 4H) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 214.0396
실측치 ; 214.0400
3-클로로프로필 3-(tert-부틸디메틸실릴옥시)벤조에이트.
무수 IMF(10ml)속에 있는 염화 tert-부틸디메틸실릴(TBDMS=C1, 10.00g, 0.067몰)과 3-클로로프로필 3-히드록시벤조에이트(12.0g, 0.055몰)용액에 이미다졸(7.61g, 0.11몰)을 첨가한다. 반응 혼합물을 1시간동안 교반한후 물로 희석하고(50ml) 헥산으로 추출한다(4×20ml). 헥산층을 물로 세척하고(2×10ml) 무수황산 나트륨으로 건조하고 다시 감압하에 농축하여 원하는 화합물을 얻는다(16.64g, 0.0506몰, 90%).
1H NMR(CDCl3)δ : 0.216(s, 6H), 0.994(s, 9H), 2.19-2.27(m, 2H), 3.69(t, 2H, J=6.3Hz), 4.46(t, 2H, J=6.3Hz), 7.01-7.64(m, 4H) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 328.1264
실측치 ; 328.1257
[3-tert-부틸디메틸실릴옥시페닐)(3-클로로프로폭시)메틸렌]아다만탄(11).
환류응축기가 구비된 1리터 3-목 플라스크를 고온공기층으로 건조시키고 아르곤 기체로 정화한다. 무수 THF(200ml)를 얼음-용기에 첨가하고 냉각시킨다. 3염화티타늄(33.32g, 0.216몰)을 교반하면서 첨가한다. 수화알루미늄 리튬(4.1g, 0.108몰)을 강하게 교반하면서 소량 첨가한다. 냉각용 용기를 제거하고 반응 혼합물을 실온으로 가온한다. 트리에틸아민(20ml)을 점적 첨가하고 반응 혼합물을 1시간동안 환류한다. 3-클로로프로필 3-tert-부틸디메틸실옥시벤조에이트(6.0g, 0.016몰) 용액과 또한 무수 THF속의 아다만콘(8.22g, 0.054몰)을 1시간동안 환류 혼합물에 점적 첨가한다. 반응혼합물을 1시간동안 환류하고 실온으로 냉각한다. 헥산(500ml)을 첨가하고 0.5시간동안 교반한 후 용액을 여과하고 감압농축시킨다. 청황색 잔유물을 크로마토그래피 분리하면(에틸아세테이트/헥산, 3 : 97) 점성오일은 알켄(11)이 나온다(4.7g, 0.010몰, 58.45%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.19(s, 6H), 0.98(s, 9H), 1.76-2.01(m, 14H), 2.62(bs, 1H), 3.22(bs, 1H), 3.52(t, 2H, J=5.7Hz), 3.63(t, 2H, J=6.6Hz), 6.74-7.20(m, 4H) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 446.2407
실측치 ; 446.2414
[(3-클로로프로톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄(12).
무수 THF(15ml)내의 알켄(11)(0.5g, 1m몰) 교반용액내 TBAF(0.32g, 1.2m몰, 1.22ml의 1M용액)을 첨가하고 그 반응혼합물을 실온에서 0.5시간동안 교반한다. 용매를 감압하에서 제거하고 그 잔유물을 헥산(20ml)에 용해한다. 용액을 물로 세척하고(10ml) 유기층은 무수 황산나트륨으로 건조시켜서 여과하고 감압하에서 농축한다. 청황색 오일은 TLC(에틸아세테이트/헥산, 20 : 80)에 의해 정제되어 순수 화합물(12)를 제공한다(0.34g, 1m몰, 92%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.5-2.03(m, 14H), 2.65(bs, 1H), 3.22(bs, 1H), 3.54(t, 2H, J=6Hz), 3.63(t, 2H, J=6.6Hz), 5.45(s, 1H), 6.78-7.26(m, 4H) ;
MS 질량 ;
계산치 ; 322.1542
실측치 ; 332.1540
[(2-시아노프로톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄(13).
시안화나트륨(9mg, 0.19m몰)을 무수 DMSO(2ml)에 용해하고 용액을 90℃로 가열한다. 알켄(12)(0.026g, 0.078ml)을 상기의 용액에 첨가하고 반응혼합물은 90℃에서 0.75시간동안 교반한다. 물(15ml)를 첨가하고 에테르로 추출한다(3×10ml). 에테르층을 물로(10ml) 씻고 무수황산나트륨으로 건조한후 여과하고 다시 감압 농축한다. TLC(에틸아세테이트/헥산, 20 : 80)로 정제하면 수순한 니트릴(13)(0.021g, 0.065mmol, 84%)를 얻게된다 :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.6-2.03(m, 14H), 2.48(t, 2H, J=7Hz), 2.64(bs, 1H), 3.18(bs, 1H), 3.49(t, 2H, J=6Hz), 4.99(s, 1H), 6.78-7.26(m, 4H) ;
IR(CHCL3)cm-1: 3660-3600, 3000, 2910, 2840, 2290, 1420, 1200, 1100 :
MS 정량 ;
계산치 ; 323.18852
실측치 ; 323.1882
[(3-카르복시프로톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄(14).
수산화나트륨(2ml의 2N용액)은 니트롤(13)(0.018g, 0.55mmol)에 첨가하고 반응혼합물은 1시간동안 환류한다. 용액을 실온으로 냉각하고 물로 희석한다(5ml). 수성액에 희석산(10ml)으로 세척하고 백색의 혼탁액을 즉시 에틸아세티이트(2×15ml)로 추출한다. 유기층은 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과한후 감압 농축한다. 원료잔유물은 TLC(에틸아세테이트/헥산 30 : 70)으로 정제하고 정제산(14)을 얻는다(0.012g, 0.035mmol, 63%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.6-2.03(m, 16H), 2.44(t, 2H, J=7Hz), 2.65(bs, 1H), 3.21(bs, 1H), 3.48(t, 2H, J=6Hz), 6.1-7.41(m, 5H) ;
MS 정량 ;
계산치 ; 342.1831
실측치 ; 342.1836
[(3-카르복시프로톡시)(3-히드록시페닐)메틸렌]아다만탄 N-히드록시숙신이미드 에스테르 15.
카르복시산(14)(0.008g, 0.02mmol)을 무수디옥산(1ml)에 용해시켰다. 디시클로헥실카르보디이미드(DCC, 0.0072g, 0.035mmol)와 N-히드록시숙신이미드(0.004g, 0.035mmol)을 상기 용액에 첨가하고 상온에서 아르곤 기체 존재하에 12시간동안 교반한다. 백색 침전물을 여과하고 용액은 감압 농축시킨다. 잔여물은 TLC(메탄올/디클로로메탄, 2 : 98)로 정제하여 순수한 생성물(15)을 제공한다(0.009g, 0.02mmol, 88%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.71-2.05(m, 14H), 2.68(bs, 1H), 2.78(t, 2H, J=7Hz), 2.86(bs, 4H), 3.21(bs, 1H), 3.47(t, 2H, J=6Hz), 5.90(bs, 1H), 6.78-7.26(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 24.56, 25.47, 27.44, 28.14, 30.23, 32.15, 37.00, 38.83, 39.04, 66.90, 67.23, 90.64, 114.52, 115.72, 121.34, 128.97, 132.07, 136.75, 141.54, 155.98, 168.41, 169.54 ;
MS 정량 ;
계산치 ; 439.1994
실측치 ; 439.1988
알켄 16.
이미다졸(0.015g, 0.22mmol)과 TBDMS 염화물(0.033g, 0.022mmol)을 무수 DMF(2ml)에 용해된 알켄(14) 용액에(0.025g, 0.07mmol) 첨가하고 실온에서 2시간동안 교반한다. 반응혼합물은 물(10ml)에 희석하고 에틸아세테이트(2×12ml)로 추출한다. 유기층은 물로(7ml) 세척하고 무수황산 나트륨으로 건조하고, 여과후 다시 감압 농축시킨다. TLC로 잔여물을 정제하면 분해된다. 따라서 원료생성물(16)을 다음단계에 직접 사용할 수 있다.
[(3-tert-부틸디메틸실릴옥시페닐)(3-카르복시프로폭시)메틸렌]아다만란(17).
비스-실릴옥시알켄(16)(0.039g, 0.068mmol)을 메탄올(5ml)에 용해시키고 H2O(2ml)에 용해된 K2CO3(2eq)를 첨가한다. 반응혼합물을 실온에서 10분간 교반한다(TLC 분석결과 출발물질의 흔적이 없다). 용액을 희석산(7ml)으로 식힌후 에틸아세테이트(2×10ml)으로 추출한다. 유기층은 H2O(5ml)에 세척하고 무수황산나트륨으로 건조시킨 후 여과하고 다시 감압농축하여 생성물(17)을 수득한다(0.025g, 0.043mmol, 83%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.19(s, 6H), 0.98(s, 9H), 1.77-1.97(m, 14H), 2.45(t, 2H, J=7.5Hz), 2.62(bs, 1H), 3.22(bs, 1H), 3.42(t, 2H, J=6.0Hz), 6.74-7.21(m, 4H) ;
MS 정량 ;
계산치 ; 456.2695
실측치 ; 456.2692
[(3-t-부틸디메틸실릴옥시페닐)(3-카르복시프로폭시)메틸렌]아다만란 N-히드록시숙신이미드 에스테르 18.
카르복시산(17)(0.025g, 0.056mmol)을 무수디옥산(1ml)에 용해한다. DCC(0.023g, 0.11mmol)과 N-히드록시숙신이미드(0.013g, 0.11mmol)을 상기 용액에 첨가하고 실온에서 아르곤 기체하에 8시간동안 교반한다. 백색침전물을 여과하고 그 용액은 TLC(에틸아세테이트/헥산, 40 : 60)으로 정제하여 알켄(18)을 제공한다(0.028g, 0.050mmol, 90%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.18(s, 6H), 0.97(s, 9H), 1.76-1.95(m, 14H), 2.61(bs, 1H), 2.72(t, 2H, J=7.8Hz), 2.82(bs, 4H), 3.21(bs, 1H), 3.45(t, 2H, J=5.7Hz), 6.74-7.26(m, 4H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 24.89, 25.55, 25.65, 27.94, 28.28, 30.27, 32.30, 33.90, 37.14, 38.92, 39.16, 49.17, 67.42, 104.93, 119.41, 121.02, 122.43, 123.84, 129.03, 131.91, 136.83, 141.66, 155.35, 168.47, 160.04.
알켄 19.
이미다졸(0.053g, 0.00078몰)과 염화 t-부틸디페닐실릴(0.216g, 0.00078몰)을 무수 DMF(2ml)에 용해된 산(14)(0.090g, 0.00026몰)용액에 첨가하고 실온에서 2시간동안 교반한다. 반응혼합물을 물(6ml)에 희석하고 에틸아세테이트로 추출한다(3×10ml). 유기층은 물로 세척하고(7ml) 무수황산 나트륨으로 건조한후 여과하고 감압농축한다. TLC로 잔여물을 정제하면 분해된다. 따라서 원료생성물(19)을 다음단계에서 직접 사용한다.
[(3-tert-부틸디페닐실릴옥시페닐)(3-카르복시-프로폭시)메틸렌]아다만란(20).
비스-실릴옥시 알칸(19)(0.215g, 0.00026몰)을 메탄올(5ml)에 용해하고 H2O(2ml)에 용해된 K2CO3(2eq)를 첨가한다. 반응혼합물을 실온에서 20분동안 교반한다(TLC결과 출발물질의 흔적이 없다). 용액을 희석산(7ml)으로 식히고 에틸아세테이트(2×20ml)로 추출한다. 유기층은 H2O(7ml)로 세척하고, 무수황산나트륨으로 건조하고, 여과 및 감압 농축하여 생성물(20)을 제공한다(0.12g, 0.0002몰, 80%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.10(s, 9H), 1.49-1.88(m, 14H), 2.31(bs, 1H), 2.34(d, 2H), 3.10(bs, 1H), 3.18(t, 2H, J=6Hz), 6.60-7.71(m, 14H), 10.5(bs, 1H)) ;
MS 정량 ;
계산치 ; 580.3008
실측치 ; 580.3012
[(3-tert-부틸디페닐실릴옥시페닐)(3-카르복시프로폭시)메틸렌]아다만란 N-히드록시숙신이미드 에스테르(21).
카르복시산(20)(0.070g, 0.00012몰)을 무수디옥산(4ml)에 용해하고 여기에 DCC(0.075g, 0.0036몰)과 N-히도록시숙신이미드(0.041g, 0.0036몰)을 첨가하고 실온에서 12시간동안 아르곤기체하에서 교반한다. 백색 침전물을 여과하고 용액을 감압농축시킨다. 잔여물을 TLC(에탄올/디클로메탄, 3 : 97)로 정제하여 생성물(21)을 정제한다(0.071g, 0.00010몰, 88%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.10(s, 9H), 1.50-1.95(m, 14H), 2.36(bs, 1H), 2.58(t, 2H, J=7.2Hz), 2.82(bs, 4H), 3.09(bs, 1H), 3.19(t, 2H, J=6Hz), 6.58-7.71(m, 14H) ;
13C NMR(CDCl3)δ : 19.36, 24.69, 24.90, 25.53, 26.43, 27.83, 28.16, 30.10, 32.07, 33.91, 37.07, 38.79, 38.93, 67.15, 119.02, 120.85, 122.13, 127.69, 128.90, 129.84, 131.63, 132.77, 135.52, 136.39, 141.37, 155.24, 168.45, 169.03 ;
MS 정량 ;
계산치 ; 677.8339
실측치 ; M-239
tert-부틸디페닐실옥시 3-(tert-부틸디페닐-실옥시)벤조에이드(22).
이미다졸(1.23g, 0.18몰)과 DPTBS 염화물(4.97g, 0.018몰)을 무수 DMF(10)에 용해된 m-히드록시벤조산 용액에 첨가하고 실온에서 4시간동안 교반한다. 반응혼합물을 물로 희석(10ml)하고 에틸아세테이트(2×15ml)로 추출한다. 유기층은 물로(10ml) 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 여과하고 다시 감압 농축시킨다. 크로마토그래피 정제(에틸아세테이트/헥산, 10 : 90)결과 생성물(22)을 얻었다(4.38g, 0.0071몰, 98%).
1H NMR(CDCl3)δ : 1.10(s, 9H), 1.18(s, 9H), 7.01-7.79(m, 24H).
M.S. 정량 ;
계산치 ; 614.
실측치 ; M-57.557
3-tert-부틸디페닐실옥시벤조산(23).
비스-실옥시 화합물(22)(4.0g, 0.0065몰)을 메탄올(25ml)에 용해하고 H2O(10ml)에 용해된 K2CO3(2eq)를 첨가한다. 반응혼합물을 20분간 실온에서 교반한다(TLC 결과 출발물질의 흔적이 없다). 용액을 희석산(20ml)으로 식히고 에틸아세테이트로 추출한다(3×20ml). 유기층은 H2O(15ml)로 세척하고 무수황산나트륨으로 건조한 후 여과하고 감압 농축시켜서 생성물(23)을 제공한다(2.43g, 0.0064몰, 99%).
1H NMR(CDCl3)δ : 1.13(s, 9H), 6.88-7.74(m, 14H), 9.7(bs, 1H).
M.S. 정량 ;
계산치 ; 376.1495
실측치 ; 376.1500
프로판-3-올 3-(tert-부틸디페닐실옥시)벤조에이트(24).
DEAD(0.14g, 0.00079몰)을 무수 THF(10ml)에 용해된 산(23)(0.3g, 0.00079몰) 용액에 첨가한다. 트리페닐포스핀(0.21g, 0.0008몰)과 THF(3ml)속의 1, 3-프로판디올(0.091g, 0.0011몰)의 혼합물을 상기용액에 천천히 주입하고 반응혼합물을 실온에서 24시간동안 교반한다. 용액을 H2O(12ml)로 식힌후 에틸아세테이트로 추출한다(2×15ml). 유기층은 무수 Na2SO4로 건조하고 감압농축시킨다. TLC(에틸아세테이트/헥산, 70 : 30)으로 정제해서 순수에스테르(24)를 제공한다(0.25g, 0.00058몰, 73%).
1H NMR(CDCl3)δ : 1.11(s, 9H), 1.88-1.96(m, 2H), 2.49(bs, 1H), 3.67(t, 2H, J=6Hz), 4.38(t, 2H, J=6Hz), 6.86-7.72(m, 14H).
M.S. 정량 ;
계산치 : 434.4126
실측치 : M+1, 435.
[(3-히드록시프로폭시)(3-tert-부틸디페닐-실옥시페닐)메틸렌]아다만란(25).
환류 응축기가 구비된 100ml 3-목 플라스크를 고온 공기총으로 건조시키고 아르곤기체로 정화한다. 3염화티타늄(1.10g, 0.068몰)을 무수 THF(15ml)에 교반하면서 첨가한다. Zn 분진율(0.70g, 0.010몰) 첨가하고 용액은 15분간 온수속에서 교반한다. 용액을 냉각(얼음용기)하고 무수 트리에틸아민(1ml)을 천천히 주입한다. 0℃에서 10분간 교반후 용액을 실온으로 가온하고 아르곤기체하에서 2시간동안 환류시킨다. 에스테르(24)(0.85g, 0.0019몰)과 무수 THF(5ml)속이 아다만톤(0.44g, 0.0029몰)의 용액을 점적 첨가하고 반응혼합물은 4시간동안 환류시킨다. 용액을 실온까지 냉각시키고 헥산(20ml)을 첨가한다. 흑색 슬러리를 H2O(20ml)에 용해시키고 에테르로 추출한다(3×10ml). 유기층을 여과하고 용액은 감압 농축한다. TLC(에틸아세테이트/헥산, 30 : 70)에 의한 정제로 생성물(25)을 수득한다(0.14g, 0.00025몰, 12%).
1H NMR(CDCl3)δ : 1.12(s, 9H), 1.50-2.1(m, 15H), 2.37(bs, 1H), 3.11(bs, 1H), 3.32(t, 2H, J=6Hz), 3.64(t, 2H, J=6Hz), 6.64-7.73(m, 14H).
13C(CDCl3)δ : 19.34, 26.43, 28.15, 30.13, 30.95, 32.05, 32.22, 36.45, 38.83, 38.91, 61.10, 67.50, 118.98, 120.92, 122.03, 127.64, 128.86, 129.78, 131.59, 132.81, 135.49, 136.58, 141.71, 155.22 .
MS 정량 :
계산치 ; 552.3059
실측치 ; 552.3066
비오틴 아미드 알켄(26).
비오틴 NHS 에스테르(Cal Biochem)(0.025g, 0.073mmol)를 무수 DMF(5ml)에 용해된 아미노알켄(10)(0.012g, 0.04mmol) 용액에 첨가한다. 반응혼합물은 아르곤기체하에서 48시간동안 교반한다. 물(5ml)을 첨가하고 디클로로메탄(2×12ml)으로 추출한다. 유기층은 무수 Na2SO4로 건조시키고 감압농축한다. 청황색 잔유물을 TLC(메탄올/디클로로메탄, 10 : 90)으로 정제해서 백색고체인 생성물(26)을 제공한다.
1H NMR(CDCl3)δ : 1.25-2.17(m, 20H), 2.65-2.94(m, 3H), 3.12-3.59(m, 6H), 4.31-4.35(m, 1H), 4.50-4.54(m, 1H), 5.26(bs, 1H), 6.17(t, 1H, J=2.4Hz), 6.40(bs, 1H), 6.75-7.32(m, 4H).
13C(CDCl3)δ : 25.45, 27.91, 28.16, 30.43, 32.25, 35.84, 37.02, 39.11, 39.57, 40.50, 55.64, 60.31, 61.95, 68.73, 115.03, 115.79, 120.91, 129.09, 133.28, 136.90, 141.70, 156.90, 164.49, 173.85.
M.S. 정량 :
계산치 ; 525.7158
실측치 ; FAB (M+23[Na]) 548.6
형광성 아미드알켄(27).
무수 디클로로메탄/DMF(3 : 1, 3ml)속에 있는 아미노알켄(10)(0.012g, 0.00004몰) 용액에 대해 5(와-6) 카르복시-형광성 숙신이미딜 에스테르(분자 검출물(0.030g, 0.00006몰)을 첨가하고 그 반응혼합물은 실온에서 24시간동안 아르곤 기체하에서 교반한다. 용액을 물로(5ml) 식히고 에틸아세테이트로 추출한다(2×12ml). 유기층을 무수 황산나트륨으로 건조하고 감압 농축시킨다. TLC(메탄올/디클로로메탄, 10 : 90)에 의한 정제결과 알켄(27)을 수득하였다(0.015g, 0.000022몰, 58%).
1H NMR(CD3OD)δ : 1.27-1.96(m, 12H), 2.60(bs, 1H), 3.07(bs, 1H), 3.56-3.62(m, 4H), 6.51-8.46(m, 13H).
M.S. 정량 :
계산치 : 657.7268
실측치 : FAB (M+1) 658
1, 2-디옥세탄 제조
디옥세탄은 다음과 같은 광산화 반응법으로 제조한다. 상기의 알켄을 이에 상응하는 디옥세탄으로 전환시킬 수 있다.
[디옥세탄 1a]
무수 디클로로메탄(4ml)에 용해된 알켄(15)(0.012g, 0.027mmol)은 계속 거품을 일으키는 산소와 Sensitox의 존재하에서 -78℃의 온도에서 1000W 나트륨등으로 빛을 방출시킨다. 1시간동안 빛방출후, 증감제를 여과분리하고 용매를 증발시켜서 디옥세탄(1a)을 수득한다(0.012g, 0.027mmol, 99%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.05-2.12(m, 14H), 2.18(bs, 1H), 2.88(bs, 4H), 3.03(bs, 1H), 3.32-3.39(m, 2H), 3.45-3.57(m, 2H), 6.8-7.32(m, 4H) :
13C NMR(CDCl3)δ : 25.59, 25.83, 25.97, 31.56, 31.81, 32.20, 32.91, 33.05, 34.68, 36.36, 38.92, 67.23, 95.60, 111.40, 116.81, 121.61, 129.61, 135.94, 156.12, 168.36.
[디옥세탄 1b]
무수 디클로로메탄(15ml)에 용해된 알켄(18)(0.03g, 0.054mmol)은 계속 거품을 일으키는 산소와 Sensitox의 존재하에서 -78℃의 온도에서 1000W 나트륨등으로 빛을 방출시킨다. 2시간동안 빛방출 후, 증감재를 여과분리하고 용매를 증발시켜서 디옥세탄(1b)을 수득한다(0.028g, 0.047mmol, 88%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.18(s, 6H), 0.97(s, 9H), 1.70-2.1(m, 14H), 2.28(bs, 1H), 2.68-2.74(m, 2H), 2.83(bs, 4H), 3.01(bs, 1H), 3.44-3.54(m, 2H), 6.71-7.40(m, 4H).
[디옥세탄 1c]
무수 디클로로메탄(15ml)에 용해된 알켄(21)(0.03g, 0.048mmol)은 계속 거품을 일으키는 산소와 Sensitox의 존재하에서 -78℃의 온도에서 1000W 나트륨등으로 빛을 방출한다. 2시간동안 빛방출 후, 증감제를 여과분리하고 용매를 증발시켜서 디옥세탄(1c)을 수득한다(0.031g, 0.044mmol, 99%) :
1H NMR(CD2Cl2)δ : 1.08(s, 9H), 1.36-2.0(m, 15H), 2.85(m, 7H), 3.47(m, 2H), 7.0-7.78(m, 14H).
[디옥세탄 2a]
6-아미노헥사놀(1.2ml, 0.010mmol)을 아르곤 기체하에서 무수디클로로메탄(2ml)에 용해된 디옥세탄(1b)(0.004g, 0.0068mmol)용액에 첨가한다. 반응혼합물을 실온에서 10분간 교반한다. 백색침전물을 여과분리하고 용액은 감압 농축한다. TLC(메탄올/디클로로메탄, 10 : 90)에 의한 정제결과 생성물(2a)가 얻어졌다(0.004g, 0.0068mmol, 100%) :
1H NMR(CDCl3)δ : 0.21(s, 6H), 0.98(s, 9H), 1.24-1.57(m, 22H), 2.12(t, 2H, J=6.6Hz), 2.15(bs, 1H), 2.30(t, 2H, J=7.2Hz), 3.26(q, 2H, J=6.3Hz), 3.60-3.66(m. 3H), 4.35(t, 2H, J=6.3Hz), 5.5(bs, 1H), 7.02-7.63(m, 4H)
[디옥세탄 2b]
6-아미노헥사놀(1mg, 0.0084mmol)을 아르곤기체하에서 무수디클롤로메탄(2ml)에 용해된 디옥세탄(1c)(2mg, 0.0028mmol) 용액에 첨가한다. 반응혼합물을 실온에서 30분간 교반한다. 백색침전물을 여과분리하고 용액은 감압 농축시킨다. TLC(메탄올/디클로로메탄, 10 : 90)에 의한 정제에 따라 생성물(2b)(1.9mg, 0.026mmol, 95%)이 나온다 :
1H NMR(CDCl3)δ : 1.08(s, 9H), 1.25-1.66(m, 22H), 3.18-3.25(m, 5H), 3.63(t, 3H, J=6.0Hz), 5.81(t, 1H), 7.32-7.69(m, 14H).
[디옥세탄 3a-c]
14 X=H (a) X=H
17 X=Si(CH3)2t-Bu (b) X=Si(CH3)2t-Bu
20 X=Si(Ph2t-Bu (c) X=Si(Ph2t-Bu
디옥세탄 3a, 3b와 3c는 표준 증감된 단일 산화법에 따라 알켄(14)(17)과 (20) 각각으로부터 수득할 수 있다.
[디옥세탄 4]
무수 디클로로메탄(10ml)에 용해된 알켄(25)(0.12g, 0.0002몰)은 계속 거품을 일으키는 산소와 함께 Sensitox 존재하에서 -78℃에서 1000W 나트륨 등으로 빛을 방출한다.
2.5시간 및 방출후 증감제를 여과분리하고 용액은 감압 농축한다.
TLC(에틸아세테이트/헥산, 30 : 70)에 의한 정제작업 결과 디옥세탄(4)(0.11g, 0.00019몰, 93%)가 수득된다.
1H NMR(CDCl3)δ : 1.09(s, 9H), 1.36-2.09(m, 16H), 2.81-3.86(m, 6H), 7.31-7.74(m, 14H).
13C NMR(CDCl3)δ : 19.25, 25.68, 25.89, 26.32, 27.44, 30.94, 31.41, 31.60, 32.20, 32.67, 32.78, 34.40, 36.29, 36.44, 37.53, 59.97, 74.44, 77.20, 95.41, 111.56, 127.77, 129.92, 132.44, 135.34, 135.48, 135.99, 1555.58.
[디옥세탄 5]
비오탄화 디옥세텐(5)은 알켄(26)으로부터 수득한다. 무수 K2CO3(0.15g)은 무수 CH2CL2(10ml)에 용해된 알켄(26)(0.012g, 0.022mmol)에 첨가하고 산소를 0℃에서 2분간 거품이 일도록 한다. 트리스(4-브로모페닐) 암모늄 헥사클로로안티모네이트(BAHA)(0.004g, 0.0048mmol)를 상기 용액에 첨가하고 O2는 0℃에서 30분간 반응혼합물속에서 거품을 일으킨다. 용액은 여과하고 감압하에서 농축한다. TLC(메탄올/CH2Cl2, 15 : 85)에 의한 정제결과 디옥세탄(5)이 수득된다(0.0091g, 0.0163mmol, 72%).
1H NMR(CD3OD/CDCl310 : 90)δ : 1.02-1.90(m, 18H), 2.23-2.28(m, 3H), 2.72(d, 1H, J=12.9Hz), 3.14-3.20(m, 1H), 3.39-3.56(m, 6H), 4.30-4.34(m, 1H), 4.48-4.52(m, 1H), 6.87-7.28(m, 4H).
[디옥세탄 6]
디클로로메탄/메탄올(9 : 1, 12ml)의 혼합물에 용해된 알켄(27)(0.011g, 0.0167mmol)은 계속 거품을 일으키는 산소와 함께 Sensitox의 존재하에서 -78℃의 온도에서 1000W 나트륨 등으로 빛을 방출한다. 1시간 방출 후 증감제를 여과분리하고 용액은 감압하에서 농축된다. TLC(메탄올/디클로로메탄, 20 : 80)에 의한 정제결과 디옥세탄(6)(0.0053g, 0.0076mmol, 46%)이 수득된다. TLC반점 분석결과 가열과정에서 황색의 화학발광 현상을 볼 수 있다.
1H NMR(CDCl3/CDOD, 3 : 1)δ : 0.88-1.98(m, 12H), 2.32(bs, 1H), 3.06(bs, 1H), 3.68(m, 4H), 6.53-8.34(m, 13H).
디옥세탄으로 직접 표시된 소혈청 알부민의 화학발광 검출.
1. BSA-디옥세탄 복합물의 제조.
디옥산-붕산염 완충액(디옥산/H2O, 1 : 9)(pH 7.5)(10ml)속의 BSA(0.15g) 용액에 대해 디옥세탄 N-히드록시숙신이미드 에스테르(1a)를 교반하면서 첨가한다. 실온상에서 0.5시간 동안 교반한후 TLC(메탄올/디클로로메탄 10 : 90) 분석결과 결합되지 않은 표시체 소량이 관측된다. 이 용액은 고압하에서 한외여과법으로 농축시킨다. 반응혼합물은 10ml 한외여과 세포속에 전달된다(Amicon, YM30, 25mm, 〉30,000MW). 이 세포를 피복하여 N2유입구에 부착한다. 먼저 N2(20psi)를 천천히 교반하면서 통과시켜 효과적으로 여과한다. 약 5분후 N압력은 점차로 50psi까지 증가한다. 용액(디옥산/물)을 출구를 통해 비이커에 수거한다. 농축물을 수성 디옥산(디옥산/H2O, 5 : 95)(10ml)로 세척하고 다시 물로(10ml) 씻는다. 농축물을 동결건조시켜 복합물이 백색 박편형 고체로 되도록한다.
디옥산-붕산염 완충액(디옥산/H2O, 1/9)(pH 7.6)(2.7ml)에 있는 BSA(0.05g)용액에 대해 디옥산(0.3ml)에 용해된 디옥세탄 N-히도록시숙신이미드 에스테르(1b)를 교반하면서 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 용액을 압력하에서 한외여과하여 농축시킨다. 농축물은 수성 디옥산(디옥산/H2O, 5 : 95)(5ml)과 증류수(5ml)로 세척한다. 농축물을 동결건조하여 복합물이 백색박편형 고체로 되게한다.
디옥산-붕산염 완충액(디옥산/H2O, 1 : 9)(pH 7.6)(2.7ml)내의 BSA(0.05g)용액에 대해 디옥산(0.3ml)에 용해된 디옥세탄 N-히드록시숙신이미드 에스테르(1c)를 교반하면서 첨가한다.
실온에서 1시간 동안 교반한 후 용액을 가압하에 한외여과하여 농축시킨다. 농축물은 수성디옥산(디옥산/H2O, 5 : 95)(5ml) 및 증류수(5ml)로 세척한다. 농축물은 동결건조하여 복합물이 백색박편형 고체로 되게한다.
2. BSA-디옥세탄 복합물의 화학 발광 현상 검출.
화학발광성 측정은 광-차단 호울더내에 있는 단일 Dynatech Immulon웰에서 실행한다. 발광현상은 Oriex 광자수 측정기에 연결한 섬유광학물을 사용하여 웰바닥에서 측정한다. 빛의 강도는 -78℃로 냉각된 RCA A-31034A 갈륨-비소 PMT로 측정한다.
앞서 언급한 2.4mg의 BSA와 디옥세탄(1a) 복합물을 마이크로-타이터웰에 놓고 90μl의 중성 CTAB(0.00125M)을 첨가하여 백색 보풀형 고체를 용해시킨다. 10M NaOH용액(10μl)을 약 25℃에서 상기 용액에 주입하고 화학발광 현상을 광도계로 기록한다. 제 1 도에서 보여주는 형광 강도는 표시된 단백질을 직접 측정할 수 있도록 한다.
유기매질 속에서 제동할때 1.2mg의 BSA와 디옥세탄(1a) 복합물은 마이크로-타이터 웰에 놓고 DMSO(90μl)를 여기에서 첨가한다. DMSO(10μl)에 넣은 0.1M 불화 테트라부틸암모늄(TBAF)용액을 상기 용액에 대해 약 25℃에서 주입하고 황광 강도는 제 2 도에서와 같이 기록하였다.
디옥세탄으로 직접 표시된 항체의 화학발광 현상검출.
1. 디옥세탄-결합 항체의 제조.
125μl DMF 내의 디옥세탄(1c)(100㎍)을 천천히(10초 이상) 100㎍ 염소 향마우수 IgG가 들어있는 25mM 트리스-HCl(pH 7.5), 1.4mM CTAB, 1.4mM CTAB의 강하게 회전중인 용액(2ml)에 첨가한다(Cappel, Cat. no. 0611-0231, Lot 32614). 이 용액을 실온에서 24시간 동안 배양하고 다시 4℃에서 저장한다.
실리카판에서 실행하는 생성물에 대한 TLC 분석결과(메탄올/CH2Cl28 : 92) 다수의 출발 디옥세탄이 항체에 공유결합하거나 또는 NHS 작용기가 가수분해되는 것을 보여준다. 제 3 도는 결과물인 TLC판이 그후 무수 DMSO내의 불화 테트라부틸암모늄용액(20% w/v)으로 제동된 것을 X선 필름에 대해 노출한 상태를 보여준다. 이 TLC분석에서 출발 디옥세탄(1c)는 판의 상단으로 이동하고 디옥세탄-결합 항체는 본래대로 남아있다.
2. 디옥세탄-결합항체의 정제
표시된 항체를 30cm Pharmacia Superose 12 컬럼을 사용한 EPLC으로 비-결합된 디옥세탄 화합물로부터 분리시킨다. 원료반응물의 분취물(850μl)을 에핀도르프 마이크로원심분리기에서 10,000rpm으로 10분간 원심분리한다. 그후 이것을 20mM 트리스-HCl pH 7.5, 0.15M NaCl, 1mM CTAB용액으로 평형화한 컬럼상에 주입한다.
디옥세탄 변형 항체를 상기 동일한 완충액으로 0.12ml/분의 유속으로 용출한다. 일부를 실리카판상에서 TLC(메탄올/CH2CH28 : 92)로 검사하여 디옥세탄-결합항체가 함유되어 있는지 측정한다. 디옥세탄-결합항체(제 4 도). (제 3 도에서의 TCL에 대한 기술한 것과 동일한 제동방법을 사용하여)를 함유한 성분의 TLC분석결과 이 성분들이 생성물만 함유하고 출발물질과 가수분해산물은 들어있지 않음이 명백하다.
3. 디옥세탄-결합항체를 사용한 웨스턴 블롯.
마우스 IgG(Capple)을 MSI나일론막(20cm×80cm) 위에 점으로 찍고 진공상태에서 30분간 건조하였다. 막을 교집포대에 넣고 0.1M 트리스-hcL pH 7.5, 0.15M NaCl, 0.05% 트윈 20용액 10ml를 첨가하고 다시 이백을 밀봉한 후 가볍게 교반하면서 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 백을 열고 차단액을 버린 후 0.1M 트리스-HCl pH 7.5, 0.15M NaCl, 0.05% 트윈 20, 1% 탈지분유가 함유된 10ml 용액과 또한 상기 디옥세탄-표시항체의 FPLC 정제작업으로 나온 성분들(약 5㎍ 변형 IgG) 200μl를 대신 채운다.
백을 밀봉하고 막을 실온에서 하룻밤동안 배양한다. 그후 막을 백에서 제거하여 1분간 탈염수 흐름상에서 세정하고 또한 0.1M 트리스-HCl pH 7.5, 0.15M NaCL, 0.05% 트윈 20, 0.1% SDS가 함유된 20ml용액이 담긴 접시에 놓는다. 이 접시를 15분간 가만히 흔들어 용액을 버린 후 두 번 세척한다. 막은 1분간 탈염수 흐름으로 씻어내고 진공 건조시킨다. 막은 코닥 XAR5 X-선 필름시이트위의 박판유리 위에 놓아 노출시키고 이것에 대해 무수 DMSO 속의 200% (w/v) 불화 테트라부틸 암모늄을 첨가해서 제동한다.
변형 항체 교잡은 100mg 단백질이 함유된 점무늬 시료에 대하여 관측된다(제 5 도). 이결과는 화학발광에 의한 디옥세탄-표시된 유생분자의 검출이 가능함을 보여주는 것이다.

Claims (19)

  1. 다음의 구조식으로 표현되는 것으로써 통상의 가수분해 효소에 의해 분석되어 빛을 방출하는 것을 특징으로 하는 디옥세탄 화합물 :
    여기서, R1은 -(CH2)n-이고, n은 1 내지 30의 정수이며, A는 하이드록실, 카르복실산, 숙신아미드, 바이오틴, 플로로레신에서 선택되며, X는 H 또는 실릴옥시등에서 가수분해성 작용기이다.
  2. 제 1 항에 있어서, A는 숙시니미드이고, 다음의 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, n은 3이고, X는 H이며 다음의 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서, n은 3이고 OX는 실릴옥시이며, 다음의 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
    여기서 실릴옥시는 제 3 부틸디메틸실릴옥시와 제 3 부틸디페닐옥시에서 선택한다.
  5. 제 1 항에 있어서, A는 -NH(CH2)mOH이고, m은 2 내지 20의 정수이고, 다음의 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
  6. 제 5 항에 있어서, n은 3이고, m은 6인 것을 특징으로 한 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서, OX는 제 3 부틸디메틸실릴옥시와 제 3 부틸디메틸실릴옥시중에서 선택되는 것을 특징으로 한 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, A는 -CO2H-이고, 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
    여기서 n은 1 내지 30의 정수이다.
  9. 제 8 항에 있어서, n이 3인 것을 특징으로 한 화합물.
  10. 제 9 항에 있어서, OX는 하이드록실, 제 3 부틸 디메틸실릴옥시와 제 3 부틸디페닐실릴옥시에서 선택되는 것을 특징으로 한 화합물.
  11. 제 1 항에 있어서, A는 OH이고, OX는 제 3 부틸디페닐실릴옥시인 것을 특징으로 한 화합물.
  12. 제 1 항에 있어서, A는 바이오틴기이고, 다음의 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 한 화합물.
    여기서 n은 2 내지 30이고, m은 4이다.
  13. 제 12 항에 있어서, n은 2이고, OX는 하이드록실인 것을 특징으로 한 화합물.
  14. 다음의 구조식으로 표현되는 것으로써, 통상의 가수분해 효소에 의해 분해되는 빛을 방출하는 1, 2-디옥세탄 화합물 제조에 사용되는 것을 특징으로 하는 알켄 화합물.
    여기서 R1은 -(CH2)n-이고, n은 1 내지 30의 정수이고, A는 할로겐, 하이드록실, NH2, CN, 카르복실산, 숙신아미드, 바이오틴과 플로로레신에서 선택되며, X는 H 또는 실릴옥시 등에서 선택되는 가수분해성 작용기이다.
  15. 제 14 항에 있어서, A는 숙신아미드이고 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 15 항에 있어서, n은 3이고 X는 H이고 또한 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 15 항에 있어서, n은 3이고, OX는 실릴옥시인 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물.
    여기서, 실릴옥시는 제 3 부틸디메틸실릴옥시와 제 3 부틸디페닐실릴옥시중에서 선택한다.
  18. 제 14 항에 있어서, n은 2이고, A는 바이오틴이며, 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 1 항에 있어서, A는 플로로레신이고, n이 2이며, 다음 구조식으로 표현되는 것을 특징으로 하는 화합물.
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