JP3177964B2 - 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 - Google Patents
発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般式
【化４】 （式中、Ｒ1 は酵素分解性基であり、Ｒ 2及びＲ3 は水
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させる発色方法において、一般式
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させる発色方法において、一般式
【０００２】
【化５】 （Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン鎖であ
り、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基
を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表されるフ
リーラジカル化合物及び／又は一般式
り、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基
を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表されるフ
リーラジカル化合物及び／又は一般式
【０００３】
【化６】 （式中、Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキサン−１，２
−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、コバルト、イ
ンジュウム、ネオジム、マンガン又はユウロピウムであ
る。）で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成
したキレート化合物の存在下に発色を行う発色方法に関
する。さらに、本発明は、この発色方法を用いる酵素免
疫測定法（以下、ＥＩＡという。）及び該ＥＩＡを組み
込んだイムノクロマト法に関する。
−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、コバルト、イ
ンジュウム、ネオジム、マンガン又はユウロピウムであ
る。）で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成
したキレート化合物の存在下に発色を行う発色方法に関
する。さらに、本発明は、この発色方法を用いる酵素免
疫測定法（以下、ＥＩＡという。）及び該ＥＩＡを組み
込んだイムノクロマト法に関する。
【０００４】
【従来の技術】従来、イムノブロット法、イムノクロマ
ト法等でインドリル誘導体が、発色基質として用いられ
ていた（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ，Ｖｏｌ．１２１，４９７−５０９（１９８６）；特
開平９−１３３６８１号公報等参照）。
ト法等でインドリル誘導体が、発色基質として用いられ
ていた（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ，Ｖｏｌ．１２１，４９７−５０９（１９８６）；特
開平９−１３３６８１号公報等参照）。
【０００５】これらの方法では、ニトロセルロース膜に
免疫反応によって結合した酵素の活性を、インドリル誘
導体を用いて測定することが行われている。インドリル
誘導体は、酵素と反応してインジゴ色素を生じ、時間の
経過とともにニトロセルロース膜上に沈着するため、目
視による測定が可能である。
免疫反応によって結合した酵素の活性を、インドリル誘
導体を用いて測定することが行われている。インドリル
誘導体は、酵素と反応してインジゴ色素を生じ、時間の
経過とともにニトロセルロース膜上に沈着するため、目
視による測定が可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】イムノブロット法で
は、インドリル誘導体を酵素と反応させて発色測定を行
うまでに２０分から６０分を必要とするため、反応時間
を短縮することが求められていた。また、イムノクロマ
ト法では、検体をニトロセルロース膜に点着し、インド
リル誘導体を含む展開液を展開させた後、検出部位の発
色量を測定して結果を得るまでに、少なくとも１０分、
通常は１５分間から数時間を要するため、イムノクロマ
ト法の特徴である簡便性を生かした緊急検査への対応に
は、さらなる測定時間の短縮が求められていた。
は、インドリル誘導体を酵素と反応させて発色測定を行
うまでに２０分から６０分を必要とするため、反応時間
を短縮することが求められていた。また、イムノクロマ
ト法では、検体をニトロセルロース膜に点着し、インド
リル誘導体を含む展開液を展開させた後、検出部位の発
色量を測定して結果を得るまでに、少なくとも１０分、
通常は１５分間から数時間を要するため、イムノクロマ
ト法の特徴である簡便性を生かした緊急検査への対応に
は、さらなる測定時間の短縮が求められていた。
【０００７】本発明者らは鋭意研究した結果、前記一般
式〔化４〕で表されるインドリル誘導体に酵素を作用さ
せる際に、前記一般式〔化５〕で表されるフリーラジカ
ル化合物、及び／又は前記一般式〔化６〕で表されるキ
レート化合物の存在下で発色を行うと、発色に要する時
間が短縮されることを見出し本発明を完成した。
式〔化４〕で表されるインドリル誘導体に酵素を作用さ
せる際に、前記一般式〔化５〕で表されるフリーラジカ
ル化合物、及び／又は前記一般式〔化６〕で表されるキ
レート化合物の存在下で発色を行うと、発色に要する時
間が短縮されることを見出し本発明を完成した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、前
記一般式〔化４〕で表されるインドリル誘導体のＲ1を
酵素の作用により脱離させ、この分解した２分子を縮合
させてインジゴ色素を生成させる際に、前記一般式〔化
５〕で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は前記
一般式〔化６〕で表されるキレート化合物を存在させる
ことを特徴とする発色方法である。生成するインジゴ色
素は所定の反応時間経過後、その発色を、目視又は機器
により測定することができる。
記一般式〔化４〕で表されるインドリル誘導体のＲ1を
酵素の作用により脱離させ、この分解した２分子を縮合
させてインジゴ色素を生成させる際に、前記一般式〔化
５〕で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は前記
一般式〔化６〕で表されるキレート化合物を存在させる
ことを特徴とする発色方法である。生成するインジゴ色
素は所定の反応時間経過後、その発色を、目視又は機器
により測定することができる。
【０００８】本発明の請求項８に記載の発明は、酵素標
識抗体又は抗原の酵素活性を、請求項１に記載の一般式
〔化１〕で表されるインドリル誘導体を用いて測定する
酵素免疫測定法において、請求項１に記載の一般式〔化
２〕で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は請求
項１に記載の一般式〔化３〕で表されるジアミン誘導体
と金属との錯体を形成したキレート化合物の存在下に発
色させることを特徴とする酵素免疫測定方法である。
識抗体又は抗原の酵素活性を、請求項１に記載の一般式
〔化１〕で表されるインドリル誘導体を用いて測定する
酵素免疫測定法において、請求項１に記載の一般式〔化
２〕で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は請求
項１に記載の一般式〔化３〕で表されるジアミン誘導体
と金属との錯体を形成したキレート化合物の存在下に発
色させることを特徴とする酵素免疫測定方法である。
【０００９】本発明の請求項１０に記載の発明は、固相
の検出部位に結合した酵素標識抗体又は抗原の酵素活性
を、請求項１に記載の一般式〔化１〕で表されるインド
リル誘導体を用いて測定するイムノクロマト法におい
て、請求項１に記載の一般式〔化２〕で表されるフリー
ラジカル化合物、及び／又は請求項１に記載の一般式
〔化３〕で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形
成したキレート化合物との存在下に発色させることを特
徴とするイムノクロマト法である。
の検出部位に結合した酵素標識抗体又は抗原の酵素活性
を、請求項１に記載の一般式〔化１〕で表されるインド
リル誘導体を用いて測定するイムノクロマト法におい
て、請求項１に記載の一般式〔化２〕で表されるフリー
ラジカル化合物、及び／又は請求項１に記載の一般式
〔化３〕で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形
成したキレート化合物との存在下に発色させることを特
徴とするイムノクロマト法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明において、前記一般式〔化
５〕で表されるフリーラジカル化合物、及び前記一般式
〔化６〕で表されるキレート化合物は、前記一般式〔化
４〕で表されるインドリル誘導体を含む反応溶液中に添
加することができる。
５〕で表されるフリーラジカル化合物、及び前記一般式
〔化６〕で表されるキレート化合物は、前記一般式〔化
４〕で表されるインドリル誘導体を含む反応溶液中に添
加することができる。
【００１１】前記一般式〔化５〕で表されるフリーラジ
カル化合物、及び／又は前記一般式〔化６〕で表される
キレート化合物は、通常前記一般式〔化４〕で表される
インドリル誘導体を含む緩衝液中に添加して使用し、例
えば、０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭか
ら２０ｍＭ程度を用いることができる。
カル化合物、及び／又は前記一般式〔化６〕で表される
キレート化合物は、通常前記一般式〔化４〕で表される
インドリル誘導体を含む緩衝液中に添加して使用し、例
えば、０．１ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭか
ら２０ｍＭ程度を用いることができる。
【００１２】この反応を行うには、緩衝液中で行うこと
が好ましく、緩衝液としては、例えば、ジエタノールア
ミン−塩酸緩衝液、アミノメチルプロパンジオール−塩
酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＣＨＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ＣＨＥＳ：Ｎ−シクロヘキシル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ−ＮａＯＨ緩衝
液（ＣＡＰＳＯ：Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ
−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ−ＮａＯ
Ｈ（ＣＡＰＳ：Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン
スルホン酸）緩衝液等を挙げることができる。さらに
は、緩衝液には、所望により塩化マグネシウムなどの塩
類を添加することもできる。
が好ましく、緩衝液としては、例えば、ジエタノールア
ミン−塩酸緩衝液、アミノメチルプロパンジオール−塩
酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＣＨＥＳ−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ＣＨＥＳ：Ｎ−シクロヘキシル−３−ア
ミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ−ＮａＯＨ緩衝
液（ＣＡＰＳＯ：Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ
−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ−ＮａＯ
Ｈ（ＣＡＰＳ：Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン
スルホン酸）緩衝液等を挙げることができる。さらに
は、緩衝液には、所望により塩化マグネシウムなどの塩
類を添加することもできる。
【００１３】前記一般式〔化５〕で表されるフリーラジ
カル化合物は、環状のアミンオキシルフリーラジカル基
を有する化合物であり、Ａとしては、置換又は無置換の
炭素数２〜３のメチレン鎖であり、該メチレン鎖には、
鎖中に酸素原子又はカルボニル基を含むこともできる。
カル化合物は、環状のアミンオキシルフリーラジカル基
を有する化合物であり、Ａとしては、置換又は無置換の
炭素数２〜３のメチレン鎖であり、該メチレン鎖には、
鎖中に酸素原子又はカルボニル基を含むこともできる。
【００１４】前記のＡで表される基としては、例えば、
−（ＣＨ2 ）3 −、−（ＣＨ2 ）2−、−ＣＨ2 −Ｏ−
ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＨ2 −等で表される基を
挙げることができる。
−（ＣＨ2 ）3 −、−（ＣＨ2 ）2−、−ＣＨ2 −Ｏ−
ＣＨ2 −、−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＨ2 −等で表される基を
挙げることができる。
【００１５】前記メチレン鎖への置換基としては、例え
ば、水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ
基等を挙げることができる。
ば、水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ
基等を挙げることができる。
【００１６】前記のカルバモイル基としては、例えば、
カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバ
モイル基、プロピルカルバモイル基、フェニルカルバモ
イル基等を挙げることができる。
カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバ
モイル基、プロピルカルバモイル基、フェニルカルバモ
イル基等を挙げることができる。
【００１７】また、前記一般式〔化５〕におけるＲ4 、
Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は、同一又は異なった水素原子、又
は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３のア
ルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、イソピロピル基など挙げることができる。
Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は、同一又は異なった水素原子、又
は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３のア
ルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、イソピロピル基など挙げることができる。
【００１８】環を形成した窒素原子の隣接した炭素原子
にアルキル基が置換した化合物は、フリーラジカル基の
安定化をはかることができる。
にアルキル基が置換した化合物は、フリーラジカル基の
安定化をはかることができる。
【００１９】前記一般式〔化５〕で表されるフリーラジ
カル化合物は、既に容易に入手可能な化合物であり、例
えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル フリーラジカル、４−ヒドロキシ−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ
メチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、４
−カルバモイル−２，２，６，６−テトラメチルピペリ
ジン−１−オキシル フリーラジカル、４−アミノ−
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ
ル フリーラジカル、２，２，６，６−テトラメチルモ
ルホリン−１−オキシル フリーラジカル、２，２，
５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラ
メチルピロリジン−１−オキシル フリーラジカル、３
−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジ
ン−１−オキシル フリーラジカル、３−カルバモイル
−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキ
シル フリーラジカル、４−オキソ−２，２，６，６−
テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカ
ル（ＡＡＱ−２）等を挙げることができる。
カル化合物は、既に容易に入手可能な化合物であり、例
えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル フリーラジカル、４−ヒドロキシ−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ
メチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、４
−カルバモイル−２，２，６，６−テトラメチルピペリ
ジン−１−オキシル フリーラジカル、４−アミノ−
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ
ル フリーラジカル、２，２，６，６−テトラメチルモ
ルホリン−１−オキシル フリーラジカル、２，２，
５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラ
メチルピロリジン−１−オキシル フリーラジカル、３
−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジ
ン−１−オキシル フリーラジカル、３−カルバモイル
−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキ
シル フリーラジカル、４−オキソ−２，２，６，６−
テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカ
ル（ＡＡＱ−２）等を挙げることができる。
【００２０】前記一般式〔化６〕で表されるジアミン誘
導体のＲ8 は、エチレン基、シクロヘキサン−１，２−
ジイル基等を挙げることができる。
導体のＲ8 は、エチレン基、シクロヘキサン−１，２−
ジイル基等を挙げることができる。
【００２１】また、前記一般式〔化６〕で表されるキレ
ート化合物としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘ
キサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸等へ鉄、銅、亜
鉛、コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン、ユ
ウロピウム等の金属が配位した化合物を挙げることがで
きる。
ート化合物としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘ
キサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸等へ鉄、銅、亜
鉛、コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン、ユ
ウロピウム等の金属が配位した化合物を挙げることがで
きる。
【００２２】前記のキレート化合物の他の例としては、
例えば、ＥＤＴＡ−鉄、ＥＤＴＡ−銅、ＥＤＴＡ−亜
鉛、ＥＤＴＡ−コバルト、ＥＤＴＡ−インジュウム、Ｅ
ＤＴＡ−マンガン、ＥＤＴＡ−ユウロピウム、ｔｒａｎ
ｓ−１，２−ジアミンシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸−鉄、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシク
ロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−銅等を挙げ
ることができる。
例えば、ＥＤＴＡ−鉄、ＥＤＴＡ−銅、ＥＤＴＡ−亜
鉛、ＥＤＴＡ−コバルト、ＥＤＴＡ−インジュウム、Ｅ
ＤＴＡ−マンガン、ＥＤＴＡ−ユウロピウム、ｔｒａｎ
ｓ−１，２−ジアミンシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，
Ｎ’−四酢酸−鉄、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシク
ロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−銅等を挙げ
ることができる。
【００２３】一方、本発明に使用する前記一般式〔化
４〕で表されるインドリル誘導体は、Ｒ1 が酵素分解性
の脱離基であり、例えば、−ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で表され
る基（Ｍは水素、アルカリ金属又はトルイジンであ
る。）、β−Ｄ−ガラクトピラノシル基、又はβ−Ｄ−
グルコピラノシル基等を挙げることができる。
４〕で表されるインドリル誘導体は、Ｒ1 が酵素分解性
の脱離基であり、例えば、−ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で表され
る基（Ｍは水素、アルカリ金属又はトルイジンであ
る。）、β−Ｄ−ガラクトピラノシル基、又はβ−Ｄ−
グルコピラノシル基等を挙げることができる。
【００２４】前記一般式〔化４〕で表されるインドリル
誘導体に作用させる酵素として、ホスファターゼを使用
する場合には、前記一般式〔化４〕で表されるインドリ
ル誘導体は、一般式
誘導体に作用させる酵素として、ホスファターゼを使用
する場合には、前記一般式〔化４〕で表されるインドリ
ル誘導体は、一般式
【００２５】
【化７】 （式中、Ｒ2 、Ｒ3 及びＭは前記と同じである。）で表
されるインドリル誘導体である。
されるインドリル誘導体である。
【００２６】また、酵素として、β−Ｄ−ガラクトシダ
ーゼを使用する場合には、一般式
ーゼを使用する場合には、一般式
【００２７】
【化８】 （式中、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同じであり、Ｇａｌはβ
−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。）で表されるイン
ドリル誘導体である。
−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。）で表されるイン
ドリル誘導体である。
【００２７】さらに、酵素として、β−Ｄ−グルコシダ
ーゼを使用する場合には、一般式
ーゼを使用する場合には、一般式
【００２８】
【化９】 （式中、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同じであり、Ｇｌｕはβ
−Ｄ−グルコピラノシル基である。）で表されるインド
リル誘導体等である。
−Ｄ−グルコピラノシル基である。）で表されるインド
リル誘導体等である。
【００２９】前記の一般式〔化４〕において、Ｒ2 及び
Ｒ3 で表されるハロゲン原子としては、例えば、塩素、
臭素、ヨウ素等を挙げることができる。なお、Ｒ2 及び
Ｒ3 で表されるハロゲン原子は、インドリンの４位、及
び／又は５位に置換していることが好ましい。
Ｒ3 で表されるハロゲン原子としては、例えば、塩素、
臭素、ヨウ素等を挙げることができる。なお、Ｒ2 及び
Ｒ3 で表されるハロゲン原子は、インドリンの４位、及
び／又は５位に置換していることが好ましい。
【００３０】前記一般式〔化７〕で表されるインドリル
誘導体において、アルカリ金属としては、例えば、ナト
リウム、カリウム等を挙げるとができる。
誘導体において、アルカリ金属としては、例えば、ナト
リウム、カリウム等を挙げるとができる。
【００３１】前記一般式〔化７〕で表されるインドリル
誘導体としては、例えば、３−インドリルリン酸、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロ
モ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリ
ルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−
６−クロロ−３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−
トルイジン塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ルリン酸 ｐ−トルイジン塩等を挙げることができる。
誘導体としては、例えば、３−インドリルリン酸、５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロ
モ−６−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリ
ルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−
６−クロロ−３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−
トルイジン塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリ
ルリン酸 ｐ−トルイジン塩等を挙げることができる。
【００３２】前記一般式〔化８〕で表されるインドリル
誘導体としては、例えば、３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド等を挙げることができる。
誘導体としては、例えば、３−インドリル−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６
−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド等を挙げることができる。
【００３３】前記一般式〔化９〕で表されるインドリル
誘導体としては、例えば、３−インドリル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド等を
挙げることができる。
誘導体としては、例えば、３−インドリル−β−Ｄ−グ
ルコピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−ク
ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド等を
挙げることができる。
【００３４】本発明の発色方法は、例えば、酵素標識試
薬を用いるＥＩＡ、該ＥＩＡを組み込んだイムノクロマ
ト法に使用することができ、他にもイムノブロット法、
電気泳動によるホスファターゼ類のアイソザイム分析、
組織染色、酵素を標識物とするＤＮＡ、ＲＮＡ等の遺伝
子測定等に使用することができる。
薬を用いるＥＩＡ、該ＥＩＡを組み込んだイムノクロマ
ト法に使用することができ、他にもイムノブロット法、
電気泳動によるホスファターゼ類のアイソザイム分析、
組織染色、酵素を標識物とするＤＮＡ、ＲＮＡ等の遺伝
子測定等に使用することができる。
【００３５】ＥＩＡでは、前記酵素で標識した抗原又は
抗体からなる酵素標識試薬、固相に結合させた抗原又は
抗体からなる固相試薬等を組み合わせて周知の方法に従
い測定を行うことができる。
抗体からなる酵素標識試薬、固相に結合させた抗原又は
抗体からなる固相試薬等を組み合わせて周知の方法に従
い測定を行うことができる。
【００３６】前記の酵素標識試薬は、前記酵素と抗原又
は抗体とを、共有結合を作る方法を利用して製造するこ
とができる。共有結合による方法としては、例えば、グ
ルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、
ピリジル・ジスルフィド法、周知の各種架橋剤（マレイ
ミド試薬等）を用いる方法等を挙げることができる（例
えば、「蛋白質核酸酵素」別冊３１号，３７〜４５頁
（１９８７）参照）。
は抗体とを、共有結合を作る方法を利用して製造するこ
とができる。共有結合による方法としては、例えば、グ
ルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、
ピリジル・ジスルフィド法、周知の各種架橋剤（マレイ
ミド試薬等）を用いる方法等を挙げることができる（例
えば、「蛋白質核酸酵素」別冊３１号，３７〜４５頁
（１９８７）参照）。
【００３７】また、固相試薬は、従来のＥＩＡに使用さ
れる各種免疫測定用の固相に抗体、又は抗原を結合させ
て製造することができる。固相としては、プラスチック
製の試験管、プラスチック製のマイクロプレートウエ
ル、ポリスチレン等のラテックス粒子、ガラスビーズ、
プラスチックビーズ等のビーズ、セルロース、ニトロセ
ルロース、グラスウール等の膜、磁性粒子等を挙げるこ
とができる。
れる各種免疫測定用の固相に抗体、又は抗原を結合させ
て製造することができる。固相としては、プラスチック
製の試験管、プラスチック製のマイクロプレートウエ
ル、ポリスチレン等のラテックス粒子、ガラスビーズ、
プラスチックビーズ等のビーズ、セルロース、ニトロセ
ルロース、グラスウール等の膜、磁性粒子等を挙げるこ
とができる。
【００３８】この固相試薬を製造するには、前記共有結
合又は非共有結合による方法として 固相と抗体又は抗原
を物理吸着させる方法を利用し、抗原又は抗体とを反応
させて製造することができる。
合又は非共有結合による方法として 固相と抗体又は抗原
を物理吸着させる方法を利用し、抗原又は抗体とを反応
させて製造することができる。
【００３９】なお、前記の説明では、酵素標識試薬及び
固相試薬に結合させる免疫反応物質を抗原又は抗体とし
たが、本願明細書で言う「抗体又は抗原」は、抗原抗体
反応（免疫反応）が可能であり、免疫複合体を形成する
ものであればよく、例えば、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、これら抗体の断片（Ｆａｂ，Ｆａ
ｂ’，Ｆ（ａｂ’）2 等）、ハプテン等も包含する意味
で用いる。
固相試薬に結合させる免疫反応物質を抗原又は抗体とし
たが、本願明細書で言う「抗体又は抗原」は、抗原抗体
反応（免疫反応）が可能であり、免疫複合体を形成する
ものであればよく、例えば、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、これら抗体の断片（Ｆａｂ，Ｆａ
ｂ’，Ｆ（ａｂ’）2 等）、ハプテン等も包含する意味
で用いる。
【００４０】本発明の適用を受けるＥＩＡは、前記固相
試薬及び酵素標識試薬を用いた周知の１ステップ法、デ
ィレイ１ステップ法、２ステップ法等のサンドイッチ
法、競合法等であり、免疫反応により固相上に免疫複合
体を形成して結合した酵素又は固相に未結合の酵素の活
性を測定することにより実施することができる。
試薬及び酵素標識試薬を用いた周知の１ステップ法、デ
ィレイ１ステップ法、２ステップ法等のサンドイッチ
法、競合法等であり、免疫反応により固相上に免疫複合
体を形成して結合した酵素又は固相に未結合の酵素の活
性を測定することにより実施することができる。
【００４１】本発明のフリーラジカル化合物、及びキレ
ート化合物を用いるＥＩＡは、例えば、ニトロセルロー
ス膜のろ紙を固相として前記ＥＩＡを組み込んだイムノ
クロマト法に適用することができる。
ート化合物を用いるＥＩＡは、例えば、ニトロセルロー
ス膜のろ紙を固相として前記ＥＩＡを組み込んだイムノ
クロマト法に適用することができる。
【００４２】このろ紙を用いる測定では、検出部位に結
合した酵素と、前記の一般式〔化４〕で表されるインド
リル誘導体との反応による発色時間を短縮することがで
きるため、検体中に含まれる微量の測定対象物であって
も短時間での測定が可能となる。
合した酵素と、前記の一般式〔化４〕で表されるインド
リル誘導体との反応による発色時間を短縮することがで
きるため、検体中に含まれる微量の測定対象物であって
も短時間での測定が可能となる。
【００４３】前記フリーラジカル化合物及び／又は前記
キレート化合物は、ろ紙上に点着して展開液中に添加す
ることができる。
キレート化合物は、ろ紙上に点着して展開液中に添加す
ることができる。
【００４４】本発明に用いる基質の前記一般式〔化４〕
で表されるインドリル誘導体は、反応によって生成する
色素が水不溶性のインジゴ色素であるため、ろ紙を用い
たイムノクロマト法、イムノブロット法等に好適に用い
られる。
で表されるインドリル誘導体は、反応によって生成する
色素が水不溶性のインジゴ色素であるため、ろ紙を用い
たイムノクロマト法、イムノブロット法等に好適に用い
られる。
【００４５】この色素の測定は、反応によって所定時間
後に生ずるインジゴ色素の発色を、目視により標準カラ
ーチャートと比較することにより、さらに、色彩色差
計、吸光光度計等の測定機器を用いることにより行うこ
とができる。
後に生ずるインジゴ色素の発色を、目視により標準カラ
ーチャートと比較することにより、さらに、色彩色差
計、吸光光度計等の測定機器を用いることにより行うこ
とができる。
【００４６】本発明の適用によるＥＩＡの測定対象物と
しては、生体内に存在する物質、薬剤等であり、例え
ば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬
剤、サイロキシン、エストロゲン、エラストラジオール
等の低分子ホルモン、ＣＥＡ、ＡＦＰ、便中ヘモグロビ
ン（ＦＯＢＴ）等の癌マーカー、ヒト免疫不全ウイル
ス、（ＨＩＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴ
ＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）等のウイルス、梅毒トレポネマ（トレポネ
ーマ・パリダム；ＴＰ）等の原虫、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−
１、ＩＬ−２、ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、Ｐ
ＤＧＦ等の各種グロースファクター、さらに、前記ウイ
ルスの適当なＤＮＡ、ＲＮＡ等、ＣＲＰ等の炎症に関連
するタンパク質等の抗原、及びこれら抗原に対する抗体
等が挙げられる。
しては、生体内に存在する物質、薬剤等であり、例え
ば、テオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬
剤、サイロキシン、エストロゲン、エラストラジオール
等の低分子ホルモン、ＣＥＡ、ＡＦＰ、便中ヘモグロビ
ン（ＦＯＢＴ）等の癌マーカー、ヒト免疫不全ウイル
ス、（ＨＩＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴ
ＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）等のウイルス、梅毒トレポネマ（トレポネ
ーマ・パリダム；ＴＰ）等の原虫、甲状腺刺激ホルモン
（ＴＳＨ）、インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−
１、ＩＬ−２、ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、Ｐ
ＤＧＦ等の各種グロースファクター、さらに、前記ウイ
ルスの適当なＤＮＡ、ＲＮＡ等、ＣＲＰ等の炎症に関連
するタンパク質等の抗原、及びこれら抗原に対する抗体
等が挙げられる。
【００４７】前記抗原、抗体等の測定に用いられる検体
としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、リンパ液等
の体液、便抽出液等が挙げられる。
としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、リンパ液等
の体液、便抽出液等が挙げられる。
【００４８】
【実施例】以下、実施例及び参考例により本発明を、さ
らに詳細に説明する。
らに詳細に説明する。
【００４９】参考例１；アルカリ性ホスファターゼ標識
ＴＰ１７抗原の作製 リコンビナントＴＰ１７抗原０．１２ｍｇに２−イミノ
チオラン１００ｎｍｏｌを加え、温度３０℃で３０分間
放置し、抗原にチオール基を導入した。ついで、アルカ
リ性ホスファターゼ３ｍｇにＮ−スクシイミジル−４−
マレイミドブチレイト（ＧＭＢＳ；同仁化学社製）３０
０ｎｍｏｌを加え、温度３０℃で６０分間放置しマレイ
ミド基を導入した。その後、チオール化ＴＰ１７抗原１
００μｇと、マレイミド化アルカリ性ホスファターゼ
２．５ｍｇを混合し、温度４℃で一昼夜カップリング反
応を行い、ゲルろ過により精製し、標識体の活性のあっ
た分画を分取してアルカリ性ホスファターゼ標識したリ
コンビナントＴＰ１７抗原（以下、アルカリ性ホスファ
ターゼ標識ＴＰ１７抗原という。）を得た。
ＴＰ１７抗原の作製 リコンビナントＴＰ１７抗原０．１２ｍｇに２−イミノ
チオラン１００ｎｍｏｌを加え、温度３０℃で３０分間
放置し、抗原にチオール基を導入した。ついで、アルカ
リ性ホスファターゼ３ｍｇにＮ−スクシイミジル−４−
マレイミドブチレイト（ＧＭＢＳ；同仁化学社製）３０
０ｎｍｏｌを加え、温度３０℃で６０分間放置しマレイ
ミド基を導入した。その後、チオール化ＴＰ１７抗原１
００μｇと、マレイミド化アルカリ性ホスファターゼ
２．５ｍｇを混合し、温度４℃で一昼夜カップリング反
応を行い、ゲルろ過により精製し、標識体の活性のあっ
た分画を分取してアルカリ性ホスファターゼ標識したリ
コンビナントＴＰ１７抗原（以下、アルカリ性ホスファ
ターゼ標識ＴＰ１７抗原という。）を得た。
【００５０】各分画のアルカリ性ホスファターゼ標識Ｔ
Ｐ１７抗原活性の確認は、以下のようにして行った。
Ｐ１７抗原活性の確認は、以下のようにして行った。
【００５１】幅５ｍｍ、長さ３０ｍｍのニトロセルロー
ス膜（ミリポア社製）の上端から１５ｍｍの位置に、リ
コンビナントＴＰ１７抗原３μｌを点着し、温度３７℃
で３０分間乾燥させ、これを試験片とした。この試験片
の上端に、ろ紙（厚さ１ｍｍ，巾１０ｍｍ，長さ１５ｍ
ｍ；ワットマンＷＦ１．５；ワットマン社製）が試験片
に５ｍｍ重なるように固定した。前記ゲルろ過により得
られた各分画２５μｌ、及びＴＰ抗体陽性血清２５μｌ
を試験管に取り混合し、この混合液にＴＰ１７抗原点着
試験片の下端を浸し５分間放置した。つぎに、０．０５
％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸
（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）を含有する
溶液２５０μｌが入つた試験管に試験片を移し、１０分
間放置した。アルカリ性ホスファターゼ標識ＴＰ１７抗
原の存在したゲルろ過分画を使用した試験片は、抗原点
着部位が青く発色した。
ス膜（ミリポア社製）の上端から１５ｍｍの位置に、リ
コンビナントＴＰ１７抗原３μｌを点着し、温度３７℃
で３０分間乾燥させ、これを試験片とした。この試験片
の上端に、ろ紙（厚さ１ｍｍ，巾１０ｍｍ，長さ１５ｍ
ｍ；ワットマンＷＦ１．５；ワットマン社製）が試験片
に５ｍｍ重なるように固定した。前記ゲルろ過により得
られた各分画２５μｌ、及びＴＰ抗体陽性血清２５μｌ
を試験管に取り混合し、この混合液にＴＰ１７抗原点着
試験片の下端を浸し５分間放置した。つぎに、０．０５
％の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸
（ＢＣＩＰ；ベーリンガーマンハイム社製）を含有する
溶液２５０μｌが入つた試験管に試験片を移し、１０分
間放置した。アルカリ性ホスファターゼ標識ＴＰ１７抗
原の存在したゲルろ過分画を使用した試験片は、抗原点
着部位が青く発色した。
【００５２】実施例１；抗ＴＰ１７抗体測定用の試験片 幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポ
ア社製）の上端から1５ｍｍの位置にリコンビナントＴ
Ｐ１７抗原を塗布装置（ショットマスター；武蔵エンジ
ニアリング社製）でライン状に点着後乾燥し、吸着固定
化して検出部位を作成した。また、ニトロセルロース膜
の上５ｍｍには、巾１０ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ワ
ットマン社ＷＦワインフィル夕ー１．５）を付設し、吸
収パッドとした。参考例１で製造したアルカリ性ホスフ
ァ夕ーゼ標識ＴＰ１７抗原溶液２０μｌを、幅５ｍｍ、
長さ５ｍｍに切つたＰＶＡシート（ベルイータ；カネボ
ウ社製）に点着後、乾燥し、このシート（標識体パッ
ド）を、ニトロセルロース膜の上端から２５ｍｍの位置
に置いた。この部分は検体滴下部となる。
ア社製）の上端から1５ｍｍの位置にリコンビナントＴ
Ｐ１７抗原を塗布装置（ショットマスター；武蔵エンジ
ニアリング社製）でライン状に点着後乾燥し、吸着固定
化して検出部位を作成した。また、ニトロセルロース膜
の上５ｍｍには、巾１０ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ワ
ットマン社ＷＦワインフィル夕ー１．５）を付設し、吸
収パッドとした。参考例１で製造したアルカリ性ホスフ
ァ夕ーゼ標識ＴＰ１７抗原溶液２０μｌを、幅５ｍｍ、
長さ５ｍｍに切つたＰＶＡシート（ベルイータ；カネボ
ウ社製）に点着後、乾燥し、このシート（標識体パッ
ド）を、ニトロセルロース膜の上端から２５ｍｍの位置
に置いた。この部分は検体滴下部となる。
【００５３】さらに、基質液の点着および展開のため、
ニトロセルロース膜の下端１０ｍｍの位置に幅５ｍｍ、
長さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社ＡＰ２５）を付設し
た。この部分に、２０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ液を５μｌ
点着した。さらに、基質パッドに、それぞれ５０ｍＭの
ＥＤＴＡ−Ｃｕ／１０μｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ−Ｆ
ｅ/ ５μｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃｏ／１０μｌ、５
０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎｄ／１０μｌを点着した。この部
位は、基質液パッドとなる。以上の方法に従って、抗Ｔ
Ｐ１７抗体測定用の試験片を作製した。比較例として、
基質パッドにキレート化合物を添加しない試験片（コン
トロール）を作製した。
ニトロセルロース膜の下端１０ｍｍの位置に幅５ｍｍ、
長さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社ＡＰ２５）を付設し
た。この部分に、２０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ液を５μｌ
点着した。さらに、基質パッドに、それぞれ５０ｍＭの
ＥＤＴＡ−Ｃｕ／１０μｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ−Ｆ
ｅ/ ５μｌ、５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃｏ／１０μｌ、５
０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎｄ／１０μｌを点着した。この部
位は、基質液パッドとなる。以上の方法に従って、抗Ｔ
Ｐ１７抗体測定用の試験片を作製した。比較例として、
基質パッドにキレート化合物を添加しない試験片（コン
トロール）を作製した。
【００５４】実施例２；抗ＴＰ１７抗体の測定 実施例１で作製した試験片の検体滴下部に、抗ＴＰ抗体
陽性被検液（ＴＰＰＡ価２０，４０，８０倍）１５μｌ
を点着後、１００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを基質パ
ッドに滴下し、吸収展開させ、反応を開始した。陽性検
出時間を目視によって測定した。その結果を〔表１〕に
示す。
陽性被検液（ＴＰＰＡ価２０，４０，８０倍）１５μｌ
を点着後、１００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを基質パ
ッドに滴下し、吸収展開させ、反応を開始した。陽性検
出時間を目視によって測定した。その結果を〔表１〕に
示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】参考例２；アルカリ性ホスファターゼ標識
抗体の作製 ウサギＩｇＧ抗体３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍ
Ｍ，ｐＨ４．７）４ｍｌに溶解し、これにｐ−キノン３
０ｍｇ／ｍｌ・エチルアルコール溶液を加え、室温で２
時間暗所で反応させた。反応後、溶液を1 ５０ｍＭ塩化
ナトリウムで平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア社
製）で緩衝液を置換し目的物を得た。このＩｇＧ ｐ−
キノン付加物溶液に、アルカリ性ホスファターゼ３０ｍ
ｇ（オリエンタル社；２５００ＩＵ／ｍｇ）を加え、冷
所（温度４〜１０℃）で１８時間反応させた。反応終了
後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−１００（ファルマシア社製）を
用いて精製し、アルカリ性ホスファターゼ標識抗体を得
た。
抗体の作製 ウサギＩｇＧ抗体３０ｍｇを、リン酸緩衝液（５０ｍ
Ｍ，ｐＨ４．７）４ｍｌに溶解し、これにｐ−キノン３
０ｍｇ／ｍｌ・エチルアルコール溶液を加え、室温で２
時間暗所で反応させた。反応後、溶液を1 ５０ｍＭ塩化
ナトリウムで平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア社
製）で緩衝液を置換し目的物を得た。このＩｇＧ ｐ−
キノン付加物溶液に、アルカリ性ホスファターゼ３０ｍ
ｇ（オリエンタル社；２５００ＩＵ／ｍｇ）を加え、冷
所（温度４〜１０℃）で１８時間反応させた。反応終了
後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−１００（ファルマシア社製）を
用いて精製し、アルカリ性ホスファターゼ標識抗体を得
た。
【００５７】実施例３；キレート化合物又はラジカル化
合物による発色時間の測定 参考例２で作製したアルカリ性ホスファターゼ標識抗体
を、Ｔｒｉｓ−塩酸酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．
５，０．１ｍＭ塩化亜鉛）で５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎ
ｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、それぞれ幅
５ｍｍ, 長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア
社製）の上端から1 ５ｍｍの位置に、塗布装置（ショッ
トマスター；武蔵エンジニアリング社製）でライン状に
点着後乾燥し、吸着固定化した。さらに、このニトロセ
ルロース膜に、実施例１と同様にして、ニトロセルロー
ス膜の両端に基質パッドおよび吸収パッドを付設した。
合物による発色時間の測定 参考例２で作製したアルカリ性ホスファターゼ標識抗体
を、Ｔｒｉｓ−塩酸酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．
５，０．１ｍＭ塩化亜鉛）で５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎ
ｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、それぞれ幅
５ｍｍ, 長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア
社製）の上端から1 ５ｍｍの位置に、塗布装置（ショッ
トマスター；武蔵エンジニアリング社製）でライン状に
点着後乾燥し、吸着固定化した。さらに、このニトロセ
ルロース膜に、実施例１と同様にして、ニトロセルロー
ス膜の両端に基質パッドおよび吸収パッドを付設した。
【００５８】ついで、３種類の濃度を点着したニトロセ
ルロース膜（アルカリ性ホスファターゼ標識抗体濃度５
０，１００，１５０ｎｇ／ｍｌ塗布）の基質パッドに、
２０ｍｇ／ｍｌ−ＢＣＩＰを５μｌづつ点着し、さら
に、１００ｍＭ ＥＤＴＡ- Ｃｕ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
−Ｆｅ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｚｎ、１００ｍＭ ４
−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−
１−オキシルラジカル（ＡＡＱ−２；同仁化学社製）を
それぞれ５μｌづつ点着し、温度３７℃で１０分間乾燥
させて試験片を作製した。この試験片の基質パッドに、
ＣＨＥＳ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴下し基質を展開
させた。目視によって発色が確認できるまでの時間を計
測した。キレート化合物又はラジカル化合物を、基質パ
ッドに添加しないコントロールの試験片と共に、その結
果を〔表２〕に示す。
ルロース膜（アルカリ性ホスファターゼ標識抗体濃度５
０，１００，１５０ｎｇ／ｍｌ塗布）の基質パッドに、
２０ｍｇ／ｍｌ−ＢＣＩＰを５μｌづつ点着し、さら
に、１００ｍＭ ＥＤＴＡ- Ｃｕ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ
−Ｆｅ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｚｎ、１００ｍＭ ４
−オキソ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−
１−オキシルラジカル（ＡＡＱ−２；同仁化学社製）を
それぞれ５μｌづつ点着し、温度３７℃で１０分間乾燥
させて試験片を作製した。この試験片の基質パッドに、
ＣＨＥＳ緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴下し基質を展開
させた。目視によって発色が確認できるまでの時間を計
測した。キレート化合物又はラジカル化合物を、基質パ
ッドに添加しないコントロールの試験片と共に、その結
果を〔表２〕に示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】実施例４；ＥＤＴＡ−Ｆｅ添加の発色時間
の測定 実施例３で作製した試験片（アルカリ性ホスファターゼ
標識抗体濃度１５０ｎｇ／ｍｌ塗布膜）５枚を用意し、
これに付設した基質パッドそれぞれに、ＢＣＩＰ２０ｍ
ｇ／ｍｌ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ２μｌ、５
μｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ１μｌ、２μｌ、５
μｌづつ点着し、温度３７℃で１０分間乾燥させた。こ
の基質パッドに、１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１
０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴
下を展開させた。目視によって発色が確認できるまでの
時間を測定した。その結果を〔表３〕に示す。
の測定 実施例３で作製した試験片（アルカリ性ホスファターゼ
標識抗体濃度１５０ｎｇ／ｍｌ塗布膜）５枚を用意し、
これに付設した基質パッドそれぞれに、ＢＣＩＰ２０ｍ
ｇ／ｍｌ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ２μｌ、５
μｌ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ１μｌ、２μｌ、５
μｌづつ点着し、温度３７℃で１０分間乾燥させた。こ
の基質パッドに、１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１
０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴
下を展開させた。目視によって発色が確認できるまでの
時間を測定した。その結果を〔表３〕に示す。
【００６１】
【表３】
【００６２】実施例５；ＨＢｓ抗原測定試験片幅５ｍｍ×長さ５．０ｃｍの ニトロセルロース膜（Ｈｉ
−Ｆｌｏｗメンブラン；ミリポア社製）の上端から1 ５
ｍｍのところに、リン酸緩衝液に置換した抗ＨＢｓ抗体
２．８６μｇを点着し、乾燥した。さらに、アルカリフ
ォスファ夕ーゼ標識抗ＨＢｓ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ社製；平均分子量＝３５万）をリン酸緩衝液に置
換し、標識体パッドに０．１６μｇ、基質パッドには、
ＢＣＩＰ（べーリンガーマンハイム社製；０．１２５ｍ
ｇ）を、それぞれ点着乾燥した。展開液には、１００ｍ
ＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．５，１ｍＭ塩化マグネシ
ウム入り）を使用し、これに５００ｍＭ ＡＡＱ−２
（同仁化学社製）を加え、終濃度を５ｍＭとした。展開
液ポット部、検体滴下窓及び検出窓を備えたプラスチッ
ク製のケースに、前記ニトロセルロース膜、基質パッ
ド、標識体パッド、吸収パッドを配置してＨＢｓ抗原測
定試験片を作製した。
−Ｆｌｏｗメンブラン；ミリポア社製）の上端から1 ５
ｍｍのところに、リン酸緩衝液に置換した抗ＨＢｓ抗体
２．８６μｇを点着し、乾燥した。さらに、アルカリフ
ォスファ夕ーゼ標識抗ＨＢｓ抗体（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄ
ｉｅｓ社製；平均分子量＝３５万）をリン酸緩衝液に置
換し、標識体パッドに０．１６μｇ、基質パッドには、
ＢＣＩＰ（べーリンガーマンハイム社製；０．１２５ｍ
ｇ）を、それぞれ点着乾燥した。展開液には、１００ｍ
ＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．５，１ｍＭ塩化マグネシ
ウム入り）を使用し、これに５００ｍＭ ＡＡＱ−２
（同仁化学社製）を加え、終濃度を５ｍＭとした。展開
液ポット部、検体滴下窓及び検出窓を備えたプラスチッ
ク製のケースに、前記ニトロセルロース膜、基質パッ
ド、標識体パッド、吸収パッドを配置してＨＢｓ抗原測
定試験片を作製した。
【００６３】比較例として、展開液にはＡＡＱ−２を含
まない１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１
ｍＭ塩化マグネシウム入り）を用い、ＨＢｓ抗原測定試
験片（コントロール）を作製した。
まない１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１
ｍＭ塩化マグネシウム入り）を用い、ＨＢｓ抗原測定試
験片（コントロール）を作製した。
【００６４】実施例６；ＨＢｓ抗原の測定 実施例５で作製した試験片を用い、各濃度のＨＢｓ抗原
（１８．５Ｕ／ｍｌ，８．５Ｕ／ｍｌ，４．２Ｕ／ｍ
ｌ，２．２Ｕ／ｍｌ，１．１Ｕ／ｍｌ）を含む血清２５
μｌを、標識体パッドに設けた検体滴下部に滴下し、直
後に展開液ポット部を押し、展開液をニトロセルロース
膜に展開させ、陽性検出時間を測定した。コントロール
と共に、その３回の測定結果を〔表４〕に示す。
（１８．５Ｕ／ｍｌ，８．５Ｕ／ｍｌ，４．２Ｕ／ｍ
ｌ，２．２Ｕ／ｍｌ，１．１Ｕ／ｍｌ）を含む血清２５
μｌを、標識体パッドに設けた検体滴下部に滴下し、直
後に展開液ポット部を押し、展開液をニトロセルロース
膜に展開させ、陽性検出時間を測定した。コントロール
と共に、その３回の測定結果を〔表４〕に示す。
【００６５】
【表４】
【００６６】実施例７；抗ＨＢｓ抗体測定用試験片幅５ｍｍ×長さ５．０ｃｍの セルロース膜（ミリポア社
製）の上端からI ５ｍｍのところに、リン酸バッファに
置換したＨＢｓ抗原（明治乳業社製）０．７μｇを点
着、乾燥した。また、ＨＢｓ抗原と、アルカリホスファ
夕ーゼをマレイミド−ヒンジ法（酵素標識法１頁、石川
栄治著；学会出版センター）に従い反応させ、アルカリ
ホスファ夕ーゼ標識ＨＢｓ抗原（平均分子量＝約３００
万）を得た。本標識抗原をリン酸緩衝液に置換し、標識
体パッド０．０２５μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ
（０．１ｍｇ）をそれぞれ点着乾燥した。展開液には、
グッドバッファを使用し、更に５００ｍＭのＡＡＱ−２
（同人化学社製）を加えて終濃度を５ｍＭとし、セルロ
ース膜、基質パッド、標識体パッド及び吸収パッドを、
前記プラスチック製のケースに配置して抗ＨＢｓ抗体測
定用試験片を作製した。
製）の上端からI ５ｍｍのところに、リン酸バッファに
置換したＨＢｓ抗原（明治乳業社製）０．７μｇを点
着、乾燥した。また、ＨＢｓ抗原と、アルカリホスファ
夕ーゼをマレイミド−ヒンジ法（酵素標識法１頁、石川
栄治著；学会出版センター）に従い反応させ、アルカリ
ホスファ夕ーゼ標識ＨＢｓ抗原（平均分子量＝約３００
万）を得た。本標識抗原をリン酸緩衝液に置換し、標識
体パッド０．０２５μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ
（０．１ｍｇ）をそれぞれ点着乾燥した。展開液には、
グッドバッファを使用し、更に５００ｍＭのＡＡＱ−２
（同人化学社製）を加えて終濃度を５ｍＭとし、セルロ
ース膜、基質パッド、標識体パッド及び吸収パッドを、
前記プラスチック製のケースに配置して抗ＨＢｓ抗体測
定用試験片を作製した。
【００６７】比較例として、展開液にはＡＡＱ−２を含
まない１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１
ｍＭ塩化マグネシウム入り）を用い、抗ＨＢｓ抗体測定
用試験片（コントロール）を作製した。
まない１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１
ｍＭ塩化マグネシウム入り）を用い、抗ＨＢｓ抗体測定
用試験片（コントロール）を作製した。
【００６８】実施例８；抗ＨＢｓ抗体の測定 実施例７で作製した試験片を用い、各濃度の抗ＨＢｓ抗
体（３０ｍＵ／ｍｌ，１９．０ｍＵ／ｍｌ，９．６ｍＵ
／ｍｌ，５．０ｍＵ／ｍｌ，２．５ｍＵ／ｍｌ，１．２
ｍＵ／ｍｌ）を含む血清２５μｌを検体滴下部に滴下
し、直後に展開液ポット部を押し、展開液を展開させ、
陽性検出時間を目視で測定した。コントロールと共に、
その３回の測定結果を〔表５〕に示す。
体（３０ｍＵ／ｍｌ，１９．０ｍＵ／ｍｌ，９．６ｍＵ
／ｍｌ，５．０ｍＵ／ｍｌ，２．５ｍＵ／ｍｌ，１．２
ｍＵ／ｍｌ）を含む血清２５μｌを検体滴下部に滴下
し、直後に展開液ポット部を押し、展開液を展開させ、
陽性検出時間を目視で測定した。コントロールと共に、
その３回の測定結果を〔表５〕に示す。
【００６９】
【表５】
【００７０】実施例９；各ＡＡＱ−２濃度での発色量の
測定幅５ｍｍ×長さ５．０ｃｍの ニトロセルロース膜（ミリ
ポア社製）の上端から1 ５ｍｍのところに、アルカリ性
ホスファターゼ標識抗体（平均分子量＝３０万）８０ｎ
ｇを点着乾燥し、展開液にＡＡＱ−２（１．２５ｍＭ，
２．５ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ）をそれぞれ
加えた１００ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（０．１
ｍＭ−ＭｇＣｌ2 ）を用いた。さらに、基質パッドに
は、ＢＣＩＰ（０．１ｍｇ）を点着、乾燥した。この試
験片の展開部ポットを押し、展開液を展開させ、１５分
後におけるアルカリ性ホスファターゼ標識抗体点着上の
発色強度を、色差計（ミノルタ社製）によって測定し
た。展開液にＡＡＱ−２を添加しない試験片を比較例と
して、その結果を図１に示す。
測定幅５ｍｍ×長さ５．０ｃｍの ニトロセルロース膜（ミリ
ポア社製）の上端から1 ５ｍｍのところに、アルカリ性
ホスファターゼ標識抗体（平均分子量＝３０万）８０ｎ
ｇを点着乾燥し、展開液にＡＡＱ−２（１．２５ｍＭ，
２．５ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ）をそれぞれ
加えた１００ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（０．１
ｍＭ−ＭｇＣｌ2 ）を用いた。さらに、基質パッドに
は、ＢＣＩＰ（０．１ｍｇ）を点着、乾燥した。この試
験片の展開部ポットを押し、展開液を展開させ、１５分
後におけるアルカリ性ホスファターゼ標識抗体点着上の
発色強度を、色差計（ミノルタ社製）によって測定し
た。展開液にＡＡＱ−２を添加しない試験片を比較例と
して、その結果を図１に示す。
【００７１】
【発明の効果】本発明の発色方法は、インドリル誘導体
と、酵素とを反応させて発色させるに際して、フリーラ
ジカル化合物及び／又はキレート化合物を添加すること
によって、従来の方法に比べインジゴ色素の生成を促進
し、測定までに要する時間を短縮することができる。
と、酵素とを反応させて発色させるに際して、フリーラ
ジカル化合物及び／又はキレート化合物を添加すること
によって、従来の方法に比べインジゴ色素の生成を促進
し、測定までに要する時間を短縮することができる。
【００７２】また、本発明の発色方法を使用したＥＩ
Ａ、および該ＥＩＡを組み込んだイムノクロマト法は、
測定時間が短縮され、さらに、微量物質の高感度測定が
可能となった。
Ａ、および該ＥＩＡを組み込んだイムノクロマト法は、
測定時間が短縮され、さらに、微量物質の高感度測定が
可能となった。
【図１】ＡＡＱ−２濃度を変えて発色量を測定した図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−181399（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−298997（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−129996（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 G01N 33/535 - 33/543 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (11)
- 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ1 は酵素分解性基、Ｒ 2及びＲ3 は水素原子
又はハロゲン原子である。）で表されるインドリル誘導
体に酵素を作用させる発色方法において、一般式 【化２】 （式中、Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン
鎖であり、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボ
ニル基を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は水
素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表さ
れるフリーラジカル化合物、及び／又は一般式 【化３】 （Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキサン−１，２−ジイ
ル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、コバルト、インジュ
ウム、ネオジム、マンガン又はユウロピウムである。）
で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキ
レート化合物の存在下に発色を行うことを特徴とする発
色方法。 - 【請求項２】 前記一般式〔化２〕の式中のＲ4 、
Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は、炭素数１〜３のアルキル基であ
る請求項１に記載の発色方法。 - 【請求項３】 前記一般式〔化２〕の式中の炭素数２〜
３のメチレン鎖への置換基は、水酸基、カルボキシル
基、カルバモイル基又はアミノ基である請求項１に記載
の発色方法。 - 【請求項４】 前記一般式〔化３〕の式中のジアミン誘
導体は、エチレンジアミン四酢酸、又はｔｒａｎｓ−
１，２−ジアミンシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸である請求項１に記載の発色方法。 - 【請求項５】 前記酵素は、ホスファターゼであり、前
記一般式〔化１〕の式中のＲ1 が−ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で
表される脱離基（Ｍは水素原子、アルカリ金属又はトル
イジンである。）である請求項１乃至４のいづれか１項
に記載の発色方法。 - 【請求項６】 前記酵素は、β−ガラクトシダーゼであ
り、前記一般式〔化１〕の式中の脱離基Ｒ1 がβ−Ｄ−
ガラクトピラノシル基である請求項１乃至４のいづれか
１項に記載の発色方法。 - 【請求項７】 前記酵素は、β−グルコシダーゼであ
り、前記一般式〔化１〕の式中の脱離基Ｒ1 がβ−Ｄ−
グルコピラノシル基である請求項１乃至４のいづれか１
項に記載の発色方法。 - 【請求項８】 酵素標識抗体又は抗原の酵素活性を、請
求項１に記載の一般式〔化１〕で表されるインドリル誘
導体を用いて測定する酵素免疫測定法において、請求項
１に記載の一般式〔化２〕で表されるフリーラジカル化
合物、及び／又は請求項１に記載の一般式〔化３〕で表
されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキレー
ト化合物の存在下に発色させることを特徴とする酵素免
疫測定方法。 - 【請求項９】 前記酵素標識抗体又は抗原は、固相に免
疫複合体を形成して結合した酵素標識抗体又は抗原であ
る請求項８に記載の酵素免疫測定法。 - 【請求項１０】 固相の検出部位に結合した酵素標識抗
体又は抗原の酵素活性を、請求項１に記載の一般式〔化
１〕で表されるインドリル誘導体を用いて測定するイム
ノクロマト法において、請求項１に記載の一般式〔化
２〕で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は請求
項１に記載の一般式〔化３〕で表されるジアミン誘導体
と金属との錯体を形成したキレート化合物との存在下に
発色させることを特徴とするイムノクロマト法。 - 【請求項１１】 前記固相は、ろ紙である請求項１０に
記載のイムノクロマト法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19359998A JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18324897 | 1997-06-25 | ||
| JP9-183248 | 1997-06-25 | ||
| JP19359998A JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1169996A JPH1169996A (ja) | 1999-03-16 |
| JP3177964B2 true JP3177964B2 (ja) | 2001-06-18 |
Family
ID=26501764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19359998A Expired - Lifetime JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3177964B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4647742B2 (ja) * | 2000-03-13 | 2011-03-09 | 三菱化学メディエンス株式会社 | アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬 |
| WO2005111616A1 (ja) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Toray Industries, Inc. | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP4839674B2 (ja) * | 2004-05-14 | 2011-12-21 | 東レ株式会社 | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP6357779B2 (ja) * | 2013-01-17 | 2018-07-18 | 東洋紡株式会社 | 酵素の安定化方法 |
-
1998
- 1998-06-25 JP JP19359998A patent/JP3177964B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1169996A (ja) | 1999-03-16 |
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