JPH1169996A - 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 - Google Patents
発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法Info
- Publication number
- JPH1169996A JPH1169996A JP19359998A JP19359998A JPH1169996A JP H1169996 A JPH1169996 A JP H1169996A JP 19359998 A JP19359998 A JP 19359998A JP 19359998 A JP19359998 A JP 19359998A JP H1169996 A JPH1169996 A JP H1169996A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- group
- general formula
- indolyl
- represented
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 インドリル誘導体に酵素を作用させる発色方
法で、発色時間を短縮する方法、この発色方法を用いる
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びこのＥＩＡを組み込んだ
イムノクロマト法の提供。 【解決手段】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ1 は酵素分解性基であり、Ｒ2 及びＲ3 は水
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させて発色させる際に、一般式 【化２】 （式中、Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン
鎖であり、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボ
ニル記を含んでもよく、Ｒ 4、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は水
素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表さ
れるフリーラジカル化合物、及び／又は一般式 【化３】 で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキ
レート化合物（式中、Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキ
サン−１，２−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、
コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン又はユウ
ロピウムである。）の存在下に行う。
法で、発色時間を短縮する方法、この発色方法を用いる
酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及びこのＥＩＡを組み込んだ
イムノクロマト法の提供。 【解決手段】 一般式 【化１】 （式中、Ｒ1 は酵素分解性基であり、Ｒ2 及びＲ3 は水
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させて発色させる際に、一般式 【化２】 （式中、Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン
鎖であり、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボ
ニル記を含んでもよく、Ｒ 4、Ｒ5 、Ｒ6 及びＲ7 は水
素原子又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表さ
れるフリーラジカル化合物、及び／又は一般式 【化３】 で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキ
レート化合物（式中、Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキ
サン−１，２−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、
コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン又はユウ
ロピウムである。）の存在下に行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般式
【化４】 （式中、Ｒ1 は酵素分解性基であり、Ｒ 2及びＲ3 は水
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させる発色法において、一般式
素原子又はハロゲン原子である。）で表されるインドリ
ル誘導体に酵素を作用させる発色法において、一般式
【０００２】
【化５】 （Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン鎖であ
り、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基
を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及びＲ 7は水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表されるフ
リーラジカル化合物及び／又は一般式
り、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基
を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及びＲ 7は水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。）で表されるフ
リーラジカル化合物及び／又は一般式
【０００３】
【化６】 で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキ
レート化合物（式中、Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキ
サン−１，２−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、
コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン又はユウ
ロピウムである。）との存在下に行う方法に関する。さ
らに、本発明は、この発色方法を用いる酵素免疫測定法
（以下ＥＩＡという）及び該ＥＩＡを組み込んだイムノ
クロマト法に関する。
レート化合物（式中、Ｒ8 はエチレン基又はシクロヘキ
サン−１，２−ジイル基であり、金属は鉄、銅、亜鉛、
コバルト、インジュウム、ネオジム、マンガン又はユウ
ロピウムである。）との存在下に行う方法に関する。さ
らに、本発明は、この発色方法を用いる酵素免疫測定法
（以下ＥＩＡという）及び該ＥＩＡを組み込んだイムノ
クロマト法に関する。
【０００４】
【従来の技術】従来、イムノブロット法、イムノクロマ
ト法等でインドリル誘導体が発色基質として用いられて
いた（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，
Ｖｏｌ．１２１，４９７−５０９（１９８６）；特開平
９−１３３６８１号等参照）。これらの方法では、ニト
ロセルロース膜に免疫反応によって結合した酵素の活性
を、インドリル誘導体を用いて測定することが行われて
いる。インドリル誘導体は、酵素と反応してインジゴ色
素を生じ、時間の経過とともにニトロセルロース膜上に
沈着するため、目視による測定が可能である。
ト法等でインドリル誘導体が発色基質として用いられて
いた（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，
Ｖｏｌ．１２１，４９７−５０９（１９８６）；特開平
９−１３３６８１号等参照）。これらの方法では、ニト
ロセルロース膜に免疫反応によって結合した酵素の活性
を、インドリル誘導体を用いて測定することが行われて
いる。インドリル誘導体は、酵素と反応してインジゴ色
素を生じ、時間の経過とともにニトロセルロース膜上に
沈着するため、目視による測定が可能である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】イムノブロット法では
インドリル誘導体を酵素と反応させて発色測定を行うま
でに２０分から６０分を必要とするため、反応時間を短
縮することが求められていた。また、イムノクロマト法
では、検体をニトロセルロース膜に点着しインドリル誘
導体を含む展開液を展開させた後、検出部位の発色量を
測定して結果を得るまでに、少なくとも１０分、通常は
１５分間から数時間を要するため、イムノクロマト法の
特徴である簡便性を生かした緊急検査への対応には、更
なる測定時間の短縮が求められていた。
インドリル誘導体を酵素と反応させて発色測定を行うま
でに２０分から６０分を必要とするため、反応時間を短
縮することが求められていた。また、イムノクロマト法
では、検体をニトロセルロース膜に点着しインドリル誘
導体を含む展開液を展開させた後、検出部位の発色量を
測定して結果を得るまでに、少なくとも１０分、通常は
１５分間から数時間を要するため、イムノクロマト法の
特徴である簡便性を生かした緊急検査への対応には、更
なる測定時間の短縮が求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究し
た結果、前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
に酵素を作用させる際に、前記一般式（ＩＩ）で表され
るフリーラジカル化合物及び／又は前記キレート化合物
の存在下行うと、発色に要する時間が短縮されることを
見出し本発明を完成した。
た結果、前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
に酵素を作用させる際に、前記一般式（ＩＩ）で表され
るフリーラジカル化合物及び／又は前記キレート化合物
の存在下行うと、発色に要する時間が短縮されることを
見出し本発明を完成した。
【０００７】本発明は、前記一般式（Ｉ）で表されるイ
ンドリル誘導体のＲ1 を酵素の作用により脱離させ、こ
の分解した２分子を縮合させてインジゴ色素を生成させ
る際に、前記一般式（ＩＩ）で表されるフリーラジカル
化合物及び／又は前記キレート化合物を存在させる発色
方法である。生成するインジゴ色素は所定の反応時間経
過後、その発色を目視又は機器により測定することがで
きる。
ンドリル誘導体のＲ1 を酵素の作用により脱離させ、こ
の分解した２分子を縮合させてインジゴ色素を生成させ
る際に、前記一般式（ＩＩ）で表されるフリーラジカル
化合物及び／又は前記キレート化合物を存在させる発色
方法である。生成するインジゴ色素は所定の反応時間経
過後、その発色を目視又は機器により測定することがで
きる。
【０００８】本発明の前記一般式（ＩＩ）で表されるフ
リーラジカル化合物及び前記キレート化合物は、前記一
般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体含む反応溶液中
に添加することができる。前記一般式（ＩＩ）で表され
るフリーラジカル化合物及び／又は前記キレート化合物
は、通常前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
の基質を含む緩衝液中に添加して使用し、例えば０．１
ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２０ｍＭ程
度を用いることができる。この反応を行うには緩衝液中
で行うことが好ましく、緩衝液としては、例えばジエタ
ノールアミン−塩酸緩衝液、アミノメチルプロパンジオ
ール−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＣＨ
ＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ＣＨＥＳ：Ｎ−シクロヘキシル
−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ＣＡＰＳＯ：Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒ
ドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ
−ＮａＯＨ（ＣＡＰＳ：Ｎ−シクロヘキシル−２−アミ
ノエタンスルホン酸）緩衝液等を挙げることができる。
更に緩衝液には所望により塩化マグネシウムなどの塩類
を添加することもできる。
リーラジカル化合物及び前記キレート化合物は、前記一
般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体含む反応溶液中
に添加することができる。前記一般式（ＩＩ）で表され
るフリーラジカル化合物及び／又は前記キレート化合物
は、通常前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
の基質を含む緩衝液中に添加して使用し、例えば０．１
ｍＭから１００ｍＭ、好ましくは１ｍＭから２０ｍＭ程
度を用いることができる。この反応を行うには緩衝液中
で行うことが好ましく、緩衝液としては、例えばジエタ
ノールアミン−塩酸緩衝液、アミノメチルプロパンジオ
ール−塩酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン緩衝液、ＣＨ
ＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ＣＨＥＳ：Ｎ−シクロヘキシル
−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ＣＡＰＳＯ：Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒ
ドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ
−ＮａＯＨ（ＣＡＰＳ：Ｎ−シクロヘキシル−２−アミ
ノエタンスルホン酸）緩衝液等を挙げることができる。
更に緩衝液には所望により塩化マグネシウムなどの塩類
を添加することもできる。
【０００９】本発明に使用される前記一般式（ＩＩ）で
表されるフリーラジカル化合物は、環状のアミンオキシ
ルフリーラジカル基を有する化合物であり、Ａとしては
置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン鎖であり、該
メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基を含む
こともできる。このＡで表される基としては、例えば−
（ＣＨ2 ）3 −、−（ＣＨ2 ）2 −、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｃ
Ｈ2 −、−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＨ2 −等で表される基を挙
げることができる。前記メチレン鎖への置換基として
は、例えば水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基、
アミノ基等を挙げることができる。カルバモイル基とし
ては例えばカルバモイル基、メチルカルバモイル基、エ
チルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、フェニ
ルカルバモイル基等を挙げることができる。また、
Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及びＲ 7は同一又は異なって水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３の
アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、イソピロピル基など挙げることができる。
環を形成した窒素原子の隣接した炭素原子にアルキル基
が置換した化合物はフリーラジカル基の安定化をはかる
ことができる。
表されるフリーラジカル化合物は、環状のアミンオキシ
ルフリーラジカル基を有する化合物であり、Ａとしては
置換又は無置換の炭素数２〜３のメチレン鎖であり、該
メチレン鎖には鎖中に酸素原子又はカルボニル基を含む
こともできる。このＡで表される基としては、例えば−
（ＣＨ2 ）3 −、−（ＣＨ2 ）2 −、−ＣＨ2 −Ｏ−Ｃ
Ｈ2 −、−ＣＨ2 −ＣＯ−ＣＨ2 −等で表される基を挙
げることができる。前記メチレン鎖への置換基として
は、例えば水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基、
アミノ基等を挙げることができる。カルバモイル基とし
ては例えばカルバモイル基、メチルカルバモイル基、エ
チルカルバモイル基、プロピルカルバモイル基、フェニ
ルカルバモイル基等を挙げることができる。また、
Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及びＲ 7は同一又は異なって水素原子
又は炭素数１〜３のアルキル基である。炭素数１〜３の
アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−
プロピル基、イソピロピル基など挙げることができる。
環を形成した窒素原子の隣接した炭素原子にアルキル基
が置換した化合物はフリーラジカル基の安定化をはかる
ことができる。
【００１０】前記一般式（ＩＩ）で表されるフリーラジ
カル化合物は、既に容易に入手可能な化合物であり、例
えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル フリーラジカル、４−ヒドロキシ−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ
メチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、４
−カルバモイル−２，２，６，６−テトラメチルピペリ
ジン−１−オキシル フリーラジカル、４−アミノ−
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ
ル フリーラジカル、２，２，６，６−テトラメチルモ
ルホリン−１−オキシル フリーラジカル、２，２，
５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラ
メチルピロリジン−１−オキシル フリーラジカル、３
−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジ
ン−１−オキシル フリーラジカル、３−カルバモイル
−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキ
シル フリーラジカル、４−オキソ−２，２，６，６−
テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカ
ル（ＡＡＱ−２）等を挙げることができる。
カル化合物は、既に容易に入手可能な化合物であり、例
えば、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−
オキシル フリーラジカル、４−ヒドロキシ−２，２，
６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、４−カルボキシ−２，２，６，６−テトラ
メチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカル、４
−カルバモイル−２，２，６，６−テトラメチルピペリ
ジン−１−オキシル フリーラジカル、４−アミノ−
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ
ル フリーラジカル、２，２，６，６−テトラメチルモ
ルホリン−１−オキシル フリーラジカル、２，２，
５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル フリ
ーラジカル、３−ヒドロキシ−２，２，５，５−テトラ
メチルピロリジン−１−オキシル フリーラジカル、３
−カルボキシ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジ
ン−１−オキシル フリーラジカル、３−カルバモイル
−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキ
シル フリーラジカル、４−オキソ−２，２，６，６−
テトラメチルピペリジン−１−オキシル フリーラジカ
ル（ＡＡＱ−２）等を挙げることができる。
【００１１】また、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるジ
アミン誘導体のＲ8 はエチレン基、シクロヘキサン−
１，２−ジイル基等を挙げることができ、前記キレート
化合物としては例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘキサン−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸等へ鉄、銅、亜鉛、コバル
ト、インジュウム、ネオジム、マンガン、ユウロピウム
等の金属が配位した化合物を挙げることができる。前記
キレート化合物としては、例えばＥＤＴＡ−鉄、ＥＤＴ
Ａ−銅、ＥＤＴＡ−亜鉛、ＥＤＴＡ−コバルト、ＥＤＴ
Ａ−インジュウム、ＥＤＴＡ−マンガン、ＥＤＴＡ−ユ
ウロピウム、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘキ
サン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−鉄、ｔｒａｎｓ−
１，２−ジアミンシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸−銅等を挙げることができる。
アミン誘導体のＲ8 はエチレン基、シクロヘキサン−
１，２−ジイル基等を挙げることができ、前記キレート
化合物としては例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘキサン−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸等へ鉄、銅、亜鉛、コバル
ト、インジュウム、ネオジム、マンガン、ユウロピウム
等の金属が配位した化合物を挙げることができる。前記
キレート化合物としては、例えばＥＤＴＡ−鉄、ＥＤＴ
Ａ−銅、ＥＤＴＡ−亜鉛、ＥＤＴＡ−コバルト、ＥＤＴ
Ａ−インジュウム、ＥＤＴＡ−マンガン、ＥＤＴＡ−ユ
ウロピウム、ｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘキ
サン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸−鉄、ｔｒａｎｓ−
１，２−ジアミンシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’
−四酢酸−銅等を挙げることができる。
【００１２】一方、本発明に使用する前記一般式（Ｉ）
で表されるインドリル誘導体は、Ｒ1 が酵素分解性の脱
離基であり、例えば−ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で表される基
（Ｍは水素、アルカリ金属又はトルイジンである。）、
β−Ｄ−ガラクトピラノシル基又はβ−Ｄ−グルコピラ
ノシル基等を挙げることができる。
で表されるインドリル誘導体は、Ｒ1 が酵素分解性の脱
離基であり、例えば−ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で表される基
（Ｍは水素、アルカリ金属又はトルイジンである。）、
β−Ｄ−ガラクトピラノシル基又はβ−Ｄ−グルコピラ
ノシル基等を挙げることができる。
【００１３】酵素としてホスファターゼを使用する場合
には前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体は、
一般式
には前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体は、
一般式
【００１４】
【化７】 （式中、Ｒ2 、Ｒ3 及びＭは前記と同じである。）で表
されるインドリル誘導体、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
使用する場合には一般式
されるインドリル誘導体、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを
使用する場合には一般式
【００１５】
【化８】 （式中、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同じであり、Ｇａｌはβ
−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。）で表されるイン
ドリル誘導体、β−Ｄ−グルコシダーゼを使用する場合
には、一般式
−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。）で表されるイン
ドリル誘導体、β−Ｄ−グルコシダーゼを使用する場合
には、一般式
【００１６】
【化９】 （式中、Ｒ2 及びＲ3 は前記と同じでありＧｌｕはβ−
Ｄ−グルコピラノシル基である。）で表されるインドリ
ル誘導体等である。Ｒ2 及びＲ3 で表されるハロゲン原
子としては、例えば塩素、臭素、ヨウ素等を挙げること
ができる。Ｒ2 及びＲ3 で表されるハロゲン原子は、イ
ンドリンの４位及び／又は５位に置換基を有することが
好ましい。
Ｄ−グルコピラノシル基である。）で表されるインドリ
ル誘導体等である。Ｒ2 及びＲ3 で表されるハロゲン原
子としては、例えば塩素、臭素、ヨウ素等を挙げること
ができる。Ｒ2 及びＲ3 で表されるハロゲン原子は、イ
ンドリンの４位及び／又は５位に置換基を有することが
好ましい。
【００１７】前記一般式（Ｉａ）で表されるインドリル
誘導体において、アルカリ金属としては例えばナトリウ
ム、カリウム等を挙げるとができる。
誘導体において、アルカリ金属としては例えばナトリウ
ム、カリウム等を挙げるとができる。
【００１８】前記一般式（Ｉａ）で表されるインドリル
誘導体としては、例えば３−インドリルリン酸、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ
−６−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリル
リン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−６
−クロロ−３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−ト
ルイジン塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル
リン酸 ｐ−トルイジン塩等を挙げることができる。
誘導体としては、例えば３−インドリルリン酸、５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、５−ブロモ
−６−クロロ−３−インドリルリン酸、３−インドリル
リン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５−ブロモ−６
−クロロ−３−インドリルリン酸 ２ナトリウム塩、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸 ｐ−ト
ルイジン塩、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル
リン酸 ｐ−トルイジン塩等を挙げることができる。
【００１９】前記一般式（Ｉｂ）で表されるインドリル
誘導体としては、例えば３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
等を挙げることができる。
誘導体としては、例えば３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−６−
クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
等を挙げることができる。
【００２０】前記一般式（Ｉｃ）で表されるインドリル
誘導体としては、例えば３−インドリル−β−Ｄ−グル
コピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド等を挙
げることができる。
誘導体としては、例えば３−インドリル−β−Ｄ−グル
コピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシド、５−ブロモ−６−クロ
ロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド等を挙
げることができる。
【００２１】本発明の発色方法は、例えば酵素標識試薬
を用いるＥＩＡ、イムノクロマト法、イムノブロット
法、電気泳動によるホスファターゼ類のアイソザイム分
析、組織染色、酵素を標識物とするＤＮＡ、ＲＮＡ等の
遺伝子測定等に使用することができる。
を用いるＥＩＡ、イムノクロマト法、イムノブロット
法、電気泳動によるホスファターゼ類のアイソザイム分
析、組織染色、酵素を標識物とするＤＮＡ、ＲＮＡ等の
遺伝子測定等に使用することができる。
【００２２】ＥＩＡでは前記酵素で標識した抗原又は抗
体からなる酵素標識試薬、固相に結合させた抗原又は抗
体からなる固相試薬等を組み合わせて周知の方法に従い
測定を行うことができる。酵素標識試薬は、前記酵素と
抗原又は抗体とを共有結合又は非共有結合を作る方法を
利用して製造することができる。共有結合による方法と
しては、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、周知の
各種架橋剤（マレイミド試薬等）を用いる方法等を挙げ
ることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１
号，３７〜４５頁（１９８７）参照）。一方、非共有結
合による方法としては前記酵素と抗体又は抗原とを物理
吸着させて製造することができる。
体からなる酵素標識試薬、固相に結合させた抗原又は抗
体からなる固相試薬等を組み合わせて周知の方法に従い
測定を行うことができる。酵素標識試薬は、前記酵素と
抗原又は抗体とを共有結合又は非共有結合を作る方法を
利用して製造することができる。共有結合による方法と
しては、例えばグルタールアルデヒド法、過ヨウ素酸
法、マレイミド法、ピリジル・ジスルフィド法、周知の
各種架橋剤（マレイミド試薬等）を用いる方法等を挙げ
ることができる（例えば「蛋白質核酸酵素」別冊３１
号，３７〜４５頁（１９８７）参照）。一方、非共有結
合による方法としては前記酵素と抗体又は抗原とを物理
吸着させて製造することができる。
【００２３】また、固相試薬は従来のＥＩＡに使用され
る各種免疫測定用の固相に抗体又は抗原を結合させて製
造することができる。固相としては、プラスチック製の
試験管、プラスチック製のマイクロプレートウエル、ポ
リスチレン等のラテックス粒子、ガラスビーズ、プラス
チックビーズ等のビーズ、セルロース、ニトロセルロー
ス、グラスウール等の膜からなる各種ろ紙、磁性粒子等
を挙げることができる。固相試薬を製造するには、前記
共有結合又は非共有結合による方法を利用して抗原又は
抗体とを反応させて製造することができる。
る各種免疫測定用の固相に抗体又は抗原を結合させて製
造することができる。固相としては、プラスチック製の
試験管、プラスチック製のマイクロプレートウエル、ポ
リスチレン等のラテックス粒子、ガラスビーズ、プラス
チックビーズ等のビーズ、セルロース、ニトロセルロー
ス、グラスウール等の膜からなる各種ろ紙、磁性粒子等
を挙げることができる。固相試薬を製造するには、前記
共有結合又は非共有結合による方法を利用して抗原又は
抗体とを反応させて製造することができる。
【００２４】尚、上記説明では、酵素標識試薬及び固相
試薬に結合させる免疫反応物質を抗原又は抗体とした
が、本願明細書で言う「抗体又は抗原」は、抗原抗体反
応（免疫反応）が可能であり、免疫複合体を形成するも
のであればよく、例えばポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、これら抗体の断片（Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ
（ａｂ’）2 等）、ハプテン等も包含する意味で用い
る。
試薬に結合させる免疫反応物質を抗原又は抗体とした
が、本願明細書で言う「抗体又は抗原」は、抗原抗体反
応（免疫反応）が可能であり、免疫複合体を形成するも
のであればよく、例えばポリクローナル抗体、モノクロ
ーナル抗体、これら抗体の断片（Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ
（ａｂ’）2 等）、ハプテン等も包含する意味で用い
る。
【００２５】本発明のＥＩＡは、前記固相試薬及び酵素
標識試薬を用いて周知の１ステップ法、ディレイ１ステ
ップ法、２ステップ法等のサンドイッチ法、競合法等を
組み合わせて行い、免疫反応により固相上に免疫複合体
を形成して結合した酵素又は固相に未結合の酵素の活性
を測定することにより実施することができる。
標識試薬を用いて周知の１ステップ法、ディレイ１ステ
ップ法、２ステップ法等のサンドイッチ法、競合法等を
組み合わせて行い、免疫反応により固相上に免疫複合体
を形成して結合した酵素又は固相に未結合の酵素の活性
を測定することにより実施することができる。
【００２６】本発明のフリーラジカル化合物及びキレー
ト化合物を用いるＥＩＡは、例えばニトロセルロース膜
のろ紙を固相とするイムノクロマト法に適用することが
できる。このろ紙を用いる測定では、検出部位に結合し
た酵素と前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
との反応による発色時間を短縮することができるため、
検体中に含まれる微量の測定対象物であっても短時間で
の測定が可能となる。前記フリーラジカル化合物及び／
又は前記キレート化合物はろ紙中、展開液中に添加する
ことができる。本発明に用いる基質の前記一般式（Ｉ）
で表されるインドリル誘導体は、反応によって生成する
色素が水不溶性のインジゴ色素であるため、ろ紙を用い
たイムノクロマト法、イムノブロット法等に好適に用い
られる。この色素の測定には、反応によって所定時間後
に生ずるインジゴ色素の発色を目視により標準カラーチ
ャートと比較することにより、更に色彩色差計、吸光光
度計等の測定機器を用いることにより行うことができ
る。
ト化合物を用いるＥＩＡは、例えばニトロセルロース膜
のろ紙を固相とするイムノクロマト法に適用することが
できる。このろ紙を用いる測定では、検出部位に結合し
た酵素と前記一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導体
との反応による発色時間を短縮することができるため、
検体中に含まれる微量の測定対象物であっても短時間で
の測定が可能となる。前記フリーラジカル化合物及び／
又は前記キレート化合物はろ紙中、展開液中に添加する
ことができる。本発明に用いる基質の前記一般式（Ｉ）
で表されるインドリル誘導体は、反応によって生成する
色素が水不溶性のインジゴ色素であるため、ろ紙を用い
たイムノクロマト法、イムノブロット法等に好適に用い
られる。この色素の測定には、反応によって所定時間後
に生ずるインジゴ色素の発色を目視により標準カラーチ
ャートと比較することにより、更に色彩色差計、吸光光
度計等の測定機器を用いることにより行うことができ
る。
【００２７】本発明のＥＩＡによる測定対象物として
は、生体内に存在する物質、薬剤等であり、例えばテオ
フィリン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬剤、サイロ
キシン、エストロゲン、エラストラジオール等の低分子
ホルモン、ＣＥＡ、ＡＦＰ、便中ヘモグロビン（ＦＯＢ
Ｔ）等の癌マーカー、ヒト免疫不全ウイルス、（ＨＩ
Ｖ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ
型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）等のウイルス、梅毒トレポネマ（トレポネーマ・パ
リダム；ＴＰ）等の原虫、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ
−２、ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等
の各種グロースファクター、更に前記ウイルスの適当な
ＤＮＡ、ＲＮＡ等、ＣＲＰ等の炎症に関連するタンパク
質等の抗原、及びこれら抗原に対する抗体である。前記
抗原、抗体等の測定に用いられる検体としては、例えば
全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液、便抽出液等
が挙げられる。
は、生体内に存在する物質、薬剤等であり、例えばテオ
フィリン、フェニトイン、バルプロ酸等の薬剤、サイロ
キシン、エストロゲン、エラストラジオール等の低分子
ホルモン、ＣＥＡ、ＡＦＰ、便中ヘモグロビン（ＦＯＢ
Ｔ）等の癌マーカー、ヒト免疫不全ウイルス、（ＨＩ
Ｖ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）、Ｂ
型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ
Ｖ）等のウイルス、梅毒トレポネマ（トレポネーマ・パ
リダム；ＴＰ）等の原虫、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳ
Ｈ）、インスリン等の高分子ホルモン、ＩＬ−１、ＩＬ
−２、ＩＬ−６等のサイトカイン、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ等
の各種グロースファクター、更に前記ウイルスの適当な
ＤＮＡ、ＲＮＡ等、ＣＲＰ等の炎症に関連するタンパク
質等の抗原、及びこれら抗原に対する抗体である。前記
抗原、抗体等の測定に用いられる検体としては、例えば
全血、血清、血漿、尿、リンパ液等の体液、便抽出液等
が挙げられる。
【００２８】
【実施例】以下実施例及び参考例により本発明を更に詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２９】参考例１ アルカリ性ホスファターゼ標識
ＴＰ１７抗原の作製 リコンビナントＴＰ１７抗原０．１２ｍｇに２−イミノ
チオラン１００ｎｍｏｌを加え、３０℃で３０分間放置
し、抗原にチオール基を導入した。次にアルカリ性ホス
ファターゼ３ｍｇにＮ−スクシイミジル−４−マレイミ
ドブチレイト（ＧＭＢＳ、同仁化学社製）３００ｎｍｏ
ｌを加え、３０℃６０分間放置しマレイミド基を導入し
た。その後チオール化ＴＰ１７抗原１００μｇとマレイ
ミド化アルカリ性ホスファターゼ２．５ｍｇを混合し、
４℃一昼夜カップリング反応を行い、ゲルろ過により精
製し、標識体の活性のあった分画を分取してアルカリ性
ホスファターゼ標識したリコンビナントＴＰ１７抗原
（以下アルカリ性ホスファターゼ標識ＴＰ１７抗原とい
う）を得た。
ＴＰ１７抗原の作製 リコンビナントＴＰ１７抗原０．１２ｍｇに２−イミノ
チオラン１００ｎｍｏｌを加え、３０℃で３０分間放置
し、抗原にチオール基を導入した。次にアルカリ性ホス
ファターゼ３ｍｇにＮ−スクシイミジル−４−マレイミ
ドブチレイト（ＧＭＢＳ、同仁化学社製）３００ｎｍｏ
ｌを加え、３０℃６０分間放置しマレイミド基を導入し
た。その後チオール化ＴＰ１７抗原１００μｇとマレイ
ミド化アルカリ性ホスファターゼ２．５ｍｇを混合し、
４℃一昼夜カップリング反応を行い、ゲルろ過により精
製し、標識体の活性のあった分画を分取してアルカリ性
ホスファターゼ標識したリコンビナントＴＰ１７抗原
（以下アルカリ性ホスファターゼ標識ＴＰ１７抗原とい
う）を得た。
【００３０】各分画のアルカリ性ホスファターゼ標識Ｔ
Ｐ１７抗原活性の確認は以下のようにして行った。幅５
ｍｍ、長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社
製）の上端から１５ｍｍの位置にリコンビナントＴＰ１
７抗原３μｌを点着し３７℃３０分間乾燥させ、これを
試験片とした。この試験片の上端にろ紙（厚さ１ｍｍ，
巾１０ｍｍ，長さ１５ｍｍ；ワットマンＷＦ１．５，ワ
ットマン社製）が試験片に５ｍｍ重なるように固定し
た。前記ゲルろ過により得られた各分画２５μｌ、及び
ＴＰ抗体陽性血清２５μｌを試験管に取り混合し、この
混合液にＴＰ１７抗原点着試験片の下端を浸し５分間放
置した。次に、０．０５％の５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ、ベーリンガーマンハ
イム社製）を含有する溶液２５０μｌが入つた試験管に
試験片を移し、１０分間放置した。アルカリ性ホスファ
ターゼ標識ＴＰ１７抗原の存在したゲルろ過分画を使用
した試験片は抗原点着部位が青く発色した。
Ｐ１７抗原活性の確認は以下のようにして行った。幅５
ｍｍ、長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社
製）の上端から１５ｍｍの位置にリコンビナントＴＰ１
７抗原３μｌを点着し３７℃３０分間乾燥させ、これを
試験片とした。この試験片の上端にろ紙（厚さ１ｍｍ，
巾１０ｍｍ，長さ１５ｍｍ；ワットマンＷＦ１．５，ワ
ットマン社製）が試験片に５ｍｍ重なるように固定し
た。前記ゲルろ過により得られた各分画２５μｌ、及び
ＴＰ抗体陽性血清２５μｌを試験管に取り混合し、この
混合液にＴＰ１７抗原点着試験片の下端を浸し５分間放
置した。次に、０．０５％の５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ、ベーリンガーマンハ
イム社製）を含有する溶液２５０μｌが入つた試験管に
試験片を移し、１０分間放置した。アルカリ性ホスファ
ターゼ標識ＴＰ１７抗原の存在したゲルろ過分画を使用
した試験片は抗原点着部位が青く発色した。
【００３１】実施例１ 抗ＴＰ１７抗体測定用の試験片 幅５ｍｍ、長さ５０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポ
ア社製）の上端から1５ｍｍの位置にリコンビナントＴ
Ｐ１７抗原を塗布装置（ショットマスター，武蔵エンジ
ニアリング社製）でライン状に点着後乾燥し、吸着固定
化して検出部位を作成した。また、ニトロセルロース膜
の上５ｍｍには巾１０ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ワッ
トマン社ＷＦワインフィル夕ー１．５）を付設し、吸収
パッドとした。参考例１で製造したアルカリ性ホスファ
夕ーゼ標識ＴＰ１７抗原溶液２０μｌを幅５ｍｍ、長さ
５ｍｍに切つたＰＶＡシート（ベルイータ，カネボウ社
製）に点着後、乾燥し、このシート（標識体パッド）を
ニトロセルロース膜の上端から２５ｍｍの位置に置い
た。この部分は検体点着部位となる。
ア社製）の上端から1５ｍｍの位置にリコンビナントＴ
Ｐ１７抗原を塗布装置（ショットマスター，武蔵エンジ
ニアリング社製）でライン状に点着後乾燥し、吸着固定
化して検出部位を作成した。また、ニトロセルロース膜
の上５ｍｍには巾１０ｍｍ、長さ２０ｍｍのろ紙（ワッ
トマン社ＷＦワインフィル夕ー１．５）を付設し、吸収
パッドとした。参考例１で製造したアルカリ性ホスファ
夕ーゼ標識ＴＰ１７抗原溶液２０μｌを幅５ｍｍ、長さ
５ｍｍに切つたＰＶＡシート（ベルイータ，カネボウ社
製）に点着後、乾燥し、このシート（標識体パッド）を
ニトロセルロース膜の上端から２５ｍｍの位置に置い
た。この部分は検体点着部位となる。
【００３２】更に基質液の点着および展開のためにのニ
トロセルロース膜の下端１０ｍｍの位置に幅５ｍｍ、長
さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社ＡＰ２５）を付設した。
この部分に２０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ液を５μｌ点着し
た。更に基質パッドにそれぞれ５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃ
ｕ／１０μｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ−Ｆｅ/ ５μｌ、
５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃｏ／１０μｌ、５０ｍＭのＥＤ
ＴＡ−Ｎｄ／１０μｌを点着した。この部位は基質液パ
ッドとなる。また、ニトロセルロース膜の上端５ｍｍに
巾１０ｍｍ，長さ２０ｍｍのろ紙（ワットマン社、ＷＦ
ワインフィル夕ー１．５）を付設し吸収パッドとした。
以上の方法に従って抗ＴＰ１７抗体測定用の試験片を作
製した。比較として基質パッドにキレート化合物を添加
しない試験片（コントロール）を作製した。
トロセルロース膜の下端１０ｍｍの位置に幅５ｍｍ、長
さ２０ｍｍのろ紙（ミリポア社ＡＰ２５）を付設した。
この部分に２０ｍｇ／ｍｌのＢＣＩＰ液を５μｌ点着し
た。更に基質パッドにそれぞれ５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃ
ｕ／１０μｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ−Ｆｅ/ ５μｌ、
５０ｍＭのＥＤＴＡ−Ｃｏ／１０μｌ、５０ｍＭのＥＤ
ＴＡ−Ｎｄ／１０μｌを点着した。この部位は基質液パ
ッドとなる。また、ニトロセルロース膜の上端５ｍｍに
巾１０ｍｍ，長さ２０ｍｍのろ紙（ワットマン社、ＷＦ
ワインフィル夕ー１．５）を付設し吸収パッドとした。
以上の方法に従って抗ＴＰ１７抗体測定用の試験片を作
製した。比較として基質パッドにキレート化合物を添加
しない試験片（コントロール）を作製した。
【００３３】実施例２ 抗ＴＰ１７抗体の測定 実施例１で作製した試験片の検体滴下部に、抗ＴＰ抗体
陽性被検液（ＴＰＰＡ価２０，４０，８０倍）１５μｌ
を点着後、１００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを基質パ
ッドに滴下し吸収展開させ、反応を開始した。陽性検出
時間を目視によって測定した。
陽性被検液（ＴＰＰＡ価２０，４０，８０倍）１５μｌ
を点着後、１００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．
５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）２００μｌを基質パ
ッドに滴下し吸収展開させ、反応を開始した。陽性検出
時間を目視によって測定した。
【００３４】
【表１】
【００３５】参考例２ アルカリ性ホスファタ一ゼ標識
抗体の作製 ウサギＩｇＧ抗体３０ｍｇをリン酸緩衝液（５０ｍＭ，
ｐＨ４．７）４ｍｌに溶解し、これにｐ−キノン３０ｍ
ｇ／ｍｌ・エチルアルコール溶液を加え、室温で２時間
暗所で反応させた。反応後溶液を1 ５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムで平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア社製）で緩
衝液を置換し目的物を得た。このＩｇＧｐ−キノン付加
物溶液にアルカリ性ホスファタ一ゼ３０ｍｇ（オリエン
タル社，２５００ＩＵ／ｍｇ）を加え、冷所（４〜１０
℃）で１８時間反応させた。反応終了後、Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ−１００（ファルマシア社製）を用いて精製し、ア
ルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体を得た。
抗体の作製 ウサギＩｇＧ抗体３０ｍｇをリン酸緩衝液（５０ｍＭ，
ｐＨ４．７）４ｍｌに溶解し、これにｐ−キノン３０ｍ
ｇ／ｍｌ・エチルアルコール溶液を加え、室温で２時間
暗所で反応させた。反応後溶液を1 ５０ｍＭ塩化ナトリ
ウムで平衡化したＰＤ−１０（ファルマシア社製）で緩
衝液を置換し目的物を得た。このＩｇＧｐ−キノン付加
物溶液にアルカリ性ホスファタ一ゼ３０ｍｇ（オリエン
タル社，２５００ＩＵ／ｍｇ）を加え、冷所（４〜１０
℃）で１８時間反応させた。反応終了後、Ｓｕｐｅｒｄ
ｅｘ−１００（ファルマシア社製）を用いて精製し、ア
ルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体を得た。
【００３６】実施例３ キレート化合物又はラジカル化
合物による発色時間の測定 参考例２で作製したアルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体
をＴｒｉｓ−塩酸酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．
５，０．１ｍＭ塩化亜鉛）で５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎ
ｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、幅５ｍｍ,
長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）の
上端から1 ５ｍｍの位置に、塗布装置（ショットマスタ
ー，武蔵エンジニアリング社製）でライン状に点着後乾
燥し、吸着固定化した。更に、このニトロセルロース膜
に実施例１と同様にしてニトロセルロース膜の両端に基
質パッドおよび吸収パッドを付設した。
合物による発色時間の測定 参考例２で作製したアルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体
をＴｒｉｓ−塩酸酸緩衝液（１００ｍＭ，ｐＨ＝７．
５，０．１ｍＭ塩化亜鉛）で５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎ
ｇ／ｍｌ又は１５０ｎｇ／ｍｌまで希釈し、幅５ｍｍ,
長さ３０ｍｍのニトロセルロース膜（ミリポア社製）の
上端から1 ５ｍｍの位置に、塗布装置（ショットマスタ
ー，武蔵エンジニアリング社製）でライン状に点着後乾
燥し、吸着固定化した。更に、このニトロセルロース膜
に実施例１と同様にしてニトロセルロース膜の両端に基
質パッドおよび吸収パッドを付設した。
【００３７】次いで３種類の濃度のニトロセルロース膜
（アルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体濃度５０，１０
０，１５０ｎｇ／ｍｌ塗布）の基質パッドに２０ｍｇ／
ｍｌ−ＢＣＩＰを５μｌづつ点着し、さらに１００ｍＭ
ＥＤＴＡ- Ｃｕ、５０ｍＭＥＤＴＡ−Ｆｅ、１００ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−Ｚｎ、１００ｍＭ ４−オキソ−２，
２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシルラ
ジカル（ＡＡＱ−２，同仁化学社製）をそれぞれ５μｌ
づつ点着し３７℃で１０分間乾燥させて試験片を作製し
た。この試験片の基質パッドにＣＨＥＳ緩衝液（１００
ｍＭ，ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）
２００μｌを滴下し基質を展開させた。目視によって発
色が確認できるまでの時間を計測した。キレート化合物
又はラジカル化合物を基質パッドに添加しないコントロ
ールの試験片とともにその結果を表２に示す。
（アルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体濃度５０，１０
０，１５０ｎｇ／ｍｌ塗布）の基質パッドに２０ｍｇ／
ｍｌ−ＢＣＩＰを５μｌづつ点着し、さらに１００ｍＭ
ＥＤＴＡ- Ｃｕ、５０ｍＭＥＤＴＡ−Ｆｅ、１００ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−Ｚｎ、１００ｍＭ ４−オキソ−２，
２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシルラ
ジカル（ＡＡＱ−２，同仁化学社製）をそれぞれ５μｌ
づつ点着し３７℃で１０分間乾燥させて試験片を作製し
た。この試験片の基質パッドにＣＨＥＳ緩衝液（１００
ｍＭ，ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）
２００μｌを滴下し基質を展開させた。目視によって発
色が確認できるまでの時間を計測した。キレート化合物
又はラジカル化合物を基質パッドに添加しないコントロ
ールの試験片とともにその結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
【００３９】実施例４ ＥＤＴＡ−Ｆｅ添加の発色時間
の測定 実施例３で作製した試験片（アルカリ性ホスファタ一ゼ
標識抗体濃度１５０ｎｇ／ｍｌ塗布膜）５枚を用意し、
これに付設した基質パッドそれぞれにＢＣＩＰ２０ｍｇ
／ｍｌ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ２μｌ、５μ
ｌ、１００ｍＭＥＤＴＡ−Ｆｅ１μｌ、２μｌ、５μｌ
づつ点着し３７℃で１０分間乾燥させた。この基質パッ
ドに１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴下を展開させ
た。目視によって発色が確認できるまでの時間を測定し
た。その結果を表３に示す。
の測定 実施例３で作製した試験片（アルカリ性ホスファタ一ゼ
標識抗体濃度１５０ｎｇ／ｍｌ塗布膜）５枚を用意し、
これに付設した基質パッドそれぞれにＢＣＩＰ２０ｍｇ
／ｍｌ、および１０ｍＭ ＥＤＴＡ−Ｆｅ２μｌ、５μ
ｌ、１００ｍＭＥＤＴＡ−Ｆｅ１μｌ、２μｌ、５μｌ
づつ点着し３７℃で１０分間乾燥させた。この基質パッ
ドに１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍ
Ｍ塩化マグネシウム入り）２００μｌを滴下を展開させ
た。目視によって発色が確認できるまでの時間を測定し
た。その結果を表３に示す。
【００４０】
【表３】
【００４１】実施例５ ＨＢｓ抗原測定試験片 ニトロセルロース膜（Ｈｉ−Ｆｌｏｗメンブラン、ミリ
ポア社製）、５ｍｍ×５．０ｃｍの上端から1 ５ｍｍの
ところに、リン酸緩衝液に置換した抗ＨＢｓ抗体２．８
６μｇを点着し、乾燥した。更にアルカリフォスファ夕
ーゼ標識抗ＨＢｓ抗体(Scantibodies 社製、平均分子量
＝３５万）をリン酸緩衝液に置換し、標識体パッドに
０．１６μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ（べーリンガー
マンハイム社製，０．１２５ｍｇ）をそれぞれ点着乾燥
した。展開液には１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１
０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）を使用し、これ
に５００ｍＭ ＡＡＱ−２（同仁化学社製）を加え、終
濃度を５ｍＭとした。展開液ポット部、検体滴下窓及び
検出窓を備えたプラスチック製のケースに前記ニトロセ
ルロース膜、基質パッド、標識体パッド、吸収パッドを
配置してＨＢｓ抗原測定試験片を作製した。
ポア社製）、５ｍｍ×５．０ｃｍの上端から1 ５ｍｍの
ところに、リン酸緩衝液に置換した抗ＨＢｓ抗体２．８
６μｇを点着し、乾燥した。更にアルカリフォスファ夕
ーゼ標識抗ＨＢｓ抗体(Scantibodies 社製、平均分子量
＝３５万）をリン酸緩衝液に置換し、標識体パッドに
０．１６μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ（べーリンガー
マンハイム社製，０．１２５ｍｇ）をそれぞれ点着乾燥
した。展開液には１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１
０．５，１ｍＭ塩化マグネシウム入り）を使用し、これ
に５００ｍＭ ＡＡＱ−２（同仁化学社製）を加え、終
濃度を５ｍＭとした。展開液ポット部、検体滴下窓及び
検出窓を備えたプラスチック製のケースに前記ニトロセ
ルロース膜、基質パッド、標識体パッド、吸収パッドを
配置してＨＢｓ抗原測定試験片を作製した。
【００４２】比較として展開液にはＡＡＱ−２を含まな
い１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）を用い、ＨＢｓ抗原測定試験片
（コントロール）を作製した。
い１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）を用い、ＨＢｓ抗原測定試験片
（コントロール）を作製した。
【００４３】実施例６ ＨＢｓ抗原の測定 実施例５で作製した試験片を用い、各濃度のＨＢｓ抗原
（１８．５Ｕ／ｍｌ，８．５Ｕ／ｍｌ，４．２Ｕ／ｍ
ｌ，２．２Ｕ／ｍｌ，１．１Ｕ／ｍｌ）を含む血清２５
μｌを標識体パッドに設けた検体滴下部に滴下し、直後
に展開液ポット部を押し、展開液をニトロセルロース膜
に展開させ、陽性検出時間を測定した。コントロールと
ともにその３回の測定結果を表４に示す。
（１８．５Ｕ／ｍｌ，８．５Ｕ／ｍｌ，４．２Ｕ／ｍ
ｌ，２．２Ｕ／ｍｌ，１．１Ｕ／ｍｌ）を含む血清２５
μｌを標識体パッドに設けた検体滴下部に滴下し、直後
に展開液ポット部を押し、展開液をニトロセルロース膜
に展開させ、陽性検出時間を測定した。コントロールと
ともにその３回の測定結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
【００４５】実施例７ 抗ＨＢｓ抗体測定用試験片 セルロース膜（ミリポア社製）、５ｍｍ×５．０ｃｍの
上端からI ５ｍｍのところに、リン酸バッファに置換し
たＨＢｓ抗原（明治乳業社製）０．７μｇを点着、乾燥
した。また、ＨＢｓ抗原とアルカリフォスファ夕ーゼを
マレイミド−ヒンジ法（酵素標識法１頁、石川栄治著；
学会出版センター）に従い反応させアルカリフオスファ
夕ーゼ標識ＨＢｓ抗原（平均分子量＝約３００万）を得
た。本標識抗原をリン酸緩衝液に置換し、標識体パッド
０．０２５μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ（０．１ｍ
ｇ）をそれぞれ点着乾燥した。展開液にはグッドバッフ
ァを使用し、更に５００ｍＭのＡＡＱ−２（同人化学社
製）を加え終濃度を５ｍＭとし、セルロース膜、基質パ
ッド、標識体パッド及び吸収パッドを前記プラスチック
製のケースに配置して抗ＨＢｓ抗体測定用試験片を作製
した。
上端からI ５ｍｍのところに、リン酸バッファに置換し
たＨＢｓ抗原（明治乳業社製）０．７μｇを点着、乾燥
した。また、ＨＢｓ抗原とアルカリフォスファ夕ーゼを
マレイミド−ヒンジ法（酵素標識法１頁、石川栄治著；
学会出版センター）に従い反応させアルカリフオスファ
夕ーゼ標識ＨＢｓ抗原（平均分子量＝約３００万）を得
た。本標識抗原をリン酸緩衝液に置換し、標識体パッド
０．０２５μｇ、基質パッドにはＢＣＩＰ（０．１ｍ
ｇ）をそれぞれ点着乾燥した。展開液にはグッドバッフ
ァを使用し、更に５００ｍＭのＡＡＱ−２（同人化学社
製）を加え終濃度を５ｍＭとし、セルロース膜、基質パ
ッド、標識体パッド及び吸収パッドを前記プラスチック
製のケースに配置して抗ＨＢｓ抗体測定用試験片を作製
した。
【００４６】比較として展開液にはＡＡＱ−２を含まな
い１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）を用い、抗ＨＢｓ抗体測定用試
験片（コントロール）を作製した。
い１００ｍＭＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ＝１０．５，１ｍＭ
塩化マグネシウム入り）を用い、抗ＨＢｓ抗体測定用試
験片（コントロール）を作製した。
【００４７】実施例８ 抗ＨＢｓ抗体の測定 実施例７で作製した試験片を用い、各濃度の抗ＨＢｓ抗
体（３０ｍＵ／ｍｌ，１９．０ｍＵ／ｍｌ，９．６ｍＵ
／ｍｌ，５．０ｍＵ／ｍｌ，２．５ｍＵ／ｍｌ，１．２
ｍＵ／ｍｌ）を含む血清２５μｌを検体滴下部に滴下
し、直後に展開液ポット部を押し、展開液を展開させ、
陽性検出時間を目視で測定した。コントロールとともに
その３回の測定結果を表５に示す。
体（３０ｍＵ／ｍｌ，１９．０ｍＵ／ｍｌ，９．６ｍＵ
／ｍｌ，５．０ｍＵ／ｍｌ，２．５ｍＵ／ｍｌ，１．２
ｍＵ／ｍｌ）を含む血清２５μｌを検体滴下部に滴下
し、直後に展開液ポット部を押し、展開液を展開させ、
陽性検出時間を目視で測定した。コントロールとともに
その３回の測定結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】実施例９ 各ＡＡＱ−２濃度での発色量の
測定 ニトロセルロース膜（ミリポア社製）、５ｍｍ×５０ｍ
ｍ の上端から1 ５ｍｍのところに、アルカリ性ホスフ
ァタ一ゼ標識抗体（平均分子量＝３０万）８０ｎｇを点
着乾燥し、展開液にＡＡＱ−２（１．２５ｍＭ，２．５
ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ）をそれぞれ加えた
１００ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（０．１ｍＭ−
ＭｇＣｌ2 ）を用いた。さらに、基質パッドにはＢＣＩ
Ｐ（０．１ｍｇ）を点着、乾燥した。この試験片の展開
部ポットを押し、展開液を展開させ、１５分後における
アルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体点着上の発色強度を
色差計（ミノルタ社製）によって測定した。展開液にＡ
ＡＱ−２を添加しない試験片を比較例としてその結果を
図１に示す。
測定 ニトロセルロース膜（ミリポア社製）、５ｍｍ×５０ｍ
ｍ の上端から1 ５ｍｍのところに、アルカリ性ホスフ
ァタ一ゼ標識抗体（平均分子量＝３０万）８０ｎｇを点
着乾燥し、展開液にＡＡＱ−２（１．２５ｍＭ，２．５
ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ，２０ｍＭ）をそれぞれ加えた
１００ｍＭ ＣＨＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（０．１ｍＭ−
ＭｇＣｌ2 ）を用いた。さらに、基質パッドにはＢＣＩ
Ｐ（０．１ｍｇ）を点着、乾燥した。この試験片の展開
部ポットを押し、展開液を展開させ、１５分後における
アルカリ性ホスファタ一ゼ標識抗体点着上の発色強度を
色差計（ミノルタ社製）によって測定した。展開液にＡ
ＡＱ−２を添加しない試験片を比較例としてその結果を
図１に示す。
【００５０】
【発明の効果】本発明は、インドリル誘導体と酵素とを
反応させて発色させる際にラジカル化合物及び／又はキ
レート化合物を添加することによって、従来の方法に比
べインジゴ色素の生成を促進し、測定までに要する時間
を短縮することができる。従って、この方法を使用した
ＥＩＡ及びイムノクロマト法では測定時間が短縮され、
更に微量物質の高感度測定が可能となった。
反応させて発色させる際にラジカル化合物及び／又はキ
レート化合物を添加することによって、従来の方法に比
べインジゴ色素の生成を促進し、測定までに要する時間
を短縮することができる。従って、この方法を使用した
ＥＩＡ及びイムノクロマト法では測定時間が短縮され、
更に微量物質の高感度測定が可能となった。
【図１】ＡＡＱ−２濃度を変えて発色量を測定した図で
ある。
ある。
Claims (11)
- 【請求項１】 一般式 【化１】 で表されるインドリル誘導体に酵素を作用させる発色法
において、一般式 【化２】 で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は一般式 【化３】 で表されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキ
レート化合物との存在下に行うことを特徴とする該方法
（式中、Ｒ1 は酵素分解性基、Ｒ 2及びＲ3 は水素原子
又はハロゲン原子、Ａは置換又は無置換の炭素数２〜３
のメチレン鎖であり、該メチレン鎖には鎖中に酸素原子
又はカルボニル基を含んでもよく、Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及
びＲ 7は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基、Ｒ8
はエチレン基又はシクロヘキサン−１，２−ジイル基で
あり、金属は鉄、銅、亜鉛、コバルト、インジュウム、
ネオジム、マンガン又はユウロピウムである。）。 - 【請求項２】 Ｒ4 、Ｒ 5、Ｒ6 及びＲ 7が炭素数１〜
３のアルキル基である請求項１記載の発色方法。 - 【請求項３】 炭素数２〜３のメチレン鎖への置換基が
水酸基、カルボキシル基、カルバモイル基又はアミノ基
である請求項１記載の発色方法。 - 【請求項４】 ジアミン誘導体がエチレンジアミン四酢
酸又はｔｒａｎｓ−１，２−ジアミンシクロヘキサン−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸である請求項１記載の発色
方法。 - 【請求項５】 酵素がホスファターゼであり、Ｒ1 が−
ＰＯ3 2- ・２Ｍ+ で表される基（Ｍは水素原子、アルカ
リ金属又はトルイジンである。）である請求項１ないし
４のいづれか１項に記載の発色方法。 - 【請求項６】 酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、Ｒ
1 がβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基である請求項１ない
し４のいづれか１項に記載の発色方法。 - 【請求項７】 酵素がβ−グルコシダーゼであり、Ｒ1
がβ−Ｄ−グルコピラノシル基である請求項１ないし４
のいづれか１項に記載の発色方法。 - 【請求項８】 酵素標識抗体又は抗原の酵素活性を、請
求項１に記載の一般式（Ｉ）で表されるインドリル誘導
体を用いて測定する酵素免疫測定法において、請求項１
に記載の一般式（ＩＩ）で表されるフリーラジカル化合
物、及び／又は請求項１に記載の一般式（ＩＩＩ）で表
されるジアミン誘導体と金属との錯体を形成したキレー
ト化合物との存在下に行うことを特徴とする該方法。 - 【請求項９】 酵素が固相に免疫複合体を形成して結合
した酵素である請求項８記載の酵素免疫測定法。 - 【請求項１０】 固相の検出部位に結合した酵素標識抗
体又は抗原の酵素活性を、請求項１に記載の一般式
（Ｉ）で表されるインドリル誘導体を用いて測定するイ
ムノクロマト法において、請求項１に記載の一般式（Ｉ
Ｉ）で表されるフリーラジカル化合物、及び／又は請求
項１に記載の一般式（ＩＩＩ）で表されるジアミン誘導
体と金属との錯体を形成したキレート化合物との存在下
に行うことを特徴とする該方法。 - 【請求項１１】 固相がろ紙である請求項１０記載のイ
ムノクロマト法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19359998A JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18324897 | 1997-06-25 | ||
| JP9-183248 | 1997-06-25 | ||
| JP19359998A JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1169996A true JPH1169996A (ja) | 1999-03-16 |
| JP3177964B2 JP3177964B2 (ja) | 2001-06-18 |
Family
ID=26501764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19359998A Expired - Lifetime JP3177964B2 (ja) | 1997-06-25 | 1998-06-25 | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3177964B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001255331A (ja) * | 2000-03-13 | 2001-09-21 | Iatron Lab Inc | アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬 |
| WO2005111616A1 (ja) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Toray Industries, Inc. | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP2005351889A (ja) * | 2004-05-14 | 2005-12-22 | Toray Ind Inc | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP2014155488A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-08-28 | Toyobo Co Ltd | 酵素の安定化方法 |
-
1998
- 1998-06-25 JP JP19359998A patent/JP3177964B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001255331A (ja) * | 2000-03-13 | 2001-09-21 | Iatron Lab Inc | アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬 |
| JP4647742B2 (ja) * | 2000-03-13 | 2011-03-09 | 三菱化学メディエンス株式会社 | アスコルビン酸の分析方法及び分析用試薬 |
| WO2005111616A1 (ja) * | 2004-05-14 | 2005-11-24 | Toray Industries, Inc. | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP2005351889A (ja) * | 2004-05-14 | 2005-12-22 | Toray Ind Inc | 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット |
| JP2014155488A (ja) * | 2013-01-17 | 2014-08-28 | Toyobo Co Ltd | 酵素の安定化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3177964B2 (ja) | 2001-06-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH10300750A (ja) | 酵素免疫測定方法及び試験片 | |
| US5188939A (en) | Displacement immunoassay utilizing an oligavalent labelled antibody | |
| JP2994036B2 (ja) | 螢光分析における干渉低減方法 | |
| US5658725A (en) | Acylated protein aggregates and their use in suppressing interference in immunoassays | |
| JPH0648996B2 (ja) | 増幅発光分析 | |
| US5998156A (en) | Color developing method, enzyme immunoassay using the color developing method, and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay | |
| EP0639272B2 (en) | Method for the determination of the amount of a thyroid hormone ligand in a biological fluid and kit for carrying out such a method | |
| US4637985A (en) | Assay processes and materials therefor | |
| IE55677B1 (en) | Iodothyronine immunoassays employing hms as tbp blocking agent | |
| JPH10502171A (ja) | 多相系におけるイムノアッセイの実施方法 | |
| JP3182527B2 (ja) | 化学発光の測定方法及びキット | |
| EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
| JPH1169996A (ja) | 発色方法、該方法を用いる酵素免疫測定法及びイムノクロマト法 | |
| JP2004538447A (ja) | 動力学アッセイ | |
| US5108934A (en) | Quantitative immunoassay utilizing liposomes | |
| JPH079428B2 (ja) | 免疫分析方法 | |
| EP0687910A1 (en) | Test kit and method for competitive specific binding assay | |
| EP0685740B1 (en) | Separation-free specific binding assays using anti-inhibitor antibodies | |
| KR940008091B1 (ko) | 리간드의 면역학적 검출방법 | |
| EP0184701B1 (en) | A method for determining a ligand | |
| JP2688943B2 (ja) | 試料中の物質の測定方法 | |
| US5998157A (en) | Acylated protein aggregates and their use as signal enhancers in an immunoassay for the detection of antibodies | |
| FR2652163A1 (fr) | Procede de detection d'une substance biologique a l'aide de ligands. | |
| Haasnoot et al. | 5. Immunochemical and receptor technologies | |
| JPH0792456B2 (ja) | カテコ−ルアミン酸性代謝物の酵素標識体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090413 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090413 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100413 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110413 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120413 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130413 Year of fee payment: 12 |
|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130413 Year of fee payment: 12 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140413 Year of fee payment: 13 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |