JP2994036B2 - 螢光分析における干渉低減方法 - Google Patents

螢光分析における干渉低減方法

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、螢光分析における干渉を低減させる方法
に関する。
現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析
あるいは定量分析に広く用いられている。現行の技術に
あっては、螢光定量分析が重要になってきている。実際
に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行
えること、螢光化合物により標識化された試薬が安定し
ていて安全であること、比較的低コストで行えること等
の多くの利点がある。
螢光を利用する検出方法は、本質的に非常に高感度で
あり、特に、変調可能なレーザ光源を使用する場合に
は、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出下
限をより低くすることができるものであることが知られ
ている（I.Wieder,“Immunofluore−scence and relate
d staining techniques",1978,Elsevier）。
斯かる方式の分析においてトレーサとして用いること
ができる多数の螢光分子が既に書物に記述されており、
それらの中で、希土類錯体が極めて有用な特性を有して
いる。そして、希土類錯体のうちの特定のものとして希
土類クリプテートを用いる分析が、ヨーロッパ特許出
願:EP 0 180 492、国際特許出願:PCT/FR 86 00269、ヨ
ーロッパ特許出願:EP 0 321 353、国際特許出願:PCT/FR
89 00562等に記載されている。希土類クリプテート
は、含塩蛋白質媒質中において非常に安定であるという
利点を有しており、斯かる特性は、均質免疫分析の場合
において格別に重要である。
このようなもとにあっても、測定感度は、測定が行わ
れる媒質中における様々な分子の存在に起因して生じる
各種の干渉によって左右されるところが大なるものとさ
れる。この問題は、干渉を生じ得るものとされる多数の
分子が存在する血清媒質中における分析の場合に取分け
深刻である。例えば、測定対象信号は、励起され得る状
態におかれ、しかも、トレーサとして用いられている分
子と同じ波長の光を発し得るものとされた分子からの発
光による干渉を受けるものとされる。
これに対し、螢光測定にあたって時分割法（time−re
solved method）をとることにより、上述の不都合を部
分的に解決することができる。この方法の原理は、比較
的長い発光寿命を有したトレーサ分子が発する螢光を他
の存在分子の発光寿命が尽きた後に測定することにあ
る。そして、斯かる場合には、希土類キレートの如くの
比較的長い寿命を有した螢光トレーサ分子を用いること
が必要とされる。
また、測定感度は、検出対象とされるアナライト（an
alyte）と標識生体特異試薬との間の結合に起因して発
せられる螢光の変化に摂動を生じさせ得るものとされ
た、媒質中の分子からの干渉の影響も受けるものとされ
る。それに対して、ヨーロッパ特許出願:EP 0 324 323
には、生体特異試薬と結合した希土類キレートを安定化
させる変調因子を用い、測定対象とされる螢光の変化が
実質的にアナライトの濃度の関数となるようになすこと
が記載されている。この変調因子の効果により、希土類
キレートが発する螢光が媒質中に存在する他の分子によ
り摂動を生じるものとされることが禁止され、その結
果、測定対象とされる螢光の変化が、抗原抗体反応のみ
の関数とされる。変調因子として提案されているものと
しては、たんぱく質，清浄剤等の巨大分子があり、それ
らは、0.1〜10g/の範囲を越えるものとされて用いら
れる。
斯かる状況にもかかわらず、測定媒質中に各種の分子
が存在することに起因する干渉の問題は、上述の如くの
方法のいかなるものによっても、十分に解消することは
できない。実際、螢光測定の感度を制限する元となって
いるものは、分析マーカーとして用いられる螢光分子の
発光を抑制することになる、媒質中に存在する分子によ
る消光作用である。希土類錯体の場合にあっては、斯か
る消光作用は、螢光抑制分子が錯体中において自由な状
態におかれた配位部位を占めるものとされる電子伝達メ
カニズムに起因するものとなる。特に、螢光分子と媒質
中に存在する分子との間で行われる酸化還元反応が指摘
され、これらのメカニズムは、発せられた螢光に無視で
きない変化を与える。
酸化還元現象に起因する螢光抑制についての記述は、
従来の均質免疫螢光分析に関する文献には見当たらな
い。
ウエーバー／他（Weber et al.）による論文:Clin.Ch
em.,1983,29/9,1665〜1672には、トリス（２′,2′−ジ
ピリジン）ルテニウム−（III）錯体についての電流滴
定検出における、特に、尿酸による干渉の影響について
記載されている。ここで述べられている錯体は、Co（I
I）消光錯体を酸化することができることになる、対応
するRu（II）錯体における酸化還元反応から発してい
る。そして、尿酸は、Ru（III）に対する還元剤として
扱われており、それゆえ、測定に干渉するものとなる。
斯かる螢光化合物と消光化合物との間の電子伝達によ
る酸化還元メカニズムは、サバティーニ／他（Sabbatin
i et al.）による論文:J.A.C.S.,1984,106,4055〜4056
において論証されている。この論文にあっては、Ｍ（C
N）6 4-錯体のユーロピウム・クリプテートによる酸化に
ついて、特に、詳細に記述されており、そのなかで、Ｍ
は、鉄，ルテニウムあるいはオスミウムである。
電子伝達を含んだメカニズム及び通常の抑制メカニズ
ムによる螢光の抑制は、実際に際しては極端に面倒な現
象である。なぜなら、抑制要因は、例えば、血清中にお
ける尿酸の如くに、測定媒質中にその成分として本来存
在するもの、あるいは、分析にあたっての添加剤あるい
は安定剤として加えられるものとされるからである。
このような抑制剤は、マーカー分子が発する螢光に大
なる影響を与える。特に、寄生酸化還元反応にあって
は、酸化還元メカニズムによる希土類イオンの還元状態
から酸化状態の転換が、希土類イオンを含む錯体の寿命
を短縮するとともに希土類イオンを含む錯体の発光スペ
クトラムを変化させ、それにより、測定感度に大なる影
響を及ぼす。
従来にあっては予期されていなかったことであるが、
この発明によって、測定媒質にフッ化物イオンを添加す
ることにより、測定媒質中に存在する抑制分子による螢
光の抑制を実質的に低減できることが見出され、特に、
生物学的媒質については、その低減の度合いが顕著であ
る。また、驚くべきことに、文献：ジェイ・エイ・シー
・エス,1980年、102、2278−2285、イー他（Yee et a
l.,J.A.C.S.,1980,102,2278−2285）における、「三価
の希土類クリプテート中におけるフッ化物イオンの結合
は、クリプテートの解離の度合いを実質的に増長し、生
成物の半減期を27日から2.8日に低減させる結果をまね
く。」という旨の記載に反して、測定媒質に添加された
フッ化物イオンは、希土類クリプテート錯体の安定性に
対して悪影響を与えないことも分かっている。
実際、測定媒質にフッ化物イオンが、特に、フッ化ナ
トリウムの形態をもって加えられることにより、トレー
サ分子として用いられている希土類クリプテートあるい
は希土類キレートが発する信号の寿命が、緩衝液単体中
において測定される信号の寿命に匹敵するまでに引き伸
ばされることが観測されている。仮説ではあるが、フッ
化物イオンは、その寸法が小であって負の電荷を有して
いることにより、希土類錯体における自由結合部位を占
めることができ、そして、抑制剤の近傍を妨げていると
言える。
このように、この発明は、少なくとも一個の螢光化合
物をトレーサとして用いるアナライトの螢光分析におけ
る干渉を低減させる、測定媒質にフッ化物イオンを添加
するステップを含んだ方法に関している。
本願の記載においては、“アナライト”は、検出及び
／又は測定の対象とされる物質あるいは類似する物質群
を意味し、また、“レセプタ（receptor）”は、特にア
ナライトの一部に結合することができる物質を意味す
る。
この発明における好ましい特徴に従えば、測定媒質
は、血清媒質の如くの生物学的媒質とされる。もし、測
定媒質が水溶液とされる場合には、フッ化ナトリウム，
フッ化セシウム，フッ化カリウム、あるいは、フッ化リ
チウムの水溶液が使用されることが望ましい。陽イオン
の選定は、用いられる媒質に応じてなされ、溶媒中にお
いてフッ化物イオンが溶解し得るものとなるようにされ
る。斯かる選定は、この発明が属する技術分野における
当業者が行うことができる範疇のものである。望ましく
は、測定媒質が血清媒質とされたもとで、血清媒質中の
濃度が50〜500mM/とされるフッ化ナトリウム（NaF）
が用いられる。
この発明における他の好ましい特徴に従えば、濃度が
50mM/〜5M/とされるフッ化カリウム（KF）が用いら
れる。
螢光トレーサ化合物としては、希土類キレートあるい
は希土類クリプテートが用いられるのが良い。使用可能
とされる希土類イオンとして、テルビウム・イオン，ユ
ーロピウム・イオン，ジスプロシウム・イオン，サマリ
ウム・イオン，ネオジミウム・イオン等が挙げられる。
好ましくは、テレビウム・イオンあるいはユーロピウム
・イオンが用いられる。
この発明による方法は、好ましくは、アナライトを含
む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／
又は測定を螢光を利用して行う方法の実施にあたり、測
定媒質中における干渉を低減すべく用いられる。そし
て、この発明に係る方法は、文献（Landon,Ann.Clin.Bi
ochem.,1981,18,253及びE.SOINI et al.,Clin.Chem.,19
79,25,353）に記載されている如くの、均質相あるいは
不均質相中における螢光免疫分析、所謂、競争分析ある
いはサンドイッチ法による分析に適用されることに大な
る意味がある。望ましくは、アナライトの検出及び／又
は測定を行う方法は均質方法とされる。
この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に
係る干渉を低減する方法は、アナライトを含む可能性の
ある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を
螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられ、ア
ナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方
法は、 １）媒質に、少なくとも一個のアナライトに対するレセ
プタを含んで成る第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、アナライト及び少なくとも一個のレセプタ
のうちから選択された第２の試薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に
対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起
するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、
平衡状態あるいは動的状態のもとで測定するステップ； を含み、第１及び第２の試薬のうちの一方が螢光ドナー
化合物と結合したものとされるとともに他方が螢光アク
セプタ化合物と結合したものとされ、また、第１の試薬
を添加するステップと第２の試薬を添加するステップと
は順序が可逆とされるものとなされる。
また、この発明における好ましい特徴に従えば、この
発明に係る方法は、アナライトを含む可能性のある媒質
中におけるアナライトの検出及び／又は測定を、以下の
１）〜５）の各ステップを含むものとされるサンドイッ
チ法による分析に従って、螢光を利用して行う方法の実
施にあたって用いられる。
１）アナライトを含む媒質に、少なくとも一個のアナラ
イトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結
合した第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、一個もしくは複数個のアナライトに対する
他のレセプタから成り、螢光アクセプタ化合物と結合し
た第２の試薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に
対する励起波長に相当する波長を有した光源からの光に
よって励起するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測
定するステップ。
この発明における好ましい特徴に従えば、上述のサン
ドイッチ法による分析は、螢光ドナー化合物もしくは螢
光アクセプタ化合物のいずれかと結合する、アナライト
に対する単一のレセプタを用いて行われる。
この発明による方法は、アナライトを含む可能性のあ
る媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を、
以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる競争
分析に従って、螢光を利用して行う方法の実施にあたっ
て用いられる。
１）アナライトを含む媒質に、アナライトに対するレセ
プタから成り、螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬
を添加するステップ； ２）媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライ
トを成す第２の試薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に
対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起
するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測
定するステップ。
さらに、この発明による干渉を低減させる方法は、ア
ナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライト
の検出及び／又は測定を、以下の１）〜５）の各ステッ
プを含むものとされる競争分析に従って、螢光を利用し
て行う方法の実施にあたって用いられる。
１）アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と
結合した、アナライトに対するレセプタから成る第１の
試薬を添加するステップ； ２）媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライト
を、第２の試薬として添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるい
は、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られ
た媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に
対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起
するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測
定するステップ。
この発明における好ましい特徴に従えば、上述のアナ
ライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法
において用いられる第１の試薬及び第２の試薬は、アナ
ライトを含む媒質に同時に添加されてもよい（その際に
は、ステップ１）とステップ２）とは同一のステップと
される）。
この発明に係る干渉を低減させる方法を用いた、アナ
ライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法
においては、希土類キレートもしくは希土類クリプテー
ト、特に、ヨーロッパ特許出願EP 0 180 429及びEP 0 3
21 353に記載されているクリプテートが、螢光ドナー化
合物として積極的に選択される。斯かる螢光ドナー化合
物は、好ましくは、ヨーロッパ特許出願EP 0 180 429に
記載されている如くの、テルビウム・クリプテート:Tb
トリスビピリジン、あるいは、ユーロピウム・クリプテ
ート:Euトリスビピリジンとされる。
また、この発明における好ましい特徴に従えば、螢光
ドナー化合物がユーロピウム・クリプテートとされると
ともに、螢光アクセプタ化合物がアロフィコシアニン，
アロフィコシアニンB,フィコシアニンＣ及びフィコシア
ニンＲの中から選択されたものとされる。
さらに、テルビウム・クリプテートを螢光ドナー化合
物として用いるとともに、ローダミン，チオニン，フィ
コシアニンR,フィコエリトロシアニン，フィコエリトリ
ンC,フィコエリトリンＢ及びフィコエリトリンＲの中か
ら選択されたものを螢光アクセプタ化合物として用いる
ことができる。
この発明は、以下に述べられる、発明を制限するもの
ではない実施例が参照されることにより、一層明瞭に理
解される。
下記の実施例においては、ユーロピウム・クリプテー
ト:Euトリスビピリジンジアミンが、ヨーロッパ特許出
願EP 0 321 353（実施例３及び４）に記載されている如
くにして用意される。
また、下記においては、次の如くの省略表記が用いら
れる。
APC ＝ アロフィコシアン（allophycocyanin） DTT ＝ ジチオトレイトール（dithiothreitol） Eu TBP ＝ ユーロピウム・クリプテート:Euトリス
ビピリジンジアミン（europium cryptate:Eutrisbipyri
dinediamine） HAS ＝ 人間血清アルブミン（human serum albu
min） IgG ＝ 免疫グロブリンＧ（immunoglobulin G） Ｎ−AANS ＝ Ｎ−アセチル−８−アニリノナフタレン
−１−スルフォン酸（Ｎ−acetyl−８−anilinonaphtha
lene−１−sulfonic acid） Ｓ−AMSA ＝ Ｓ−アセチルメルカプトスクシニック・
アンヒドライド（Ｓ−acetylmercaptosuccinic anhydri
de） SPDP ＝ Ｎ−スクシンイミジル ３−（ピリジン
−２−イリジチオ）プロピオナート（Ｎ−succinimidyl
3−（pyridin−２−yldithio）propionate） sulfo−SMCC ＝ サルフォスクシンイミジル（４−Ｎ
−マレイミドメチル）−サイクロヘキサン−１−カルボ
キシレート（sulfosuccinimidyl（４−Ｎ−maleimidome
thyl）−cyclohexane−１−carboxylate） T4 ＝ チロキシン（thyroxin） 実施例 1: 血清媒質中におけるユーロピウム・クリプテート:Euト
リスビピリジンジアミンの発光寿命に対するフッ化ナト
リウム（NaF）の効果 ユーロピウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジ
アミンにより発せられる信号の寿命に対するフッ化ナト
リウムの効果を評価するため、先ず、抗プロラクチン・
モノクロナル抗体E1（セ・ア・エス バイオ アンテル
ナシオナル、フランス）にユーロピウム・クリプテート
を結合させることによって、均質免疫分析に用いられる
共役溶液と同じものである、抗体／ユーロピウム・クリ
プテート共役溶液が用意された。そして、この共役溶液
の発光寿命が、燐酸塩緩衝媒質中、及び、NaFの濃度を
異にする複数種の血清媒質中において測定された。
A.抗体／ユーロピウム・クリプテート:Euトリスビピリ
ジンジアミン共役溶液の用意 ａ）sulfo−SMCCによるEu TBPの活性化 10％（v/v）のジメチルフォルムアミドを含むpH7.0の
20mM燐酸塩緩衝液中における濃度が25mMとされたsulfo
−SMCC溶液が、5mg（５・10-6mol）のEu TBPに、Eu T
BPの1molに対して活性化剤が2.5molとされる割合となる
ように加えられる。そして、室温のもとで45分間活性化
された後、反応媒質が0.8μｍのフィルタが用いられて
濾過され、生成された沈殿物が除去される。さらに、不
所望な反応生成物（sulfo−SMCC,N−ハイドロオキシス
クシンイミド，（Ｎ−マレイミドメチル）カルボキシル
酸）が、10％（v/v）のジメチルフォルムアミドを含むp
H7.0の20mM燐酸塩緩衝液中に置かれたイオン交換樹脂柱
（Mono Q: ファーマシア，スウエーデン）を用いたイ
オン交換クロマトグラフィによって除去される。Eu TB
P−マレイミドの濃度は、波長を307nmとする光に対する
モル吸光係数が25,000（ε307nm＝25,000M-1・cm-1）と
なるように設定される。
ｂ）SPDPによるIgG E1の活性化 pH7.0の100mM燐酸塩緩衝液に5mgのIgG E1が溶解され
て得られた濃度を10mg/mとするIgG E1が、それに対
してジオキサン中の濃度が6.4mMとされたSPDP溶液（ピ
アース、米国）が、IgG E1に対するSPDPのモル比が16
対４となるように加えられて活性化される。そして、室
温のもとで35分間活性化された後、IgG−ピリジン−２
−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6.5の100mM燐酸塩緩衝
液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用いられて
精製される。
その後、室温のもとにおかれた15分間において、蛋白
質が濃縮されるとともに、ピリジン−２−イェール ジ
スルファイド基がDTT溶液（シグマ、米国）によって最
終濃度が19mMとなるように希釈される。そして、DTT及
びピリジン−２−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6.5の10
0mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱
（ファーマシア，スウェーデン）が用いられて精製され
ることにより除去される。IgG−SHの濃度は、波長を280
nmとする光に対するモル吸光係数が210,000（ε280nm＝
210,000M-1・cm-1）となるように設定される。
ｃ）Eu TBP−マレイミドによるIgG E1の共役化 チオール基は、IgG E1−SHに対するEu TBP−マレイ
ミドのモル比が30対10となるようにマレイミドと結合せ
しめられる。暗い場所に摂氏４度の状態で置かれ、緩や
かに攪拌されるもとで、18時間に亙ってインキュベート
された後、室温のもとで１時間に亙り、自由状態のまま
で残ったチオール基が100mM N−メチルマレイミド溶液
（シグマ、米国）が加えられることにより捕獲される状
態とされ、最終濃度が20mMとなるようにされる。その
後、非結合状態にあるEu TBPが、摂氏４度とされたpH
7.0の100mM燐酸塩緩衝液中での透析によい、消尽状態
（透析槽内において螢光が発せられなくなる状態）とな
るように除去されていく。
このようにして得られる共役溶液の特性は、波長を30
7nm及び280nmとする光に対する吸収度合いによって設定
され、実験的に求められた比:A307nm/A280nmによって定
められるEu TBPの内在吸収が考慮され、下記の如くの
値によりあらわされる。
Eu TBP−マレイミドのモル吸光係数： ε307nm＝25,000M-1・cm-1 IgG E1−SHのモル吸光係数： ε280nm＝210,000M-1・cm-1 ε307nm＝0M-1・cm-1 B.抗体／ユーロピウム・クリプテート共役溶液の発光寿
命についての水中及びNaFの存在のもとにおける血清媒
質中における測定 上述の如くにして用意されたIgG E1/Eu TBP共役溶
液が、1g/の人間血清アルブミン（HSA）及び異なる濃
度の複数種のフッ化ナトリウム（NaF）を夫々を含んだ
複数種のpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液の各々の中において
1/250に希釈される。
それにより得られる溶液200μが、100μの新生子
牛の血清あるいは燐酸塩緩衝液に加えられる。そして、
共役溶液の発光寿命が、以下に述べられる如くのレーザ
螢光光度計（試作品）が用いられたもとで波長260nmの
光について測定される。
レーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザ（レ
ーザ サイエンス 社製，モデルLS1−337ND）が励起光
源（波長337.1nm）として用いられる。パルス幅が3nsと
され、また、パルス反復周波数は10Hzである。発せられ
たレーザ光ビームはフィルタ（コーニング）を通過する
ものとされて、波長を337nmとする光以外のノイズ光成
分が除去される。そして、窒素パルスレーザからのレー
ザ光ビームは、測定室に入射した後、45度の角度をもっ
て設置された、紫外線を反射して可視光を透過させる特
性を有するダイクロイック・フィルタによって反射され
る。ダイクロイック・フィルタによって反射されたレー
ザ光ビームは、シリカレンズによって、マイクロプレー
トに設けられた測定ウエル上に集束せしめられる。
共役溶液が発する螢光は、同じレンズにより20度の立
体角をもって集められて平行化され、ダイクロイック・
フィルタを直接的に透過する（可視螢光）。そして、信
号（共役溶液が発する螢光）は、検出対象とされる螢光
波長に応じたものとされる特性を有した干渉フィルタに
よってノイズ光成分が除去されたものとされた後、その
光度が光電増倍器（ハママツ R2949）が用いられて測
定される。
信号光度の測定に用いられる光子カウンタは、SR−40
0（スタンフォード リサーチ システムズ）であり、
その動作及びレーザとの同期状態は、RS−232形式の出
力端を有したIBM PC−ATタイプのコンピュータによって
制御される。光電増倍器からのパルスは、光子カウンタ
によって光電増倍器における信号対雑音比に対する要求
を小にできるように選定された弁別レベルを越えた部分
が、所定の遅れ時間（td）後、所定のタイムウインドウ
（tg）に亙って記録される。
IBM PC−ATタイプのコンピュータによる駆動のもとに
測定用マイクロプレートの位置を変えるステップモータ
を備えたＸ−Ｙテーブルが用いられ、そのＸ−Ｙテーブ
ルによって、励起用のレーザ光ビームが、自動的に、マ
イクロプレートに設けられた96個の測定ウエルの夫々を
順次照射して励起することになる状態がとられる。
なお、ARCUS螢光光度計（エル・ケー・ビー，スウェ
ーデン）を、螢光化合物の発光に応じた干渉フィルタと
共に、使用することもできる。
信号光度の測定は、遅れ時間（td）が50〜600μｓと
され、タイムウインドウ（tg）が100μｓとされたもと
で行われる。その測定結果は、下記の表Ｉに示される如
くである。
表Ｉに示される測定結果は、血清媒質中における信号
の寿命が、媒質中のNaFの濃度の増加に応じて顕著に増
大することをあらわしており、共役溶液中のNaFの濃度
が500mM以上の場合には、共役溶液の発光寿命は、NaFが
存在しない血清媒質中の共役溶液の発光寿命の２倍以上
となる。
実施例 2: 血清媒質におけるユーロピウム・クリプテート:Euトリ
スビピリジンジアミンの発光寿命に対するフッ化カリウ
ム（KF）の効果 実施例１の場合と同様にして用意されたIgG E1/Eu
TBP共役溶液が、1g/の人間血清アルブミン（HSA）及
び異なる濃度の複数種のフッ化カリウム（KF）を夫々を
含んだ複数種のpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液の各々の中に
おいて、1/250に希釈される。
それにより得られる溶液200μが、100μの新生子
牛の血清に加えられる。そして、共役溶液の発光寿命の
測定が、実施例１の場合と同様に行われ、測定結果は、
下記の表IIに示される如くである。
表IIに示される測定結果は、血清媒質中における信号
の寿命が、媒質中のKFの濃度の増加に応じて顕著に増大
することをあらわしている。
実施例 3: 異なった媒質中でのNaFの存在のもとにおけるユーロピ
ウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジアミンの発
光寿命に対する異なった添加剤の効果 用いられる媒質は、新生子牛の血清及び人間の血清
（血清プール）である。
IgG 3D3/Eu TBP共役溶液（実施例１の場合における
IgG E1/Eu TBP共役溶液と同様に、抗プロラクチン3D3
モノクロナル抗体（セ・ア・エス バイオ アンテルナ
シオナル、フランス）にユーロピウム・クリプテートを
結合させることによって用意される）が、150mMのNaF及
び1g/の人間血清アルブミン（HSA）を含んだpH7.0の1
00mM燐酸塩希釈緩衝液中において、0.5μg/mの濃度を
有するものとされて用いられる。そして、100μの血
清,100μの抗体／クリプテート共役溶液、及び、異な
る濃度を有した異種の添加剤:EDTA,NaN3及びメルチオラ
ートを夫々含んだ複数種の100μの緩衝液のうちの一
つを含んだサンプルが用意される。
抗体／クリプテート共役溶液の発光寿命は、ARCUS螢
光光度計（エル・ケー・ビー，スウェーデン）が用いら
れ、波長を620nmとする光について、遅れ時間が50〜600
μｓとされたもとで100μｓに亙って測定される。各分
析において、抗体／クリプテート共役溶液に対する添加
剤が加えられず、それ自体によって得られる値が基準と
して設定され、その後、各サンプルが、100μの血清,
100μの抗体／クリプテート共役溶液、及び、添加物
を含まない100μの緩衝液を含むものとされる。測定
結果は、下記の表IIIに示される如くである。
表IIIに示される測定結果は、測定媒質にフッ化ナト
リウムが添加されていることにより、共役溶液の発光寿
命が、他の添加剤の種類及びその濃度にかかわらず、実
質的に一定に維持されることをあらわしている。
実施例 4: プロラクチンの分析 均質免疫分析が、典型的なものとしてプロラクチンの
分析をもって行われた。
この分析においては、プロラクチンにおける二つの区
別された抗原決定基として認められている抗プロラクチ
ンE1及び3D3モノクロナル抗体（セ・ア・エス バイオ
アンテルナシオナル、フランス）が、夫々、ユーロピ
ウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジアミン及び
アロフィコシアニン（シアノテック、米国）と結合した
ものとされて用いられた。
A.IgG 3D3/APCの用意 ａ）sulfo−SMCCによるAPCの活性化 市販されている硫酸アンモニウムの60％水溶液中の沈
殿物として得られるAPC（3mg）が遠心分離器にかけられ
る。そして、上澄液が除去されて得られる残りの部分
が、250μのpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液とされ、その
燐酸塩緩衝液が0.8μｍのフィルタが用いられて濾過さ
れて、その中の懸濁粒子が除去される。さらに、濾過液
が、pH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イ
オン交換樹脂柱（ファーマシア、スウエーデン）を用い
た排斥クロマトグラフィによって精製される。排斥イオ
ン交換樹脂柱内で溶離されたAPCの濃度は、波長を650nm
とする光に対するモル吸光係数が、731,000（ε650nm＝
731,000M-1・cm-1）となるように設定される。
得られたAPCは、pH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中の濃度
が6.9mMとされたsulfo−SMCC溶液が添加され、１時間に
亙って緩やかに攪拌されるもとで反応が促進される状態
におかれることによって活性化される（APCに対するsul
fo−SMCCのモル比は75対15とされる）。そして、APC−
マレイミドが、5mMのEDTAを含むpH6.5の100mM燐酸塩緩
衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用いられ
て精製され、IgG 3D3との結合まで摂氏４度に維持され
る。
ｂ）SPDPによるIgG 3D3の活性化 pH7.0の100mM燐酸塩緩衝液に5mgのIgG 3D3が溶解さ
れて得られた濃度を10mg/mとするIgG 3D3が、それに
対してジオキサン中の濃度が6.4mMとされたSPDP溶液
（ピアース、米国）が、IgG 3D3に対するSPDPのモル比
が7.5対１となるように加えられて活性化される。そし
て、室温のもとで35分間活性化された後、IgG−ピリジ
ン−２−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6.5の100mM燐酸
塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用い
られて精製される。
その後、室温のもとにおかれた15分間において、蛋白
質が濃縮されるとともに、ピリジン−２−イェール ジ
スルファイド基がDTT溶液（シグマ、米国）によって最
終濃度が19mMとなるように希釈される。そして、DTT及
びピリジン−２−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6.5の10
0mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱
が用いられて精製されることにより除去される。IgG−S
Hの濃度は、波長を280nmとする光に対するモル吸光係数
が210,000（ε280nm＝210,000M-1・cm-1）となるように
設定される。
ｃ）APC−マレイミドによるIgG 3D3−SHの共役化 チオール基は、1mgのIgG 3D3−SHに対して2.51mgの
活性化されたAPCが加えられることによってマレイミド
と結合せしめられる。暗い場所に摂氏４度の状態で置か
れ、緩やかに攪拌されるもとで、18時間に亙ってインキ
ュベートされた後、室温のもとで１時間に亙り、自由状
態のままで残ったチオール基が100mM N−メチルマレイ
ミド溶液（シグマ、米国）が加えられることにより捕獲
される状態とされ、最終濃度が20mMとなるようにされ
る。その後、反応媒質が、pH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中
に置かれたTSK G3000SWイオン交換樹脂柱（ベックマ
ン、米国）が用いられたゲル濾過によって精製される。
このようにして溶離される精製された共役溶液中にお
けるAPC及びIgG 3D3の夫々の濃度は、波長を280nm及び
650nmとする光に対する吸収度合いによって設定され、
下記の計算式によりあらわされる。
〔APC〕mol/l＝A650nm/710,000 〔IgG〕mol/l＝A280nm−Ａ′280nm/210,000 ここで、Ａ′280nmは、波長を280nmとする光に対して
のAPC−マレイミドの貢献をあらわす。
人間血清アルブミン（HSA）は、1g/の量をもって共
役溶液に加えられ、その後、共役溶液は小分けされて摂
氏−20度のもとで凍結せしめられる。
B.IgG E1/Eu TBP共役溶液の用意 IgG E1/Eu TBP共役溶液は、実施例１の場合におけ
る手法に従って用意される。
C.プロラクチンの分析への適用 上述の如くにして用意された標識抗体は、下記の如く
の状態のもとで用いられる。
IgG E1は、150mMのNaF及び1g/のHSAを含んだpH7.0
の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が１μg/mとされ
たユーロピウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジ
アミンによって標識化された状態。
IgG 3D3は、150mMのNaF及び1g/のHSAを含んだpH7.
0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が2.5μg/mとさ
れたアロフィコシアニン（シアノテック、米国）によっ
て標識化された状態。
複数のプロラクチン標準溶液が、夫々異なった媒質、
即ち、上述の緩衝液，人間の血清のプール及び新生子牛
の血清の夫々について形成される。
サンプル量は、100μとされ、各共役溶液の100μ
が加え合わされて得られる混合溶液が、96個の測定ウエ
ルが設けられたマイクロプレート（ダイナミック、米
国）上において、室温のもとに60分間インキュベートさ
れる。そして、結果は、実施例１において用いられた如
くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレ
ーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザが励起光
源として用いられるとともに、通過波長域を645〜665nm
とするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時
間（td）が50μｓとされ、測定用タイムウインドウ
（tg）が100μｓとされたもとで行われる。
その測定結果は、第１図に示される。第１図において
は、横軸に、IU/mを単位としてあらわされたプロラク
チンの量がとられ、縦軸に、下記の式によって求められ
る有効信号ΔＦがとられている。
第１図に示される測定結果は、フッ化ナトリウムが存
在することにより、螢光抑制血清要因の存在にかかわら
ず、分析が遂行されることをあらわしている。
実施例 5: プロラクチンの分析 他の均質免疫分析も、典型的なものとしてプロラクチ
ンの分析をもって行われ、その際における測定媒質には
フッ化カリウム（KF）が存在するものとされた。
実施例４に関連して記述された如くにして用意された
標識抗体は、下記の如くの状態のもとで用いられる。
IgG E1は、600mMのKF及び1g/のHSAを含んだpH7.0
の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が１μg/mとされ
たユーロピウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジ
アミンによって標識化された状態。
IgG 3D3は、600mMのKF及び1g/のHSAを含んだpH7.0
の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が、2.5μg/とさ
れたアロフィコシアニン（シアノテック、米国）によっ
て標識化された状態。
複数のプロラクチン標準溶液が、新生子牛の血清につ
いて形成される。
分析及び螢光の測定は実施例４に関連して記述された
如くの状態のもとで行われるが、結果の処理は、レーザ
螢光光度計による信号光度の測定が、遅れ時間（td）が
50μｓとされ、タイムウインドウ（tg）が400μｓとさ
れたもとで行われることによりなされる。
その測定結果は、第２図に示される。第２図において
は、横軸に、IU/mを単位としてあらわされたプロラク
チンの量がとられ、縦軸に、実施例４の場合と同様にし
て求めらる有効信号ΔＦがとられている。
第２図に示される測定結果は、測定媒質中におけるフ
ッ化カリウムの存在により、螢光抑制血清要因の存在に
かかわらず、分析感度が良好に確保されることをあらわ
している。
実施例 ６ 上述の実施例２に関連して記述された分析と同様な分
析において、最終濃度が100mMとされるフッ化ナトリウ
ムの効果が、3D3 抗体/Euトリスビピリジン・クリプテ
ート共役溶液が用いられた50種の人間の血清について試
された。得られた結果は、血清媒質についての斯かるタ
イプの分析において実験に観測される事柄に反して、抗
体／クリプテート共役溶液の発光寿命が一定とされるこ
とを示している。
実施例 7: シゴキシンの分析 シゴキシンは、心不全に対処するための薬品の活性素
成分として用いられる強心配糖体である。
A.過ヨウ素酸塩との結合によるアロフィコシアニン−ジ
ゴキシン・トレーサの用意 ａ）過ヨウ素酸塩によるジゴキシンの活性化 268μのNaIO4溶液（フルカ、スイス）が、268μ
の無水エタノール中にジゴキシンが5.35mg含まれて成る
ジゴキシン懸濁液（参照番号37100 フルカ、スイス）
に加えられる。それにより得られた混合液が、攪拌され
る状態をもって、室温のもとで20分間インキュベートさ
れ、その後、100μの0.1Mグリセリンが加えられるこ
とにより反応が停止せしめられる。活性化されたジゴキ
シンの最終濃度は、初期重量と最終量とに関連して算出
され、1.2×10-2Mとされる。
ｂ）活性化されたジゴキシンのアロフィコシアニン（AP
C）との結合 95μの過ヨウ素酸塩によって活性化されたジゴキシ
ン溶液が、pH9.0の硼酸塩緩衝液中における2mの精製
されたAPC溶液（シアノテック、米国）に加えられる。
それにより得られる混合液が、緩やかに攪拌される状態
をもって、室温のもとで１時間30分に亙ってインキュベ
ートされ、その後、1.32mの硼酸塩緩衝液中におけるN
aBH4の濃度が5mgとされた水酸化硼素ナトリウム溶液の1
00μが加えられることにより反応が停止せしめられ
る。
ｃ）APC−ジゴキシン・トレーサの精製 2mの反応混合液が、HR 10/10 G25イオン交換樹脂柱
（ファーマシア、スウェーデン）に噴射されて、pH7.0
の100mM燐酸塩緩衝液中で平衡化されるとともに排除体
積において溶離される。過剰試薬は、8mの緩衝液によ
って溶離される。
1.22mg/mのAPC（波長を650nmとする光に対する吸光
度による測定による）を含む、およそ4mのAPC−ジゴ
キシン結合生成物の溶液が回復せしめられる。ジゴキシ
ンの濃度は、RIAあるいはDELFIA（ファーマシア、スウ
ェーデン）によって求められる。算出されたアロフィコ
シアニン対ジゴキシンの最終モル比はおよそ0.8であ
る。
B.人間の血清中におけるジゴキシンの競争均質分析 抗体／ユーロピウム・クリプテート:Eu TBPジアミン
共役溶液が、抗ジゴキサン・マウス・モノクロナル抗体
（参照番号G 31604 M、アンテルシム、フランス）が用
いられ、実施例１に関連して記述された如くにして用意
される。この抗体／クリプテート共役溶液は、150mMのN
aF及び1g/のHASを含んだpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中
における濃度が0.5μg/mとされて用いられる。
APC−ジゴキサン・トレーサは、150mMのNaF及び1g/
のHSAを含んだpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃
度が0.2μg/mとされて用いられる。
ジゴキサン標準溶液は、ジゴキサン溶液（フルカ、ス
イス）が、人間の血清中において、50/50の配分とされ
たエタノール−水混合液における濃度が1mg/mとされ
るように希釈されることによって用意される。標準溶液
曲線は、50μの燐酸塩緩衝液,50μの基準溶液,100
μのAPC−ジゴキサン・トレーサ、及び、100μの抗
体／クリプテート共役溶液を含んだ複数種のサンプルの
助けを得て描かれる。
分析対象とされる複数種のサンプルは、50μの標準
溶液が50μの個々の分析されるべき血清に置き換えら
れることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、96個の測定ウエルが設けられたマイクロプレ
ート（ダイナミック、米国）において行われる。室温の
もとに30分間インキュベートされた後、結果が、実施例
１に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用い
られて処理される。このレーザ螢光光度計においては、
通過波長域を655〜675nmとするフィルタが備えられ、信
号光度の測定が、遅れ時間が50μｓとされ、測定用タイ
ムウインドウが100μｓとされたもとで行われる。
その測定結果は、B/B0比のパーセンテージとしてあら
わされ、Ｂは、各標準溶液に関して得られる値であり、
また、B0は、標準溶液０に関して得られる値である。得
られた結果は、表IVに示される。
表IVに示される測定結果は、得られた値が、ジゴキサ
ンの濃度の増加に応じてリニアーに低減する関係にある
ことをあらわしている。そして、測定媒質中にフッ化ナ
トリウムが存在することにより、血清媒質中におけるジ
ゴキサンの分析が、ng/mオーダーの高感度をもって遂
行されることになる。
実施例 8: チロキシンの分析 A.アロフィコシアニン−チロキシン（APC−T4）トレー
サの用意 ａ）Ｓ−AMSAによるチロキシンの活性化 メタノール中に8.7mg/m（50mM）含まれたＳ−AMSA
の溶液（シグマ、米国）の500μが、メタノール中に2
0mg/m含まれたT4の溶液（カルバイオシェム、フラン
ス）の500μに加えられ、それにより得られた混合液
が、メタノール中に6.95mg/m（100mM）含まれたハイ
ドロキシルアミンの溶液の500μが加えられる前に、
室温のもとで15分間インキュベートされる。その後、97
5μの反応混合液が除去され、525μのMILLIPORE HA
0.45μｍフィルタによって濾過された二重蒸留水が加
えられる。この溶液は、そのうちの250μが、Pep.RPC
HR 5/5 HPLCイオン交換樹脂柱を通過するものとされ、
65/35の配分とされたエタノール−水混合液によって溶
離される。
溶離された最初の３個のピークは回復せしめられ、そ
れに続く部分が混合されて、回転蒸発器において蒸発せ
しめられる。それにより、およそ3mgの活性化されたT4
（T4−SH）が回復せしめられる。
ｂ）SMCCによるアロフィコシアニンの活性化 10mgのAPCが、AMICON CENTRICON 30コーンが用いられ
るもとで精製されるとともに濃縮され、その700μに
ついて10.6mg/mの濃度を有するものとされる。pH7.0
の100mM燐酸塩緩衝液中に10mg/m含まれたsulfo−SMCC
の溶液（ピアース、米国）の160μが、APC溶液に加え
られる。それにより得られる反応溶液は、それにより得
られる混合液が、攪拌される状態をもって、室温のもと
で１時間インキュベートされ、その後、活性化されたAP
Cが、pH7.0の燐酸塩緩衝液中に置かれたG25 HR 10/10イ
オン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）を用い
た排除クロマトグラフィによって精製される。
ｃ）活性化されたチロキシンの活性化されたアロフィコ
シアニンとの結合 T4−SHのフラスコ内には、200μのメタノールが混
入しており、その溶液の50MμがpH7.0の100mM燐酸塩
緩衝液中における2mの活性化されたAPC溶液に加えら
れる。それにより得られる反応混合液が、攪拌される状
態をもって、摂氏４度のもとで18時間に亙ってインキュ
ベートされ、その後、過剰マレイミドの部位が、燐酸塩
緩衝液中における1/10のメルカプトエタノール（シグ
マ、米国）の５μによって遮断される。
ｄ）APC−T4トレーサの精製 反応混合液が、AMICON CENTRICON 30限外濾過装置が
用いられるもとで、全体で1mとなるように濃縮され、
それに、燐酸塩緩衝液中に1mg/m含まれたＮ−AANSの
溶液の50μが加えられる（Ｎ−AANSの最終濃度は、お
よそ50g/m）。トレーサは、最終的に、pH7.0の100nM
燐酸塩溶離緩衝液中に置かれたPHARMACIA G25 HR 10/10
排除クロマトグラフィ・イオン交換樹脂柱が用いられて
精製され、0.8mg/mの濃度を有した、およそ2.5mの
トレーサとされる（算出された波長650nmの光に対する
モル吸光係数は、ε＝731,000である）。
各APC分子に結合するT4分子の数は、トレーサのRIA及
びT4標準溶液曲線（T4−KPR kit、オリス アンディス
トリ、フランス）との比較によって求められる。計算に
よれば、精製されたトレーサについてのAPCに対するT4
の比は1.4である。
APC−T4トレーサは、Ｎ−ANS（コダック、米国）から
合成されたＮ−AANSの存在のもとに、ヒンズ他により記
述された手法（CLIN.CHEM.,32,16〜21,1986）によって
精製される。
B.人間の血清中におけるチロキシンの競争均質分析 抗体／ユーロピウム・クリプテート:Eu TBPジアミン
共役溶液が、抗T4R41マウス・モノクロナル抗体（セ・
ア・エス バイオ アンテルナシオナル、フランス）が
用いられ、実施例１に関連して記述された如くにして用
意される。この共役溶液は、120mMのNaF及び0.2％のHSA
を含んだpH7.0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が2g
/mとされて用いられる。
T4標準溶液は、イオン交換処理が施されてT4が無いも
のとされた人間の血清中においてT4が希釈されることに
よって用意される。標準溶液曲線は、50μのＮ−AANS
溶液,50μのT4を含まない人間の血清、あるいは、50
μのT4標準溶液,100μのAPC−T4トレーサ、及び、1
00μの抗体／クリプテート共役溶液を含んだ250μ
の複数種のサンプルの助けを得て描かれる。
分析対象とされる複数種のサンプルは、50μの標準
溶液が50μの個々の分析されるべき血清に置き換えら
れることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、96個の測定ウエルが設けられたマイクロプレ
ート（ダイナミック、米国）において行われる。室温の
もとに30分間インキュベートされた後、結果が、実施例
１に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用い
られて処理される。このレーザ螢光光度計においては、
励起光源として、周波数を1,000Hzとするフラシュ・ラ
ンプが用いられるとともに、通過波長域を655〜675nmと
するフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間
が50μｓとされ、測定用タイムウインドウが100μｓと
されたもとで行われる。
その測定結果は、B/B0比のパーセンテージとしてあら
わされ、Ｂは、各標準溶液に関して得られる値であり、
また、B0は、標準溶液０に関して得られる値である。分
析対象とされる各サンプルの濃度は、標準溶液曲線との
比較がなされて算出される。
得られた結果は、表Ｖに示される。
表Ｖに示される測定結果は、得られた値が、T4の濃度
の増加に応じてリニアーに低減する関係にあることをあ
らわしている。そして、測定媒質中にフッ化ナトリウム
が存在することにより、血清媒質中における測定感度が
良好に確保されることになる。
実施例 9: 19.9抗原の分析 19.9抗原は、結腸癌を代表する炭水化物である。19.9
抗原に対する部位は反復的抗原決定基とされるので、同
一の抗体がドナーを伴って標識化される態様とアクセプ
タを伴って標識化される態様とのいずれをもとり得るこ
とになる。
19.9抗原の分析としての均質免疫分析は、実施例４に
関連して記述された如くにして用意された抗体/Eu TBP
共役溶液及び抗体/APC共役溶液が用いられて行われる。
19.9抗原及び抗19.9抗体は、米国の“セントコール”か
ら入手できる。二つの共役溶液の夫々は、150mMのNaF及
び1g/のHSAを含んだpH6.0の100mM燐酸塩緩衝液中にお
いて希釈される。19.9抗原の標準溶液は、19.9抗原の濃
縮溶液が新生子牛の血清中において希釈されることによ
って用意される。
そして、以下のものが、96個の測定ウエルが設けられ
たポリスチレン製のマイクロプレート（ダイナミック、
米国）上に順次加えられる。
・50μの19.9抗原の標準溶液 ・50μの希釈緩衝液 ・100μの濃度が0.5μg/mとされた抗体/Eu TBP共
役溶液 ・100μの濃度が５μg/mとされた抗体/APC共役溶液 室温のもとに３時間30分に亙ってインキュベートされ
た後、結果が、実施例１に関連して記載された如くのレ
ーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢
光光度計においては、通過波長域を640〜660nmとするフ
ィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μ
ｓとされ、測定用タイムウインドウが400μｓとされた
もとで行われる。測定結果は、表VIにアービトレーショ
ン単位（AU）によりあらわされて示される如くである。
表VIに示される測定結果は、測定された信号が測定媒
質中における19.9抗原の量の増加に比例して増加する関
係にあることをあらわしている。そして、測定媒質中に
フッ化ナトリウムが存在することにより、血清媒質中に
おける測定が高感度をもって行われることになる。
実施例 10: 初期癌抗原（CEA）の分析 初期癌抗原の分析としての均質免疫分析は、二つのモ
ノクロナル抗体G12及びG15（セ・ア・エス バイオ ア
ンテルナシオナル、フランス）が用いられて行われ、モ
ノクロナル抗体G12及びG15は、夫々、ユーロピウム・ク
リプテート:Eu TBP及びアロフィコシアニンに結合した
ものとされる。
二つの共役溶液、即ち、G12/Eu TBP及びG15/APCの夫
々は、150mMのNaF及び1g/のHSAを含んだ100mM燐酸塩
緩衝液中において希釈される。
そして、以下のものが、ポリスチレン製のマイクロプ
レート（ダイナテック、米国）上に順次加えられる。
・100μの標準溶液 ・100μの濃度が0.5μg/mとされたG12/クリプテー
ト共役溶液 ・100μの濃度が５μg/mとされたG15/APC共役溶液 摂氏37度のもとで３時間に亙ってインキュベートされ
た後、結果が、実施例１に関連して記載された如くのレ
ーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢
光光度計においては、通過波長域を640〜660nmとするフ
ィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μ
ｓとされ、測定用タイムウインドウが400μｓとされた
もとで行われる。測定結果は、表VIIにアービトレーシ
ョン単位（AU）によりあらわされて示される如くであ
る。
表VIIに示される測定結果は、発せられた信号がCEAの
濃度の増加に比例して増加する関係にあることをあらわ
している。さらに、信号の増幅により、CEAの検出がng/
mオーダーの高感度をもって行われることになる。
また、測定媒質中にフッ化ナトリウムが存在すること
により、測定が高感度をもって行われることになる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジォル エティエンヌ ジャン―ピエー ル フランス 30200 バニュール―シー― セーズ アレ ドュ ロマラン ２ (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/78 G01N 21/64 G01N 33/533

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】測定媒質にフッ化物イオンを添加すること
    を特徴とする、トレーサとして少なくとも一つの螢光化
    合物を用いて行うアナライトの螢光分析における干渉を
    低減させる方法。
  2. 【請求項２】用いられる螢光トレーサが希土類キレート
    もしくは希土類クリプテートであることを特徴とする請
    求の範囲第１項記載の方法。
  3. 【請求項３】測定媒質が生物学的媒質であることを特徴
    とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】測定媒質が血清媒質であることを特徴とす
    る請求の範囲第３項記載の方法。
  5. 【請求項５】測定媒質にフッ化ナトリウム，フッ化セシ
    ウム，フッ化カリウムもしくはフッ化リチウムが添加さ
    れることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項記載
    の方法。
  6. 【請求項６】測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化
    ナトリウムの濃度が50mM/〜500mM/に選定されたこ
    とを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化
    カリウムの濃度が50mM/〜5M/に選定されたことを特
    徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
  8. 【請求項８】アナライトを含んでいる可能性のある媒質
    中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して
    行う方法の実施に際して、測定媒質における干渉をフッ
    化物イオンを用いて低減させるフッ化物イオンの使用方
    法。
  9. 【請求項９】アナライトを含んでいる可能性のある媒質
    中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して
    行う方法が均質方法とされたことを特徴とする請求の範
    囲第８項記載の方法。
  10. 【請求項１０】アナライトを含んでいる可能性のある媒
    質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用し
    て行う方法が、 １）上記媒質に、上記アナライトに対する少なくとも一
    個のレセプタを含んで成る第１の試薬を添加するステッ
    プ； ２）上記媒質に、上記アナライト及び少なくとも一個の
    レセプタのうちから選定された第２の試薬を添加するス
    テップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後
    に、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に
    対する励起波長に相当する波長の光によって励起するス
    テップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、
    平衡状態あるいは動的状態のもとで測定するステップ； を含み、上記第１及び第２の試薬のうちの一方が上記螢
    光ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が
    上記螢光アクセプタ化合物と結合したものとされ、ま
    た、上記第１の試薬を添加するステップと上記第２の試
    薬を添加するステップとは順序が可逆とされるものとさ
    れたことを特徴とする請求の範囲第８項又は第９項記載
    の使用方法。
  11. 【請求項１１】アナライトを含んでいる可能性のある媒
    質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用し
    て行う方法が、 １）上記アナライトを含んだ媒質に、少なくとも一つの
    上記アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー
    化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、一つもしくは二つ以上の他の上記アナ
    ライトに対するレセプタから成り、螢光アクセプタ化合
    物と結合した第２の試薬を添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後
    に、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、光源からの上記螢光
    ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長の光によ
    って励起するステップ；及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号
    を測定するステップ； を含んで成るサンドイッチ法による分析に従うものとさ
    れたことを特徴とする請求の範囲第10項記載の使用方
    法。
  12. 【請求項１２】アナライトを含んでいる可能性のある媒
    質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用し
    て行う方法が、 １）上記アナライトを含んだ媒質に、上記アナライトに
    対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結合した
    第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナ
    ライトを成す第２の試薬を添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後
    に、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合
    物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起す
    るステップ； 及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号
    を測定するステップ； を含んで成る競争分析に従うものとされたことを特徴と
    する請求の範囲第10項記載の使用方法。
  13. 【請求項１３】アナライトを含んでいる可能性のある媒
    質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用し
    て行う方法が、 １）上記アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合
    物と結合した、上記アナライトに対するレセプタから成
    る第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライ
    トを第２の試薬として添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あ
    るいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後
    に、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合
    物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起す
    るステップ； 及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号
    を測定するステップ； を含んで成る競争分析に従うものとされたことを特徴と
    する請求の範囲第10項記載の使用方法。
  14. 【請求項１４】第１の試薬及び第２の試薬がアナライト
    を含んだ媒質に同時に添加されることを特徴とする請求
    の範囲第10項，第11項，第12項又は第13項記載の使用方
    法。
  15. 【請求項１５】アナライトに対する単一のレセプタであ
    って螢光ドナー化合物または螢光アクセプタ化合物と結
    合したものが用いられることを特徴とする請求の範囲第
    10項又は第11項記載の使用方法。
  16. 【請求項１６】螢光ドナー化合物が希土類キレートもし
    くは希土類クリプテートとされることを特徴とする請求
    の範囲第10項，第11項，第12項，第13項，第14項又は第
    15項記載の使用方法。
  17. 【請求項１７】希土類クリプテートがテルビウム・クリ
    プテートもしくはユーロピウム・クリプテートとされる
    ことを特徴とする請求の範囲第16項記載の使用方法。
  18. 【請求項１８】螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプ
    テート:Tbトリスジピリジンもしくはユーロピウム・ク
    リプテート:Euトリスジピリジンとされることを特徴と
    する請求の範囲第17項記載の使用方法。
  19. 【請求項１９】螢光ドナー化合物がユーロピウム・クリ
    プテートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がア
    ロフィコシアニン，アロフィコシアニンB,フィコシアニ
    ンＣ及びフィコシアニンＲのうちから選択されたものと
    されることを特徴とする請求の範囲第10項，第11項，第
    12項，第13項，第14項，第15項又は第16項記載の使用方
    法。
  20. 【請求項２０】螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプ
    テートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がロー
    ダミン，チオニン，フィコシアニンR,フィコエリトロシ
    アニン，フィコエリトリンC,フィコエリトリンＢ及びフ
    ィコエリトリンＲのうちから選択されたものとされるこ
    とを特徴とする請求の範囲第10項，第11項，第12項，第
    13項，第14項，第15項又は第16項記載の使用方法。
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