JPH05508925A - 螢光分析における干渉低減方法 - Google Patents

螢光分析における干渉低減方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 螢光分析における干渉低減方法 この発明は、螢光分析における干渉を低減させる方法に関する。
現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析あるいは定量分析に広く用 いられている。現行の技術にあっては、螢光定量分析が重要になってきている。
実際に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行えること、螢光化合 物により標識化された試薬が安定していて安全であること、比較的低コストで行 えること等の多くの利点がある。
螢光を利用する検出方法は、本質的に非常に高感度であり、特に、変調可能なレ ーザ光源を使用する場合には、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出 下限をより低くすることができるものであることが知られている(1. Wie der、 ”Immunofluore−scence and relate d’ staining techniques”、1978. Elsevi er)。
斯かる方式の分析においてトレーサとして用いることができる多数の螢光分子が 既に書物に記述されており、それらの中で、希土類錯体が極めて有用な特性を有 している。そして、希土類錯体のうちの特定のものとして希土類クリブテートを 用いる分析が、ヨーロッパ特許出願: EP O180492、国際特許出願:  PCT/FR8600269、ヨーロッパ特許出願: EP 0321353 、国際特許出願二PcT/FR8600562等に記載されている。希土類クリ プテートは、含塩蛋白質媒質中において非常に安定であるという利点を有してお り、斯かる特性は、均質免疫分析の場合において格別に重要である。
このようなもとにあっても、測定感度は、測定が行われる媒質中における様々な 分子の存在に起因して生じる各種の干渉によって左右されるところが大なるもの とされる。この問題は、干渉を生じ得るものとされる多数の分子が存在する血清 媒質中における分析の場合に取分は深刻である。例えば、測定対象信号は、励起 され得る状態におかれ、しかも、トレーサとして用いられている分子と同じ波長 の光を発し得るものとされた分子からの発光による干渉を受けるものとされる。
これに対し、螢光測定にあたって時分割法(time−resolved me −thOd)をとることにより、上述の不都合を部分的に解消することができる 。この方法の原理は、比較的長い発光寿命を有したトレーサ分子が発する螢光を 他の存在分子の発光寿命が尽きた後に測定することにある。そして、斯かる場合 には、希土類キレートの如くの比較的長い寿命を有した螢光トレーサ分子を用い ることが必要とされる。
また、測定感度は′、検出対象とされるアナライト(analyte)と標識生 体特異試薬との間の結合に起因して発せられる螢光の変化に摂動を生じさせ得る ものとされた、媒質中の分子からの干渉の影響も受けるものとされる。それに対 して、ヨーロッパ特許出願: EP O324323には、生体特異試薬と結合 した希土類キレートを安定化させる変調因子を用い、測定対象とされる螢光の変 化が実質的にアナライトの濃度の関数となるようになすことが記載されている。
この変調因子の効果により、希土類キレートが発する螢光が媒質中に存在する他 の分子により摂動を生じるものとされることが禁止され、その結果、測定対象と される螢光の変化が、抗原抗体反応のみの関数とされる。変調因子として提案さ れているものとしては、たんばく質、清浄剤等の巨大分子があり、それらは、0 .1−10 g/A’の範囲を越えるものとされて用いられる。
斯かる状況にもかかわらず、測定媒質中に各種の分子が存在することに起因する 干渉の問題は、上述の如くの方法のいかなるもによっても、十分に解消すること はできない。実際、螢光測定の感度を制限する元となっているものは、分析マー カーとして用いられる螢光分子の発光を抑制することになる、媒質中に存在する 分子による消光作用である。希土類錯体の場合にあっては、斯かる消光作用は、 螢光抑制分子が錯体中において自由な状態におかれた配位部位を占めるものとさ れる電子伝達メカニズムに起因するものとなる。特に、螢光分子と媒質中に存在 する分子との間で行われる酸化還元反応が指摘され、これらのメカニズムは、発 せられた螢光に無視できない変化を与える。
酸化還元現象に起因する螢光抑制についての記述は、従来の均質免疫螢光分析に 関する文献には見当たらない。
ウェーバ−/他(Weber et al、)による論文: C11n、 Ch em、、 1983、29/9.1665〜l672には、トリス(2’、2’  −ジピリジン)ルテニウム−(III)錯体についての電流滴定検出における 、特に、尿酸による干渉の影響について記載されている。ここで述べられている 錯体は、Co(II)消光錯体を酸化することができることになる、対応するR  u (II)錯体における酸化還元反応から発している。そして、尿酸は、R u (III)に対する還元剤として扱われており、それゆえ、測定に干渉する ものとなる。
斯かる螢光化合物と消光化合物との間の電子伝達による酸化還元メカニズムは、 サバティー二/他(5abbatini et al、) l:よる論文: J 、 A、 C,S、、 1984.106.4055〜4056 において論証 されている。この論文にあっては、M (CN) 6を一錯体のユーロピウム・ クリブテートによる酸化について、特に、詳細に記述されており、そのなかで、 Mは、鉄、ルテニウムあるいはオスミウムである。
電子伝達を含んだメカニズム及び通常の抑制メカニズムによる螢光の抑制は、実 際に際しては極端に面倒な現象である。なぜなら、抑制要因は、例えば、血清中 における尿酸の如くに、測定媒質中の化合物として本来存在するもの、あるいは 、分析にあたっての添加剤あるいは安定剤として加えられるものとされるからで ある。
このような抑制剤は、マーカー分子が発する螢光に大なる影響を与える。特に、 寄生酸化還元反応にあっては、酸化還元メカニズムによる希土類イオンの還元状 態から酸化状態の転換が、希土類イオンを含む錯体の寿命を短縮するとともに希 土類イオンを含む錯体の発光スペクトラムを変化させ、それにより、測定感度に 大なる影響を及ぼす; 従来にあっては予期されていなかったことであるが、この発明によって、測定媒 質にフッ化物イオンを添加することにより、測定媒質中に存在する抑制分子によ る螢光の抑制を実質的に低減できることが見出され、特に、生物学的媒質につい ては、その低減の度合いが顕著である。また、驚くべきことに、文献ニジエイ・ エイ・シー・ニス、1980年、102.2278−2285、イー他(Yee  et al、、 J、A、C,S、、 1980.102.2278−228 5)における、「三価の希土類クリプテート中におけるフッ化物イオンの結合は 、クリブテートの解離の度合いを実質的に増長し、生成物の半減期を27日から 2.8日に低減させる結果をまねく。」という旨の記載に反して、測定媒質に添 加されたフッ化物イオンは、希土類クリブテート錯体の安定性に対して悪影響を 与えないことも分かっている。
実際、測定媒質にフッ化物イオンが、特に、フッ化ナトリウムの形態をもって加 えられる°ことζ三より、トレーサ分子として用いられている希土類クリブテー トあるいは希土類キレートが発する信号の寿命が、緩衝液単体中において測定さ れる信号の寿命に匹敵するまでに引き伸ばされることが観測されている。仮説で はあるが、フッ化物イオンは、その寸法が小であって負の電荷を有していること により、希土類錯体における自由結合部位を占めることができ、そして、抑制剤 の近接を妨げていると言える。
このように、この発明は、少なくとも一個の螢光化合物をトレーサとして用いる アナライトの螢光分析における干渉を低減させる、測定媒質にフッ化物イオンを 添加するステップを含んだ方法に関している。
本願の記載においては、“アナライビは、検出及び/又は測定の対象とされる物 質あるいは類似する物質群を意味し、また、“レセプタ(receptor)” は、特にアナライトの一部に結合することができる物質を意味する。
この発明における好ましい特徴に従えば、測定媒質は、血清媒質の如くの生物学 的媒質とされる。もし、測定媒質が水溶液とされる場合には、フッ化ナトリウム 、フッ化セシウム、フッ化カリウム、あるいは、フッ化リチウムの水溶液が使用 されることが望ましい。陽イオンの選定は、用いられる媒質に応じてなされ、溶 媒中においてフッ化物イオンが溶解し得るものとなるようにされる。斯かる選定 は、この発明が属する技術分野における当業者が行うことができる範晴のもので ある。望ましくは、測定媒質が血清媒質とされたもとで、血清媒質中の濃度が5 0〜500 mW/lとされるフッ化ナトリウム(NaF)が用いられる。
この発明における他の好ましい特徴に従えば、濃度が50mM、/f〜5M/l とされるフッ化カリウム(KF)が用いられる。
螢光トレーサ化合物としては、希土類キレートあるいは希土類クリブテートが用 いられるのが良い。使用可能とされる希土類イオンとして、テルビウム・イオン 、ユーロピウム・イオン、ジスプロシウム・イオン、サマリウム・イオン、ネオ ジミウム・イオン等が挙げられる。好ましくは、テルビウム・イオンあるいはユ ーロピウム・イオンが用いられる。
この発明による方法は、好ましくは、アナライトを含む可能性のある媒質中にお けるアナライトの検出及び/又は測定を螢光を利用して行う方法の実施にあたり 、測定媒質中における干渉を低減すべく用いられる。そして、この発明に係る方 法は、文献(La−ndon、 Ann、 Cl1n、 B’iochem、、  1981.18.253 及びE、 5OINI etal、、 Cl1n、  Chem、、 1979.25.353)に記載されている如くの、均質相あ るいは不均質相中における螢光免疫分析、所謂、競争分析あるいは過剰分析に適 用されることに大なる意味がある。望ましくは、アナライトの検出及び/又は測 定を行う方法は均質方法とされる。
この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に係る干渉を低減する方法は 、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び/又は測 定を螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられ、アナライトの検出及び /又は測定を螢光を利用して行う方法は、 l)媒質に、少なくとも一個のアナライトに対するレセプタを含んで成る第1の 試薬を添加するステップ;2)媒質に、アナライト及び少なくとも一個のレセプ タのうちから選択された第2の試薬を添加するステップ;3)第1及び第2の試 薬の夫々が添加された後、あるいは、第1及び第2の試薬の両者が添加された後 、得られた媒質をインキュベートするステップ; 4)インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ; 及び、 5)螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状 態のもとで測定するステップ;を含み、第1及び第2の試薬のうちの一方が螢光 ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が螢光アクセプタ化合物と結 合したものとされ、また、第1の試薬を添加するステップと第2の試薬を添加す るステップとは順序が可逆とされるものとなされる。
また、この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に係る方法は、アナラ イトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び/又は測定を、以 下の1)〜5)の各ステップを含むものとされる過剰分析方法の助けを得たもと で、螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられる。
1)アナライトを含む媒質に、少なくとも一個のアナライトに2)媒質に、−個 もしくは複数個のアナライトに対する他のレセプタから成り、螢光アクセプタ化 合物と結合した第2の試薬を添加するステップ; 3)第1及び第2の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第1及び第2の試薬 の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ; 4)インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光源からの光によって励起するステップ; 及び、 5)螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
この発明における好ましい特徴に従えば、上述の過剰分析方法は、螢光ドナー化 合物もしくは螢光アクセプタ化合物のいずれかと結合する、アナライトに対する 単一のレセプタを用いて行われる。
この発明による方法は、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライ トつ検出及び/又は測定を、以下の1)〜5)の各ステップを含むものとされる 競争分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行う方法の実施にあたって用 いられる。
1)アナライトを含む媒質に、アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナ ー化合物と結合した第1の試薬を添加するステップ; 2)媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第2の試薬を添 加するステップ; 3)第1及び第2の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第1及び第2の試薬 の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ; 4)インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ; 及び、 5)螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
さらに、この発明による干渉を低減させる方法は、アナライトを含む可能性のあ る媒質中におけるアナライトの検出及び/又は測定を、以下の1)〜5)の各ス テップを含むものとされる競争分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行 う方法の実施にあたって用いられる。
l)アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した、アナライトに 対するレセプタから成る第1の試薬を添加するステップ; 2)媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライトを、第2の試薬として添加 するステップ; 3)第1及び第2′の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第1及び第2の試 薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ; 4)インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ; 及び、 5)螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。
この発明における好ましい特徴に従えば、上述のアナライトの検出及び/又は測 定を螢光を利用して行う方法において用いられる第1の試薬及び第2の試薬は、 アナライトを含む媒質に同時に添加されてもよい(その際には、ステップl)と ステップ2)とは同一のステップとされる)。
この発明に係る干渉を低減させる方法を用いた、アナライトの検出及び/又は測 定を螢光を利用して行う方法においては、希土類キレートもしくは希土類クリプ テート、特に、ヨーロッパ特許出願HP 0180429及びEP 03213 53に記載されているクリブテートが、螢光ドナー化合物として積極的に選択さ れる。斯かる螢光ドナー化合物は、好ましくは、ヨーロッパ特許出願EP 01 80429に記載されている如くの、テルビウム・クリブテート:Tbトリスビ ピリジン、あるいは、ユーロピウム・クリブテート:Euトリスビピリジンとさ れる。
また、この発明における好ましい特徴に従えば、螢光ドナー化合物がユーロピウ ム・クリブテートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がアロフィコシアニ ン、アロフィコシアニンB、フィコシアニンC及びフィコシアニンRの中から選 択されたものとされる。 ′ さらに、テルビウム・クリプテートを螢光ドナー化合物として用いるとともに、 ローダミン、チオニン、フィコシアニンR,フィコエリトロシアニン、フィコエ リトリンC,フィコエリトリンB及びフィコエリトリンRの中から選択されたも のを螢光アクセプタ化合物として用いることができる。
この発明は、下記に述べられる、発明を制限するものではない実施例が参照され ることにより、一層明瞭に理解される。
下記の実施例においては、ユーロピウム・クリブテート:Euトリスビピリジン ジアミンが、ヨーロッパ特許出願EP O321353(実施例3及び4)に記 載されている如くにして用意される。
また、下記においては、次の如くの省略表記が用いられる。
APC= アロフィコシアン(aJ Iophycocyanrn)DTT =  ジチオトレイトール(dithiothreitol)Eu TBP = ユ ーロピウム・クラブテート:Eut−リスビピリジンジアミン(europiu m cryptate: Eutrisbipyr+dinediamine) HSA = 人間血清アルブミン(human serum albumin) IgG = 免疫グロブリンG (immunoglobulin G )N− AANS = N−アセチル−8−アニリノナフタレン−1−スルフォン酸(N −acetyl−8−anilinonaph−thalene−1−sulf onic acid)S−AMSA = S−アセチルメルカプトスクシニック ・アンヒドライド(S−acetylmercaptosuccinic an −hydride) SPDP =N−スクシンイミジル 3−(ピリジン−2−イリジチオ)プロピ オナート (N−succin−imidyl 3−(pyridin−2−y ldithio)propionate)s ulfo −S M CC= サ ルフォスフシンイミジル(4−N−7レイミドメチル)−サイクロヘキサン−1 −カルボキシレート(sulfosuccinimi−dyl (4−N−ma leimidomethyl)−cyclohexa−ne−1−carbox ylate) T、 = チロキシン(thyroxin)実施例 l: 血清媒質中におけるユーロピウム・クリプテート:Euトリスビピリジンジアミ ンの発光寿命に対するフッ化ナトリウム(NaF)ユーロピウム・クリブテート :Euトリスビピリジンジアミンにより発せられる信号の寿命に対するフッ化ナ トリウムの効果を評価するため、先ず、抗プロラクチン・モノクロナル抗体E1 (セ・ア・ニス バイオ アンチルナジオナル、フランス)にユーロピウム・ク リブテートを結合させることによって、均質免疫分析に用いられる共役溶液と同 じものである、抗体/ユーロピウム・クリブテート共役溶液が用意された。そし て、この共役溶液の発光寿命が、燐酸塩緩衝媒質中、及び、NaFの濃度を異に する複数種の血清媒質中において測定された。
10%(V/V)のジメチルフォルムアミドを含むpH7,0の20mM燐酸塩 緩衝液中における濃度が25mMとされたs ulfo −S M CC溶液が 、5mg (5−10−’ mol)のEu TBPに、Eu TBPの1mo lに対して活性化剤が2.5molとされる割合となるように加えられる。そし て、室温のもとて45分間活性化された後、反応媒質が0.8μmのフィルタが 用いられて濾過され、生成された沈殿物が除去される。さらに、不所望な反応生 成物(s ulfo −S M CC,N−ハイドロオキシスクシンイミド、( N−マレイミドメチル)カルボキシル酸)が、 10%(V/V)のジメチルフ ォルムアミドを含むpH7,0の20mM燐酸塩緩衝液中に置かれたイオン交換 樹脂柱(Mono Q : ファーマシア、スウェーデン)を用いたイオン交換 クロマトグラフィによって除去される。Eu TBP−マレイミドの濃度は、波 長を307nmとする光に対するモル吸光係数が25,000(ε、。r、、  ” 25,000 M−’・Cf1l一つとなるように設定される。
b)SPDPによるIgG Elの活性化pH7,0の100mM燐酸塩緩衝液 に5mgのIgGE+が溶解されて得られた濃度を10 mg/mlとするIg G E+が、それに対してジオキサン中の濃度が6.4mMとされた5PDP溶 液(ピアース、米国)が、IgG E+に対する5PDPのモル比が16対4と なるように加えられて活性化される。そして、室温のもとて35分間活性化され た後、IgG〜ピリジン−2−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6,5の 100mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用いられて 精製される。
その後、室温のもとにおかれた15分間において、蛋白質が濃縮されるとともに 、レジジン−2−イエール ジスルファイド基がDTT溶液(シグマ、米国)に よって最終濃度が19mMとなるように希釈される。そして、DTT及びピリジ ン−2−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6,5の100mM燐酸塩緩衝 液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱(ファーマシア、スウェーデン)が 用いられて精製されることにより除去される。IgG−3Hの濃度は、波長を2 80nmとする光に対するモル吸光係数が210.000(ε2so−、= 2 10.000 M −’ ・cm−’)となるように設定される。
チオール基は、IgG E、−8Hに対するEuTBP−7レイミドのモル比が 30対10となるようにマレイミドと結合せしめられる。暗い場所に摂氏4度の 状態で置かれ、緩やかに攪拌されるもとで、18時間に亙ってインキュベートさ れた後、室温のもとて1時間に亙り、自由状態のままで残ったチオール基が10 0mM N−メチルマレイミド溶液(シグマ、米国)が加えられることにより捕 獲される状態とされ、最終濃度が20mMとなるようにされる。その後、非結合 状態にあるEu TBPが、摂氏4度とされたpH7,0の100mM燐酸塩緩 衝液中での透析により、消尽状態(透析槽内において螢光が発せられなくなる状 態)となるように除去されていく。
このようにして得られる共役溶液の特性は、波長を307nm及び280nmと する光に対する吸収度合いによって設定され、実験的にめられた比: Asot ns/Ays。。、によって定められるEu TBPの内在吸収が考慮され、下 記の如くの値によりあられされる。
Eu TBP−マレイミドのモル吸光係数:ε、。7、”= 25,000 M  −’ −cm−’IgG El−8Hのモル吸光係数: εQ*On。= 210,000 M −1°cm−’εso7.m ” OM  −’ −Cm−’B、抗体/ユーロピウム・クリブテート共役溶液の発光寿命 についての水中及びNaFの存在のもとにおける血清媒質中における測定 上述の如くにして用意されたI g G E + / E u T B P共役 溶液が、1g/lの人間血清アルブミン(HS A)及び異なる濃度の複数種の フッ化ナトリウム(NaF)を夫々を含んだ複数種のpH7,0の100mM燐 酸塩緩衝液の各々の中において17250に希釈される。
それにより得られる溶液200μlが、 100μlの新生子牛の血清あるいは 燐酸塩緩衝液に加えられる。そして、共役溶液の発光寿命が、以下に述べられる 如くのレーザ螢光光度計(試作品)が用いられたもとで波長620nmの光につ いて測定される。
レーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザ(レーザ サイエンス 社製、 モデルLSI −337ND)が励起光源(波長337. lnm)として用い られる。パルス幅が3nsとされ、また、パルス反復周波数は10Hzである。
発せられたレーザ光ビームはフィルタ(コーニング)を通過するものとされて、 波長を337nmとする光以外のノイズ光成分が除去される。そして、窒素パル スレーザからのレーザ光ビームは、測定室に入射した後、45度の角度をもって 設置された、紫外線を反射して可視光を透過させる特性を有するダイクロイック ・フィルタによって反射される。ダイクロイック・フィルタによって反′射され たレーザ光ビームは、シリカレンズによって、マイクロプレートに設けられた測 定ウェル上に集束せし共役溶液が発する螢光は、同じレンズにより20度の立体 角をもって集められて平行化され、ダイクロイック・フィルタを直接的に透過す る(可視螢光)。そして、信号(共役溶液が発する螢光)は、検出対象とされる 螢光波長に応じたものとされる特性を有した干渉フィルタによってノイズ光成分 が除去されたものとされた後、その光度が光電増倍器(ハママツ R2949) が用いられて測定される。
信号光度の測定に用いられる光子カウンタは、5R−400(スタンフォード  リサーチ システムズ)であり、その動作及びレーザとの同期状態は、R3−2 32形式の出力端を有したIBM PC−ATタイプのコンピュータによって制 御される。光電増倍器からのパルスは、光子カウンタによって光電増倍器におけ る信号対雑音比に対する要求を小にできるように選定された弁別レベルを越えた 部分が、所定の遅れ時間(t4)後、所定のタイムウィンドウ(t、)に亙って 記録される。
IBM PC−ATタイプのコンピュータによる駆動のもとに測定用マイクロプ レートの位置を変えるステップモータを備えたX−Yテーブルが用いられ、その X−Yテーブルによって、励起用のレーザ光ビームが、自動的に、マイクロプレ ートに設けられた96個の測定ウェルの夫々を順次照射して励起することになる 状態がとられる。
なお、ARCUS螢光光度計(エル・ケー・ビー、スウェーデン)を、螢光化合 物の発光に応じた干渉フィルタと共に、使用することもできる。
信号光度の測定は、遅れ時間(t6)が50〜600μsとされ、タイムウィン ドウ(t、)が100μsとされたもとで行われる。
その測定結果は、下記の表工に示される如くである。
表I γは、発せられた信号の寿命 表Iに示される測定結果は、血清媒質中における信号の寿命が、媒質中のNaF の濃度の増加に応じて顕著に増大することをあられしており、共役溶液中のNa Fの濃度が500mM以上の場合には、共役溶液の発光寿命は、NaFが存在し ない血清媒質中の共役溶液の発光寿命の2倍・以上となる。
実施例 2・ 血清媒質中におけるユーロピウム・クリプテート:Eu)リスビピリジンジアミ ンの発光寿命に対するフッ化カリウム(K F)の効果 実施例1の場合と同様にして用意されたI g G E + / E uTBP 共役溶液が、1g/lの人間血清アルブミン(HS A)及び異なる濃度の複数 種のフッ化カリウム(KF)を夫々を含んだ複数種のp)17.0の100mM 燐酸塩緩衝液の各々の中においてl/250に希釈される。
それにより得られる溶液200μlが、100μlの新生子牛の血清に加えられ る。そして、共役溶液の発光寿命の測定が、実施例1の場合と同様に行われ、測 定結果は、下記の表■に示される如くである。
γは、発せられた信号の寿命 表■に示される測定結果は、血清媒質中における信号の寿命が、媒質中のKFの 濃度の増加に応じて顕著に増大することをあられしている。
用いられる媒質は、新生子牛の血清及び人間の血清(血清プール)である。
IgG 3D3/Eu TBP共役溶液(実施例1の場合におけるI g G  E I/ E u T B P共役溶液と同様に、抗プロラクチン3D3モノク ロナル抗体(セ・ア・ニス バイオ アンチルナジオナル、フランス)にユーロ ピウム・クリブテートを結合させることによって用意される)が、150 mM のNaF及び1g/lの人間血清アルブミン(HS A)を含んだpH7,0の 100mM燐酸塩希釈緩衝液中において0.5μg/mlの濃度を有するものと されて用いられる。そして、 100μlの血清、100μlの抗体/クリブテ ート共役溶液、及び、異なる濃度を有した異種の添加剤1: EDTA、 N  a N !及びメルチオラートを夫々含んだ複数種の100μlの緩衝液のうち の一つを含んだサンプルが用意される。
抗体/クリプテート共役溶液の発光寿命は、ARCUS螢光光度計(エル・ケー ・ビー、スウェーデン)が用いられ、波長を620nmとする光について、遅れ 時間が50〜600μsとされたもとで100μsに亙って測定される。各分析 において、抗体/クリブテート共役溶液に対する添加剤が加えられず、それ自体 によって得られる値が基準として設定され、その後、各サンプルが、100μl の血清、100μlの抗体/クリプテート共役溶液、及び、添加物を含まない1 00μlの緩衝液を含むものとされる。測定結果は、下記の表■に示され′る如 くである。
表■ 表 ■(続き) 表■に示される測定結果は、測定媒質にフッ化ナトリウムが添加されていること により、共役溶液の発光寿命が、他の添加剤の種類及びその濃度にかかわらず、 実質的に一定に維持されることをあられしている。
均質免疫分析が、典型的なものとしてプロラクチンの分析をもって行われた。
この分析においては、プロラクチンにおける二つの区別された抗原決定基として 認められている抗プロラクチンE、及び3D3モノクロナル抗体(セ・ア・ニス  バイオ アンチルナジオナル、フランス)が、夫々、ユーロピウム・クリプテ ート:Euトリスビピリジンジアミン及びアロフィコシアニン(シアノチック、 米国)と結合したものとされて用いられた。
市販されている硫酸アンモニウムの60%水溶液中の沈殿物として得られるAP C(3mg)が遠心分離器にかけられる。そして、上澄液が除去されて得られる 残りの部分が、250μlのpH7,0の100mM燐酸塩緩衝液とされ、その 燐酸塩緩衝液が0.8μmのフィルタが用いられて濾過されて、その中の懸濁粒 子が除去される。
さらに、濾過液が、pH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微 細イオン交換樹脂柱(ファーマシア、スウェーデン)を用いた排斥クロマトグラ フィによって精製される。排斥イオン交換樹脂柱内で溶離されたAPCの濃度は 、波長を650nmとする光に対するモル吸光係数が731,000 (εss a、、 = 731,000 M−’・cm−’)となるように設定される。
得られたAPCは、pH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中の濃度が6゜9mM とされた5ulfo −S M CC溶液が添加され、1時間に亙って緩やかに 攪拌されるもとて反応が促進される状態におかれることによって活性化される( APCに対する5ulfo −S M CCのモル比は75対15とされる)。
そして、APC−マレイミドが、5mMのEDTAを含むpH6,5の100m M燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製され 、IgG 3D3との結合まで摂氏4度に維持される。
b)SPDPによるIgG 3D3の活性化pH7,0の100mM燐酸塩緩衝 液に5mgのIgG 3D3が溶解されて得られた濃度を10 mg/mfとす るIgG 3D3が、それに対してジオキサン中の濃度が6.4mMとされた5 PDP溶液(ピアース、米国)が、I″gG 3D3に対する5PDPのモル比 が7゜5対lとなるように加えられて活性化される。そして、室温のもとて35 分間活性化された後、IgG−ピリジン−2−千オンが、5mMのEDTAを含 むpH6,5の100mM燐酸塩緩衝液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂 柱が用いられて精製される。
その後、室温のもとにおかれた15分間において、蛋白質が濃縮されるとともに 、ピリジン−2−イエール ジスルファイド基がDTT溶液(シグマ、米国)に よって最終濃度が19mMとなるように希釈される。そして、DTT及びピリジ ン−2−チオンが、5mMのEDTAを含むpH6,5の100mM燐酸塩緩衝 液中に置かれたG25微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製されることにより 除去される。I gG−SHの濃度は、波長を280nmとする光に対するモル 吸光係数が210,000 Cε281+、、 = 210,000 M −’  ・Cm−’)となるように設定される。
c)APC−7レイミドによるIgG 3D3−3Hの共役化チオール基は、1 mgのIgG 3D3−3Hに対して2.51mgの活性化されたAPCが加え られることによってマレイミドと結合せしめられる。暗い場所に摂氏4度の状態 で置かれ、緩やかに攪拌されるもとで、18時間に亙ってインキュベートされた 後、室温のもとて1時間に亙り、自由状態のままで残ったチオール基がloOm M N−メチルマレイミド溶液(シグマ、米国)が加えられることにより捕獲さ れる状態とされ、最終濃度が20mMとなるようにされる。その後、反応媒質が 、pH7,0の100a+M燐酸塩緩衝液中に置かれたTSK G3000SW イオン交換樹脂柱(ベックマン、米国)が用いられたゲル濾過によって精製され る。
このようにして溶離される精製された共役溶液中におけるAPC及びIgG 3 D3の夫々の濃度は、波長を280nm及び650nmとする光に対する吸収度 合いによって設定され、下記の計算式によりあられされる。
CA P C) −0l/l = Aaso、−/ 710,000[gG]、 。I/l = A+sonm A’ 2g0n。/ 210,000ここで、” 28+1n+aは、波長を280nmとする光に対してのAPC−マレイミドの 貢献をあられす。
人間血清アルブミン(HS A)は、Ig#’の量をもって共役溶液に加えられ 、その後、共役溶液は小分けされて摂氏−20度のもとて凍結せしめられる。
B、I gG E、/Eu TBP共役溶液の用意IgG E1/Eu TBP 共役溶液は、実施例Iの場合における手法に従って用意される。
C,プロラクチンの分析への適用 上述の如くにして用意された標識抗体は、下記の如くの状態のもとで用いられる 。
IgGE+は、150mMのNaF及びLg/I!のHSAを含んだpH7,0 の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度がlμg/lni!とされたユーロピ ウム・クリブテート:Eu)リスビピリジンジアミンによって標識化された状態 。
IgG 3D3は、150mMのNaF及び1g/lのHSAを含んだpH7, 0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が2.5μg/lnl!とされたア ロフィコシアニン(シアノチック、米国)によって標識化された状態。
複数のプロラクチン標準溶液が、夫々異なった媒質、即ち、上述の緩衝液9人間 の血清のプール及び新生子牛の血清の夫々について形成される。
サンプル量は100μlとされ、各共役溶液の100μlが加え合わされて得ら れる混合溶液が、96個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート(ダイナチ ック、米国)上において、室温のもとに60分間インキュベートされる。そして 、結果は、実施例1において用いられた如くのレーザ螢光光度計が用いられて処 理される。このレーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザが励起光源とし て用いられるとともに、通過波長域を645〜665nmとするフィルタが備え られ、信号光度の測定が、遅れ時間(t、)が 50μsとされ、測定用タイム ウィンドウ(t、)が100μsとされたもとで行われる。
その測定結果は、第1図に示される。第1図においては、横軸に、IU/m i を単位としてあられされたプロラクチンの量がとられ、縦軸に、下記の式によっ てめられる有効信号ΔFがとられている。
第1図に示される測定結果は、フッ化ナトリウムが存在することにより、螢光抑 制血清要因の存在にかかわらず、分析が遂行されることをあられしている。
他の均質免疫分析′も、典型的なものとしてプロラクチンの分析をもって行われ 、その際における測定媒質にはフッ化カリウム(K F)が存在するものとされ た。
実施例4に関連して記述された如くにして用意された標識抗体は、下記の如くの 状態のもとで用いられる。
IgG Elは、600mM (D K F及びxg#lのISAを含んだpH 7,0の1oOn+M燐酸塩緩衝液中における濃度が1μg/m/とされたユー ロピウム・クリプテート:Euトリスビピソジンシアミンによって標識化された 状態。
IgG 3D3は、600m1J (D K F及びIg#?のISAを含んだ pH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が2.5μg/lとされた アロフィコシアニン(シアノチック、米国)によって標識化された状態。
複数のプロラクチン標準溶液が、新生子牛の血清について形成される。
分析及び螢光の測定は実施例4に関連して記述された如くの状 。
態のもとで行われるが、結果の処理は、レーザ螢光光度計による信号光度の測定 が、遅れ時間(t、)が50μsとされ、タイムウィンドウ(t、)が400μ sとされたもとで行われることによりなされる。
その測定結果は、第2図に示される。第2図においては、横軸に、IU/m 1 を単位としてあられされたプロラクチンの量がとられ、縦軸に、実施例4の場合 と同様にしてめられる有効信号ΔFがとられている。
第2図に示される測定結果は、測定媒質中におけるフッ化カリウムの存在により 、螢光抑制血清要因の存在にががわらず、分析感度が良好に確保さすることをあ られしている。
実施例 6 上述の実施例2に関連して記述された分析と同様な分析において、最終濃度が1 00mMとされるフッ化ナトリウムの効果が、3D3 抗体/Eu)リスビピリ ジン・クリブテート共役溶液が用いられた50種の人間の血清について試された 。得られた結果は、血清媒質についての斯かるタイプの分析において実際に観測 される事柄に反して、抗体/クリプテート共役溶液の発光寿命が一定とされるこ とを示している。
実施例 7: ジゴキシンは、心不全に対処するための薬品の活性素成分として用いられる強心 配糖体である。
2681tlのNa1Ot溶液(フル力、スイス)が、268μfの無水エタノ ール中にジゴキシンが5.35mg含まれて成るジゴキシン懸濁液(参照番号3 7100 フル力、スイス)に加えられる。それにより得られた混合液が、攪拌 される状態をもって、室温のもとて20分間インキュベートされ、その後、10 0μlのO,1Mグリセリンが加えられることにより反応が停止せしめられる。
活性化されたジゴキシンの最終濃度は、初期重量と最終量とに関連して算出され 、1.2 xlO−2Mとされる。
95μlの過ヨウ素酸塩によって活性化されたジゴキシン溶液が、p)19.0 の硼酸塩緩衝液中における2rnlの精製されたAPC溶液(シアノチック、米 国)に加えられる。それにより得られる混合液が、緩やかに攪拌される状態をも って、室温のもとて1時間30分に亙ってインキュベートされ、その後、1.3 2+nlの硼酸塩緩衝液中におけるN a B H*の濃度が5mgとされた水 酸化硼素ナトリウム溶液の100μlが加えられることにより反応が停止せしめ られる。
c)APC−ジゴキシン・トレーサの精製2mlの反応混合液が、HR10/1 0 G25イオン交換樹脂柱(ファーマンア、スウェーデン)に噴射されて、p H7,0の100mM燐酸塩緩衝液中で平衡化されるとともに排除体積において 溶離される。過剰試薬は、8tnlの緩衝液によって溶離される。
1.22 mg/mfのAPC<波長を650nmとする光に対する吸光度によ る測定による)を含む、およそ4mlのAPC−ジゴキシン結合生成物の溶液が 回復せしめられる。ジゴキシンの濃度は、RlAあるいはDELFIA (ファ ーマシア、スウェーデン)によってめられる。算出されたアロフィコシアニン対 ジゴキシンの最終モル比はおよそ0.8である。
B9人間の血清中におけるジゴキシンの競争均質分析抗体/ユーロピウム・クリ プテート:Eu TBPジアミン共役溶液が、抗ジゴキ世ン・マウス・モノクロ ナル抗体(参照番号G 31604 M 、アンチルシム、フランス)が用いら れ、実施例1に関連して記述された如くにして用意される。この抗体/クリブテ ート共役溶液は、150mMのNaF及びIg/i’のISAを含んだpH7, 0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が0.5μg/rnlとされて用い られる。
APC−ジゴキサン・トレーサは、150mMのNaF及び1g/lのISAを 含んだpH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中における濃度が0.2μg/m! !とされて用いられる。
ジゴキシン懸濁液は、ジゴキシン溶液(フル力、スイス)が、人間の血清中にお いて、50150の配分とされたエタノール−水混合液における濃度がll11 g/lll1とされるように希釈されることによって用意される。標準溶液曲線 は、50μlの燐酸塩緩衝液、 50μlの標準溶液、100μlのAPC−ジ ゴキサン・トレーサ、及ヒ、100μlの抗体/クリプテート共役溶液を含んだ 複数種のサンプルの助けを得て描かれる。
分析対象とされる複数種のサンプルは、50μlの標準溶液が50μlの個々の 分析されるべき血清に置き換えられることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、96個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート(ダイナチック、米 国)において行われる。室温のもとに30分間インキュベートされた後、結果が 、実施何重に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理され る。このレーザ螢光光度計においては、通過波長域を655〜675nmとする フィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μsとされ、測定用タ イムウィンドウが100μsとされたもとで行われる。
その測定結果は、−B/B、比のパーセンテージとしてあられされ、Bは、各標 準溶液に関して得られる値であり、また、Boは、標準溶液0に関して得られる 値である。得られた結果は、表■に示される。
表■に示される測定結果は、得られた値が、ジゴキサンの濃度の増加に応じてリ ニアーに低減する関係にあることをあられしている。そして、測定媒質中にフッ 化ナトリウムが存在することにより、血清媒質中におけるジゴキサンの分析が、 ng/mlオーダーの高感度をもって遂行されることになる。
実施例 8: メタノール中に8.7mg/m !! (50mM)含まれたS−AMSAの溶 液(シグマ、米国)の500μfが、メタノール中に20 mg/m1含*れた T、の溶液(カルパイオシエム、フランス)の500μlに加えられ、それによ り得られた混合液が、メタノール中に6.95mg/ml (100mM)含ま れたハイトロキシルアミンの溶液の500μlが加えられる前に、室温のもとで 15分間インキュベートされる。
その後、975μlの反応混合液が除去され、525μlのMILLIPO−R E HA O,45μmフィルタによって濾過された二重蒸留水が加えられる。
この溶液は、そのうちの250μfが、Pep、RPCHR515HPLCイオ ン交換樹脂柱を通過するものとされ、65/ 35 の配分とされたエタノール −水混合液によって溶離される。
溶離された最初の3個のピークは回復せしめられ、それに続く部分が混合されて 、回転蒸発器において蒸発せしめられる。それにより、およそ3mgの活性化さ れたT、(T、−5R)が回復せしめられる。
b)SMCCによるアロフィコシアニンの活性化10 mgのAPCが、AMI CON C[!NTRIC0N 30 ) −ンが用いられるちとで精製される とともに濃縮され、その700μlについて10゜6 mg7mlの濃度を有す るものとされる。pH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中に10 mg/ml含 まれた5ulfo −S M CCの溶液(ピアース、米国)の180μlが、 APC!液に加えられる。それにより得られる反応溶液は、それにより得られる 混合液が、攪拌される状態をもって、室温のもとて1時間インキュベートされ、 その後、活性化されたAPCが、pH7,0の燐酸塩緩衝液中に置かれたG25  )IR10/10イオン交換樹脂柱、(ファニマシア、スウェーデン)を用い た排除クロマトグラフィによって精製される。
T、−3Hのフラズコ内には、200μlのメタノールが混入しており、その溶 液の50MμlがpH7,0の100mM燐酸塩緩衝液中における2mj?の活 性化されたAPC溶液に加えられる。それにより得られる反応混合液が、攪拌さ れる状態をもって、摂氏4度のもとて18時間に亙ってインキュベートされ、そ の後、過剰マレイミドの部位が、燐酸塩緩衝液中におけるI/10のメルカプト エタノール(シグマ、米国)の5μlによって遮断される。
d)APC−Tl )レーザの精製 反応混合液が、AMICON CENTRICON 30限外濾過装置が用いら れるもとで、全体で1mlとなるように濃縮され、それに、燐酸塩緩衝液中に1 mg/mz含まれたN−AANSの溶液の50μlが加えられる(N−AANS の最終濃度は、およそ50μlml )。トレーサは、最終的に、pH7,0の 1100n燐酸塩溶離緩衝液中に置かれたPHARMACIA G25 HR1 0/10排除クロマトグラフイ・イオン交換樹脂柱が用いられて精製され、0. 8 mg/mj!の濃度を有した、およそ2゜511IIのトレーサとされる( 算出された波長650nmの光に対するモル吸光係数は、ε=731.000で ある)。
各APC分子に結合するT4分子の数は、トレーサのRIA及びT、標準溶液曲 線(T4〜KPRkit 、オリス アンディストリ、フランス)との比較によ ってめられる。計算によれば、精製されたトレーサについてのAPCに対するT 4の比は1.4である。
APC−T、)−レーザは、N−ANS (コダック、米国)から合成されたN −AANSの存在のもとに、ヒンズ他により記述された手法(CLfN、 CH EM、、 32.16〜21.1988)によって精製される。
B6人間の血清中におけるチロキシンの競争均質分析抗体/ユーロピウム・クリ ブテート:Eu TBPジアミン共役溶液が、抗T4R41マウス・モノクロナ ル抗体(セ・ア・ニスバイオ アンチルナジオナル、フランス)が用いられ、実 施例1に関連して記述された如くにして用意される。この共役溶液は、120m MのNaF及び0.2%のH8Aを含んだpH7,0の100mM燐酸塩緩衝液 中における濃度が2 g/mlとされて用いられる。
T4標準溶液は、イオン交換処理が施されてT4が無いものとされた人間の血清 中においてT4が希釈されることによって用意される。標準溶液曲線は、50μ lのN−AANS溶液、50ulのT4を含まない人間の血清、あるいは、50 μlのT、標準溶液。
■00μlのAPC−T4 トレーサ、及び、 1ooμlノ抗体/クリブテー ト共役溶液を含んだ250μlの複数種のサンプルの助けを得て描かれる。
分析対象とされる複数種のサンプルは、50μlの標準溶液が50μlの個々の 分析されるべき血清に置き換えられることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、96個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート(ダイナチック、米 国)において行われる。室温のもとに30分間インキュベートされた後、結果が 、実施例1に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理され る。このレーザ螢光光度計においては、励起光源として、周波数を1.000H zとするフランス・ランプが用いられるとともに、通過波長域を655〜675 nmとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μsとされ 、測定用タイムウィンドウが100μsとされたもとで行われる。 ・ その測定結果は、B/B、比のパーセンテージとしてあられされ、Bは、各標準 溶液に関して得られる値であり、また、B、は、標準溶液Oに関して得られる値 である。分析対象とされる各サンプルの濃度は、標準溶液曲線との比較がなされ て算出される。
得られた結果は、表Vに示される。
表■ 表■に示される測定結果は、得られた値が、T4の濃度の増加に応じてリニアー に低減する関係にあることをあられしている。
そして、測定媒質中にフッ化大トリウムが存在することにより、血清媒質中にお ける測定感度が良好に確保されることになる。
19.9抗原は、結腸癌を代表する炭水化物である。19.9抗原に対する部位 は反復的抗原決定基とされるので、同一の抗体がドナーを伴って標識化される態 様とアクセプタを伴って標識化される態様とのいずれをもとり得ることになる。
19.9抗原の分析としての均質免疫分析は、実施例4に関連して記述された如 くにして用意された抗体/Eu TBP共役溶液及び抗体/APC共役溶液が用 いられて行われる。19.9抗原及び抗19.9抗体は、米国の“セントコール ”から入手できる。二つの共役溶液の夫々は、150mMのNaF及びIg/  lのISAを含んだpH6,0の100mM燐酸塩緩衝液中において希釈される 。19.9抗原の標準溶液は、19.9抗原の濃縮溶液が新生子牛の血清中にお いて希釈されることによって用意される。
そして、以下のものが、96個の測定ウェルが設けられたポリスチレン製のマイ クロプレート(ダイナチック、米国)上に順次加えられる。
・50μlの19.9抗原の標準溶液 ・50μlの希釈緩衝液 一100μlの濃度が0.5μg/mlとされた抗体/EuTBP共役溶液 ・100μlの濃度が5μg/lとされた抗体/APC共役溶液 室温のもとに3時間30分に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例1 に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレ ーザ螢光光度計においては、通過波長域を640〜660nmとするフィルタが 備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μsとされ、測定用タイムウィン ドウが400μsとされたもとで行われる。測定結果は、表■にアービトレーン ヨン単位(AU)−によりあられされて示される如(である。
表V■ 表■に示される測定結果は、測定された信号が測定媒質中における19.9抗原 の量の増加に比例して増加する関係にあることをあられしている。そして、測定 媒質中にフッ化ナトリウムが存在することにより、血清媒質中における測定が高 感度をもって行われることになる。
実施例 10・ 初期癌抗原(CEA)の分析 初期癌抗原の分析としての均質免疫分析は、二つのモノクロナル抗体G12及び G15(セ・ア・ニス バイオ アンチルナジオナル、フランス)が用いられて 行われ、モノクロナル抗体G12及びG15は、夫々、ユーロピウム・クリプテ ート:Eu TBP及びアロフィコシアニンに結合したものとされる。
二つの共役溶液、即ち、G12/Eu TBP及びGI5/APCの夫々は、1 50mMのNaF及びIg/A’のISAを含んだ100mM燐酸塩緩衝液中に おいて希釈される。
そして、以下のものが、ポリスチレン製のマイクロプレート(ダイナチック、米 国)上に順次加えられる。
・100μlの標′準溶液 ・100μlの濃度が0.5μg/mlとされたG12/クリブテート共役溶液 一100μZの濃度が5μg/mlとされたG15/APC共役溶液 摂氏37度のもとて3時間に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例1 に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレ ーザ螢光光度計においては、通過波長域を640〜660nmとするフィルタが 備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が50μsとされ、測定用タイムウィン ドウが400μsとされたもとで行われる。測定結果は、表■にアービトレージ ョン単位(AU)によりあられされて示される如くである。
表■ 表■に示される測定結果は、発せられた信号がCEAの濃度の増加に比例して増 加する関係にあることをあられしている。さらに、信号の増幅により、CEAの 検出がng/m lオーダーの高感度をもって行われることになる。
また、測定媒質中にフッ化ナトリウムが存在することにより、測定が高感度をも って行われることになる。
第2図 要約書 測定媒質に燐酸塩イオンを加えるステ・ノブを含んだ、アナライトの螢光分析に おける干渉を低減させる方法。この方法it、アナライトを含んでいると考えら れる媒質にお客するアナライトの存在を、螢光を利用して検出及び/又(よ測定 をするため用(1られる。
国際調査報告 国際調査報告 FR9100566 S^ 49378

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.測定媒質にフッ化物イオンを添加することを特徴とする、トレーサとして少 なくとも一つの螢光化合物を用いて行うアナライトの螢光分析における干渉を低 減させる方法。
  2. 2.用いられる螢光トレーサが希土類キレートもしくは希土類クリプテートであ ることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方法。
  3. 3.測定媒質が生物学的媒質であることを特徴とする請求の範囲第1項又は第2 項記載の方法。
  4. 4.測定媒質が血清媒質であることを特徴とする請求の範囲第3項記載の方法。
  5. 5.測定媒質にフッ化ナトリウム,フッ化セシウム,フッ化カリウムもしくはフ ッ化リチウムが添加されることを特徴とする請求の範囲第3項又は第4項記載の 方法。
  6. 6.測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化ナトリウムの濃度が50mM/l 〜500mM/lに選定されたことを特徴とする請求の範囲第5項記載の方法。
  7. 7.測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化カリウムの濃度が50mM/l〜 5M/lに選定されたことを特徴とする請求の範囲第5項記載の方法。
  8. 8.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又は 測定を螢光を利用して行う方法の実施に際して、測定媒質における干渉をフッ化 物イオンを用いて低減させるフッ化物イオンの使用方法。
  9. 9.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又は 測定を螢光を利用して行う方法が均質方法とされたことを特徴とする請求の範囲 第8項記載の方法。
  10. 10.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又 は測定を螢光を利用して行う方法が、1)上記媒質に、上記アナライトに対する 少なくとも一個のレセプタを含んで成る第1の試薬を添加するステップ;2)上 記媒質に、上記アナライト及び少なくとも一個のレセプタのうちから選定された 第2の試薬を添加するステップ;3)上記第1及び第2の試薬の夫々が添加され た後、あるいは、上記第1及び第2の試薬の両者が添加された後に、得られた媒 質をインキュベートするステップ; 4)インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長の光によって励起するステップ;及び、5)螢光アクセプタ化合物によっ て発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状態のもとで測定するステップ;を 含み、上記第1及び第2の試薬のうちの一方が上記螢光ドナー化合物と結合した ものとされるとともに他方が上記螢光アクセプタ化合物と結合したものとされ、 また、上記第1の試薬を添加するステップと上記第2の試薬を添加するステップ とは順序が可逆とされるものとされたことを特徴とする請求の範囲第8項又は第 9項記載の使用方法。
  11. 11.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又 は測定を螢光を利用して行う方法が、1)上記アナライトを含んだ媒質に、少な くとも一つの上記アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結 合した第1の試薬を添加するステップ; 2)上記媒質に、一つもしくは二つ以上の他の上記アナライトに対するレセプタ から成り、螢光アクセプタ化合物と結合した第2の試薬を添加するステップ; 3)上記第1及び第2の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第1及び第 2の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ ; 4)インキュベートされた媒質を、光源からの上記螢光ドナー化合物に対する励 起波長に相当する波長の光によって励起するステップ;及び、 5)上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ; を含んで成る過剰分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範 囲第10項記載の使用方法。
  12. 12.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又 は測定を螢光を利用して行う方法が、1)上記アナライトを含んだ媒質に、上記 アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結合した第1の試薬 を添加するステップ; 2)上記媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第2の試薬 を添加するステップ; 3)上記第1及び第2の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第1及び第 2の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ ; 4)インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相 当する波長の光によって励起するステップ;及び、 5)上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ; を含んで成る競争分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範 囲第10項記載の使用方法。
  13. 13.アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び/又 は測定を螢光を利用して行う方法が、1)上記アナライトを含む媒質に、螢光ア クセプタ化合物と結合した、上記アナライトに対するレセプタから成る第1の試 薬を添加するステップ; 2)上記媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライトを第2の試薬として添 加するステップ; 3)上記第1及び第2の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第1及び第 2の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ ; 4)インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相 当する波長の光によって励起するステップ;及び、 5)上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ; を含んで成る競争分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範 囲第10項記載の使用方法。
  14. 14.第1の試薬及び第2の試薬がアナライトを含んだ媒質に同時に添加される ことを特徴とする請求の範囲第10項,第11項,第12項又は第13項記載の 使用方法。
  15. 15.アナライトに対する単一のレセプタであって螢光ドナー化合物または螢光 アクセプタ化合物と結合したものが用いられることを特徴とする請求の範囲第1 0項又は第11項記載の使用方法。
  16. 16.螢光ドナー化合物が希土類キレートもしくは希土類クリプテートとされる ことを特徴とする請求の範囲第10項,第11項,第12項,第13項,第14 項又は第15項記載の使用方法。
  17. 17.希土類クリプテートがテルビウム・クリプテートもしくはユーロピウム・ クリプテートとされることを特徴とする請求の範囲第16項記載の使用方法。
  18. 18.螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプテート:Tbトリスジピリジンも しくはユーロピウム・クリプテート:Euトリスジピリジンとされることを特徴 とする請求の範囲第17項記載の使用方法。
  19. 19.螢光ドナー化合物がユーロピウム・クリプテートとされるとともに、螢光 アクセプタ化合物がアロフィコシアニン,アロフィコシアニンB,フィコシアニ ンC及びフィコシアニンRのうちから選択されたものとされることを特徴とする 請求の範囲第10項,第11項,第12項,第13項,第14項,第15項又は 第16項記載の使用方法。
  20. 20.螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプテートとされるとともに、螢光ア クセプタ化合物がローダミン,チオニン,フィコシアニンR,フィコエリトロシ アニン,フィコエリトリンC,フィコエリトリンB及びフィコエリトリンRのう ちから選択されたものとされることを特徴とする請求の範囲第10項,第11項 ,第12項,第13項,第14項,第15項又は第16項記載の使用方法。
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