JPH05508925A

JPH05508925A - 螢光分析における干渉低減方法

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Publication number: JPH05508925A
Application number: JP91512787A
Authority: JP
Inventors: マチ　ジェラール; デュモン　クリストーフェ; ジォル　エティエンヌ　ジャン―ピエール
Original assignee: セ　ア　エス　バイオ　アンテルナシィオナル
Priority date: 1990-07-13
Filing date: 1991-07-12
Publication date: 1993-12-09
Anticipated expiration: 2014-12-27
Also published as: GR3015399T3; DE69105978D1; EP0539435B1; DK0539435T3; AU8218591A; EP0539435A1; FR2664702B1; ES2068599T3; WO1992001224A1; FR2664702A1; JP2994036B2; DE69105978T2; ATE115728T1; US5627074A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】螢光分析における干渉低減方法この発明は、螢光分析における干渉を低減させる方法に関する。

現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析あるいは定量分析に広く用いられている。現行の技術にあっては、螢光定量分析が重要になってきている。

実際に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行えること、螢光化合物により標識化された試薬が安定していて安全であること、比較的低コストで行えること等の多くの利点がある。

螢光を利用する検出方法は、本質的に非常に高感度であり、特に、変調可能なレーザ光源を使用する場合には、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出下限をより低くすることができるものであることが知られている（１．　Ｗｉｅｄｅｒ、　”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅ−ｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ’　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、１９７８．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）。

斯かる方式の分析においてトレーサとして用いることができる多数の螢光分子が既に書物に記述されており、それらの中で、希土類錯体が極めて有用な特性を有している。そして、希土類錯体のうちの特定のものとして希土類クリブテートを用いる分析が、ヨーロッパ特許出願：　ＥＰ　Ｏ１８０４９２、国際特許出願：　ＰＣＴ／ＦＲ８６００２６９、ヨーロッパ特許出願：　ＥＰ　０３２１３５３、国際特許出願二ＰｃＴ／ＦＲ８６００５６２等に記載されている。希土類クリプテートは、含塩蛋白質媒質中において非常に安定であるという利点を有しており、斯かる特性は、均質免疫分析の場合において格別に重要である。

このようなもとにあっても、測定感度は、測定が行われる媒質中における様々な分子の存在に起因して生じる各種の干渉によって左右されるところが大なるものとされる。この問題は、干渉を生じ得るものとされる多数の分子が存在する血清媒質中における分析の場合に取分は深刻である。例えば、測定対象信号は、励起され得る状態におかれ、しかも、トレーサとして用いられている分子と同じ波長の光を発し得るものとされた分子からの発光による干渉を受けるものとされる。

これに対し、螢光測定にあたって時分割法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｍｅ −ｔｈＯｄ）をとることにより、上述の不都合を部分的に解消することができる。この方法の原理は、比較的長い発光寿命を有したトレーサ分子が発する螢光を他の存在分子の発光寿命が尽きた後に測定することにある。そして、斯かる場合には、希土類キレートの如くの比較的長い寿命を有した螢光トレーサ分子を用いることが必要とされる。

また、測定感度は′、検出対象とされるアナライト（ａｎａｌｙｔｅ）と標識生体特異試薬との間の結合に起因して発せられる螢光の変化に摂動を生じさせ得るものとされた、媒質中の分子からの干渉の影響も受けるものとされる。それに対して、ヨーロッパ特許出願：　ＥＰ　Ｏ３２４３２３には、生体特異試薬と結合した希土類キレートを安定化させる変調因子を用い、測定対象とされる螢光の変化が実質的にアナライトの濃度の関数となるようになすことが記載されている。

この変調因子の効果により、希土類キレートが発する螢光が媒質中に存在する他の分子により摂動を生じるものとされることが禁止され、その結果、測定対象とされる螢光の変化が、抗原抗体反応のみの関数とされる。変調因子として提案されているものとしては、たんばく質、清浄剤等の巨大分子があり、それらは、０．１−１０　ｇ／Ａ’の範囲を越えるものとされて用いられる。

斯かる状況にもかかわらず、測定媒質中に各種の分子が存在することに起因する干渉の問題は、上述の如くの方法のいかなるもによっても、十分に解消することはできない。実際、螢光測定の感度を制限する元となっているものは、分析マーカーとして用いられる螢光分子の発光を抑制することになる、媒質中に存在する分子による消光作用である。希土類錯体の場合にあっては、斯かる消光作用は、螢光抑制分子が錯体中において自由な状態におかれた配位部位を占めるものとされる電子伝達メカニズムに起因するものとなる。特に、螢光分子と媒質中に存在する分子との間で行われる酸化還元反応が指摘され、これらのメカニズムは、発せられた螢光に無視できない変化を与える。

酸化還元現象に起因する螢光抑制についての記述は、従来の均質免疫螢光分析に関する文献には見当たらない。

ウェーバ−／他（Ｗｅｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）による論文：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　１９８３、２９／９．１６６５〜ｌ６７２には、トリス（２’、２’ 　−ジピリジン）ルテニウム−（ＩＩＩ）錯体についての電流滴定検出における、特に、尿酸による干渉の影響について記載されている。ここで述べられている錯体は、Ｃｏ（ＩＩ）消光錯体を酸化することができることになる、対応するＲ　ｕ　（ＩＩ）錯体における酸化還元反応から発している。そして、尿酸は、Ｒｕ　（ＩＩＩ）に対する還元剤として扱われており、それゆえ、測定に干渉するものとなる。

斯かる螢光化合物と消光化合物との間の電子伝達による酸化還元メカニズムは、サバティー二／他（５ａｂｂａｔｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）　ｌ：よる論文：　Ｊ、　Ａ、　Ｃ，Ｓ、、　１９８４．１０６．４０５５〜４０５６　において論証されている。この論文にあっては、Ｍ　（ＣＮ）　６を一錯体のユーロピウム・クリブテートによる酸化について、特に、詳細に記述されており、そのなかで、Ｍは、鉄、ルテニウムあるいはオスミウムである。

電子伝達を含んだメカニズム及び通常の抑制メカニズムによる螢光の抑制は、実際に際しては極端に面倒な現象である。なぜなら、抑制要因は、例えば、血清中における尿酸の如くに、測定媒質中の化合物として本来存在するもの、あるいは、分析にあたっての添加剤あるいは安定剤として加えられるものとされるからである。

このような抑制剤は、マーカー分子が発する螢光に大なる影響を与える。特に、寄生酸化還元反応にあっては、酸化還元メカニズムによる希土類イオンの還元状態から酸化状態の転換が、希土類イオンを含む錯体の寿命を短縮するとともに希土類イオンを含む錯体の発光スペクトラムを変化させ、それにより、測定感度に大なる影響を及ぼす；従来にあっては予期されていなかったことであるが、この発明によって、測定媒質にフッ化物イオンを添加することにより、測定媒質中に存在する抑制分子による螢光の抑制を実質的に低減できることが見出され、特に、生物学的媒質については、その低減の度合いが顕著である。また、驚くべきことに、文献ニジエイ・エイ・シー・ニス、１９８０年、１０２．２２７８−２２８５、イー他（Ｙｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ａ、Ｃ，Ｓ、、　１９８０．１０２．２２７８−２２８５）における、「三価の希土類クリプテート中におけるフッ化物イオンの結合は、クリブテートの解離の度合いを実質的に増長し、生成物の半減期を２７日から２．８日に低減させる結果をまねく。」という旨の記載に反して、測定媒質に添加されたフッ化物イオンは、希土類クリブテート錯体の安定性に対して悪影響を与えないことも分かっている。

実際、測定媒質にフッ化物イオンが、特に、フッ化ナトリウムの形態をもって加えられる°ことζ三より、トレーサ分子として用いられている希土類クリブテートあるいは希土類キレートが発する信号の寿命が、緩衝液単体中において測定される信号の寿命に匹敵するまでに引き伸ばされることが観測されている。仮説ではあるが、フッ化物イオンは、その寸法が小であって負の電荷を有していることにより、希土類錯体における自由結合部位を占めることができ、そして、抑制剤の近接を妨げていると言える。

このように、この発明は、少なくとも一個の螢光化合物をトレーサとして用いるアナライトの螢光分析における干渉を低減させる、測定媒質にフッ化物イオンを添加するステップを含んだ方法に関している。

本願の記載においては、“アナライビは、検出及び／又は測定の対象とされる物質あるいは類似する物質群を意味し、また、“レセプタ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）” は、特にアナライトの一部に結合することができる物質を意味する。

この発明における好ましい特徴に従えば、測定媒質は、血清媒質の如くの生物学的媒質とされる。もし、測定媒質が水溶液とされる場合には、フッ化ナトリウム、フッ化セシウム、フッ化カリウム、あるいは、フッ化リチウムの水溶液が使用されることが望ましい。陽イオンの選定は、用いられる媒質に応じてなされ、溶媒中においてフッ化物イオンが溶解し得るものとなるようにされる。斯かる選定は、この発明が属する技術分野における当業者が行うことができる範晴のものである。望ましくは、測定媒質が血清媒質とされたもとで、血清媒質中の濃度が５０〜５００　ｍＷ／ｌとされるフッ化ナトリウム（ＮａＦ）が用いられる。

この発明における他の好ましい特徴に従えば、濃度が５０ｍＭ、／ｆ〜５Ｍ／ｌとされるフッ化カリウム（ＫＦ）が用いられる。

螢光トレーサ化合物としては、希土類キレートあるいは希土類クリブテートが用いられるのが良い。使用可能とされる希土類イオンとして、テルビウム・イオン、ユーロピウム・イオン、ジスプロシウム・イオン、サマリウム・イオン、ネオジミウム・イオン等が挙げられる。好ましくは、テルビウム・イオンあるいはユーロピウム・イオンが用いられる。

この発明による方法は、好ましくは、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法の実施にあたり、測定媒質中における干渉を低減すべく用いられる。そして、この発明に係る方法は、文献（Ｌａ−ｎｄｏｎ、　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂ’ｉｏｃｈｅｍ、、　１９８１．１８．２５３　及びＥ、　５ＯＩＮＩ　ｅｔａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７９．２５．３５３）に記載されている如くの、均質相あるいは不均質相中における螢光免疫分析、所謂、競争分析あるいは過剰分析に適用されることに大なる意味がある。望ましくは、アナライトの検出及び／又は測定を行う方法は均質方法とされる。

この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に係る干渉を低減する方法は、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられ、アナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法は、ｌ）媒質に、少なくとも一個のアナライトに対するレセプタを含んで成る第１の試薬を添加するステップ；２）媒質に、アナライト及び少なくとも一個のレセプタのうちから選択された第２の試薬を添加するステップ；３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起するステップ；　及び、５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状態のもとで測定するステップ；を含み、第１及び第２の試薬のうちの一方が螢光ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が螢光アクセプタ化合物と結合したものとされ、また、第１の試薬を添加するステップと第２の試薬を添加するステップとは順序が可逆とされるものとなされる。

また、この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に係る方法は、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を、以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる過剰分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられる。

１）アナライトを含む媒質に、少なくとも一個のアナライトに２）媒質に、−個もしくは複数個のアナライトに対する他のレセプタから成り、螢光アクセプタ化合物と結合した第２の試薬を添加するステップ；３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した光源からの光によって励起するステップ；　及び、５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。

この発明における好ましい特徴に従えば、上述の過剰分析方法は、螢光ドナー化合物もしくは螢光アクセプタ化合物のいずれかと結合する、アナライトに対する単一のレセプタを用いて行われる。

この発明による方法は、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトつ検出及び／又は測定を、以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる競争分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられる。

１）アナライトを含む媒質に、アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ；２）媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第２の試薬を添加するステップ；３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起するステップ；　及び、５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。

さらに、この発明による干渉を低減させる方法は、アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を、以下の１）〜５）の各ステップを含むものとされる競争分析方法の助けを得たもとで、螢光を利用して行う方法の実施にあたって用いられる。

ｌ）アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した、アナライトに対するレセプタから成る第１の試薬を添加するステップ；２）媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライトを、第２の試薬として添加するステップ；３）第１及び第２′の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起するステップ；　及び、５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ。

この発明における好ましい特徴に従えば、上述のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法において用いられる第１の試薬及び第２の試薬は、アナライトを含む媒質に同時に添加されてもよい（その際には、ステップｌ）とステップ２）とは同一のステップとされる）。

この発明に係る干渉を低減させる方法を用いた、アナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法においては、希土類キレートもしくは希土類クリプテート、特に、ヨーロッパ特許出願ＨＰ　０１８０４２９及びＥＰ　０３２１３５３に記載されているクリブテートが、螢光ドナー化合物として積極的に選択される。斯かる螢光ドナー化合物は、好ましくは、ヨーロッパ特許出願ＥＰ　０１８０４２９に記載されている如くの、テルビウム・クリブテート：Ｔｂトリスビピリジン、あるいは、ユーロピウム・クリブテート：Ｅｕトリスビピリジンとされる。

また、この発明における好ましい特徴に従えば、螢光ドナー化合物がユーロピウム・クリブテートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がアロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシアニンＣ及びフィコシアニンＲの中から選択されたものとされる。　′ さらに、テルビウム・クリプテートを螢光ドナー化合物として用いるとともに、ローダミン、チオニン、フィコシアニンＲ，フィコエリトロシアニン、フィコエリトリンＣ，フィコエリトリンＢ及びフィコエリトリンＲの中から選択されたものを螢光アクセプタ化合物として用いることができる。

この発明は、下記に述べられる、発明を制限するものではない実施例が参照されることにより、一層明瞭に理解される。

下記の実施例においては、ユーロピウム・クリブテート：Ｅｕトリスビピリジンジアミンが、ヨーロッパ特許出願ＥＰ　Ｏ３２１３５３（実施例３及び４）に記載されている如くにして用意される。

また、下記においては、次の如くの省略表記が用いられる。

ＡＰＣ＝　アロフィコシアン（ａＪ　Ｉｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｒｎ）ＤＴＴ　＝　ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）Ｅｕ　ＴＢＰ　＝　ユーロピウム・クラブテート：Ｅｕｔ−リスビピリジンジアミン（ｅｕｒｏｐｉｕｍ　ｃｒｙｐｔａｔｅ：　Ｅｕｔｒｉｓｂｉｐｙｒ＋ｄｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）ＨＳＡ　＝　人間血清アルブミン（ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ）ＩｇＧ　＝　免疫グロブリンＧ　（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ　）Ｎ− ＡＡＮＳ　＝　Ｎ−アセチル−８−アニリノナフタレン−１−スルフォン酸（Ｎ −ａｃｅｔｙｌ−８−ａｎｉｌｉｎｏｎａｐｈ−ｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）Ｓ−ＡＭＳＡ　＝　Ｓ−アセチルメルカプトスクシニック・アンヒドライド（Ｓ−ａｃｅｔｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｎ −ｈｙｄｒｉｄｅ）ＳＰＤＰ　＝Ｎ−スクシンイミジル　３−（ピリジン−２−イリジチオ）プロピオナート　（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎ−ｉｍｉｄｙｌ　３−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）ｓ　ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ＝　サルフォスフシンイミジル（４−Ｎ−７レイミドメチル）−サイクロヘキサン−１ −カルボキシレート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉ−ｄｙｌ　（４−Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａ−ｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）Ｔ、　＝　チロキシン（ｔｈｙｒｏｘｉｎ）実施例　ｌ：血清媒質中におけるユーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスビピリジンジアミンの発光寿命に対するフッ化ナトリウム（ＮａＦ）ユーロピウム・クリブテート：Ｅｕトリスビピリジンジアミンにより発せられる信号の寿命に対するフッ化ナトリウムの効果を評価するため、先ず、抗プロラクチン・モノクロナル抗体Ｅ１（セ・ア・ニス　バイオ　アンチルナジオナル、フランス）にユーロピウム・クリブテートを結合させることによって、均質免疫分析に用いられる共役溶液と同じものである、抗体／ユーロピウム・クリブテート共役溶液が用意された。そして、この共役溶液の発光寿命が、燐酸塩緩衝媒質中、及び、ＮａＦの濃度を異にする複数種の血清媒質中において測定された。

１０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルフォルムアミドを含むｐＨ７，０の２０ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が２５ｍＭとされたｓ　ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ溶液が、５ｍｇ　（５−１０−’　ｍｏｌ）のＥｕ　ＴＢＰに、Ｅｕ　ＴＢＰの１ｍｏｌに対して活性化剤が２．５ｍｏｌとされる割合となるように加えられる。そして、室温のもとて４５分間活性化された後、反応媒質が０．８μｍのフィルタが用いられて濾過され、生成された沈殿物が除去される。さらに、不所望な反応生成物（ｓ　ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ，Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミド、（Ｎ−マレイミドメチル）カルボキシル酸）が、　１０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルフォルムアミドを含むｐＨ７，０の２０ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたイオン交換樹脂柱（Ｍｏｎｏ　Ｑ　：　ファーマシア、スウェーデン）を用いたイオン交換クロマトグラフィによって除去される。Ｅｕ　ＴＢＰ−マレイミドの濃度は、波長を３０７ｎｍとする光に対するモル吸光係数が２５，０００（ε、。ｒ、、　 ”　２５，０００　Ｍ−’・Ｃｆ１ｌ一つとなるように設定される。

ｂ）ＳＰＤＰによるＩｇＧ　Ｅｌの活性化ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液に５ｍｇのＩｇＧＥ＋が溶解されて得られた濃度を１０　ｍｇ／ｍｌとするＩｇＧ　Ｅ＋が、それに対してジオキサン中の濃度が６．４ｍＭとされた５ＰＤＰ溶液（ピアース、米国）が、ＩｇＧ　Ｅ＋に対する５ＰＤＰのモル比が１６対４となるように加えられて活性化される。そして、室温のもとて３５分間活性化された後、ＩｇＧ〜ピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製される。

その後、室温のもとにおかれた１５分間において、蛋白質が濃縮されるとともに、レジジン−２−イエール　ジスルファイド基がＤＴＴ溶液（シグマ、米国）によって最終濃度が１９ｍＭとなるように希釈される。そして、ＤＴＴ及びピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）が用いられて精製されることにより除去される。ＩｇＧ−３Ｈの濃度は、波長を２８０ｎｍとする光に対するモル吸光係数が２１０．０００（ε２ｓｏ−、＝　２１０．０００　Ｍ　−’　・ｃｍ−’）となるように設定される。

チオール基は、ＩｇＧ　Ｅ、−８Ｈに対するＥｕＴＢＰ−７レイミドのモル比が３０対１０となるようにマレイミドと結合せしめられる。暗い場所に摂氏４度の状態で置かれ、緩やかに攪拌されるもとで、１８時間に亙ってインキュベートされた後、室温のもとて１時間に亙り、自由状態のままで残ったチオール基が１００ｍＭ　Ｎ−メチルマレイミド溶液（シグマ、米国）が加えられることにより捕獲される状態とされ、最終濃度が２０ｍＭとなるようにされる。その後、非結合状態にあるＥｕ　ＴＢＰが、摂氏４度とされたｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中での透析により、消尽状態（透析槽内において螢光が発せられなくなる状態）となるように除去されていく。

このようにして得られる共役溶液の特性は、波長を３０７ｎｍ及び２８０ｎｍとする光に対する吸収度合いによって設定され、実験的にめられた比：　Ａｓｏｔｎｓ／Ａｙｓ。。、によって定められるＥｕ　ＴＢＰの内在吸収が考慮され、下記の如くの値によりあられされる。

Ｅｕ　ＴＢＰ−マレイミドのモル吸光係数：ε、。７、”＝　２５，０００　Ｍ　−’　−ｃｍ−’ＩｇＧ　Ｅｌ−８Ｈのモル吸光係数： εＱ＊Ｏｎ。＝　２１０，０００　Ｍ　−１°ｃｍ−’εｓｏ７．ｍ　”　ＯＭ　−’　−Ｃｍ−’Ｂ、抗体／ユーロピウム・クリブテート共役溶液の発光寿命についての水中及びＮａＦの存在のもとにおける血清媒質中における測定上述の如くにして用意されたＩ　ｇ　Ｇ　Ｅ　＋　／　Ｅ　ｕ　Ｔ　Ｂ　Ｐ共役溶液が、１ｇ／ｌの人間血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）及び異なる濃度の複数種のフッ化ナトリウム（ＮａＦ）を夫々を含んだ複数種のｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液の各々の中において１７２５０に希釈される。

それにより得られる溶液２００μｌが、　１００μｌの新生子牛の血清あるいは燐酸塩緩衝液に加えられる。そして、共役溶液の発光寿命が、以下に述べられる如くのレーザ螢光光度計（試作品）が用いられたもとで波長６２０ｎｍの光について測定される。

レーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザ（レーザ　サイエンス　社製、モデルＬＳＩ　−３３７ＮＤ）が励起光源（波長３３７．　ｌｎｍ）として用いられる。パルス幅が３ｎｓとされ、また、パルス反復周波数は１０Ｈｚである。

発せられたレーザ光ビームはフィルタ（コーニング）を通過するものとされて、波長を３３７ｎｍとする光以外のノイズ光成分が除去される。そして、窒素パルスレーザからのレーザ光ビームは、測定室に入射した後、４５度の角度をもって設置された、紫外線を反射して可視光を透過させる特性を有するダイクロイック・フィルタによって反射される。ダイクロイック・フィルタによって反′射されたレーザ光ビームは、シリカレンズによって、マイクロプレートに設けられた測定ウェル上に集束せし共役溶液が発する螢光は、同じレンズにより２０度の立体角をもって集められて平行化され、ダイクロイック・フィルタを直接的に透過する（可視螢光）。そして、信号（共役溶液が発する螢光）は、検出対象とされる螢光波長に応じたものとされる特性を有した干渉フィルタによってノイズ光成分が除去されたものとされた後、その光度が光電増倍器（ハママツ　Ｒ２９４９）が用いられて測定される。

信号光度の測定に用いられる光子カウンタは、５Ｒ−４００（スタンフォード　リサーチ　システムズ）であり、その動作及びレーザとの同期状態は、Ｒ３−２３２形式の出力端を有したＩＢＭ　ＰＣ−ＡＴタイプのコンピュータによって制御される。光電増倍器からのパルスは、光子カウンタによって光電増倍器における信号対雑音比に対する要求を小にできるように選定された弁別レベルを越えた部分が、所定の遅れ時間（ｔ４）後、所定のタイムウィンドウ（ｔ、）に亙って記録される。

ＩＢＭ　ＰＣ−ＡＴタイプのコンピュータによる駆動のもとに測定用マイクロプレートの位置を変えるステップモータを備えたＸ−Ｙテーブルが用いられ、そのＸ−Ｙテーブルによって、励起用のレーザ光ビームが、自動的に、マイクロプレートに設けられた９６個の測定ウェルの夫々を順次照射して励起することになる状態がとられる。

なお、ＡＲＣＵＳ螢光光度計（エル・ケー・ビー、スウェーデン）を、螢光化合物の発光に応じた干渉フィルタと共に、使用することもできる。

信号光度の測定は、遅れ時間（ｔ６）が５０〜６００μｓとされ、タイムウィンドウ（ｔ、）が１００μｓとされたもとで行われる。

その測定結果は、下記の表工に示される如くである。

表Ｉ γは、発せられた信号の寿命表Ｉに示される測定結果は、血清媒質中における信号の寿命が、媒質中のＮａＦの濃度の増加に応じて顕著に増大することをあられしており、共役溶液中のＮａＦの濃度が５００ｍＭ以上の場合には、共役溶液の発光寿命は、ＮａＦが存在しない血清媒質中の共役溶液の発光寿命の２倍・以上となる。

実施例　２・血清媒質中におけるユーロピウム・クリプテート：Ｅｕ）リスビピリジンジアミンの発光寿命に対するフッ化カリウム（Ｋ　Ｆ）の効果実施例１の場合と同様にして用意されたＩ　ｇ　Ｇ　Ｅ　＋　／　Ｅ　ｕＴＢＰ共役溶液が、１ｇ／ｌの人間血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）及び異なる濃度の複数種のフッ化カリウム（ＫＦ）を夫々を含んだ複数種のｐ）１７．０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液の各々の中においてｌ／２５０に希釈される。

それにより得られる溶液２００μｌが、１００μｌの新生子牛の血清に加えられる。そして、共役溶液の発光寿命の測定が、実施例１の場合と同様に行われ、測定結果は、下記の表■に示される如くである。

γは、発せられた信号の寿命表■に示される測定結果は、血清媒質中における信号の寿命が、媒質中のＫＦの濃度の増加に応じて顕著に増大することをあられしている。

用いられる媒質は、新生子牛の血清及び人間の血清（血清プール）である。

ＩｇＧ　３Ｄ３／Ｅｕ　ＴＢＰ共役溶液（実施例１の場合におけるＩ　ｇ　Ｇ　Ｅ　Ｉ／　Ｅ　ｕ　Ｔ　Ｂ　Ｐ共役溶液と同様に、抗プロラクチン３Ｄ３モノクロナル抗体（セ・ア・ニス　バイオ　アンチルナジオナル、フランス）にユーロピウム・クリブテートを結合させることによって用意される）が、１５０　ｍＭのＮａＦ及び１ｇ／ｌの人間血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）を含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩希釈緩衝液中において０．５μｇ／ｍｌの濃度を有するものとされて用いられる。そして、　１００μｌの血清、１００μｌの抗体／クリブテート共役溶液、及び、異なる濃度を有した異種の添加剤１：　ＥＤＴＡ、　Ｎ　ａ　Ｎ　！及びメルチオラートを夫々含んだ複数種の１００μｌの緩衝液のうちの一つを含んだサンプルが用意される。

抗体／クリプテート共役溶液の発光寿命は、ＡＲＣＵＳ螢光光度計（エル・ケー・ビー、スウェーデン）が用いられ、波長を６２０ｎｍとする光について、遅れ時間が５０〜６００μｓとされたもとで１００μｓに亙って測定される。各分析において、抗体／クリブテート共役溶液に対する添加剤が加えられず、それ自体によって得られる値が基準として設定され、その後、各サンプルが、１００μｌの血清、１００μｌの抗体／クリプテート共役溶液、及び、添加物を含まない１００μｌの緩衝液を含むものとされる。測定結果は、下記の表■に示され′る如くである。

表■ 表　■（続き）表■に示される測定結果は、測定媒質にフッ化ナトリウムが添加されていることにより、共役溶液の発光寿命が、他の添加剤の種類及びその濃度にかかわらず、実質的に一定に維持されることをあられしている。

均質免疫分析が、典型的なものとしてプロラクチンの分析をもって行われた。

この分析においては、プロラクチンにおける二つの区別された抗原決定基として認められている抗プロラクチンＥ、及び３Ｄ３モノクロナル抗体（セ・ア・ニス　バイオ　アンチルナジオナル、フランス）が、夫々、ユーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスビピリジンジアミン及びアロフィコシアニン（シアノチック、米国）と結合したものとされて用いられた。

市販されている硫酸アンモニウムの６０％水溶液中の沈殿物として得られるＡＰＣ（３ｍｇ）が遠心分離器にかけられる。そして、上澄液が除去されて得られる残りの部分が、２５０μｌのｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液とされ、その燐酸塩緩衝液が０．８μｍのフィルタが用いられて濾過されて、その中の懸濁粒子が除去される。

さらに、濾過液が、ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）を用いた排斥クロマトグラフィによって精製される。排斥イオン交換樹脂柱内で溶離されたＡＰＣの濃度は、波長を６５０ｎｍとする光に対するモル吸光係数が７３１，０００　（εｓｓａ、、　＝　７３１，０００　Ｍ−’・ｃｍ−’）となるように設定される。

得られたＡＰＣは、ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中の濃度が６゜９ｍＭとされた５ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ溶液が添加され、１時間に亙って緩やかに攪拌されるもとて反応が促進される状態におかれることによって活性化される（ＡＰＣに対する５ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣのモル比は７５対１５とされる）。

そして、ＡＰＣ−マレイミドが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製され、ＩｇＧ　３Ｄ３との結合まで摂氏４度に維持される。

ｂ）ＳＰＤＰによるＩｇＧ　３Ｄ３の活性化ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液に５ｍｇのＩｇＧ　３Ｄ３が溶解されて得られた濃度を１０　ｍｇ／ｍｆとするＩｇＧ　３Ｄ３が、それに対してジオキサン中の濃度が６．４ｍＭとされた５ＰＤＰ溶液（ピアース、米国）が、Ｉ″ｇＧ　３Ｄ３に対する５ＰＤＰのモル比が７゜５対ｌとなるように加えられて活性化される。そして、室温のもとて３５分間活性化された後、ＩｇＧ−ピリジン−２−千オンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製される。

その後、室温のもとにおかれた１５分間において、蛋白質が濃縮されるとともに、ピリジン−２−イエール　ジスルファイド基がＤＴＴ溶液（シグマ、米国）によって最終濃度が１９ｍＭとなるように希釈される。そして、ＤＴＴ及びピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製されることにより除去される。Ｉ　ｇＧ−ＳＨの濃度は、波長を２８０ｎｍとする光に対するモル吸光係数が２１０，０００　Ｃε２８１＋、、　＝　２１０，０００　Ｍ　−’ 　・Ｃｍ−’）となるように設定される。

ｃ）ＡＰＣ−７レイミドによるＩｇＧ　３Ｄ３−３Ｈの共役化チオール基は、１ｍｇのＩｇＧ　３Ｄ３−３Ｈに対して２．５１ｍｇの活性化されたＡＰＣが加えられることによってマレイミドと結合せしめられる。暗い場所に摂氏４度の状態で置かれ、緩やかに攪拌されるもとで、１８時間に亙ってインキュベートされた後、室温のもとて１時間に亙り、自由状態のままで残ったチオール基がｌｏＯｍＭ　Ｎ−メチルマレイミド溶液（シグマ、米国）が加えられることにより捕獲される状態とされ、最終濃度が２０ｍＭとなるようにされる。その後、反応媒質が、ｐＨ７，０の１００ａ＋Ｍ燐酸塩緩衝液中に置かれたＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷイオン交換樹脂柱（ベックマン、米国）が用いられたゲル濾過によって精製される。

このようにして溶離される精製された共役溶液中におけるＡＰＣ及びＩｇＧ　３Ｄ３の夫々の濃度は、波長を２８０ｎｍ及び６５０ｎｍとする光に対する吸収度合いによって設定され、下記の計算式によりあられされる。

ＣＡ　Ｐ　Ｃ）　−０ｌ／ｌ　＝　Ａａｓｏ、−／　７１０，０００［ｇＧ］、。Ｉ／ｌ　＝　Ａ＋ｓｏｎｍ　Ａ’　２ｇ０ｎ。／　２１０，０００ここで、” ２８＋１ｎ＋ａは、波長を２８０ｎｍとする光に対してのＡＰＣ−マレイミドの貢献をあられす。

人間血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）は、Ｉｇ＃’の量をもって共役溶液に加えられ、その後、共役溶液は小分けされて摂氏−２０度のもとて凍結せしめられる。

Ｂ、Ｉ　ｇＧ　Ｅ、／Ｅｕ　ＴＢＰ共役溶液の用意ＩｇＧ　Ｅ１／Ｅｕ　ＴＢＰ共役溶液は、実施例Ｉの場合における手法に従って用意される。

Ｃ，プロラクチンの分析への適用上述の如くにして用意された標識抗体は、下記の如くの状態のもとで用いられる。

ＩｇＧＥ＋は、１５０ｍＭのＮａＦ及びＬｇ／Ｉ！のＨＳＡを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度がｌμｇ／ｌｎｉ！とされたユーロピウム・クリブテート：Ｅｕ）リスビピリジンジアミンによって標識化された状態。

ＩｇＧ　３Ｄ３は、１５０ｍＭのＮａＦ及び１ｇ／ｌのＨＳＡを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が２．５μｇ／ｌｎｌ！とされたアロフィコシアニン（シアノチック、米国）によって標識化された状態。

複数のプロラクチン標準溶液が、夫々異なった媒質、即ち、上述の緩衝液９人間の血清のプール及び新生子牛の血清の夫々について形成される。

サンプル量は１００μｌとされ、各共役溶液の１００μｌが加え合わされて得られる混合溶液が、９６個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート（ダイナチック、米国）上において、室温のもとに６０分間インキュベートされる。そして、結果は、実施例１において用いられた如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザが励起光源として用いられるとともに、通過波長域を６４５〜６６５ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間（ｔ、）が　５０μｓとされ、測定用タイムウィンドウ（ｔ、）が１００μｓとされたもとで行われる。

その測定結果は、第１図に示される。第１図においては、横軸に、ＩＵ／ｍ　ｉを単位としてあられされたプロラクチンの量がとられ、縦軸に、下記の式によってめられる有効信号ΔＦがとられている。

第１図に示される測定結果は、フッ化ナトリウムが存在することにより、螢光抑制血清要因の存在にかかわらず、分析が遂行されることをあられしている。

他の均質免疫分析′も、典型的なものとしてプロラクチンの分析をもって行われ、その際における測定媒質にはフッ化カリウム（Ｋ　Ｆ）が存在するものとされた。

実施例４に関連して記述された如くにして用意された標識抗体は、下記の如くの状態のもとで用いられる。

ＩｇＧ　Ｅｌは、６００ｍＭ　（Ｄ　Ｋ　Ｆ及びｘｇ＃ｌのＩＳＡを含んだｐＨ７，０の１ｏＯｎ＋Ｍ燐酸塩緩衝液中における濃度が１μｇ／ｍ／とされたユーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスビピソジンシアミンによって標識化された状態。

ＩｇＧ　３Ｄ３は、６００ｍ１Ｊ　（Ｄ　Ｋ　Ｆ及びＩｇ＃？のＩＳＡを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が２．５μｇ／ｌとされたアロフィコシアニン（シアノチック、米国）によって標識化された状態。

複数のプロラクチン標準溶液が、新生子牛の血清について形成される。

分析及び螢光の測定は実施例４に関連して記述された如くの状　。

態のもとで行われるが、結果の処理は、レーザ螢光光度計による信号光度の測定が、遅れ時間（ｔ、）が５０μｓとされ、タイムウィンドウ（ｔ、）が４００μ ｓとされたもとで行われることによりなされる。

その測定結果は、第２図に示される。第２図においては、横軸に、ＩＵ／ｍ　１を単位としてあられされたプロラクチンの量がとられ、縦軸に、実施例４の場合と同様にしてめられる有効信号ΔＦがとられている。

第２図に示される測定結果は、測定媒質中におけるフッ化カリウムの存在により、螢光抑制血清要因の存在にががわらず、分析感度が良好に確保さすることをあられしている。

実施例　６上述の実施例２に関連して記述された分析と同様な分析において、最終濃度が１００ｍＭとされるフッ化ナトリウムの効果が、３Ｄ３　抗体／Ｅｕ）リスビピリジン・クリブテート共役溶液が用いられた５０種の人間の血清について試された。得られた結果は、血清媒質についての斯かるタイプの分析において実際に観測される事柄に反して、抗体／クリプテート共役溶液の発光寿命が一定とされることを示している。

実施例　７：ジゴキシンは、心不全に対処するための薬品の活性素成分として用いられる強心配糖体である。

２６８１ｔｌのＮａ１Ｏｔ溶液（フル力、スイス）が、２６８μｆの無水エタノール中にジゴキシンが５．３５ｍｇ含まれて成るジゴキシン懸濁液（参照番号３７１００　フル力、スイス）に加えられる。それにより得られた混合液が、攪拌される状態をもって、室温のもとて２０分間インキュベートされ、その後、１００μｌのＯ，１Ｍグリセリンが加えられることにより反応が停止せしめられる。

活性化されたジゴキシンの最終濃度は、初期重量と最終量とに関連して算出され、１．２　ｘｌＯ−２Ｍとされる。

９５μｌの過ヨウ素酸塩によって活性化されたジゴキシン溶液が、ｐ）１９．０の硼酸塩緩衝液中における２ｒｎｌの精製されたＡＰＣ溶液（シアノチック、米国）に加えられる。それにより得られる混合液が、緩やかに攪拌される状態をもって、室温のもとて１時間３０分に亙ってインキュベートされ、その後、１．３２＋ｎｌの硼酸塩緩衝液中におけるＮ　ａ　Ｂ　Ｈ＊の濃度が５ｍｇとされた水酸化硼素ナトリウム溶液の１００μｌが加えられることにより反応が停止せしめられる。

ｃ）ＡＰＣ−ジゴキシン・トレーサの精製２ｍｌの反応混合液が、ＨＲ１０／１０　Ｇ２５イオン交換樹脂柱（ファーマンア、スウェーデン）に噴射されて、ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中で平衡化されるとともに排除体積において溶離される。過剰試薬は、８ｔｎｌの緩衝液によって溶離される。

１．２２　ｍｇ／ｍｆのＡＰＣ＜波長を６５０ｎｍとする光に対する吸光度による測定による）を含む、およそ４ｍｌのＡＰＣ−ジゴキシン結合生成物の溶液が回復せしめられる。ジゴキシンの濃度は、ＲｌＡあるいはＤＥＬＦＩＡ　（ファーマシア、スウェーデン）によってめられる。算出されたアロフィコシアニン対ジゴキシンの最終モル比はおよそ０．８である。

Ｂ９人間の血清中におけるジゴキシンの競争均質分析抗体／ユーロピウム・クリプテート：Ｅｕ　ＴＢＰジアミン共役溶液が、抗ジゴキ世ン・マウス・モノクロナル抗体（参照番号Ｇ　３１６０４　Ｍ　、アンチルシム、フランス）が用いられ、実施例１に関連して記述された如くにして用意される。この抗体／クリブテート共役溶液は、１５０ｍＭのＮａＦ及びＩｇ／ｉ’のＩＳＡを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が０．５μｇ／ｒｎｌとされて用いられる。

ＡＰＣ−ジゴキサン・トレーサは、１５０ｍＭのＮａＦ及び１ｇ／ｌのＩＳＡを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が０．２μｇ／ｍ！！とされて用いられる。

ジゴキシン懸濁液は、ジゴキシン溶液（フル力、スイス）が、人間の血清中において、５０１５０の配分とされたエタノール−水混合液における濃度がｌｌ１１ｇ／ｌｌｌ１とされるように希釈されることによって用意される。標準溶液曲線は、５０μｌの燐酸塩緩衝液、　５０μｌの標準溶液、１００μｌのＡＰＣ−ジゴキサン・トレーサ、及ヒ、１００μｌの抗体／クリプテート共役溶液を含んだ複数種のサンプルの助けを得て描かれる。

分析対象とされる複数種のサンプルは、５０μｌの標準溶液が５０μｌの個々の分析されるべき血清に置き換えられることを除いて、同じ組成を有する。

分析は、９６個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート（ダイナチック、米国）において行われる。室温のもとに３０分間インキュベートされた後、結果が、実施何重に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢光光度計においては、通過波長域を６５５〜６７５ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィンドウが１００μｓとされたもとで行われる。

その測定結果は、−Ｂ／Ｂ、比のパーセンテージとしてあられされ、Ｂは、各標準溶液に関して得られる値であり、また、Ｂｏは、標準溶液０に関して得られる値である。得られた結果は、表■に示される。

表■に示される測定結果は、得られた値が、ジゴキサンの濃度の増加に応じてリニアーに低減する関係にあることをあられしている。そして、測定媒質中にフッ化ナトリウムが存在することにより、血清媒質中におけるジゴキサンの分析が、ｎｇ／ｍｌオーダーの高感度をもって遂行されることになる。

実施例　８：メタノール中に８．７ｍｇ／ｍ　！！　（５０ｍＭ）含まれたＳ−ＡＭＳＡの溶液（シグマ、米国）の５００μｆが、メタノール中に２０　ｍｇ／ｍ１含＊れたＴ、の溶液（カルパイオシエム、フランス）の５００μｌに加えられ、それにより得られた混合液が、メタノール中に６．９５ｍｇ／ｍｌ　（１００ｍＭ）含まれたハイトロキシルアミンの溶液の５００μｌが加えられる前に、室温のもとで１５分間インキュベートされる。

その後、９７５μｌの反応混合液が除去され、５２５μｌのＭＩＬＬＩＰＯ−ＲＥ　ＨＡ　Ｏ，４５μｍフィルタによって濾過された二重蒸留水が加えられる。

この溶液は、そのうちの２５０μｆが、Ｐｅｐ、ＲＰＣＨＲ５１５ＨＰＬＣイオン交換樹脂柱を通過するものとされ、６５／　３５　の配分とされたエタノール −水混合液によって溶離される。

溶離された最初の３個のピークは回復せしめられ、それに続く部分が混合されて、回転蒸発器において蒸発せしめられる。それにより、およそ３ｍｇの活性化されたＴ、（Ｔ、−５Ｒ）が回復せしめられる。

ｂ）ＳＭＣＣによるアロフィコシアニンの活性化１０　ｍｇのＡＰＣが、ＡＭＩＣＯＮ　Ｃ［！ＮＴＲＩＣ０Ｎ　３０　）　−ンが用いられるちとで精製されるとともに濃縮され、その７００μｌについて１０゜６　ｍｇ７ｍｌの濃度を有するものとされる。ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に１０　ｍｇ／ｍｌ含まれた５ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣの溶液（ピアース、米国）の１８０μｌが、ＡＰＣ！液に加えられる。それにより得られる反応溶液は、それにより得られる混合液が、攪拌される状態をもって、室温のもとて１時間インキュベートされ、その後、活性化されたＡＰＣが、ｐＨ７，０の燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５　）ＩＲ１０／１０イオン交換樹脂柱、（ファニマシア、スウェーデン）を用いた排除クロマトグラフィによって精製される。

Ｔ、−３Ｈのフラズコ内には、２００μｌのメタノールが混入しており、その溶液の５０ＭμｌがｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における２ｍｊ？の活性化されたＡＰＣ溶液に加えられる。それにより得られる反応混合液が、攪拌される状態をもって、摂氏４度のもとて１８時間に亙ってインキュベートされ、その後、過剰マレイミドの部位が、燐酸塩緩衝液中におけるＩ／１０のメルカプトエタノール（シグマ、米国）の５μｌによって遮断される。

ｄ）ＡＰＣ−Ｔｌ　）レーザの精製反応混合液が、ＡＭＩＣＯＮ　ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ　３０限外濾過装置が用いられるもとで、全体で１ｍｌとなるように濃縮され、それに、燐酸塩緩衝液中に１ｍｇ／ｍｚ含まれたＮ−ＡＡＮＳの溶液の５０μｌが加えられる（Ｎ−ＡＡＮＳの最終濃度は、およそ５０μｌｍｌ　）。トレーサは、最終的に、ｐＨ７，０の１１００ｎ燐酸塩溶離緩衝液中に置かれたＰＨＡＲＭＡＣＩＡ　Ｇ２５　ＨＲ１０／１０排除クロマトグラフイ・イオン交換樹脂柱が用いられて精製され、０．８　ｍｇ／ｍｊ！の濃度を有した、およそ２゜５１１ＩＩのトレーサとされる（算出された波長６５０ｎｍの光に対するモル吸光係数は、ε＝７３１．０００である）。

各ＡＰＣ分子に結合するＴ４分子の数は、トレーサのＲＩＡ及びＴ、標準溶液曲線（Ｔ４〜ＫＰＲｋｉｔ　、オリス　アンディストリ、フランス）との比較によってめられる。計算によれば、精製されたトレーサについてのＡＰＣに対するＴ４の比は１．４である。

ＡＰＣ−Ｔ、）−レーザは、Ｎ−ＡＮＳ　（コダック、米国）から合成されたＮ −ＡＡＮＳの存在のもとに、ヒンズ他により記述された手法（ＣＬｆＮ、　ＣＨＥＭ、、　３２．１６〜２１．１９８８）によって精製される。

Ｂ６人間の血清中におけるチロキシンの競争均質分析抗体／ユーロピウム・クリブテート：Ｅｕ　ＴＢＰジアミン共役溶液が、抗Ｔ４Ｒ４１マウス・モノクロナル抗体（セ・ア・ニスバイオ　アンチルナジオナル、フランス）が用いられ、実施例１に関連して記述された如くにして用意される。この共役溶液は、１２０ｍＭのＮａＦ及び０．２％のＨ８Ａを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が２　ｇ／ｍｌとされて用いられる。

Ｔ４標準溶液は、イオン交換処理が施されてＴ４が無いものとされた人間の血清中においてＴ４が希釈されることによって用意される。標準溶液曲線は、５０μ ｌのＮ−ＡＡＮＳ溶液、５０ｕｌのＴ４を含まない人間の血清、あるいは、５０ μｌのＴ、標準溶液。

■００μｌのＡＰＣ−Ｔ４　トレーサ、及び、　１ｏｏμｌノ抗体／クリブテート共役溶液を含んだ２５０μｌの複数種のサンプルの助けを得て描かれる。

分析は、９６個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート（ダイナチック、米国）において行われる。室温のもとに３０分間インキュベートされた後、結果が、実施例１に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢光光度計においては、励起光源として、周波数を１．０００Ｈｚとするフランス・ランプが用いられるとともに、通過波長域を６５５〜６７５ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィンドウが１００μｓとされたもとで行われる。　・その測定結果は、Ｂ／Ｂ、比のパーセンテージとしてあられされ、Ｂは、各標準溶液に関して得られる値であり、また、Ｂ、は、標準溶液Ｏに関して得られる値である。分析対象とされる各サンプルの濃度は、標準溶液曲線との比較がなされて算出される。

得られた結果は、表Ｖに示される。

表■ 表■に示される測定結果は、得られた値が、Ｔ４の濃度の増加に応じてリニアーに低減する関係にあることをあられしている。

そして、測定媒質中にフッ化大トリウムが存在することにより、血清媒質中における測定感度が良好に確保されることになる。

１９．９抗原は、結腸癌を代表する炭水化物である。１９．９抗原に対する部位は反復的抗原決定基とされるので、同一の抗体がドナーを伴って標識化される態様とアクセプタを伴って標識化される態様とのいずれをもとり得ることになる。

１９．９抗原の分析としての均質免疫分析は、実施例４に関連して記述された如くにして用意された抗体／Ｅｕ　ＴＢＰ共役溶液及び抗体／ＡＰＣ共役溶液が用いられて行われる。１９．９抗原及び抗１９．９抗体は、米国の“セントコール ”から入手できる。二つの共役溶液の夫々は、１５０ｍＭのＮａＦ及びＩｇ／　ｌのＩＳＡを含んだｐＨ６，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中において希釈される。１９．９抗原の標準溶液は、１９．９抗原の濃縮溶液が新生子牛の血清中において希釈されることによって用意される。

そして、以下のものが、９６個の測定ウェルが設けられたポリスチレン製のマイクロプレート（ダイナチック、米国）上に順次加えられる。

・５０μｌの１９．９抗原の標準溶液・５０μｌの希釈緩衝液一１００μｌの濃度が０．５μｇ／ｍｌとされた抗体／ＥｕＴＢＰ共役溶液・１００μｌの濃度が５μｇ／ｌとされた抗体／ＡＰＣ共役溶液室温のもとに３時間３０分に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例１に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢光光度計においては、通過波長域を６４０〜６６０ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィンドウが４００μｓとされたもとで行われる。測定結果は、表■にアービトレーンヨン単位（ＡＵ）−によりあられされて示される如（である。

表Ｖ■ 表■に示される測定結果は、測定された信号が測定媒質中における１９．９抗原の量の増加に比例して増加する関係にあることをあられしている。そして、測定媒質中にフッ化ナトリウムが存在することにより、血清媒質中における測定が高感度をもって行われることになる。

実施例　１０・初期癌抗原（ＣＥＡ）の分析初期癌抗原の分析としての均質免疫分析は、二つのモノクロナル抗体Ｇ１２及びＧ１５（セ・ア・ニス　バイオ　アンチルナジオナル、フランス）が用いられて行われ、モノクロナル抗体Ｇ１２及びＧ１５は、夫々、ユーロピウム・クリプテート：Ｅｕ　ＴＢＰ及びアロフィコシアニンに結合したものとされる。

二つの共役溶液、即ち、Ｇ１２／Ｅｕ　ＴＢＰ及びＧＩ５／ＡＰＣの夫々は、１５０ｍＭのＮａＦ及びＩｇ／Ａ’のＩＳＡを含んだ１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中において希釈される。

そして、以下のものが、ポリスチレン製のマイクロプレート（ダイナチック、米国）上に順次加えられる。

・１００μｌの標′準溶液・１００μｌの濃度が０．５μｇ／ｍｌとされたＧ１２／クリブテート共役溶液一１００μＺの濃度が５μｇ／ｍｌとされたＧ１５／ＡＰＣ共役溶液摂氏３７度のもとて３時間に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例１に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理される。このレーザ螢光光度計においては、通過波長域を６４０〜６６０ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィンドウが４００μｓとされたもとで行われる。測定結果は、表■にアービトレージョン単位（ＡＵ）によりあられされて示される如くである。

表■ 表■に示される測定結果は、発せられた信号がＣＥＡの濃度の増加に比例して増加する関係にあることをあられしている。さらに、信号の増幅により、ＣＥＡの検出がｎｇ／ｍ　ｌオーダーの高感度をもって行われることになる。

また、測定媒質中にフッ化ナトリウムが存在することにより、測定が高感度をもって行われることになる。

第２図要約書測定媒質に燐酸塩イオンを加えるステ・ノブを含んだ、アナライトの螢光分析における干渉を低減させる方法。この方法ｉｔ、アナライトを含んでいると考えられる媒質にお客するアナライトの存在を、螢光を利用して検出及び／又（よ測定をするため用（１られる。

国際調査報告国際調査報告ＦＲ９１００５６６Ｓ＾　４９３７８

Claims

【特許請求の範囲】

１．測定媒質にフッ化物イオンを添加することを特徴とする、トレーサとして少なくとも一つの螢光化合物を用いて行うアナライトの螢光分析における干渉を低減させる方法。
２．用いられる螢光トレーサが希土類キレートもしくは希土類クリプテートであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。
３．測定媒質が生物学的媒質であることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
４．測定媒質が血清媒質であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
５．測定媒質にフッ化ナトリウム，フッ化セシウム，フッ化カリウムもしくはフッ化リチウムが添加されることを特徴とする請求の範囲第３項又は第４項記載の方法。
６．測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化ナトリウムの濃度が５０ｍＭ／ｌ〜５００ｍＭ／ｌに選定されたことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
７．測定媒質が血清媒質とされ、かつ、フッ化カリウムの濃度が５０ｍＭ／ｌ〜５Ｍ／ｌに選定されたことを特徴とする請求の範囲第５項記載の方法。
８．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法の実施に際して、測定媒質における干渉をフッ化物イオンを用いて低減させるフッ化物イオンの使用方法。
９．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法が均質方法とされたことを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
１０．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法が、１）上記媒質に、上記アナライトに対する少なくとも一個のレセプタを含んで成る第１の試薬を添加するステップ；２）上記媒質に、上記アナライト及び少なくとも一個のレセプタのうちから選定された第２の試薬を添加するステップ；３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起するステップ；及び、５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を、平衡状態あるいは動的状態のもとで測定するステップ；を含み、上記第１及び第２の試薬のうちの一方が上記螢光ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が上記螢光アクセプタ化合物と結合したものとされ、また、上記第１の試薬を添加するステップと上記第２の試薬を添加するステップとは順序が可逆とされるものとされたことを特徴とする請求の範囲第８項又は第９項記載の使用方法。
１１．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法が、１）上記アナライトを含んだ媒質に、少なくとも一つの上記アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ；２）上記媒質に、一つもしくは二つ以上の他の上記アナライトに対するレセプタから成り、螢光アクセプタ化合物と結合した第２の試薬を添加するステップ；３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、光源からの上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起するステップ；及び、５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ；を含んで成る過剰分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の使用方法。
１２．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法が、１）上記アナライトを含んだ媒質に、上記アナライトに対するレセプタから成り、螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ；２）上記媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第２の試薬を添加するステップ；３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起するステップ；及び、５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ；を含んで成る競争分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の使用方法。
１３．アナライトを含んでいる可能性のある媒質中のアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用して行う方法が、１）上記アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した、上記アナライトに対するレセプタから成る第１の試薬を添加するステップ；２）上記媒質に、螢光ドナー化合物と結合したアナライトを第２の試薬として添加するステップ；３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第２の試薬の両者が添加された後に、得られた媒質をインキュベートするステップ；４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長の光によって励起するステップ；及び、５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ；を含んで成る競争分析方法の助けを得るものとされたことを特徴とする請求の範囲第１０項記載の使用方法。
１４．第１の試薬及び第２の試薬がアナライトを含んだ媒質に同時に添加されることを特徴とする請求の範囲第１０項，第１１項，第１２項又は第１３項記載の使用方法。
１５．アナライトに対する単一のレセプタであって螢光ドナー化合物または螢光アクセプタ化合物と結合したものが用いられることを特徴とする請求の範囲第１０項又は第１１項記載の使用方法。
１６．螢光ドナー化合物が希土類キレートもしくは希土類クリプテートとされることを特徴とする請求の範囲第１０項，第１１項，第１２項，第１３項，第１４項又は第１５項記載の使用方法。
１７．希土類クリプテートがテルビウム・クリプテートもしくはユーロピウム・クリプテートとされることを特徴とする請求の範囲第１６項記載の使用方法。
１８．螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプテート：Ｔｂトリスジピリジンもしくはユーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスジピリジンとされることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の使用方法。
１９．螢光ドナー化合物がユーロピウム・クリプテートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がアロフィコシアニン，アロフィコシアニンＢ，フィコシアニンＣ及びフィコシアニンＲのうちから選択されたものとされることを特徴とする請求の範囲第１０項，第１１項，第１２項，第１３項，第１４項，第１５項又は第１６項記載の使用方法。
２０．螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプテートとされるとともに、螢光アクセプタ化合物がローダミン，チオニン，フィコシアニンＲ，フィコエリトロシアニン，フィコエリトリンＣ，フィコエリトリンＢ及びフィコエリトリンＲのうちから選択されたものとされることを特徴とする請求の範囲第１０項，第１１項，第１２項，第１３項，第１４項，第１５項又は第１６項記載の使用方法。