JP2005351889A - 標的物質を迅速簡便に検出する方法およびそのための酵素免疫学的キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的物質を認識する物質を表面に固定化した支持体、標的物質に対する酵素標識抗体、酵素標識抗体を発色させた後の反応産物が水不溶性となる基質より構成され、該支持体表面の発色によってサンプル中の標的物質を検出することを特徴とする酵素免疫学的キット、または、インキュベーション工程と発色工程の2段階の反応工程からなり、かつ発色反応後の支持体表面の色を目視によって判断することで、サンプル中の標的物質を検出、または標的物質濃度を測定する。
【選択図】図4
Description
(2)少なくとも1種類の標的物質を認識する物質を表面に固定化した後に非標的物質の非特異吸着を阻害する処理を施し、さらに少なくとも1種類の既知濃度の標的物質を反応させた支持体、少なくとも1種類の該標的物質に対する酵素標識抗体、少なくとも1種類の該酵素標識抗体を発色させた後の反応産物が水不溶性となる基質およびそれらを収容する少なくとも1つの容器を含んでなり、該容器中で抗体抗原反応および発色反応させ、かつ標的物質を認識する物質が前記支持体表面に、サンプル量に対して2cm2/ml以上になるように固定化されている、該支持体表面の既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質の濃度を測定することを特徴とする酵素免疫学的キット。
(3)さらに、同時に該支持体表面の発色によってサンプル中の標的物質を検出するとともに該支持体表面の既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質の濃度を測定することを特徴とする(2)に記載の酵素免疫学的キット。
(4)標的物質を認識する物質を含む溶液と支持体を接触させることで支持体の表面に標的物質を認識する物質を固定化する酵素免疫学的キットであって、
固定化する際の前記溶液中の標的物質を認識する物質の濃度が0.1〜20μg/mlである(1)〜(3)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(5)さらに、固定化する際のpHが6.5〜8.0である(4)記載の酵素免疫学的キット。
(6)さらに、標的物質に対する酵素標識抗体の濃度が0.1〜20μg/mlである(4)または(5)に記載の酵素免疫学的キット。
(7)支持体に固定化された標的物質を認識する物質が、サンプル中の標的物質の濃度と発色の強さが一次的な相関関係になる量で固定化されている、(1)〜(6)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(8)前記標的物質を認識する物質が標的物質に対する抗体であって、かつ該抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする(1)〜(7)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(9)防腐剤による処理、加圧処理もしくは加熱処理、または不活性ガスもしくは真空状態での保存により処理後6ヶ月経つまで標的物質を認識する物質の活性が低下しないことを特徴とする(1)〜(8)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(10)前記支持体が、棒状、板状またはくぼみを有した形状であることを特徴とする(1)〜(9)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(11)前記酵素標識抗体がモノクローナル抗体である、(1)〜(10)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(12)モノクローナル抗体がヒトインターロイキンに対する抗体である(11)記載の酵素免疫学的キット。
(13)前記モノクローナル抗体がIgGである(11)または(12)に記載の酵素免疫学的キット。
(14)前記モノクローナル抗体がIgG1である(13)に記載の酵素免疫学的キット。
(15)前記ヒトインターロイキンがIL−6またはIL−8である(12)〜(14)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(16)モノクローナル抗体がヒトIL−6のアミノ酸配列の149〜173番のアミノ酸からなる断片を認識するモノクローナル抗体である(15)に記載の酵素免疫学的キット。
(17)モノクローナル抗体がヒトIL−6のアミノ酸配列の153〜162番のアミノ酸からなる断片を認識するモノクローナル抗体である(15)に記載の酵素免疫学的キット。
(18)ヒトIL−6に対する抗体が微工研菌寄託第10713号として微生物工業技術院研究所に寄託されているハイブリドーマが産生するクローンIG61である(16)に記載の酵素免疫学的キット。
(19)ヒトIL−8に対する抗体が微工研菌寄託第12710号として微生物工業技術院研究所に寄託されているハイブリドーマが産生するクローンEL139である(17)記載の酵素免疫学的キット。
(20)前記酵素標識抗体の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼのいずれかから選択される、(1)〜(19)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(21)前記酵素標識抗体の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであり、かつ、前記基質が、3−アミノ−9−エチルカルバゾール、5−アミノサリチル酸、4−クロロ−1−ナフトール、o−フェニレンジアミン、2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルフォン酸)、3,3−ジアミノベンジジン、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、o−ジアニシジン、3,3−ジメトキシベンジジンのいずれかを含んだ溶液から選択される、(1)〜(20)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(22)前記酵素標識抗体の酵素がアルカリフォスファターゼであり、かつ前記基質が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェート、ニトロブルーテトラゾリウム、p−ニトロフェニルリン酸のいずれかを含んだ溶液から選択される、(1)〜(21)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(23)前記酵素標識抗体の酵素がβ−D−ガラクトシダーゼであり、かつ、前記基質がo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシドまたは5−ブロモ−4−クロロ−3−インドール−β−D−ガラクトピラノシドのいずれかを含んだ溶液から選択される、(1)〜(22)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(24)前記標的物質がサイトカイン、黄色ブドウ球菌外毒素、A群連鎖球菌外毒素のいずれかである、(1)〜(23)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(25)前記サイトカインが炎症性のサイトカインである、(24)に記載の酵素免疫学的キット。
(26)前記炎症性のサイトカインが、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、TNF−α、IFN−γのいずれかである、(25)に記載の酵素免疫学的キット。
(27)前記サイトカインの検出限界濃度を500pg/mlとしたことを特徴とする、(24)〜(26)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(28)前記黄色ブドウ球菌外毒素がスーパー抗原である、(24)に記載の酵素免疫学的キット。
(29)前記スーパー抗原がSEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEH、SEI、SEJ、TSST−1のいずれかである、(28)に記載の酵素免疫学的キット。
(30)前記A群連鎖球菌外毒素がスーパー抗原である、(24)に記載の酵素免疫学的キット。
(31)前記スーパー抗原がSPEA、SPEC、SPEF、SPEG、SPEHのいずれかである、(30)に記載の酵素免疫学的キット。
(32)高サイトカイン血症が原因の疾患を迅速に判定するための、(1)〜(27)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(33)黄色ブドウ球菌が原因の疾患を迅速に判定するための、(1)〜(24)、(28)および(29)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(34)A群β溶血性連鎖球菌が原因の疾患を迅速に判定するための、(1)〜(24)、(30)および(31)のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
(35)支持体表面の発色を測定装置により数値化し、該数値を用いて発色を定量化する(1)〜(35)のいずれかに記載の酵素免疫学的キットであって、支持体から反射した光を400〜700nmの範囲で分光し、各波長毎の反射率を測定してXYZまたはL*a*b*で表色系におけるパラメーターを測定することを特徴とする酵素免疫学的キット。
(36)(1)〜(35)のいずれかに記載の酵素免疫学的キットを用いて、サンプル中の標的物質を検出、またはサンプル中の標的物質濃度を測定する方法。
(37)標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体、サンプルおよび標的物質に対する酵素標識抗体を同時にインキュベーションするインキュベーション工程と、反応産物が水不溶性となる基質によって発色させる発色工程の2段階の反応工程からなり、インキュベーション工程において、標的物質を認識する物質が前記支持体表面に、サンプル量に対して、2cm2/ml以上になるように添加し、かつ発色反応後の支持体表面の色を目視によって判断することを特徴とする、サンプル中の標的物質を検出するための方法。
(38)標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体に標的物質を認識する物質を固定化する際の標的物質を認識する物質の溶液の濃度が0.1〜20μg/mlであり、pHが6.5〜8.0である、(36)に記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(39)発色工程において用いる標的物質に対する酵素標識抗体の濃度が0.1〜20μg/mlである(37)または(38)に記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(40)(37)〜(39)のいずれかに記載の方法であって、発色反応後の支持体表面の色を目視によって判断することを特徴とする、サンプル中の標的物質濃度を測定するための方法。
(41)(37)〜(39)のいずれかに記載の方法であって、かつ発色反応後の支持体表面の色を機器によって数値化し、それを用いて発色を定量することを特徴とする、サンプル中の標的物質を検出するための方法。
(42)試料から反射された光を400〜700nmの範囲で分光し、各波長ごとの反射率を測定して表色系におけるパラメーターを測定する(36)〜(41)のいずれかに記載の方法であって、表色系がXYZまたはL*a*b*であることを特徴とするサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(43)前記インキュベーション工程と発色工程との間に、洗浄工程を含む、(37)〜(42)のいずれかに記載の方法。
(44)インキュベーション、洗浄、発色の各工程で反応温度が4℃〜40℃の範囲であることを特徴とする(37)〜(43)のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(45)前記インキュベーション工程、発色工程、洗浄工程が室温によって実施される、(44)に記載の方法。
(46)サンプルの量が200μl以下である、(37)〜(45)のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(47)前記インキュベーション工程の時間が5〜60分の範囲であり、かつ、前記発色工程の時間が5〜30分の範囲とする、(37)〜(46)のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(48)標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体の当該標的物質を認識する物質で被覆された部分の一部および被覆されていない部分の一部の少なくとも一方に、少なくとも1種類の既知濃度の標的物質を反応させた後、既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質濃度を測定する、(37)〜(47)のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
(49)(37)〜(48)のいずれかに記載された方法であって、標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体が、少なくとも2種類の、異なる濃度の標的物質を認識する物質で被覆されており、少なくとも2カ所の発色具合を比較することによってサンプル中の標的物質濃度を測定する方法。
(50)前記標的物質がサイトカインであり、その検出限界濃度が500pg/mlである、(37)〜(49)のいずれかに記載の方法。
(51)(24)〜(27)および(32)のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによってサイトカインを検出し、高サイトカイン血症を診断する方法。
(52)(28)、(29)、および(33)のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによって黄色ブドウ球菌外毒素を検出し、黄色ブドウ球菌が原因の疾患を診断する方法。
(53)(30)、(31)および(34)のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによってA群β溶血性連鎖球菌外毒素を検出し、A群β溶血性連鎖球菌が原因の疾患を診断する方法。
表色系とは、物体の色や光源の色を数値や記号で表現する方法をいう。なかでも、L*a*b*表色系は国際照明委員会(CIE)が定めた均等色空間のひとつであり、また、JIS(JIS Z8729)にも採用されている。L*a*b*表色系は、試料のXYZ表色系における三刺激値のX、Y、Zから計算される。XYZ表色系は現在CIE標準表色系として各表色系の基礎となっている光の三原色の加法混色の原理に基づいており、色度図を使って色をYxyの3つの値で表す。Yは反射率で明度に対応し、xyが色度になる。L*a*b*表色系では、明度がL*、色相と彩度を表す色度がa*、b*で表され、L*が大きいほど白に近づき、L*が小さいほど黒に近づく。a*は赤方向、−a*は緑方向、b*は黄方向、−b*は青方向を示しており、数字の絶対値が大きくなるに従って色鮮やかになり、数字の絶対値が小さくなるほどくすんだ色になる。そのため、人間の色覚に最も近いとされている。本発明において、機器による表色系パラメーター測定は発色の度合いを機器によって数値化し、それを用いて発色を定量することができれば限定はない。具体的には試料から反射された光を可視領域である400〜700nmの範囲で分光し、各波長ごとの反射率を測定して表色系におけるパラメーターを計算できれば良く、この反射率測定からXYZ表色系でのパラメーターやL*a*b*表色系でのパラメーターなどが計算できる。反射率の測定は、例えば市販の分光測色計(色彩計)を用いて行うことができる。
この際、上記の条件で測定を行った場合、サンプル中の標的物質の濃度と分光反射率から計算されるL*、a*、b*等の値やL*a*b*表色系における座標L*、a*、b*の差であるΔL*、Δa*、Δb*から計算できるΔE*(ab)の値は、一定範囲濃度で一次的な相関関係にあるので、サンプル中の標的物質の濃度を正確に定量することができる。また、L*a*b*法により数値化された値は、人間の色覚により判断した明度や彩度に近いため、目視による迅速な判定結果とも相関が高く、かつ精度も高いという特徴を有しており、迅速測定と正確な定量を同時に行う際には吸光度による定量方法よりも優れている。
説明する。
サイトカインは免疫反応、炎症反応に深く関わる微量生理活性物質で、おもに白血球から産生され、IL−1、IL−6、TNFはいずれも急性期反応を引き起こし、肝細胞に一連の急性期タンパク質を合成、分泌させるほか、内因性発熱物質として作用する。IL−2はキラー細胞の誘導や活性化、B細胞増殖など多様な作用を示す。IL−8は好中球とT細胞を炎症局所に引き寄せる。IFN−γはマクロファージを活性化して活性酸素の産生を促進したりする。
その後容器中およびスティックに付着している溶液を除去し、牛血清アルブミン(セロロジカル社製)が0.5%添加されたリン酸緩衝食塩水1mlに支持体を浸漬し、室温(22℃)で2時間静置することでブロッキング処理を施した。その後容器中およびスティックに付着している溶液を除去し、30%のサッカロースを含むリン酸緩衝溶液1mlに浸漬し保存処理を施した。その後容器中および支持体に付着している溶液を除去した。抗ヒトIL−8ポリクローナル抗体は、ヒト線維芽細胞由来天然型IL−8をウサギに皮下投与して得られた抗血清を、IL−8固定化カラムを用いたアフィニティー精製したものを用いた。
HRP標識化抗IL−8モノクローナル抗体が0.5μg/mlとなるよう、牛血清アルブミン(セロロジカル社製)が0.25%、Tween20(東京化成社製)が0.05%添加されているリン酸緩衝食塩水にて調整し、これをポリプロピレン製容器に250μlずつ分注した。HRP標識モノクローナル抗体は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている微工研菌寄第12710号 EL139を培養することにより得たモノクローナル抗体を、HRPにて標識化して得た。これに、ヒトIL−8(バイオソース社製)が、それぞれ4ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0ng/mlとなるよう調整されたヒト血漿(バイオソース社製ELISAによってIL−8が検出感度以下の濃度であることを確認済)をそれぞれ別々の容器に250μlずつ分注した。これに実施例1で作製した支持体を浸漬し、30分間室温(22℃)で静置した。支持体は実施例1の操作後41日経過していた。このとき、支持体において、抗ヒトIL−8ポリクローナル抗体を表面に固定化した部分に対するヒト血漿量の比は6.7cm2/mlであった。その後、容器中および支持体に付着している溶液を除去し、蒸留水にて洗浄した。容器に3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを含む基質(プロメガ社製)を1ml分注し、15分間室温で静置した。その後、溶液中および支持体に付着している溶液を除去し、蒸留水にて洗浄した。支持体の発色の度合いを目視およびL*a*b*表色系にて確認した。L*値、a*値、b*値は、コニカミノルタ社分光測色計(CM−2600d)を使用して測定し、0ng/mlのL*値、a*値、b*値と比較した。図1にIL−8を添加したヒト血漿による支持体の発色を示す写真を示し、表1にΔL*値、Δa*値、Δb*値を示す。
抗ヒトIL−6ポリクローナル抗体が2μg/mlとなるようリン酸緩衝食塩水にて調製し、ポリプロピレン容器に1ml分注した。これにポリスチレン製支持体(ヌンク社製)を浸漬し、4℃で18時間静置することでスティックに抗IL−6抗体を固定化した。その後容器中およびスティックに付着している溶液を除去し、牛血清アルブミン(セロロジカル社製)が0.5%添加されたリン酸緩衝食塩水1mlに支持体を浸漬し、室温(22℃)で2時間静置することでブロッキング処理を施した。その後容器中およびスティックに付着している溶液を除去し、30%のサッカロースを含むリン酸緩衝溶液1mlに浸漬し保存処理を施した。その後容器中および支持体に付着している溶液を除去した。抗ヒトIL−6ポリクローナル抗体は、ヒト線維芽細胞由来の天然型IL−6をヤギに皮下投与して得られた抗血清を、IL−6固定化カラムを用いたアフィニティー精製したものを用いた。
HRP標識化抗IL−6モノクローナル抗体が0.5μg/mlとなるよう、牛血清アルブミン(セロロジカル社製)が0.25%、Tween20(東京化成社製)が0.05%添加されているリン酸緩衝食塩水にて調整し、これをポリプロピレン製容器に250μlずつ分注した。HRP標識モノクローナル抗体は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている微工研菌寄第10713号(国際寄託第2878号) IG61を培養することにより得たモノクローナル抗体を、HRPにて標識化して得た。これにヒトIL−6(バイオソース社製)が、それぞれ5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0ng/mlとなるよう調整されたヒト血漿(バイオソース社製ELISAによってIL−6が検出感度以下の濃度であることを確認済)をそれぞれ別々の容器に250μlずつ分注した。これに実施例1で作製した支持体を浸漬し、30分間室温(22℃)で静置した。支持体は実施例1の操作後41日経過していた。このとき、支持体において、抗ヒトIL−6ポリクローナル抗体を表面に固定化した部分に対するヒト血漿量の比は6.7cm2/mlであった。その後、容器中および支持体に付着している溶液を除去し、蒸留水にて洗浄した。容器に3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンを含む基質(プロメガ社製)を1ml分注し、15分間室温で静置した。その後、溶液中および支持体に付着している溶液を除去し、蒸留水にて洗浄した。支持体の発色の度合いを目視およびL*a*b*表色系にて確認した。L*値、a*値、b*値は、コニカミノルタ社分光測色計(CM−2600d)を使用して測定し、0ng/mlのL*値、a*値、b*値と比較した。図2に、IL−6を添加したヒト血漿による支持体の発色を示す写真を示し、表2にΔL*値、Δa*値、Δb*値を示す。
サイトカインの濃度とL*値、a*値、b*値が相関すること、またサンプル中のサイトカインの濃度が500pg/ml以上である場合にのみ発色が確認できることが示された。
比較例1:支持体への標的物質に対する抗体の固定化量による発色度合い
実施例1における抗ヒトIL−8ポリクローナル抗体および実施例3における抗ヒトIL−6ポリクローナル抗体が0.05μg/ml、25μg/mlとなるよう調製した。後の操作はサンプルとして、IL−6、IL−8がそれぞれ0.5ng/mlとなるよう調整されたヒト血漿(バイオソース社製ELISAによってIL−6およびIL−8が検出感度以下の濃度であることを確認済)を用いた他、実施例1〜4に従った。
このように、支持体への標的物質に対する抗体の固定化量が少なすぎる場合、および多すぎる場合には発色度合いが低下し、サンプル中のサイトカインの濃度が500pg/mlである発色が確認できなかった。
実施例2におけるHRP標識化抗IL−8モノクローナル抗体および実施例*におけるHRP標識化抗IL−6モノクローナル抗体が0.05μg/ml、25μg/mlとなるよう調製した。後の操作はサンプルとして、IL−6、IL−8がそれぞれ0.5ng/mlとなるよう調整されたヒト血漿(バイオソース社製ELISAによってIL−6およびIL−8が検出感度以下の濃度であることを確認済)とサイトカインを含まないヒト血漿を用いた他、実施例1〜4に従った。
このように、標的物質に対する酵素標識抗体の濃度が低すぎる場合にはサンプル中のサイトカインの濃度が500pg/mlである発色が確認できなかった。また多すぎる場合には非特異発色によりサイトカインが含まれていないサンプルでも発色してしまうことを確認した。
実施例2において、ヒトIL−8が添加されたヒト血漿の代わりに、サイトカイン濃度が既知である高サイトカイン患者の血清を使用し、支持体の発色の度合いを確認した。
患者血中サイトカイン濃度は、ELISA(バイオソース社製)によって確認した。図3に患者血清中のIL−8による支持体の発色(L*a*b*表色系による定量)を示す写真を示し、表3にΔL*値、Δa*値、Δb*値を示す。
度を測定することができ、高サイトカイン血症を診断することができた。
Claims (53)
- 少なくとも1種類の標的物質を認識する物質を表面に固定化した後に非標的物質の非特異吸着を阻害する処理を施した支持体、少なくとも1種類の該標的物質に対する酵素標識抗体、少なくとも1種類の該酵素標識抗体を発色させた後の反応産物が水不溶性となる基質およびそれらを収容する少なくとも1つの容器を含んでなり、該容器中で抗体抗原反応および発色反応させ、かつ標的物質を認識する物質が前記支持体表面に、サンプル量に対して2cm2/ml以上になるように固定化されている、該支持体表面の発色によってサンプル中の標的物質を検出することを特徴とする酵素免疫学的キット。
- 少なくとも1種類の標的物質を認識する物質を表面に固定化した後に非標的物質の非特異吸着を阻害する処理を施し、さらに少なくとも1種類の既知濃度の標的物質を反応させた支持体、少なくとも1種類の該標的物質に対する酵素標識抗体、少なくとも1種類の該酵素標識抗体を発色させた後の反応産物が水不溶性となる基質およびそれらを収容する少なくとも1つの容器を含んでなり、該容器中で抗体抗原反応および発色反応させ、かつ標的物質を認識する物質が前記支持体表面に、サンプル量に対して2cm2/ml以上になるように固定化されている、該支持体表面の既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質の濃度を測定することを特徴とする酵素免疫学的キット。
- さらに、同時に該支持体表面の発色によってサンプル中の標的物質を検出するとともに該支持体表面の既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質の濃度を測定することを特徴とする請求項2に記載の酵素免疫学的キット。
- 標的物質を認識する物質を含む溶液と支持体を接触させることで支持体の表面に標的物質を認識する物質を固定化する酵素免疫学的キットであって、
固定化する際の前記溶液中の標的物質を認識する物質の濃度が0.1〜20μg/mlである請求項1〜3のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。 - さらに、固定化する際のpHが6.5〜8.0である請求項4記載の酵素免疫学的キット。
- さらに、標的物質に対する酵素標識抗体の濃度が0.1〜20μg/mlである請求項4または5に記載の酵素免疫学的キット。
- 支持体に固定化された標的物質を認識する物質が、サンプル中の標的物質の濃度と発色の強さが一次的な相関関係になる量で固定化されている、請求項1〜6のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記標的物質を認識する物質が標的物質に対する抗体であって、かつ該抗体がポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 防腐剤による処理、加圧処理もしくは加熱処理、または不活性ガスもしくは真空状態での保存により処理後6ヶ月経つまで標的物質を認識する物質の活性が低下しないことを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記支持体が、棒状、板状またはくぼみを有した形状であることを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記酵素標識抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜10のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- モノクローナル抗体がヒトインターロイキンに対する抗体である請求項11記載の酵素免疫学的キット。
- 前記モノクローナル抗体がIgGである請求項11または12に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記モノクローナル抗体がIgG1である請求項13に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記ヒトインターロイキンがIL−6またはIL−8である請求項12〜14のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- モノクローナル抗体がヒトIL−6のアミノ酸配列の149〜173番のアミノ酸からなる断片を認識するモノクローナル抗体である請求項15に記載の酵素免疫学的キット。
- モノクローナル抗体がヒトIL−6のアミノ酸配列の153〜162番のアミノ酸からなる断片を認識するモノクローナル抗体である請求項15に記載の酵素免疫学的キット。
- ヒトIL−6に対する抗体が微工研菌寄託第10713号として微生物工業技術院研究所に寄託されているハイブリドーマが産生するクローンIG61である請求項16に記載の酵素免疫学的キット。
- ヒトIL−8に対する抗体が微工研菌寄託第12710号として微生物工業技術院研究所に寄託されているハイブリドーマが産生するクローンEL139である請求項17記載の酵素免疫学的キット。
- 前記酵素標識抗体の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−D−ガラクトシダーゼのいずれかから選択される、請求項1〜19のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記酵素標識抗体の酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼであり、かつ、前記基質が、3−アミノ−9−エチルカルバゾール、5−アミノサリチル酸、4−クロロ−1−ナフトール、o−フェニレンジアミン、2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンズチアゾリン−6−スルフォン酸)、3,3−ジアミノベンジジン、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、o−ジアニシジン、3,3−ジメトキシベンジジンのいずれかを含んだ溶液から選択される、請求項1〜20のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記酵素標識抗体の酵素がアルカリフォスファターゼであり、かつ前記基質が、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェート、ニトロブルーテトラゾリウム、p−ニトロフェニルリン酸のいずれかを含んだ溶液から選択される、請求項1〜21のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記酵素標識抗体の酵素がβ−D−ガラクトシダーゼであり、かつ、前記基質がo−ニトロフェニル−β−D−ガラクトシドまたは5−ブロモ−4−クロロ−3−インドール−β−D−ガラクトピラノシドのいずれかを含んだ溶液から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記標的物質がサイトカイン、黄色ブドウ球菌外毒素、A群連鎖球菌外毒素のいずれかである、請求項1〜23のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記サイトカインが炎症性のサイトカインである、請求項24に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記炎症性のサイトカインが、IL−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、TNF−α、IFN−γのいずれかである、請求項25に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記サイトカインの検出限界濃度を500pg/mlとしたことを特徴とする、請求項24〜26のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 前記黄色ブドウ球菌外毒素がスーパー抗原である、請求項24に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記スーパー抗原がSEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEH、SEI、SEJ、TSST−1のいずれかである、請求項28に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記A群連鎖球菌外毒素がスーパー抗原である、請求項24に記載の酵素免疫学的キット。
- 前記スーパー抗原がSPEA、SPEC、SPEF、SPEG、SPEHのいずれかである、請求項30に記載の酵素免疫学的キット。
- 高サイトカイン血症が原因の疾患を迅速に判定するための、請求項1〜27のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 黄色ブドウ球菌が原因の疾患を迅速に判定するための、請求項1〜24、28および29のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- A群β溶血性連鎖球菌が原因の疾患を迅速に判定するための、請求項1〜24、30および31のいずれかに記載の酵素免疫学的キット。
- 支持体表面の発色を測定装置により数値化し、該数値を用いて発色を定量化する請求項1〜35のいずれかに記載の酵素免疫学的キットであって、支持体から反射した光を400〜700nmの範囲で分光し、各波長毎の反射率を測定してXYZまたはL*a*b*で表色系におけるパラメーターを測定することを特徴とする酵素免疫学的キット。
- 請求項1〜35のいずれかに記載の酵素免疫学的キットを用いて、サンプル中の標的物質を検出、またはサンプル中の標的物質濃度を測定する方法。
- 標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体、サンプルおよび標的物質に対する酵素標識抗体を同時にインキュベーションするインキュベーション工程と、反応産物が水不溶性となる基質によって発色させる発色工程の2段階の反応工程からなり、インキュベーション工程において、標的物質を認識する物質が前記支持体表面に、サンプル量に対して、2cm2/ml以上になるように添加し、かつ発色反応後の支持体表面の色を目視によって判断することを特徴とする、サンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体に標的物質を認識する物質を固定化する際の標的物質を認識する物質の溶液の濃度が0.1〜20μg/mlであり、pHが6.5〜8.0である、請求項36に記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 発色工程において用いる標的物質に対する酵素標識抗体の濃度が0.1〜20μg/mlである請求項37または38に記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 請求項37〜39のいずれかに記載の方法であって、発色反応後の支持体表面の色を目視によって判断することを特徴とする、サンプル中の標的物質濃度を測定するための方法。
- 請求項37〜39のいずれかに記載の方法であって、かつ発色反応後の支持体表面の色を機器によって数値化し、それを用いて発色を定量することを特徴とする、サンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 試料から反射された光を400〜700nmの範囲で分光し、各波長ごとの反射率を測定して表色系におけるパラメーターを測定する請求項36〜41のいずれかに記載の方法であって、表色系がXYZまたはL*a*b*であることを特徴とするサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 前記インキュベーション工程と発色工程との間に、洗浄工程を含む、請求項37〜42のいずれかに記載の方法。
- インキュベーション、洗浄、発色の各工程で反応温度が4℃〜40℃の範囲であることを特徴とする請求項37〜43のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 前記インキュベーション工程、発色工程、洗浄工程が室温によって実施される、請求項44に記載の方法。
- サンプルの量が200μl以下である、請求項37〜45のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 前記インキュベーション工程の時間が5〜60分の範囲であり、かつ、前記発色工程の時間が5〜30分の範囲とする、請求項37〜46のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体の当該標的物質を認識する物質で被覆された部分の一部および被覆されていない部分の一部の少なくとも一方に、少なくとも1種類の既知濃度の標的物質を反応させた後、既知濃度の標的物質が反応している部分とそれ以外の部分の発色の比較によって未知濃度のサンプル中の標的物質濃度を測定する、請求項37〜47のいずれかに記載のサンプル中の標的物質を検出するための方法。
- 請求項37〜48のいずれかに記載された方法であって、標的物質を認識する物質で被覆された部分を有する支持体が、少なくとも2種類の、異なる濃度の標的物質を認識する物質で被覆されており、少なくとも2カ所の発色具合を比較することによってサンプル中の標的物質濃度を測定する方法。
- 前記標的物質がサイトカインであり、その検出限界濃度が500pg/mlである、請求項37〜49のいずれかに記載の方法。
- 請求項24〜27および32のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによってサイトカインを検出し、高サイトカイン血症を診断する方法。
- 請求項28、29、および33のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによって黄色ブドウ球菌外毒素を検出し、黄色ブドウ球菌が原因の疾患を診断する方法。
- 請求項30、31および34のいずれかに記載の酵素免疫学的キットによってA群β溶血性連鎖球菌外毒素を検出し、A群β溶血性連鎖球菌が原因の疾患を診断する方法。
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